פרוטוקול זה מדגים את השילוב של הדמיה ואלקטרופיזיולוגיה כדי לזהות באופן אמין דפולריזציה מתפשטת בעכברים בוגרים בעקבות פגיעה מוחית טראומטית קלה.
מאמר שיטה
שילוב הדמיה ואלקטרופיזיולוגיה כדי להמחיש ולתעד דפולריזציה מתפשטת בעכברים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
התפשטות דפולריזציה (SDs) הם אירועים מסיביים במוח שלעתים קרובות אינם מזוהים בשל התפשטותם האיטית דרך החומר האפור. מכיוון שזיהוי SD יכול להיות חמקמק, הוא מאושר בצורה אופטימלית באמצעות מספר שיטות. פרוטוקול זה מתאר שיטות לשילוב הדמיה ואלקטרופיזיולוגיה לאיתור SDs באופן שרוב המעבדות יכולות לאמץ באופן אמין וקל. SDs מתרחשים בעקבות פגיעות מוח טראומטיות, שבץ מוחי, דימומים תת-עכבישיים, איסכמיה והילה של מיגרנה. מבחינה היסטורית, SDs הוקלטו באמצעות מגברי DC, שיכולים לפתור את השינוי החוץ-תאי האיטי ואת השקע בפעילות בתדר גבוה. עם זאת, כמעט בלתי אפשרי להשתמש במגברי DC עבור הקלטות in vivo כרוניות. פרוטוקול זה משתמש במגבר AC נפוץ להקלטות אלקטרופיזיולוגיה in vivo כדי לאשר דיכאון בתדר גבוה, יחד עם הדמיה לא פולשנית הנחוצה לזיהוי גל ההתפשטות של SD. ניתן לאמץ ו/או לשנות שיטות אלה באופן מהימן עבור רוב הגישות הניסיוניות כדי לאשר נוכחות או היעדר SDs לאחר פגיעה מוחית.
מבוא
התפשטות דפולריזציה (SDs) קשורה למצבים נוירולוגיים שונים, כולל פגיעה מוחית טראומטית (TBI), שבץ מוחי, דימומים תת-עכבישיים, איסכמיה והילה מיגרנה1. SDs היו מעורבים בהתקדמות של נזק לרקמות בשבץ מוחי וב-TBIs2. המנגנון המדויק העומד בבסיס התקדמות אובדן הרקמות נותר לא ברור3,4. עם זאת, SDs מתרחשים כאשר הדרישות המטבוליות של נוירונים אינן מתמלאות במספיק חמצן וגלוקוז, מכיוון שתפקודה של משאבת הנתרן-אשלגן התלויה ב-ATP הופך להיות לא מספיק כדי לשמור על שיפועי יונים. כדי להבין את תפקידם של SDs באובדן רקמות, יש צורך בטכניקות מדויקות כדי למדוד ולחקור אותן, וזה חיוני לקידום הידע המדעי. SDs הם אירועים נוירולוגיים משמעותיים שלעתים קרובות יכולים להיות בלתי מזוהים עקב מגבלות תכנון ניסוי ו/או מכשור.
התפקיד של התפשטות דפולריזציה (SDs) בהתקדמות הפציעה מתבהר כעת, אך תפקידם בפגיעות מוח טראומטיות קלות (mTBIs) נותר לא ברור. מחקרים אחרונים שהשתמשו בטכניקות המתוארות בכתב יד זה הראו ש-SDs מופעלים במודלים של עכברי mTBI עם גולגולת סגורה, אפילו כאשר אין נזק גלוי לרקמות או דימום5, 6. מחקרים אלה מצביעים על כך ש-SDs עשויים לתרום לליקויים נוירולוגיים חריפים ולדלקת עצבית. בנוסף, נוכחותם של SDs המושרים על ידי mTBI הייתה קשורה קשר הדוק לליקויים התנהגותיים חריפים6,7. לכן, סביר להניח ש-SDs מופעלים בכל המודלים של TBI, אולם עדיין קשה לברר את תפקידם ללא אישור. אישור נוכחותם של SDs הוא חיוני להערכה מדויקת של התוצאות של mTBIs.
התפשטות דפולריזציה (SDs) מזוהה על ידי ירידה משמעותית בפוטנציאל החוץ-תאי, המכונה "משמרת DC", ועל ידי דיכאון של פעילות בתדר גבוה8. "משמרת DC" לוקחת בדרך כלל שניות לפתור (~10 שניות)9. כדי ללכוד את "משמרת DC", יש צורך במגבר DC ואלקטרודות חוט כסף. עם זאת, אלקטרופיזיולוגיה in vivo מבוצעת בדרך כלל עם מגברי AC, שנועדו לסנן אירועים בתדר נמוך כדי להפחית את חפצי התנועה. למרבה הצער, סינון זה בתדר נמוך מסיר גם את "משמרת DC". בנוסף, כסף רעיל ואינו מתאים להקלטות כרוניות. מגברי AC נפוצים יכולים לזהות את הדיכאון של פעילות בתדר גבוה, אך ללא "משמרת DC" הנלווית, אישור נוכחותו של SD הוא מאתגר.
ניתן לזהות דפולריזציות מתפשטות (SDs) גם באמצעות טכניקות הדמיה שונות. לרוב, SDs מצולמים באמצעות הדמיית ניגודיות כתמי לייזר, המודדת את זרימת הדם המוחי דרך הגולגולת השלמה10. SDs משפיעים באופן משמעותי על כלי הדם במוח ועל זרימת הדם. ברוב המינים מלבד עכברים, SDs גורמים לגל מתפשט של היפרפרפוזיה שנע עם הקצה המוביל של SD11. ניתן לדמות SDs גם באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים של סידן או גלוטמט12, אם כי זה דורש העמסת רקמה עם צבעים או אינדיקטורים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית12,13. מעניין שניתן לצפות ב-SDs בעין בלתי עקב אותות אופטיים מהותיים (iOS) הקשורים ל-SD14. iOS הם אותות מורכבים המורכבים ממולקולות אוטופלואורסצנטיות כמו NAD(P)H ו-FADH15,16, נפיחות רקמות17, ושינויים פוטנציאליים בזרימת הדם במוח. למרות מורכבותם, אותות iOS אמינים וניתן ללכוד אותם ב-mice18. פרוטוקול זה מתאר את השיטה להדמיית iOS מכיוון שניתן ליישם טכניקה זו בכל מעבדה ללא צורך בנגיפים מיוחדים או בעלי חיים מהונדסים.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לאשר באופן ניסיוני נוכחות או היעדר דפולריזציה מתפשטת (SD) בעקבות פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI) באמצעות הדמיה ואלקטרופיזיולוגיה בו זמנית. אלקטרופיזיולוגיה in vivo, המופעלת על ידי מגברים מתקדמים, היא טכניקה נפוצה. עם זאת, מגברים אלה אינם מסוגלים לזהות את "היסט DC" האופייני. לכן, טכניקות הדמיה, כמתואר בפרוטוקול זה, משמשות כדי לאשר בביטחון את נוכחותם או היעדרם של SDs. היתרון בשילוב הדמיה ואלקטרופיזיולוגיה הוא שהדמיה יכולה לזהות את התפשטות ה-SD, בעוד שאלקטרופיזיולוגיה יכולה לזהות את הדיכאון בתדר גבוה הנלווה.
בסך הכל, שיטה זו מתאימה לחקירת נוכחות של התפשטות דפולריזציה (SDs) בעקבות פגיעה מוחית טראומטית (TBI). היישום שלו יכול לשפר את ההבנה של תפקוד הרשת בקליפת המוח לאחר TBI ו-SDs. ניתן להתאים פרוטוקול זה ממודל פגיעת גולגולת סגורה למודלים אחרים, כגון פגיעה מבוקרת בקליפת המוח, כלי הקשה נוזליים או ירידה במשקל. יישום פרוטוקול זה במעבדות רבות יכול להבהיר את תפקידם של SDs בחומרות TBI שונות. ניתן להשתמש בכל מודל TBI מבוסס, ואחריו הליכי הדמיה ואלקטרופיזיולוגיה של iOS המתוארים בפרוטוקול זה.
פרוטוקול
כל ההליכים בוצעו בהתאם לוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של המכון באוניברסיטת ניו מקסיקו. עכברי C57BL/6J הושגו ממקור מסחרי. מספר שווה של עכברים זכרים ונקבות שימשו בטווח הגילאים של 8-14 שבועות. כל העכברים שקלו כ-20 גרם. פרטים על בעלי החיים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים. קובץ משלים 1 מכיל את רשימת הקיצורים.
1. הכנת הגולגולת להדמיה ואלקטרופיזיולוגיה
- להרדים את בעל החיים בקופסת אינדוקציה איזופלורן עם 2%-3% איזופלורן ב-100% חמצן, תוך הבטחת עומק הרדמה נאות ללא רתיעה מצביטת כף.
- יש לתת משככי כאבים לפני הניתוח (בופרנורפין בשחרור איטי, 3.25 מ"ג/ק"ג, SQ) לפני הכנסת החיה למסגרת סטריאוטקסית ולשמור על הרדמה (2% איזופלורן).
- הוסיפו משחה עיניים ושמרו על טמפרטורת הגוף של החיה עם כרית חימום עם משוב על טמפרטורת הגוף.
- גלח את השיער מעל הגולגולת היכן שיהיה החתך, במורד קו האמצע מסדק העין ועד למבדה.
- הסר את השיער הקצוץ לפני עיקור העור עם קרצוף ותמיסה של חומר חיטוי וחיטוי. סיימו עם 70% אתנול, וחזרו על הפעולה שלוש פעמים כדי להבטיח אתר ניתוח סטרילי.
- בעזרת להב אזמל #10, בצע חתך במורד קו האמצע מרוסטרל לזנב, ומיד לאחר מכן מריחת דבק ציאנואקרילט בדרגה רפואית על החתך. מורחים את העור לרוחב כדי לחשוף את הגולגולת.
- הוסף עוד טיפה או שתיים של דבק ציאנואקרילט על הגולגולת כדי להוסיף הגנה נוספת לגולגולת.
הערה: מריחת דבק רגישה לזמן מכיוון שהגולגולת תתחיל להיות אטומה כאשר היא נחשפת לאוויר למשך יותר מ-10 שניות. זה יטשטש את ההדמיה של ה-SD באמצעות שיטות הדמיה. - בזמן שהדבק מתייבש, השתמש במספריים כירורגיים סטריליים כדי להגדיל את גודל החתך מעל המוח הקטן. לאחר הגדרת הדבק, התחל בהשתלת אלקטרודות בורג גולגולת.
- עקר ברגי גולגולת על ידי מעקר חרוזים למשך 20-30 שניות לפני ההשתלה.
- הנח את ברגי הגולגולת באזור מרוחק מאתר ההתחלה של SD כדי לשמור על חלון חזותי פתוח.
הערה: עבור הקלטות כרוניות בקליפת המוח הראייתית הראשונית, נעשה שימוש בשלושה ברגי גולגולת. הבורג הראשון ממוקם בערך ב y = -6.00 מ"מ מהברגמה, במוח הקטן, ומשמש כאלקטרודת ייחוס. אלקטרודות ההקלטה ממוקמות ב-y = -2.79 מ"מ מברגמה ו-x = ±2.5 מ"מ מקו האמצע, בתוך ההמיספרה השמאלית והימנית. - בעזרת מקדח בגודל 0.8 מ"מ, קדחו חורי פיילוט דרך הגולגולת. כדי להבטיח שלא ייגרם נזק לרקמה הבסיסית, -0.5 מ"מ ב-z הוא אידיאלי. השתמש בברגים #00-90 המולחמים מראש לסיכות זהב עם חוט נירוסטה.
- סובב את הברגים כלפי מטה לתוך הגולגולת.1.5-2 סיבובים מלאים יעבירו את הבורג דרך הגולגולת ובמגע עם המשטח בקליפת המוח.
- סובב חוט עודף סביב הבורג, מה שמאפשר רפיון מסוים בחוט למיקום הבמה מאוחר יותר.
- באמצעות אותם הליכים, הנח את ברגי הגולגולת האחרים.
- לאחר שכל ברגי הגולגולת נמצאים במקומם, חבר את כל פיני הזהב למחבר ה-headstage הרצוי. החזק את המחבר במקומו באמצעות הזרוע הסטריאוטקסית והחזק את פיני המחבר קרוב מעל ראשי הברגים תוך הקפדה על כך שהחוטים אינם נוגעים.
- אטמו את כל האזור בדבק ציאנואקרילט, והקפידו לא לשבש את אזור ההדמיה מול ברגי הגולגולת.
- בנה מלט דנטלי סביב בסיס סיכות הזהב, וודא שסיכות הזהב מברגי הגולגולת אינן מחוברות לסיכות הזהב בשלב הראש.
- אפשר למלט הדנטלי להתרפא לפני הסרת מחבר ה-headstage.
- הסר את החיה מהמסגרת הסטריאוטקסית והנח אותה בחזרה לכלוב הביתי כדי להתאושש. עקוב אחר הטיפול הסטנדרטי לאחר הניתוח והשאיר בעלי חיים על כרית חימום בזמן ההתאוששות מההרדמה.
הערה: לאחר הניתוח, החיות היו בביתן יחיד ועקבו אחר כאבים מדי יום. פעל לפי ההנחיות המוסדיות המקומיות לשיכוך כאבים. אם משתמשים בבופרנורפין בשחרור איטי, יש לעקוב אחר כאבים ופוטנציאל לתת מנה נוספת לאחר 72 שעות.
- הסר כל חפץ שעלול להיתפס באלקטרודות, כולל דיור והעשרה. השתמש במצעים סטנדרטיים עם גישה אד ליביום למזון ומים.
הערה: אפשר תקופת החלמה של יומיים בין הניתוח להקלטה.
2. איתור דפולריזציות מתפשטות באמצעות הדמיית אותות אופטיים פנימיים (iOS) ואלקטרופיזיולוגיה של AC-
- להרדים את בעלי החיים עם 2% איזופלורן ב-100% חמצן.
הערה: חלק ההדמיה של הליך זה אמור להימשך ~5 דקות, וכמות החשיפה לאיזופלורן צריכה להיות עקבית. - הנח את החיה במסגרת סטריאוטקסית. דרך חרוט האף, שמור על 1%-2% איזופלורן בחמצן.
הערה: זה קריטי לשמור על עומק הרדמה תקין, שכן איזופלורן ידוע כמפחית SDs. מומלץ לשמור על 60-70 נשימות לדקה לאורך כל הניסוי. - מקם את החיה מתחת למצלמה וודא שהמצלמה ממוקדת במשטח קליפת המוח על ידי כוונון טבעת המיקוד.
- מרחו שמן מינרלי על אזור ההדמיה כדי להגביר את השקיפות.
- הפעל את המחשבים, לוח ה-LED וציוד האלקטרופיזיולוגיה.
הערה: לוח LED פועל בצורה הטובה ביותר כאשר הוא ממוקם מול החיה כדי להאיר את חלון ההדמיה כאשר האורות העיליים כבויים. האור הוגדר ל-~2,400 לוקס (95% הספק) עם הגדרת טמפרטורה קרירה של 4000K. - הגדרת טעינה עבור iOS באמצעות Micro-Manager19,20,21,22.
- לחץ על שידור חי כדי view העכבר מתחת למצלמה ומרכז את הגולגולת של החיה מתחת למצלמה. סגור את חלון "Live".
- לחץ על Multi-D Acq.
- בחלון רכישה רב-ממדית, בחר את נקודות הזמן הרצויות.
הערה: מומלץ לספור 750 תמונות במרווח של 250 אלפיות השנייה. - שמור תמונות בנתיב הקובץ הרצוי ובקידומת השם.
- חבר את סיכות הזהב מהחיה למחבר headstage ולאחר מכן ל-headstage.
- הגדרת טעינה עבור תוכנת Intan.
- לחץ על בחר פורמט קובץ סמל, ובחלון מוקפץ, בחר קובץ אחד לכל פורמט סוג אות. פעולה זו תשמור את הקובץ כ-".dat" לשימוש נוסף ב-MATLAB.
- בכרטיסייה BW תחת רוחב פס חומרה, בחר ampרוחב פס של 0.13-500 הרץ.
- תחת בורר תצוגת מסנן, בחר WIDE כדי לכסות את טווח האותות הרחב ביותר.
- כדי לבחור את נתיב הקובץ הרצוי לשמירה, לחץ על סמל בחר שם קובץ.
- בצע פגיעה באמצעות אימפקטור אלקטרומגנטי.
הערה: הגדרות ההשפעה הן מהירות פגיעה של 4 מ' לשנייה וסטייה של 5 מ"מ.- הפעל את המקפיע וודא שהקצה נסוג ונמתח כראוי על ידי החלקת המתג התלת-כיווני כדי למשוך את הקצה ולהאריך את הקצה. יש להאריך את הקצה לפני שמניחים את החיה מתחת לקצה.
- תנועו במהירות, הניחו את החיה על מיטת קצף והחליקו את המיטה מתחת לקצה.
- יישר את קצה הפגיעה בקו האמצע ו-1 מ"מ של ברגמה.
- הורד את קצה הפגיעה עד שהוא נוגע בחוזקה בחלק העליון של ראש החיה.
הערה: אל תדחוף את הקצה כלפי מטה לתוך הראש. - דחוף את הידית כדי למשוך את קצה הפגיעה ולאחר מכן הורד אותו ידנית 5 מ"מ לפני הפעלת ידית הפגיעה.
- הסר מיד את החיה ממיטת הקצף והנח את החיה מתחת למצלמה להדמיה תוך 5 שניות, כאשר ה-SD מופעל מהפגיעה.
- התחל הדמיית iOS על ידי לחיצה על Acquire! בחלון רכישה רב-ממדית. תמונה למשך 4 דקות כדי ללכוד את כל ה-SD.
- התחל את הקלטת האלקטרופיזיולוגיה על ידי לחיצה על סמל ההקלטה בתוכנת Intan.
- הסר את החיה מכרית הקצף ואפשר לבעל החיים להתאושש בזירה פתוחה או בכלוב ביתי.
הערה: מומלץ לרשום אלקטרופיזיולוגיה למשך שעה אחת לפחות כדי לאפשר לתפקוד הרשת בקליפת המוח להתאושש. - בסיום ההקלטה, נתק את החיה מהבמה הראשית ומהמחבר והחזר את החיה לכלוב שלה.
הערה: מומלץ להמתין 24 שעות בין כל פגיעה להקלטה. החיה יכולה להישאר בכלוב הביתי שלה כל הזמן מחוץ להקלטות.
3. הדמיה וכימות של תמונות iOS
- ב-ImageJ19,20,21,22, פתח את ערימת התמונות על-ידי לחיצה על קובץ > ייבוא > רצף תמונות.
- גלול ידנית בין תמונות כדי להבטיח חוסר תנועה או כל חפץ אחר.
- כדי ליצור את העלילה של ה-SD, צור החזר ROI באמצעות הסמן כדי לצייר ריבוע.
הערה: מומלץ להשתמש בריבוע בגודל 30 x 30 פיקסלים. ניתן להשתמש בכל צורה או גודל, אך לוודא שגודל ההחזר על ההשקעה אינו משתנה בין בעלי חיים. - צור עלילה על ידי לחיצה על ערימות תמונה > > פרופיל ציר Z. בגרף החדש שנוצר, לחץ על כפתור החי. חזור לערימת התמונות של ה-SD והזז את החזר ה-ROI עד שהגרף יציג את עקומת ה-SD. העלילה אמורה להיראות כמו גל חטא עם עלייה ראשונית ואחריה ירידה מתחת לקו הבסיס וחזרה איטית לקו הבסיס תוך מספר דקות.
הערה: ניתן לבטא את העלילות כיחידות שרירותיות (AU) או כאחוז בסיס באמצעות התמונות הראשונות כממוצע הבסיס. - בתרשים שנוצר, לחץ על רשימה כדי ליצור רשימת ערכים שניתן לשרטט בתוכנה אחרת ליצירת גרפים או ב-Matlab.
- לצורך הדמיה, הפוך את התמונה בגווני אפור לטבלת חיפוש ב- ImageJ by Image > טבלאות חיפוש > Fire.
4. ניתוח אלקטרופיזיולוגיה
הערה: מומלץ לנצל במידה רבה את המומחיות של מעבדת בוזאקי ואת הקוד שנוצר על ידי MATLAB להדמיה וניתוח של נתוני אלקטרופיזיולוגיה. הניתוח ידרוש הורדת MATLAB עם קוד הפעלה מוסדי וקובץ ה-zip "Buzcode" של מעבדת בוזאקי באמצעות GitHub (https://github.com/buzsakilab/buzcode).
- בתוכנת האלקטרופיזיולוגיה של Intan, ודא שהנתונים הגולמיים המיוצאים נשמרים בפורמט ".dat".
הערה: ניתן להתקין את Matlab מאתר MathWorks. קוד הפעלה מוסדי או אישי נחוץ לרכישה ושימוש ב-Matlab. ניסיון קודם בהפעלת קוד ב-Matlab נחוץ לביצוע ניתוח זה. - השתמש בפונקציית Buzaki code bz_LoadBinary כדי לטעון את הנתונים ל-Matlab.
הערה: דוגמה "'נתונים' = bz_LoadBinary ('נתיב קובץ נתונים מלא', 'תדירות', תדירות דגימה, nChannels, מספר ערוצים); - סנן את רעש ה-AC באמצעות מסנן חריץ שבמרכזו 60 הרץ
הערה: דוגמה notch_freq = 60; [b,a] = iirnotch(notch_freq/(sampling_frequency/2), notch_bandwidth/(sampling_frequency/2)); filtered_data = filtfilt(b, a, נתונים); - בודד את הפעילות בתדר גבוה באמצעות מסנן פס פס בטווח של 0.5-100 הרץ, בהתאם להמלצות קבוצת COSBID לניתוח והדמיה של דפולריזציות מתפשטות (SDs).
- חשב את ספקטרוגרמת ההספק באמצעות הפקודה pspectrum ב-MatLab.
- כדי להמחיש את הספקטרוגרמה של התדר הגבוה וההספק באותו סולם זמן ובעמודה אחת.
הערה: מהעלילות תהיה הרחבה של השקע בתדר גבוה ואובדן כוח.
תוצאות
איור 1 מציג ייצוג גרפי של מערך הניסוי. ברגי הגולגולת להקלטה ממוקמים בקליפת המוח החזותית הראשונית, כאשר אלקטרודת בורג גולגולת אחת ממוקמת ב-cerebellar vermis כאלקטרודת הארקה. ברגי הגולגולת והפינים מזהב מקובעים לגולגולת באמצעות דבק ציאנואקרילט ומלט דנטלי. חיוני להגביל את המלט הדנטלי לחלק הזנבי (caudal) של הגולגולת כדי להשאיר מקום להחלמה ולדימיון. מיקום הפגיעה, הממוקם במרכז קו האמצע ובמרחק של כ-1 mm רוסטרלית ל-bregma, מסומן ב-איור 1.
תמונות מייצגות של אותות אופטיים פנימיים (iOS) מוצגות ב-איור 2A. תמונות בגווני אפור מומרות באמצעות טבלת חיפוש Fire כדי לשפר את הוויזואליזציה של דה-פולריזציות מתפשטות (SDs). ה-iOS כולל אותות שונים, ביניהם NAD(P)H, FADH והחזרת רקמה, מה שהופך את הפרשנות וההשוואה של אותות אלו למאתגרת. כלי דם גדולים צריכים להיות גלויים בבירור דרך חלון הדבק המהיר (מסומנים בחצים), בעוד שהקו המקווקו ב-איור 2A מסמן את הגל המתפשט של ה-SD. למרות ש-SDs קשים לצפייה בזמן אמת, הם הופכים לבולטים יותר כאשר התמונות מואצות (ראו סרטון משלים 1). חלק מהענפים הקטנים עשויים להיראות כ"נעלמים" עקב כיווץ כלי דם (איור 2A). אזור עניין (ROI) קטן שהוצא מערימת התמונות אמור להניב תרשים בציר Z דומה לזה שב-איור 2B. מהקלטות האלקטרופיזיולוגיה, האות בעל התדר הגבוה שהופק אמור להיראות כמו הפנלים העליונים של איור 2C,D. הקלטות אלו התחילו מיד לאחר פגיעת ראש טראומטית קלה (mTBI), כאשר בעלי החיים נותרו תחת הרדשת isoflurane במהלך 4 דקות של דימות iOS. לאחר הסרת ה-isoflurane, פעילות בתדר גבוה אמורה לחזור במהירות בתוך דקה בבעלי חיים מקבוצת השם (sham), כפי שמוצג ב-איור 2C (מלבן אדום). לעומת זאת, אם התרחש SD, פעילות התדר הגבוה תישאר מדורגית למשך מספר דקות לפני ההחלמה (איור 2D, מלבן אדום). הפנלים התחתונים של איור 2C,D מציגים את ההספק המחושב (V²) עבור כל תרשים תדר גבוה. תרשומים אלו של הספק מסייעים בזיהוי הדיכוי וההחלמה של פעילות התדר הגבוה על ידי העלייה המהירה בהספק (מסומנת על ידי הקצה הימני של המלבנים האדומים).
איור 1הארגון הניסיוני ומיקומי פגיעת האימפקט וברגי הגולגולת. המשטח הגבי (dorsal) של הגולגולת נחשף באמצעות חתך בעור. הגולגולת והעור נסגרו בעזרת דבק ציאנואקרילט כדי לשפר את השקיפות. חור קידוח (burr hole) עבור האלקטרודה המקריקה (ground) קודח בנקודה y = -6.00 ו-x = 0 ביחס לברגמה (bregma). חורי קידוח עבור אלקטרודות ההקלטה ממוקמים בנקודה y = -2.79 ו-x = ±2.5 ביחס לברגמה. ברגי פלדת אל חלון מוברגים דרך הגולגולת ומולחמים לפיני זהב באמצעות חוט פלדת אל חלון לא מצופה. יש להקפיד לא לכסות את שטח הפנים של הגולגולת בכמות מופרזת של סמנט דנטלי, כדי להבטיח מרחב מספיק עבור הפגיעה והדימיון. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה מוגדלת של איור זה.
איור 2: תמונות iOS והקלטות AC מייצגות. (A) תמונות iOS מייצגות עם חצים המצביעים על כלי דם. תמונות בגווני אפור הומרו ללוחית חיפוש Fire ב-ImageJ לצורך שיפור הוויזואליזציה. הקו השחור המקווקו מסמן את ה-SD המתפשט, הנראה כגל של עצימות מוגברת ב-iOS. ה-SD נראה בבירור בעת גלילה מהירה דרך כל ערימת התמונות. אות ה-iOS משקף שינויים פיזיולוגיים ומטבוליים שונים הקשורים ל-SD, כולל ייצור מיטוכונדריאלי של NAD(P)H ו-FADH ובצקת נוירונלית. הריבוע השחור מדגיש את אזור העניין (ROI) המשמש ליצירת העקבה ב-(B). סרגל קנה מידה: 1 mm. (B) עקבה מייצגת של iOS SD המבוטאת כאחוז מהקו הבסיסי. אות ה-iOS עולה וחוזר לקרוב לקו הבסיסי תוך כ-60 s. למרות ששינויים באותות ה-iOS הם קטנים (כ-10%), הם מספיקים כדי לזהות את ה-SD. בהקלטות AC עבור חיות השם (C) ו-SD (D), העקבות העליונות מראות פעילות בתדר גבוה, והעקבות התחתונות מייצגות הספק (V²). ריבועים כחולים מצביעים על תקופות של הרדמה באיזופלורן, בעוד שהריבוע האדום מסמן את תקופת ההתאוששות של הפעילות בתדר גבוה מהאיזופלורן ומה-SD. הדיכוי הממושך המושרה על ידי SD עומד בניגוד להתאוששות המהירה של הפעילות לאחר איזופלורן בלבד (שם). אנא לחצו כאן להצגת גרסה מוגדלת של איור זה.
סרטון משלים 1: ויזואליזציה של גל מתפשט. קובץ הווידאו הוארץ למהירות של פי 8 בקירוב כדי להקל על הזיהוי הוויזואלי של הגל המתפשט. התמונה בגווני אפור הומרה ללוחית חיפוש מסוג Fire ונשמרה כקובץ .AVI בתוכנת ImageJ. אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 1: רשימת קיצורים. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
דיון
התפשטות דה-פולריזציה חיונית במודלים שונים של מחלות, כולל פגיעה מוחית טראומטית (TBI), שבץ ומיגרנה1. זיהוי מדויק של SDs חיוני להבנת תפקידם בליקויים התנהגותיים חריפים ו/או הפעלת המערכת הנוירו-אימונית לאחר פגיעות מוח טראומטיות קלות (mTBIs)23,24. כדי להפחית את הסיכון להחמצת SDs בעת שימוש בשיטה אחת, יש צורך בגישה רב-שיטתית להדמיה והקלטה יעילה של SDs.
בעוד ששילוב טכניקות מאפשר אישור של התפשטות דפולריזציה (SDs), לכל טכניקה עשויות להיות מלכודות פוטנציאליות. טכניקות ההדמיה המתוארות בפרוטוקול זה נגישות לרוב המעבדות ומפורטות על ידי זפדה ועמיתיו25. הכנת חלון הגולגולת היא קריטית, מכיוון שחלונות אטומים יכולים להוביל לתמונות לא חד משמעיות26. ניתן להקל על בעיה זו על ידי מזעור חשיפת הגולגולת לאוויר לפני מריחת דבק ציאנואקרילט. בנוסף, ניתן לשפר את שקיפות החלון עם טיפת שמן מינרלי לפני ההדמיה. חפצי תנועה יכולים גם לסבך את אישור ה-SD, ולכן מזעור החפצים הללו חיוני להשגת וידאו ברור. כדי לטפל בכך, חשוב לשמור על החיה תחת איזופלורן לאורך כל תהליך ההדמיה27. שימוש בקונוס אף מקל על העברה יעילה של החיה בין הפגיעה להגדרת ההקלטה. זה קריטי להחזיר במהירות את החיה מתחת לחרוט האף לאחר הפגיעה כדי ללכוד כמה שיותר מהתפשטות ה-SD. במודל הזה של פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI), הקלטה של כ-4 דקות בדרך כלל מספיקה כדי ללכוד את כל ה-SD. אולם ב-TBIs חמורים יותר, SDs ספונטניים עשויים להיווצר על ידי נזק לרקמות28. הדמיה רציפה יכולה לזהות את ה-SDs הספונטניים הללו, אך הרדמה איזופלורן ממושכת עלולה להקשות על התבוננות בדיכאון בתדר גבוה. ניתן לזהות SDs ספונטניים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה על ידי שקעים נוספים בפעילות בתדירות גבוהה, אך קשה לאשר את הקשר בין דיכאון ל-SD ללא הדמיה.
עם התפתחותם של מגברי Open-Ephys ו-Intan, אלקטרופיזיולוגיה in vivo נגישה כיום למעבדות רבות. כל ההקלטות האלקטרופיזיולוגיות דורשות השתלה של ברגי גולגולת ו/או אלקטרודות. בפרוטוקול זה, יש תקופת חביון של יומיים בין השתלת ברגי הגולגולת לרישום כדי לתמוך בהחלמה. בעוד שתקופה זו עשויה שלא להספיק למוח להתאושש לחלוטין מההשתלה, אמור להיות נזק מינימלי מכיוון שברגי הגולגולת אינם חודרים לרקמת המוח. בנוסף, השקיפות של הגולגולת האטומה בציאנואקרילט פוחתת עם הזמן, ולכן יש לבצע הדמיה בהקדם האפשרי כדי להשיג שקיפות אופטימלית. עבור אלקטרופיזיולוגיה, חיוני למזער רעש של 60 הרץ. ודא שאזור הניסוי מבודד מתח AC ומוארק כהלכה ל-Intan ampחיים יותר. למרות שלא ניתן לבטל לחלוטין חפצי תנועה, מדי תאוצה בראש הבמה יכולים לסייע בזיהוי והסרה של תקופות תנועה במהלך העיבוד שלאחר העיבוד. בסך הכל, טכניקות אלה יכולות לספק תובנות חשובות לגבי התאוששות SD ותפקוד רשת קליפת המוח לאחר פגיעות מוח טראומטיות קלות (mTBIs).
מגבלה אחת של טכניקות אלה היא שבעלי החיים נמצאים תחת הרדמה במהלך ההדמיה. אולם רוב המודלים של TBI דורשים הרדמה, וההרדמה המורחבת לא צפויה להשפיע באופן משמעותי על תכנון הניסוי. איזופלורן מפחית משמעותית את הפעילות בתדר גבוה27. אם החשיפה לאיזופלורן נמשכת מעבר לתקופת ההדמיה, היא עלולה לסבך את הזיהוי של התאוששות פעילות בתדר גבוה בעקבות ה-SD. לכן, זה קריטי לכלול קבוצה דמה או איזופלורן בלבד בתכנון הניסוי כדי להשוות את ההתאוששות של פעילות בתדירות גבוהה, כפי שמוצג באיור 2. מגבלה נוספת היא שהקלטות אלקטרופיזיולוגיה אינן מזהות את היסט DC. המשרעת ומשך משמרת ה-DC הם אינדיקטורים לבריאות הרקמות ולהתאוששות מ-SD28. אף על פי כן, אישור SDs באמצעות הטכניקות האלה עדיין יספק תובנות חשובות לגבי מחקר TBI.
כל חוקרי TBI יפיקו תועלת מהשיטות שתוארו כאן, מאחר שסביר מאוד שכל המודלים של TBI מייצרים דה-פולריזציה מתפשטת (SDs). תחום ה-TBI ירוויח משמעותית מהבנת התפקיד של SDs בפציעה, התקדמות פציעה, הפעלה נוירו-אימונית והתאוששות. מחקרים אחרונים מצביעים על כך ש-SDs תורמים לליקויים התנהגותיים ועשויים להיות מנגנון בסיסי של ליקוי נוירולוגי 5,7. הטכניקות המתוארות בפרוטוקול הזה יסייעו בהבהרת הקשר בין TBI ל-SD. יישומים עתידיים של הטכניקות האלה יכולים להתרחב לתחומי מחקר אחרים, כולל שבץ, אפילפסיה ומיגרנה.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIGMS PR200891 P20GM109089 ומשרד ההגנה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| #00-90 x .118 בורג מכונה | ארה"ב מיקרו בורג | 00.90-118-M-SS-P, אמזון | |
| בקוטר 0.8 מ"מ מקדחה | PCB מקדחה | WYTP21, אמזון | |
| 16-A Headstage | Intan | C3335 | |
| 2.1 מ"מ קוצים מיקרו מקדחה | Fine Science Tools | 19007-21 | |
| AC ampliifier | Intan | RHD C57BL | |
| /6J עכברים | מעבדת ג'קסון | Jax#000664 | |
| מצלמת CCD | Mightex | TCE-1304-U | |
| עדשת הרחבה | Zeikos | ZE-ETN | |
| Ethiqa XR (שחרור איטי בופרנורפין) | אספקה וטרינרית במערב התיכון | מספר מוצר 267.10000.3 | |
| סיכת מחבר זהב (נקבה) | A-M Systems | 520100 | |
| פין מחבר זהב (זכר) | A-M Systems | 520200 | |
| ImageJ2/Fiji | Image J | NA | |
| Impactor One | Leica | 39463930 | |
| לוח פאנל LED | Supon | L122t | |
| MATLAB | MathWorks | הפעלה מוסדי או אישי | |
| דבק ציאנואקרילט בדרגה רפואית | MasterBond | MB287 | |
| מיקרו-מנהל תוכנת מצלמה | תמונה J | NA | |
| מקדחה/פוליש ציפורניים | Makartt מקדחת ציפורניים קובץ ציפורניים חשמלי | JD700 | |
| מחברים אומנטיים | Omnetics | A79014-001 | |
| RHX תוכנת רכישת נתונים | Intan | NA | |
| חוט נירוסטה לא מצופה (0.005 אינץ') | A-M Systems | 792800 | |
| מסגרת סטריאוטקסית | Kopf Intruments | 1923-B | |
| Teets 'ריפוי קר' צמנט דנטלי | מערכות A-M | 525000, 526000 | |
| עדשת מצלמת | XLR Nikon | NIKKOR 50 מ"מ f/1.8-16 |
מקורות
- Pietrobon, D., Moskowitz, M. Chaos and commotion in the wake of cortical spreading depression and spreading depolarizations. Nat Rev Neurosci. 15 (6), 379-393 (2014).
- Hartings, J. A., et al. Repetitive cortical spreading depolarizations in a case of severe brain trauma. Neurological Res. 30 (8), 876-882 (2008).
- Andrew, R. D., et al. Questioning glutamate excitotoxicity in acute brain damage: The importance of spreading depolarization. Neurocrit Care. 37, 11-30 (2022).
- Andrew, R. D., et al. Thecritical role of spreading depolarizations in early brain injury: Consensus and contention. Neurocrit Care. 37, 83-101 (2022).
- Pacheco, J., et al. Spreading depolarizations are associated with concussion-like behavior. eNeuro. 6 (6), (2019).
- Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C. Y., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. J Neurotrauma. 35, 1-10 (2018).
- Pinkowski, N. J., et al. Spreading depolarizations contribute to the acute behavior deficits associated with a mild traumatic brain injury in mice. J Neurotrauma. 41 (1-2), 271-291 (2023).
- Dreier, J. P., et al. Recording, analysis, and interpretation of spreading depolarizations in neurointensive care: Review and recommendations of the COSBID research group. J Cereb Blood Flow and Metab. 37 (5), 1595-1625 (2017).
- Herreras, O., Somjen, G. G. Analysis of potential shifts associated with recurrent spreading depression and prolonged unstable spreading depression induced by microdialysis of elevated K+ in hippocampus of anesthetized rats. Brain Res. 610 (2), 283-294 (1993).
- Boas, D. A., Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging in biomedical optics. J Biomed Opt. 15 (1), 011109(2014).
- Hadjikhani, N., et al. Mechanisms of migraine aura revealed by functional MRI in human visual cortex. PNAS. 98 (8), 4687-4692 (2001).
- Dietz, R. M., Weis, J. H., Shuttleworth, C. W. Contributions of Ca2+ and Zn2+ to spreading depression-like events and neuronal injury. J Neurochem. 109 (Suppl 1), 145-152 (2009).
- Reinhart, K. M., Shuttleworth, C. W. Ketamine reduces deleterious consequences of spreading depolarizations. Exp Neurol. 305, 121-128 (2018).
- Mané, M., Müller, M. Temporo-spectral imaging of intrinsic optical signals during hypoxia-induced spreading depression-like depolarization. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Brennan, A. M., Connor, J. A., Shuttleworth, C. W. NAD(P)H fluorescence transients after synaptic activity in brain slices: predominant role of mitochondrial function. J Cereb Blood Flow and Metab. 26 (11), 1389-1406 (2006).
- Shuttleworth, C. W., Brennan, A. M., Connor, J. A NAD(P)H fluorescence imaging of postsynaptic neuronal activation in murine hippocampal slices. J Neurosci. 23 (8), 3196-3208 (2003).
- Sword, J., Croom, D., Wang, P. L., Thompson, R. J., Kirov, S. A. Neuronal pannexin-1 channels are not molecular routes of water influx during spreading depolarization-induced dendritic beading. J Cereb Blood Flow and Metab. 37 (5), 1626-1633 (2017).
- Chung, D. Y., et al. Real-time non-invasive in vivo visible light detection of cortical spreading depolarizations in mice. J Neurosci Methods. 309, 143-146 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinform. 18 (1), 1-26 (2017).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. 14, (2010).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. J of Biol Methods. 1 (2), e10(2014).
- Soldozy, S., et al. Cortical spreading depression in the setting of traumatic brain injury. World Neurosurg. 134, 50-57 (2020).
- Zepeda, A., Arias, C., Sengpiel, F. Optical imaging of intrinsic signals: Recent developments in the methodology and its applications. J Neurosci Methods. 136 (1), 1-21 (2004).
- Steinzeig, A., Molotkov, D., Castrén, E. Chronic imaging through "transparent skull" in mice. PLoS One. 12 (8), (2017).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Hudetz, A. G., Vizuete, J. A., Pillay, S. Differential effects of isoflurane on high-frequency and low-frequency oscillations in the cerebral cortex and hippocampus in freely moving rats. Anesthesiology. 114 (3), 1588-1595 (2011).
- Reinhart, K. M., Morton, R. A., Brennan, K. C., Carlson, A. P., Shuttleworth, C. W. Ketamine improves neuronal recovery following spreading depolarization in peri-infarct tissues. J Neurochem. 168 (5), 855-867 (2023).
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
