מאמר שיטה

אבלציה של תאי לייזר בזחלי דרוזופילה שלמים חושפת תחרות סינפטית

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67053

⸱

26 ביולי 2024

 ,  , 
1Stiles-Nicholson Brain Institute, Florida Atlantic University, 2Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מדגים אבלציה של תאי לייזר של נוירונים בודדים בזחלי דרוזופילה שלמים. השיטה מאפשרת לחקור את ההשפעה של הפחתת התחרות בין תאי עצב במערכת העצבים המתפתחת.

תקציר

הפרוטוקול מתאר אבלציה של נוירון יחיד עם מערכת לייזר של 2 פוטונים במערכת העצבים המרכזית (CNS) של זחלי Drosophila melanogaster שלמים. באמצעות שיטה לא פולשנית זו, ניתן לתפעל את מערכת העצבים המתפתחת באופן ספציפי לתא. שיבוש ההתפתחות של נוירונים בודדים ברשת יכול לשמש כדי לחקור כיצד מערכת העצבים יכולה לפצות על אובדן קלט סינפטי. תאי עצב בודדים הופעלו באופן ספציפי במערכת הסיבים הענקית של דרוזופילה, תוך התמקדות בשני נוירונים: סיב הענק הפרה-סינפטי (GF) והנוירון המוטורי הטרגוטרוצנטרלי הפוסט-סינפטי (TTMn). סינפסות ה-GF עם ה-TTMn האיפסילטרלי, שהוא חיוני לתגובת הבריחה. אבלציה של אחד ה-GFs במוח הכוכבהשלישי , מיד לאחר שה-GF מתחיל בצמיחה אקסונלית, מסירה לצמיתות את התא במהלך התפתחות מערכת העצבים המרכזית. ה-GF הנותר מגיב לשכן הנעדר ויוצר מסוף סינפטי חוץ רחמי ל-TTMn הנגדי. מסוף לא טיפוסי זה, סימטרי דו-צדדי, מעצבב את שני ה-TTMns, כפי שמודגם על-ידי צימוד צבעים, ומניע את שני תאי העצב המוטוריים, כפי שמודגם בבדיקות אלקטרופיזיולוגיות. לסיכום, אבלציה של נוירון יחיד מדגימה תחרות סינפטית בין זוג נוירונים דו-צדדיים שיכולים לפצות על אובדן של נוירון אחד ולהחזיר תגובות נורמליות למעגל המילוט.

מבוא

אבלציה בלייזר היא כלי מועדף לניתוח מעגלים עצביים במגוון רחב של אורגניזמים. הוא פותח במערכות גנטיות כמו תולעים וזבובים, והוא יושם ברחבי ממלכת החי כדי לחקור את המבנה, התפקוד וההתפתחות של מערכת העצבים 1,2,3. כאן, אבלציה של נוירון יחיד שימשה כדי לחקור כיצד נוירונים מתקשרים במהלך הרכבת מעגלים בדרוזופילה. מערכת המילוט של הזבוב היא מעגל מועדף לניתוח מכיוון שהיא מכילה את הנוירונים הגדולים ביותר ואת הסינפסות הגדולות ביותר בזבוב הבוגר, והמעגל אופיין היטב בעשורים האחרונים4. התפקיד שממלאות אינטראקציות נוירון-נוירון בהרכבת מעגל הסיבים הענק הוא מוקד המחקר הזה.

סוג אחד של אינטראקציה שהיה מוקד במדעי המוח מאז עבודתם של הובל וויזל בשנות השישים הוא "תחרות סינפטית"5,6. בפרוטוקול זה, אבלציה בלייזר שימשה כדי לבחון מחדש את תפקידה של התחרות באמצעות אבלציה חד-תאית במערכת הסיבים הענקית (GFS) של דרוזופילה, שם ניתן לגלות את היסודות המולקולריים של התופעות.

אבלציה של תאי עצב בזבוב המתפתח הייתה קשה ממגוון סיבות, כולל הדמיה של נוירוני המטרה, דיוק שיטת האבלציה והישרדות הדגימה. כדי להתגבר על בעיות אלה ב-GFS, מערכת UAS/Gal47 שימשה לסימון תאי עצב בעלי עניין, ומיקרוסקופ בעל שני פוטונים שימש להסרת הסיב הענק הפרה-סינפטי או נוירון מנוע הקפיצה הפוסט-סינפטי (TTMn).

במחקר זה, כדי לקבוע את התפקיד שתאי עצב דו-צדדיים שכנים ממלאים בהתאמת קישוריות סינפטית וחוזק סינפטי ב-GFS, אחד מזוגות תאי העצב הדו-צדדיים (GF קדם-סינפטי או נוירון מוטורי פוסט-סינפטי) נמחק ממש לפני התפתחות הגולם. בשלב התפתחותי זה, אקסונוגנזה GF לא הושלמה8. לאחר מכן נבדקו מבנה ה-GF ותפקודו של המעגל הסינפטי אצל הבוגר, תוך מתן תשומת לב מיוחדת לתפוקה של ה-GF הנותר.

פרוטוקול

כל בעלי החיים ששימשו לפרוטוקול היו מהמין Drosophila melanogaster. אין בעיות אתיות סביב השימוש במין זה. לא היה צורך באישור אתי כדי לבצע עבודה זו. הפרטים של מיני הדרוזופילה , ריאגנטים וציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. גידול דרוזופילה ובחירת שלב הזחל הנכון

  1. בחר קו דרייבר Gal4 המניע ביטוי בתאים שיש לאבלט ושלב אותו מחדש עם או חצה אותו לקו כתב UAS-GFP. לגדל זבובים על מזון זבובים סטנדרטי ב 25 ° C.
    הערה: עבור אבלציה של סיבים ענקיים (GF), R91H05-Gal4 או A307-Gal4 שולבו מחדש עם UAS-GFP. ShakB(קטלני)-GAL4 בשילוב עם UAS-GFP שימש לאבלציות TTMn (ראה טבלת חומרים).
  2. זחלים נבחרים שהחלו לצאת מהמזון ולזחול במעלה הצד של בקבוקון המזון. זחלים אלה נמצאים בשלב הנדוד, שהוא השלב המועדף לביצוע אבלציה של תאי GF.
    הערה: אבלציה יכולה להתבצע בכל שלב הזחל. שלב הזחל האחרון היה חשוב למניפולציה של התפתחות ה-GFS מכיוון שניתן לזהות בקלות את גופי תאי ה-GF במוח, אך אקסוני ה-GF לא יצרו קשרים עם מטרותיהם בשלב זה.

2. הכנת זחלהכוכבהשלישי

הערה: הזחלים הורדמו בשיטה דומה לזו של בורה ואחרים. כדי לשמור על זמני הליך קצרים, הכינו רק זחל אחד בכל פעם. חשיפה קצרה להרדמה תשפר את הישרדותם של חיות ניסוי10.

  1. הכינו צלחת זכוכית עם מכסה הדוק. מניחים כדור צמר גפן בצלחת, ומתחת למכסה אדים, מוסיפים כ 3-5 מ"ל של אתיל אתר (מסוכן, נוזל דליק, מעיל מעבדה, כפפות, משקפי מגן). מכסים את המנה במכסה.
  2. אספו זחליאינסטאר בודדים מבקבוקוני זבובים. בשלב הזחלהשלישי , הזחלים עוזבים את מדיום המזון וזוחלים למעלה לאורך הצד של בקבוקון המזון11.
    1. ודאו שהזחלים עדיין נעים ולא התחילו בהיווצרות בובות. זחלים שהם נייחים ומראים קיצור של הגוף מתחילים בגור ואינם מתאימים לאבלציה. הרימו את הזחלים בעזרת מברשת צבע קטנה.
      הערה: שלב הזחלהשלישי מתחיל לאחר ההתכה השנייה ב 72 שעות של התפתחות (לאחר הטלת ביצים), ונמשך עד היווצרות puparium ב 120 שעות עבור זבובים גדל ב 25 ° C.
  3. מעבירים זחל אחד למיכל קטן ופתוח. מניחים את המיכל בצלחת הזכוכית עם אתר אתיל וסוגרים את המנה בחוזקה. בעת פתיחת צלחת הזכוכית, הניחו אותה מתחת לשנורקל או במכסה אדים כדי למנוע מהאדים לברוח.
    1. במרווחים של 30 שניות, הסירו את המכסה עם הזחל מהצלחת ובדקו את ניידות הזחל תחת מיקרוסקופ דיסקציה. הזחל בדרך כלל יהיה משותק בתוך דקה אחת. ברגע שהווים בפה מפסיקים להתעוות, הזחל מוכן להרכבה. יש להשליך את כל הזחלים שאינם משותקים לחלוטין לאחר 3 דקות.
      הערה: החלק העליון של מכסה הפוך של צינור מיקרוצנטריפוגה (מכסה שהוסר מהצינור) יכול לשמש כמיכל.

3. הרכבת זחלים על שקופיות לאבלציה

  1. הניחו את הזחל המורדם על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית. לטבול את הזחל בטיפת מלח חרקים; זה ישטוף חלק משאריות המזון שעלולות להידבק לזחל.
  2. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, להסיר את רוב מלוחים עם רקמת נייר. מקם את הצד הגבי של הזחל כלפי מעלה עבור אבלציה GF או את הצד הגחוני כלפי מעלה עבור אבלציה TTMn. הורידו לאט לאט כיסוי זכוכית על הזחל. הוסיפו מי מלח לצד הכיסוי כדי למלא את החלל שבין מגלשת הזכוכית לחלקת הכיסוי.
  3. עבור אבלציה GF, בדוק את מיקום המוח תחת הגדלה גבוהה במיקרוסקופ דיסקציה. ודא כי המוח שוכב בגובה והוא גלוי דרך הקוטיקולה. לעתים קרובות, המוח יהיה מכוסה ברקמת שומן, מה שהופך הדמיה ואבלציה התא בלתי אפשרי.
    1. כדי לעקור כל רקמת שומן המכסה את המוח, הפעילו לחץ קל על הכיסוי עם מלקחיים והזיזו את הכיסוי מצד לצד. אם לא ניתן להזיז את רקמת השומן מהמוח בדרך זו, השתמשו בזחל אחר במקום.

4. איתור תאי היעד

הערה: המערכת מרובת הפוטונים ששימשה למחקר זה הורכבה על מיקרוסקופ זקוף. תוכנה ספציפית למערכת שימשה לשליטה בהגדרות רכישה וגירוי לייזר. המערכת צוידה במקור אור אפיפלואורסצנטי לאיתור הדגימות. עדשת המטרה הייתה עדשת טבילה במים עם הגדלה של פי 25, מרחק עבודה ארוך של 2 מ"מ ו-NA של 1.10.

  1. הניחו את הדגימה על במת המיקרוסקופ הרב-פוטוני והשתמשו במסנן GFP כדי לאתר את הדגימה במצב אפיפלואורסצנטי. עבור אבלציה של GF, ניתן לזהות את גופי התא במוח, כפי שניתן לראות באיור 1A,C,D. עבור אבלציה של TTMn, ניתן לזהות צביר של ארבעה תאים מהצד הגחוני בחוט העצב הגחוני (VNC), כפי שמוצג באיור 1A,B. בסיום המיקוד, מרכזו את התאים בשדה הראייה ועברו למצב של 2 פוטונים.

5. הגדרת פרמטרי אבלציה

  1. התאם את הגדרות הלייזר ואת רווח הגלאי כדי להציג את התאים המבטאים GFP באמצעות סורק Galvano. אורך גל של 870 ננומטר פועל בצורה הטובה ביותר להמחשת אות GFP. מרכז את התא בשדה הראייה.
  2. השתמש באזור עניין מעגלי (ROI) כדי להגדיר את האזור עבור אבלציה. ודא שהחזר ההשקעה מכסה את רוב פני השטח של התא (איור 1E,G).
  3. הגדר את פרוטוקול האבלציה בתוכנה. הגדר מסגרת רכישה אחת, לאחר מכן גירוי, ואחריה מסגרת רכישה נוספת.
  4. הפעל את הגדרת עוצמת לייזר הגירוי בערך נמוך יותר (10%-20%) והפעל את פרוטוקול הגירוי. אבלציה מוצלחת יכולה להיות מזוהה על-ידי עיגול ברור במרכז הסומה של התא במיקום החזר ההשקעה, ועלייה בפלואורסצנטיות סביב החזר ההשקעה (איור 1F).
    1. אם האבלציה לא הצליחה ורק הלבינה את התא (איור 1H), הגדילו את עוצמת הלייזר בהפרשים קבועים של 5% או את מספר הלולאות אחת בכל פעם והריצו את הפרוטוקול שוב. עוצמת הלייזר המופעלת הייתה בין 10% ל -40% עבור המערכת המשמשת בפרוטוקול.
      הערה: הגדרות עוצמת הלייזר עבור אבלציה תלויות מאוד בעומק התאים הממוקמים ברקמה ובגורמים אחרים כגון קיפול ציפורניים. אם התאים בהירים ונראים בבירור, עוצמת הלייזר תהיה בקצה התחתון של הטווח. עוצמת הלייזר תהיה שונה עבור כל מערכת בהתאם לדגם הלייזר ולגיל הלייזר.

figure-protocol-1
איור 1: זיהוי תאי עצב לאבלציה בלייזר בזחלי דרוזופילה L3 שלמים. (A) סכמה של המיקום של סיב ענק (GF) סומא במוח וצביר של נוירונים מוטוריים המכילים את הנוירון המוטורי הטרגוטרוצנטרלי (TTMn) בחוט העצב הגחוני (VNC). (B) הקרנה בעוצמה מרבית של ביטוי מניע shakB(קטלני)-Gal4 של GFP בזחל VNC. קו האמצע מסומן על ידי הקו המקווקו. העיגול מציין את צביר תאי העצב המכילים את TTMn המיועדים לאבלציה בלייזר. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (C) מבט הקרנה חלקי של מוח הזחל המבטא GFP תחת הבקרה של A307-Gal4. העיגול מציין את סומא GF המיועד לאבלציה בלייזר. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (D) הקרנה בעוצמה מרבית של המוח עם R91H05-Gal4 המניע UAS-GFP. שני ה-GFs (מעגלים) ניתנים לזיהוי לפי מיקום, צורה וגודל. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (E) GF סומא תצוגה מוגדלת לפני אבלציה בלייזר. מעגל המג'נטה מציין את אזור המטרה לאבלציה בלייזר. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (F) GF סומא תצוגה מוגדלת לאחר מסירת כוח לייזר מקומי ואבלציה מוצלחת. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (G) GF סומא תצוגה מוגדלת לפני אבלציה בלייזר. מעגל המג'נטה מציין את אזור המטרה לאבלציה בלייזר. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (H) GF סומא תצוגה מוגדלת לאחר מסירה של כוח לייזר מקומי ואבלציה (הלבנה) לא מוצלחת. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

6. שחזור הזחלים

  1. לאחר הצתת התא בהצלחה, הסירו את הכיסוי והרימו בעדינות את הזחלים מהמגלשה בעזרת מברשת. מניחים את הזחלים בבקבוקון מזון. הזחלים יתחילו לזחול שוב תוך 30 דקות.
    הערה: שמירה על זמן הליך קצר משפרת את שיעורי ההישרדות של בעלי חיים. עם ניסיון, ניתן לבצע את הניסוי תוך קצת פחות מ-10 דקות.
  2. המשיכו לגדל זחלים בתנאים סטנדרטיים עד שהם נסגרים ממעטפת הגולם.

7. בדיקת הפונקציונליות של GFS בזבובים בוגרים

הערה: השלבים הבאים מוסברים בפירוט ב- Allan and Godenschwege12, and Augustin et al.13.

  1. בדיקת זבובים בוגרים בגיל 2-5 ימים לאחר האקלוסיה. מרדימים זבובים עםCO2 ומרכיבים אותם על שעווה דנטלית על ידי דחיפת הרגליים לתוך השעווה. פרשו את הכנפיים בזווית של 90 מעלות וקיבעו אותן במקומן בעזרת השעווה. אבטחו את הראש על ידי דחיפת החוטם לתוך השעווה.
  2. הניחו חוטי גירוי בשתי העיניים, חוט הארקה לתוך הבטן, ואלקטרודות הקלטה מזכוכית לתוך שרירי הקפיצה (TTM) בכל צד.
  3. לעורר את מעגל GF עם גירויים בודדים כדי למדוד את חביון התגובה עבור שני השרירים. לעורר את המעגל עם 100 הרץ ו 200 הרץ רכבות של גירויים, בהתאמה, כדי למדוד את התדר הבא עבור שני השרירים.

8. דיסקציה ותיוג של מערכת הסיבים הענקית להדמיה קונפוקלית

הערה: דיסקציה CNS זבוב והזרקת צבע מפורטים ב Boerner ו Godenschwege14.

  1. הסירו בעדינות את הזבוב משעוות השיניים בעזרת מלקחיים והעבירו אותו לצלחת פטרי מרופדת באלסטומרים מסיליקון תחת טווח דיסקציה.
  2. הסירו את הרגליים, הכנפיים והחוטם בעזרת מספריים והשתמשו בסיכות חרקים כדי לאבטח את הצד הגבי של הזבוב כלפי מעלה בציפוי האלסטומר.
  3. בצע חתך רוחבי לאורך קו האמצע מהבטן האמצעית, דרך בית החזה כולו, ובמעלה הצוואר, המחבר את בית החזה לראש. פתח את הזבוב עם סיכות חרקים. הסר איברים ובלוטות מן הזבוב מבלי לפגוע במערכת העצבים.
    הערה: בשלב זה, ניתן להזריק לאקסונים של GF צבעים כדי לסמן את ה-GFs ואת תאי העצב המצמדים חשמלית13.
  4. הסר את קפסולת הראש מהראש כדי לחשוף את המוח.

9. אימונוהיסטוכימיה של מערכת העצבים

  1. לאחר דיסקציה CNS, לתקן את הזבוב ב 4% PFA ב PBS במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר (RT). שטפו במשך 20 דקות ב-PBS ב-RT (3 פעמים).
  2. חסום את הדגימה למשך שעה אחת ב- RT ב- 3% BSA ב- PBS עם תמיסת חומרי ניקוי של 0.5%.
  3. יש לדגור במשך 2-3 לילות בטמפרטורה של 4°C ב-3% BSA ב-PBS עם 0.3% תמיסת דטרגנט וארנבת נגד GFP (1:500). שטפו במשך 20 דקות ב-PBS ב-RT (6 פעמים).
  4. לדגור לילה ב 4 °C ב PBS עם אנטי ארנב Alexa 488. שטפו במשך 20 דקות ב-PBS ב-RT (6 פעמים).
  5. יש לייבש דגימות עם סדרת אתנול עולה (50%, 70%, 90%, 100% אתנול) למשך 10 דקות בכל שלב. הסירו את הפינים וחתכו את שרירי הבטן והטיסה. העבירו את שאר בית החזה המכיל את מערכת העצבים למגלשה וכסו אותו באמצעי הרכבה כמו מתיל סליצילאט. הניחו מכסה על הדגימה ואטמו אותה בלק.
  6. דמיינו את מערכת העצבים במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לנתח את האנטומיה של מסוף GF.

תוצאות

שיטה זו יכולה לשמש כדי לתפעל את הפיתוח של רשתות עצביות ספציפיות במערכת העצבים של Drosophila. שאלת המחקר העיקרית כאן הייתה היווצרות קשרים סינפטיים. הסרת ה-GF הפרה-סינפטי או ה-TTMn הבתר-סינפטי אפשרה לחקור סינפטוגנזה תגובתית בסינפסה מרכזית זו ובמנגנונים המולקולריים החיוניים לתפקוד ולהתפתחות הסינפטיים. כמתואר בפרוטוקול, בוצעה אבלציה של תאי לייזר של אחד ה-GFs או של אחד ה-TTMns, ונותחו ההשפעות על הסינפסה לאחר התפתחות הגלמים בזבוב הבוגר.

כדי להבטיח שלהליך לא תהיה השפעה שלילית על הישרדות בעלי החיים, בוצעו במקביל אבלציות מדומה. עבור אבלציות מדומה, בעלי חיים טופלו באותו אופן כמו חיות ניסוי, אך פולסי לייזר הועברו בעוצמת לייזר של 0%. ב-82.4% מהמקרים, בעלי חיים מאבלציות מדומות התפתחו לזבובים בוגרים. GFs של זבובי ablated מדומים היו מסוגלים להגיב עם השהיה של פחות מ 1 ms ולעקוב אחר גירוי 100 Hz עבור 79.3% של גירויים. לא ניתן היה להבחין בין אנטומיה של GF לבין זבובים שלא טופלו.

עבור כל חיית ניסוי, האבלציה אומתה אנטומית. בבעלי חיים שעברו ABLATED של GF, ה-GF הלא מבולבל הוזרק באמצעות צבע וצולם (ראו להלן). אם רק אקסון GF אחד נראה בחיבור הצווארי (CvC), אבלציה של GF השני הניחה. אבלציה יכולה להיות מאומתת גם באמצעות היעדר סומא עם תווית GFP בצד האבלאטי של המוח (איור 2A, עיגול). כדי להעריך אבלציה של TTMn, נותח אות ה-GFP ב-VNC הבוגר שבו ניתן לזהות בקלות את הסומה והדנדריט של TTMn. היעדרו של TTMn בצד אחד זוהה בקלות עקב מחסור בסומה ובדנדריטים (איור 2B, עיגול).

כדי לבחון את תפקוד ה-GFS בזבובים שטופלו, תועדו פוטנציאלים סינפטיים משרירי הקפיצה12,13, אשר עצבניים על-ידי TTMn (איור 3A). ה-GFs יוצרים סינפסה חשמלית-כימית מעורבת עם הדנדריט המדיאליTTMn 15. מסוף ה-GF אינו מסועף ומראה כיפוף רוחבי טיפוסי המנוגד לדנדריט TTMn באזור הסינפטי (איור 3D, איור 4A ראש חץ). בזבובי בקרה, כל GF מעצבב את המוטונוירון האיפסילטרלי שלו באופן בלעדי. בהקלטות מסיבי TTM עוצמת החיבור הוערכה על-ידי ניתוח חביון התגובה בגירוי של 1 הרץ ובעקבות גירוי בתדר של 100 הרץ (איור 3B,C). זבובי ביקורת הראו השהיית תגובה ממוצעת של פחות מאלפית שנייה אחת, ויכלו לעקוב אחר גירוי של 100 הרץ עבור 78.1% מהגירויים (איור 3B). לאחר ביצוע רישומים פיזיולוגיים, הדגימה נותחה כדי לחשוף את CNS ו- GFs, אשר הוזרקו בצבע עם תערובת של TRITC-Dextran ונוירוביוטין. מולקולת דקסטרן הגדולה מסמנת את האקסון GF ואת הטרמינל, אך אינה עוברת דרך צמתי רווחים. נוירוביוטין יכול לחצות את צמתי המרווחים בין GF ו-TTMn, והאות של נוירוביוטין זוהה בדנדריט הבתר-סינפטי (איור 3E,F, ראשי חץ). צימוד צבע זה של נוירוביוטין אישר צימוד חשמלי בין שני תאי העצב. נוירוביוטין יכול להיות מזוהה גם בתאי עצב רבים אחרים ב-VNC שמחוברים דרך צמתים מרווחים ל-GF16 (איור 3E,F).

אותן בדיקות פיזיולוגיות ואנטומיות בוצעו לאחר ש-GF אחד עבר אבלציה ב-L3. האקסון של רוב (13/15) מה-GFs הנותרים בזבובי אבלציה מציג פיצול של הטרמינל לשני ענפים: אחד במיקום האיפסילטרלי הרגיל ואחד חוצה את קו האמצע למיקום הומולוגי הנוגד את ה-GF השלם (איור 3G, חץ). כל ענף צומד לאחד הדנדריטים של TTMn (איור 3H,I, ראשי חץ). רישומים פיזיולוגיים מה-TTMs אישרו את הקשר הסינפטי הזה של GF אחד לשני ה-TTMns, אם כי חלש מהרגיל. השהיות התגובה TTM היו גדולות ממילישנייה אחת עבור שני הצדדים, והתדרים הבאים ב-100 הרץ היו 37.1% עבור TTMn ipsilateral ל-GF השלם ו-28% עבור TTM הנגדי (איור 3C).

מאחר שאבלציה של GF אחד גרמה ל-GF הנותר לעצב את שני נוירוני המטרה, הניסוי הבא נועד לבחון את התגובה של GF שכנים כאשר חסר נוירון מטרה מוטורי איפסילטרלי נורמלי. לצורך ניסוי זה, אחד מתאי העצב הבתר-סינפטיים נמחק, והאנטומיה והתפקוד של TTMn הנותרים, כמו גם המורפולוגיה של מסופי GF, הוערכו. כאשר דמיינו גם TTMns וגם GFs בחיות ביקורת בוגרות, האזור של מגע סינפטי משוער נראה בבירור (איור 4A, ראשי חץ). כל דנדריט מדיאלי TTMn הוצמד למסוף הפרה-סינפטי GF האיפסילטרלי. הקרנות קטנות של דנדריטים TTMn משני הצדדים באו במגע עם קו האמצע (איור 4C; כניסה). צימוד צבע עם נוירוביוטין נראה באופן בולט בשני TTMn (איור 4D, ראשי חץ).

כאשר TTMn אחד עבר אבלציה, המורפולוגיה של הדנדריט המדיאלי TTMn שנותר השתנתה. הדנדריט המדיאלי בדגימות האלה השתרע על ענף ארוך ועבה לאורך קו האמצע (איור 4I,K; חיצים צהובים). נוסף על כך, הקרנות דקות יותר לכיוון שני הדקי GF נמתחו קדימה (איור 4E,G; ראשי חץ צהובים). ה-GF, איפסילטרלי ל-TTMn, הראה את האנטומיה הרגילה שלו עם מסוף המקרין לאורך הדנדריט של TTMn.

תגובתו של ה-GF ה"יתום" ללא נוירון מוטורי מטרה הייתה בעלת עניין עיקרי. ברוב המקרים (61.5% מהחיות), ה-GF המיתום הציג טרמינל מפוצל עם טרמינל אחד בצד האיפסילטרלי והטרמינל השני חוצה את קו האמצע ומקרין לכיוון הדנדריט TTMn הנגדי (איור 4J, חיצים). הענפים המוצלבים האלה של ה-GF היו תמיד קטנים יותר מאלה שנצפו בניסוי המשלים כאשר ה-GF השכן היה אבלאט (איור 3F). המסוף האיפסילטרלי יצר קשר עם ענף TTMn שהשתרע לאורך קו האמצע (איור 4I, חץ צהוב). ב-23% מהדגימות, ה-GF המיתום חצה את קו האמצע (איור 4F, חץ) והוקרן לאורך אחד הענפים הקדמיים של TTMn (איור 4E, ראשי חץ צהובים) והוצמד ל-TTMn הנותר (איור 4H, ראש חץ).

שני פנוטיפים נוספים נצפו בזבובי אבלציה TTMn (איור 4M). באחד מתוך 13 זבובים, שני הזבובים ביצעו את הכיפוף הרגיל ונשארו בצדי מערכת העצבים שלהם. במקרה אחר, ה-GF המיתום הציג את הפנוטיפ האינסופי, שבו ה-GF המיתום לא יצר טרמינל ועצר לפני האזור שבו הוא מתכופף בדרך כלל. עבור כל ארבעת הפנוטיפים, רישומי TTM בצד TTMn השלם היו דומים לפיזיולוגיה של Wildtype (WT) עם חביון תגובה מתחת לאלפית השנייה אחת ותדירות עוקבת ב-100Hz ב-100% או קרוב ל-100%. הסרת יעד אחד יכולה לאפשר לשני GFs לשתף את TTMn היעד הנותר. ברוב המקרים, שני GFs ייצרו חיבור עם TTMn הנותר. בדרך כלל, GF יתום יציג מסוף דו צדדי. בזבובי בקרה, GFs לעולם לא יחצו את קו האמצע; עם זאת, בכ-85% מזבובי האבלציה של TTMn, GF אחד חצה את קו האמצע כדי ליצור קשר עם TTMn הנגדי. העצבוב של TTMn אחד על ידי שני GF לא השפיע לרעה על התפקוד הסינפטי.

ראוי לציין כי היעדר GF השכן יש השפעה גדולה יותר מאשר היעדר הנוירון המוטורי המטרה. המסוף הדו-צדדי שנוצר בהיעדר GF קונטרלטרלי הוא הרבה יותר גדול ופונקציונלי בבירור מאשר השינויים כאשר המטרה מוסרת.

figure-results-1
איור 2: דוגמאות לאבלציות מוצלחות במערכת העצבים המרכזית הבוגרת. (A) הקרנה בעוצמה מרבית של מוח זבוב בוגר לאחר אבלציה של זחל GF. GFP (ירוק) מונע על ידי A307-GAL4. העיגול מציין את האזור שבו חסר ה-GF האבלאטי. ראש החץ מצביע על ה-GF הנותר המבטא GFP בצד השני של המוח. ה-GF היה מלא ב-TRITC-Dextran (אדום). האקסון מקרין אחורית לכיוון VNC. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. (B) הקרנה בעוצמה מרבית של VNC בוגר שבו TTMn אחד הותקן ב-L3. ה-TTMn (ראש החץ) הנותר מבטא GFP תחת מנהל ההתקן shakB (קטלני). האזור של TTMn החסר מסומן על-ידי המעגל. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 3: אבלציה של זחל של סיב ענק אחד (GF) גורמת להסתעפות דו-צדדית של הטרמינל הפרה-סינפטי של ה-GF הנותר. (A) סכמטי של מערך הניסוי לבדיקת המבנה והתפקוד של מערכת סיבי ענק בוגרים (GFS). אלקטרודת ההקלטה מודדת את ההשהיה ואת התדירות הבאה של פלט הנוירון המוטורי הטרגוטרוצנטרלי (TTMn) בשרירים הטרגוטרוצנטרליים (TTM) בעת גירוי המוח בחיה השלמה. לאחר דיסקציה של מערכת העצבים, הצבע הוזרק לאקסונים של GF בחיבור הצווארי (CvC). (ב,ג) מעקב דגימה עבור השהיית תגובת TTM ותדירות הבאה ב- 100 הרץ (n מייצג את מספר TTM שנרשם מכל מצב עם השהיה ממוצעת ותדירות עוקבת מוצגת). (B) חיות ביקורת עם שני GF שלמים מראות השהיות TTM מתחת לאלפיות השנייה אחת ותדרים עוקבים קרובים ל-100% ב-100 הרץ. (C) ה-GF היחיד שנותר בבעלי חיים אבלטים מעצבב את שני ה-TTMns. ההשהיה של שני ה-TTMns ארוכה יותר מאשר בקבוצת הביקורת, ולאחר מכן ב-100 הרץ, התדירות מופחתת באופן משמעותי. (ד-י) הקרנה בעוצמה מרבית של ערימות תמונות קונפוקליות עבור GF מלאות צבע. TRITC-Dextran (D,G,F,I באדום) ו-Neurobiotin (E,H,F,I באפור) הוזרקו במשותף. נוירוביוטין יכול לחצות צמתים מרווחים בין ה-GF ל-TTMn, ולתייג את תאי העצב הפוסט-סינפטיים. הקווים המקווקוים מציינים את קו האמצע. (D) אנטומיה טיפוסית של GF של חיות בקרה עם כיפוף טרמינלי. (ה,ו) נוירוביוטין מתייג נוירונים פוסט-סינפטיים רבים המחוברים חשמלית ל-GFs. הדנדריטים הטרנס המסומנים באופן סינפטי TTMn מסומנים על ידי ראשי חץ. (G) לאחר אבלציה, ה-GF הנותר מצמיח מסוף נוסף (חץ), אשר חוצה את קו האמצע כדי לעצב את TTMn הנגדי. (H,I) שני ראשי החצים (TTMn) מצומדים לאותו GF. פסי קנה מידה: 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 4. אבלציה של זחל של נוירון מוטורי טרגוטרוצנטרלי אחד (TTMn) גורמת לעצבוב של TTMn הנותר על ידי שני סיבי הענק (GF). (א-ל) הקרנות בעוצמה מרבית של ערימות תמונות קונפוקליות של TTMns שסומנו ב-GFP (ירוק) תחת שליטת shakB(קטלני)-Gal4 וה-GFs מולאו בצבע TRITC-Dextran (מגנטה) ו-Neurobiotin (אדום). הקו המקווקו מציין את קו האמצע של מערכת העצבים. (א-ד) דגימות בקרה כאשר שני TTMns שלמים. ה-GFs גורמים למסוף הטיפוסי שלהם להתכופף מקו האמצע כדי ליצור קשר עם TTMn (A,B), וכל GF יוצר קשר עם TTMn אחד. דנדריטים של TTMn נפגשים בקו האמצע (C). כל GF הוא צבע המחובר ל-TTMn שלו (D, ראשי חץ לבנים). (ה-ה) ה-TTMn השמאלי היה משובש. הדנדריט המדיאלי של שאר פרויקטי TTMn מעבר לקו האמצע (G, חץ צהוב). ה-GF המיתום חוצה את קו האמצע (חץ לבן) באזור הסינפטי ויוצר מגע עם הדנדריט הנגדי TTMn (E,F). ה-GFs מצומדים ל-TTMn הנותר (H, ראש חץ). (ט-ל) דוגמה לפנוטיפ GF אחר שבו TTMn השמאלי היה ablated. הדנדריט המדיאלי של שאר פרויקטי TTMn מעבר לקו האמצע (I ו-K, חץ צהוב). GF היתום השמאלי עושה מסוף דו-צדדי; ענף אחד מקרין באופן קונטרלטרלי, והשני נשאר איפסילטרלי (J, חצים) כדי להתחבר ל-TTMn. פסי קנה מידה: 20 מיקרומטר. (M) סכמטי של ארבעת הפנוטיפים השונים של GF שנצפו בחיות אבלציה TTMn. n מציין את מספר בעלי החיים בכל כיתה. נתון הם הממוצעים עם שגיאת תקן עבור השהיית תגובת TTM ותדירות עוקבת (FF) ב- 100 הרץ עבור הצד של TTMn השלם. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

אבלציה של תאים במיקרוסקופ של 2 פוטונים הוכחה כשיטה מוצלחת ביותר למניפולציה של התפתחות מעגלים עצביים בדרוזופילה. מכיוון ששיטה זו אינה פולשנית, היא גורמת נזק מינימלי לחיה. הנתונים תומכים בתועלת של מניפולציה ספציפית לתא זה של מעגלים ידועים.

קריטי להצלחת האבלציה היה בחירת הנהג המתאים ביותר של Gal4. מכיוון שה- GFS נחקר היטב, קווי נהג ספציפיים רבים של Gal4 תוארו7. רוב הדרייברים של Gal4 מוגבלים מאוד, אך עדיין באים לידי ביטוי בתאי עצב רבים אחרים. אתגר אחד היה לזהות באופן אמין את תאי המטרה בחיה השלמה. עבור בעלי חיים עם תווית GFP גלויה בבירור, אבלציה יכולה להתבצע בעוצמת לייזר נמוכה ולעתים קרובות דרשה רק ניסוי אחד. בבעלי חיים שבהם רקמת השומן כיסתה את המוח או שביטוי ה-GFP היה חלש, מחיקת תאי המטרה דרשה עוצמת לייזר גבוהה יותר ולולאות מרובות של חשיפה ללייזר. גופי תאי ה-GF היו ממוקמים בעומק של כ-100 מיקרומטר מהצד הגבי של המוח. עבור ניסויים שבהם תאי המטרה ממוקמים בעומק עמוק יותר, זה עשוי להיות שימושי לבצע אבלציה בשלבים מוקדמים יותר של הזחל, כאשר מערכת העצבים קטנה יותר.

בניסויים קודמים במעבדה נבדקו שיטות שונות לאבלציה של תאים. שימוש במערכת UAS/Gal4 כדי להניע ביטוי של רעלים הוביל גם למחיקה של נוירונים ספציפיים. עם זאת, הרבה יותר קשה לשלוט במחיקה של תאים בודדים ולהימנע מהשפעות מחוץ למטרה. הקושי השני הוא שליטה בעיתוי המדויק של אירוע מחיקת התא. אבלציה של תאי לייזר אפשרה שליטה מדויקת במיקום המטרה ובתזמון המחיקה, אך עדיין היו כמה אתגרים להתגבר עליהם לפני שהשיטה שוכללה והושגו שיעורי הצלחה של מעל 80% (הישרדות בעלי חיים ואבלציה מוצלחת של תאים). שיעור ההישרדות של בעלי החיים הושפע לרעה מחשיפה ארוכה לאתר אתילי וזמני הליך ארוכים. מחקרים הראו כי שיעורי הישרדות גבוהים לגור (78%) ואקלוסיה למבוגרים (67%) יכולים להיות מושגים עבור חשיפה של 3.5 דקות של זחלי L3 דרוזופילה לאתיל אתר10. חשיפה של 3.5 דקות תבטיח שבעל החיים לא יהיה בתנועה עד 8 שעות. עבור אבלציה של תאי לייזר, בעלי חיים צריכים להיות חסרי תנועה למשך 30 דקות או פחות. לכן, זמן החשיפה לאתר אתילי יכול להישמר הרבה מתחת ל -3.5 דקות. ברוב המקרים, הזחלים היו חסרי תנועה לחלוטין תוך דקה אחת.

תוצאות אבלציה בלייזר מראות כי GF יכול להיות ablated נקי, ואת ההשפעה על GF השכן contralateral מוערך בקלות. תוצאת האבלציה הייתה ברורה ועקבית. ב-13 מתוך 15 אבלציות חד-תאיות, השותפים הנותרים של GF מציגים מסוף דו-צדדי שמעולם לא נראה בחיות ביקורת. ניתן לזהות בקלות את הטרמינל הדו-צדדי הזה, והענף הקונטרה-לטרלי יוצא הדופן דומה בגודלו לטרמינל רגיל ומצומד בצבע לנוירון המוטורי של המטרה הנגדית. הטרמינל הדו-צדדי מצומד לנוירונים המוטוריים של המטרה ומתפקד כמעט פראי ברוב הדגימות, מניע הן את המטרה הנורמלית-איפסילטרלית והן את נוירון המטרה המוטורי הנגדי עם השהיות ותדרים עוקבים ליד ערכי הבקרה.

הניסוי המשלים, אבלציה חד-צדדית של נוירון מוטורי מטרה, מספק השוואה מעניינת. הנוירון המוטורי הנותר מפגין לעתים קרובות גידול דנדריטי תגובתי, המרחיב תהליך מעבר לקו האמצע לתוך החלל שבדרך כלל תפוס על ידי השכן שנמחק. אף על פי שדנדריט זה אינו גדול כמו הדנדריט שנמחק, הוא מדגים תגובה דומה לכך שה-GFs חסרים את בן זוגם הדו-צדדי. לעומת זאת, ה-GF חסר המטרה מגיב רק במידה צנועה למטרה הנעדרת, ומאריך תהליכים קלים לאורך קו האמצע ולאורך הדנדריטים הנותרים של הנוירונים המוטוריים. תגובה צנועה זו עומדת בניגוד חריף לתגובה הדרמטית של ה-GF ל-GF הומולוגי דו-צדדי חסר, שבו נוצר מסוף קונטרה-לטרלי גדול המשלים את הטרמינל הרגיל ויוצר מסוף דו-צדדי.

ניסוי אבלציה מקביל נעשה לאחרונה על הקלט הפרה-סינפטי ל-GF במוח, שם התגלה סוג דומה של "תחרות" על החלל הסינפטי17. קלט חזותי לאריח GF הוא הגלומרולוס שבו נוירוני ההקרנה החזותית (VPN) מגיעים לדנדריטים של GF. מחיקת קבוצה אחת של שירותי VPN (במקרה זה גנטית) מראה כי שירותי ה-VPN הנותרים משתלטים ומעצבנים חלק מהמרחב הסינפטי של השכן הנעדר ומייצרים התאוששות פיזיולוגית מפצה של התגובה החזותית לגירויים מתקרבים. כאשר המגיעים הראשונים נמחקים, המגיעים המאוחרים יותר תופסים מקום ואינם תפוסים עוד. הדמיון הפנומנולוגי העיקרי לעבודה הנוכחית הוא התפקיד לכאורה שממלאת התפוסה הפיזית בקביעת האיזון בין התשומות השונות. נראה כי מסופי הפלט של שני ה-GFs מתחרים זה בזה על מרחב סינפטי פיזי.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ניסויים במיקרוסקופ בעל 2 פוטונים בוצעו בליבת דימות התא המתקדמת של מכון המוח FAU סטיילס-ניקולסון. ברצוננו להודות ליוזמת יופיטר למדעי החיים על התמיכה הכספית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jaxkson ImmunoResearch111-545-003
חלבון פלואורסצנטי אנטי ירוק, ארנבפישר סיינטיפיקA111221:500 ריכוז
Apo LWD 25x/1.10W ObjectiveNikonMRD77220טבילה במים למרחק עבודה ארוך
סרום בקר אלבומין (BSA)SigmaB4287-25G
זיקית Ti: Sapphire Vision II לייזרקוהרנטי
כדור כותנהGenesee Scientific51-101
Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, ליזין ניתן לתיקון (fluoro-Ruby)Fisher ScientificD1817
מתכון מלחמ- Gu and O'Dowd, 2006
Ethyl EtherFisher ScientificE134-1סכנה, נוזל דליק
מזון זבובים B (מתכון בלומינגטון)LabExpress7001-NV
מתיל סליצילאטפישר סיינטיפיקO3695-500
צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לאפנדורף22363204
כיסוי מיקרוסקופ החלקה 18x18 #1.5פישר סיינטיפיק12-541A
מעקב נוירוביוטין מעבדותSP-1120
ניקון A1R מיקרוסקופ רב-פוטוניניקוןעל מעמד מיקרוסופ FN1 זקוף
NIS Elements מחקר מתקדםשל Nikonתוכנת רכישה וניתוח נתונים
Paraformaldehyde (PFA)Fisher ScientificT353-500
PBS (Phosphate Buffered Salin)Fisher BioReagentsBP2944-100טבליות
R91H05-Gal4בלומינגטון מרכז מניות דרוזופילה40594
shakB (קטלני)-GAl4מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה51633
שקופית זכוכית מיקרוסקופ סופרפרוסטפישר סיינטיפיק12-550-143
טריטון X-100פישר סיינטיפיק422355000תמיסת דטרגנט
UAS-10xGFPבלומינגטון מרכז המניות דרוזופילה32185
Drosophila וקטור

מקורות

  1. Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
  2. Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission. BMC Biol. 12, 92(2014).
  3. Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
  4. Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).
  5. Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint. J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).
  6. Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens. J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).
  7. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  8. Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster. J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).
  9. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
  10. Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae. Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).
  11. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
  12. Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), 5453(2010).
  13. Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. (47), e2412(2011).
  14. Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. (52), e3080(2011).
  15. Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
  16. Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), 0346(2018).
  17. Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

GFP
אבלציה של תאי לייזר בזחלי דרוזופילה שלמים חושפת תחרות סינפטית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.