Method Article

שיטה משולבת ליצירת אופטרודים אלקטרופיזיולוגיים גמישים ונוחים להקלטה רב-אזורית in vivo

DOI:

10.3791/67071

⸱

November 21st, 2024

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medical Neurobiology and MOE Frontiers Center for Brain Science, Institutes of Brain Science, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו גישה פשוטה וחסכונית לייצור אלקטרודות וערכנו הקלטות של אותות באזורים מרובים בעכברים הנעים בחופשיות. שימוש באופטוגנטיקה, לצד אלקטרופיזיולוגיה רב-אזורית ורישום אותות סידן, איפשר גילוי של פעילויות עצביות באזורים שונים במודל הצתת ההתקפים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפילפסיה היא הפרעה נוירולוגית המאופיינת בהפרשות חריגות מסונכרנות המערבות אזורי מוח מרובים. נגעים מוקדיים מאפשרים התפשטות של אותות אפילפטיים דרך מעגלים עצביים קשורים. לכן, רישום in vivo של פוטנציאל שדה מקומי (LFP) מאזורי המוח הקריטיים חיוני לפענוח המעגלים המעורבים בהתפשטות התקפים. עם זאת, השיטות הנוכחיות לייצור אלקטרודות והשתלתן חסרות גמישות. כאן, אנו מציגים מכשיר שימושי המיועד לרישומים אלקטרופיזיולוגיים (LFPs ואלקטרואנצפלוגרפיה [EEG]) באזורים מרובים. בנוסף, שילבנו בצורה חלקה מניפולציה אופטוגנטית ורישום איתות סידן עם רישום LFP. הפרשות חזקות לאחר מכן נצפו במספר אזורים נפרדים במהלך התקפים אפילפטיים, מלווים באיתות סידן מוגבר. הגישה המשמשת במחקר זה מציעה אסטרטגיה נוחה וגמישה להקלטות עצביות סינכרוניות באזורים שונים במוח. הוא טומן בחובו פוטנציאל לקידום המחקר על הפרעות נוירולוגיות על ידי מתן תובנות לגבי הפרופילים העצביים של אזורים מרובים המעורבים בהפרעות אלה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפילפסיה היא מצב נוירולוגי שכיח המאופיין בהתקפים חוזרים, המתבטאים בעוויתות, הפרעות חושיות ואובדן הכרה1. המנגנונים הפתופיזיולוגיים העומדים בבסיס האפילפסיה מורכבים וכוללים אזורי מוח מרובים המחוברים זה לזה 2,3. ההתקדמות האחרונה בדימות מוחי שפכה אור על רשתות בקנה מידה גדול המעורבות באפילפסיה 4,5. עם זאת, ההבנה של המעגלים החשמליים ומנגנוני הרשת המורכבים העומדים בבסיס הייצור וההפצה של אפילפסיה נותרה מוגבלת, בין היתר בשל יישום לא מספיק של טכניקות רישום עצבי רב-אזורי6. לכן, פיתוח שיטה גמישה ומשולבת המסוגלת לנטר בו זמנית פעילות עצבית על פני אזורי מוח שונים הוא הכרחי.

רישומים אלקטרופיזיולוגיים מבוצעים כדי ללכוד התקפים ולקבוע את נוכחותה של אפילפסיה7. למעט רישום פעילות אלקטרופיזיולוגית, יש דגש הולך וגובר על פעילות הסידן המדויקת של אוכלוסיות עצביות ספציפיות במחקרי אפילפסיה 8,9. התקדמות בסינתזת אינדיקטור סידן ותכנוני בדיקות שונים הניעו חוקרים לאמץ פוטומטריה של סיבים ללכידת שינויים בפעילות העצבית ובחומרים עצביים במוח10,11. שתי השיטות העצמאיות לגילוי פעילות עצבית, כלומר אלקטרופיזיולוגיה ורישום פוטומטריית סיבים, משלימות זו את זו, ומאפשרות הבנה מקיפה יותר של תהליכים עצביים דינמיים.

נוסף על כך, הקלטה סינכרונית וויסות הפעילות העצבית חיוניים להשגת תובנות על תפקוד המוח הן ברמת הרשת והן ברמת התאים. גישה זו מאפשרת לחוקרים לצפות ולתפעל את התהליכים המורכבים של המוח בזמן אמת. אופטוגנטיקה התפתחה ככלי חיוני לחקירת איתות עצבי, בשל יכולתה הייחודית לגירוי סלקטיבי או עיכוב12. למרות יישומים נרחבים של רישום אלקטרופיזיולוגי רב-אתרי במדעי המוח13, השילוב של רישום אלקטרופיזיולוגי רב-אזורי עם פוטומטריית סיבים ומניפולציה אופטוגנטית נותר מוגבל. חשוב מכך, השיטות הנוכחיות לייצור והשתלת אלקטרודות רב-אזוריות חסרות גמישות14. מגבלות אלה מעכבות את יכולתנו לנתח פונקציות ואינטראקציות ספציפיות של מעגלים על פני אזורים מרובים. כאן, אנו מציגים גישה חסכונית ונוחה לרישום רב-אזורי in vivo השופכת אור על תהליכים עצביים באזורים שונים בהתקפים הנגרמים על ידי הצתה והפרעות נוירופסיכיאטריות אחרות.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה קיבל את אישור הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פודאן ונערך בהתאם להנחיות ולתקנות שעוצבו על ידי מדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל האמצעים האפשריים יושמו כדי למזער את מספר בעלי החיים שנוצלו במחקר זה. הזמן הדרוש לביצוע כל שלב נכלל בשלבים המתאימים.

1. הכנת אלקטרודות (איור 1)

  1. חותכים אורך מתאים של חוט טונגסטן (~ 20 מ"מ) ושורפים את שכבת הבידוד בקצה אחד כדי לחשוף את חוט הטונגסטן (1.6-2 מ"מ). כופפו את הקצה השני של החוט לצורת "L" (ראו איור 1A, ~1 דקות)
  2. הניחו בזהירות את קצה ה-"L" של חוט הטונגסטן על הסיב האופטי (ראו איור 1B, ~1 דקות).
    הערה: חוט הטונגסטן צריך להיות ארוך ב-0.2-0.4 מ"מ מקצה הסיב האופטי.
  3. טבלו טיפת דבק ומרחו אותה על הממשק של הסיב האופטי וחוט הטונגסטן (ראו איור 1C, ~1 דקות). בשל מתח הפנים של הנוזל, חוט הטונגסטן יתחבר לסיב האופטי.
  4. מרחו את הדבק פעם אחת והניחו לו להתייבש. לאחר מכן, מרחו שכבה שנייה. זה יהדק עוד יותר את הקשר בין חוט הטונגסטן לבין הסיב האופטי (ראו איור 1C, ~1 דקות).
    הערה: במהלך תהליך היישום, יש להקפיד למנוע מהדבק לזרום לקצה הסיב האופטי, שכן הדבר עלול להשפיע על העברתו.
  5. בפינת צורת "L", השתמש בדבק כדי לקשור היטב את בסיס הסיב האופטי ואת חוט הטונגסטן יחד (~ 1 דקות).
    הערה: שטח המגע המוגבר וההתמצקות הכדורית של טיפת הדבק מבטיחים קשר איתן בין הסיב האופטי לחוט הטונגסטן.
  6. השתמשו בהלחמה כדי ליצור חיבור בין חוט הטונגסטן לבין הסיכה של המחבר הנשי (ראו איור 1D, ~3 דקות עבור כל אחד מהם)
    הערה: מכיוון שחוט טונגסטן אינו רגיש לחום, ניתן להגדיל את שיעור ההצלחה של הלחמה לכמעט 100% על ידי שרוול מתכת המעוצב על ידי חיתוך מיקום חריץ הסיכה כדי לאחד פיזית את שני המרכיבים. לאחר מכן, הלחמה הממלאת את השרוול מבטיחה חיבור יציב בין חוט הטונגסטן המוחדר לבין הסיכה.
  7. על פי תכנון הניסוי, הלחמת את מספר האופטרודים הנדרש (ראו איור 1E, ~10 דקות)
    הערה: במחקר זה נעשה שימוש בשלושה אופטרודים.
  8. חותכים את חוט האמייל לאורך המתאים (~ 30 מ"מ) ושורפים את הבידוד משני קצותיו. כורכים קצה אחד של חוט האמייל סביב בסיס הבורג ומרסקים אותו. חברו את הקצה השני של חוט האמייל לפינים של המחבר הנשי באמצעות מגהץ הלחמה, המשמש כרישום EEG וחיבור הארקה עבור אלקטרודת הגולגולת (ראו איור 1F, ~5 דקות)
    הערה: בשל הגמישות של חוט האמייל, נוח לחבר את הגולגולת ואת הפינים של המחבר הנשי. הלחמה לאחר פיתול חוט האמייל סביב בורג אמינה יותר מהלחמה להרכבה משטחית.
  9. יש למרוח דבק בהמסה חמה על מערך הפינים של המחבר הנשי כדי לעטוף את המחבר הנשי ולוודא שמפרקי ההלחמה עטופים במלואם. במהלך התמצקות הדבק המומס בחום, עצבו את הדבק באמצעות לוח פלסטיק כדי למזער את תפוסת החלל במהלך ההשתלה (ראו איור 1F, ~3 דקות)
    הערה: בשל סיכוני הכוויה הפוטנציאליים הקשורים לשימוש בדבק נמס חם, דבק AB נחשב לחלופה בטוחה יותר.
  10. לאחר מכן, השתמש במד עוצמת אור ובמולטימטר דיגיטלי כדי למדוד בהירות ומוליכות. לאחר שעוברים את הבדיקות האלה, ההתקנה מוכנה לשימוש (ראו איור 1G, ~2 דקות)
    הערה: בעת עבודה עם לייזר, יש ללבוש תמיד משקפי מגן המתאימים לאורך הגל הספציפי ולעוצמה של אור הלייזר. סיבים איכותיים נדרשים כדי להעביר לפחות 80% מהאור מקצה חוט התיקון לקצה הסיב המושתל. בנוסף, נמדדה ההתנגדות מקצה חוט הטונגסטן לחריץ ראש הסיכה בטווח מקובל של 1-5 Ω.
  11. לפני השימוש, לטבול את האלקטרודות מוכן 75% אלכוהול במשך 15 דקות, ולאחר מכן להעביר אותם מלוחים סטרילי (~ 16 דקות).
    הערה: המשקל הכולל של התקן האלקטרודה העטוף (0.6701 ± 0.01123 גרם, n = 4) אינו משפיע על פעילות העכברים. האלקטרודות מעוקרות מראש באמצעות עיקור פלזמה.

2. פרוטוקול להשתלת אלקטרודות (איור 2)

  1. הרדימו את העכברים עם איזופלורן (2%-4%) ואבטחו אותם במנגנון סטריאוטקסי (ראו איור 2A, ~2 דקות). יש להשתמש במשחת עיניים על עיני עכבר כדי למנוע יובש בזמן הרדמה. יש למרוח לידוקאין על העור סביב היקף החתך הגולגולתי והזרקה תת עורית של קרפרופן במינון של 5 מ"ג/ק"ג.
    הערה: הרדמה נכונה מאושרת באמצעות היעדר רפלקס התיקון ואובדן התגובה לצביטת הבוהן. עבור הליכים כירורגיים ממושכים, באמצעות הרדמה בהזרקה מתאים יותר.
  2. לאחר אבטחת החיה במנגנון הסטריאוטקסי, חתכו את הקרקפת לאורך קצה הגולגולת ונגבו את משטח הגולגולת עם 75% אלכוהול כדי לחשוף את מיקומי הברגמה והלמבדה (ראו איור 2B, ~3 דקות).
    הערה: ההליך הטרום ניתוחי כולל גזיזת שיער, חיטוי אתר הניתוח, חיטוי מראש של המכשירים וכלי הניתוח.
  3. פלסו את המוח וקידחו חורים (~0.8 מ"מ) מעל אזורי העניין (ROI) באמצעות מיקרו-מקדחה. הזריקו לנגיפים הרלוונטיים משאבת מזרק (ראו איור 2C - F, ~20 דקות).
    הערה: מידע מפורט על הווירוסים וה-ROI במחקר זה מוצג בטבלת החומרים ובאיור 3.
  4. החזיקו את האופטרודים עם מחזיק והזיזו את קצהו לנקודת הברגמה, תוך הגדרת מיקום זה כ'אפס'. באמצעות נקודת הברגמה כקואורדינטת הייחוס, הזיזו את האופטרודות לאזורי המטרה (ראו איור 2G, ~3 דקות). מקם את optrodes 0.3 מ"מ מעל אתר הזרקת הנגיף.
    הערה: באסטרטגיית ההשתלה האנכית, המרחק המינימלי בין שתי האלקטרודות הוא כ-2 מ"מ, בהתאם לעובי שרוול הסיב האופטי והקוטר החיצוני של הפרול. ניתן להשתמש בשיטת החדרה זוויתית להקלטה בו זמנית מאזורים קרובים.
  5. לאחר החדרת הסיבים האופטיים לאזורי המוח המתאימים, מרחו כמות קטנה של דבק רקמה סביבם כדי לכסות את הרקמה החשופה. לאחר מכן, החל ברצף דבק נוסף ומעט מלט דנטלי. לאחר שהמלט הדנטלי מתמצק, שחררו את המחזיק בזהירות (ראו איור 2H, ~5 דקות).
  6. לפני כל השתלת אופטרוד חדשה, בצעו כיול מחדש, הכולל חזרה על שלב 2.4 (ראו איור 2I).
    הערה: עבור כל השתלה, מקם את האופטרוד בברגמה כנקודת ה'אפס'.
  7. לאחר השתלת כל האופטרודים, קדח את החורים מאחורי נקודת הלמבדה עבור 'קרקע' ומעל הניאוקורטקס עבור 'EEG' באמצעות מיקרו-מקדחה (~ דקה אחת).
    הערה: גודל החור שנקדח (~ 1.1 מ"מ) צריך להתאים לקוטר הבורג.
  8. הכניסו ברגי גולגולת לתוך החור שמעל קליפת המוח ומאחורי נקודת הלמדא (ראו איור 2J, ~5 דקות).
    הערה: ברגי גולגולת משמשים להקלטה והארקה של EEG, בהתאמה.
  9. ארגנו את חוטי הטונגסטן וחוטי האמייל כך שימוקמו מעל אזור ההשתלה ולא ייחשפו מחוץ לגולגולת. אבטח את מיקום המחבר הנשי באמצעות מחזיק (ראה איור 2K, ~2 דקות).
  10. מלאו את אתר ההשתלה בצמנט דנטלי כדי להבטיח חיבור יציב בין מכשיר האלקטרודה לגולגולת. עטפו את החוטים הפנימיים, והשאירו את חורי ההחדרה של המחבר הנשי חשופים לחיבור לבמת הראש (ראו איור 2L, ~6 דקות).
  11. לאחר התקשות הצמנט הדנטלי, יש למרוח יוד על העור סביב היקף הקרקפת החשופה ולאחר מכן להניח את בעל החיים על כרית חימום (~ 1 דקות).
    הערה: ודא כי בעל החיים אינו נשאר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה. יש לשמור על תנאים סטריליים לאורך כל ניתוח ההישרדות.
  12. מתן אנטיביוטיקה ומשככי כאבים לתמיכה בהתאוששות לאחר הניתוח.
    הערה: בעלי חיים שעברו ניתוח אינם מובאים מחדש לחברתם של בעלי חיים אחרים עד שהחלימו לחלוטין. בעלי חיים קיבלו זריקות תוך צפקיות של נתרן ceftriaxone (180 מ"ג / ק"ג), וזריקות תת עוריות של קרפרופן (5 מ"ג / ק"ג), וג'ל לידוקאין נמרח על פצעי הניתוח מדי יום במשך 3 ימים. בעלי החיים נדרשים לשרוד לתקופה מוגדרת כדי להשלים את הבדיקות ההתנהגותיות. לאחר מכן, הם יעברו המתת חסד באמצעות איזופלורן 4%-5%, ולאחר מכן זילוח וחיתוך רקמות כדי להעריך זיהום ויראלי ואת אתרי השתלת האלקטרודות.

3. פרוטוקול להקלטה in vivo brain

  1. לפני ביצוע הקלטת אותות ובדיקות התנהגותיות (בדיקת שדה פתוח)15, ודא שהעכבר עובר תקופה של 3 ימים של טיפול עדין כדי להתאקלם בסביבה.
    הערה: במחקר זה, העכברים הונחו בשדה פתוח (42 ס"מ × 42 ס"מ) כדי לנוע בחופשיות, מה שמאפשר לנו לצפות בהתנהגות ההתקפים שלהם.
  2. לאחר הרדמת העכברים עם איזופלורן (2%-4%), חברו את הסיבים האופטיים ברצף לפי סדר אתר ההקלטה לפני החדרת הראש.
  3. הגדר את פולס האור של 635 ננומטר עם מחזור עבודה של 10% ב- 20 הרץ. הגדר את גירוי האור למשך 10 שניות (200 פעימות) במהלך ההקלטה. הגדר את העוצמה בקצות הסיב האופטי על 3 mW.
  4. השתמש במערכת פוטומטריה סיבים כדי להקליט את תקופת הבדיקה ההתנהגותית של אותות Gcamp6m בקצב דגימה של 30 הרץ על ערוץ LED של 470 ננומטר.
  5. הקלטה בו זמנית של אותות סידן, LFPs ו-EEG תחת גירוי אופטוגנטי, יחד עם ביצועים התנהגותיים תואמים (ראו איור 3).
  6. השתמש בתיוג סינכרון אותות של Transistor-Transistor Logic (TTL) כדי להבטיח עקביות זמנית בנתונים מוקלטים.

4. עיבוד נתונים

  1. טען נתוני פוטומטריה לתוכנת MATLAB. לאחר מכן, השתמש בקידוד מותאם אישית (קובץ משלים 1) כדי לבטל את מגמת אות הסידן.
  2. הגדר את השינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות באמצעות משוואה (1):
    ΔF/F = (Ft - F0)/ F0 (1)
    כאשר Ft מייצג את ערכי הפלואורסצנטיות של אות הסידן בזמן אמת, ו- F0 מציין את עוצמת הפלואורסצנטיות הבסיסית הממוצעת לפני האירוע.
  3. יש לייבא את הנתונים האלקטרופיזיולוגיים, קצב דגימה של 1000 הרץ, ל-MATLAB (קובץ משלים 2).
  4. לתאם את התצוגה של איתות סידן ונתונים אלקטרופיזיולוגיים ביישור עם סמנים מסונכרנים.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שילבנו אופטוגנטיקה עם רישום אלקטרופיזיולוגי רב-אזורי והדמיית סידן כדי לצפות בפעילות העצבית באזורים שונים במוח במהלך התקפים אופטוגנטיים. למטרה זו, וירוס הקשור לאדנו (AAV) המבטא ChrimsonR תחת שליטתו של מקדם CaMKIIα (AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherry)16 הוזרק לאתר אפילפטוגני קלאסי, קליפת המוח הפיריפורמית (ROI 1)17, במכרסמים. נוסף על כך, AAV-hsyn-Gcamp6m18 הוזרק לשלושה אזורים (ROI 1-3, כפי שמוצג באיור 3A). לאחר מכן, הושתלו אופטרודות בהתאמה אישית באזורים האלה, ואלקטרודות EEG הושתלו בגולגולת הנגדית (איור 3B).

ChrimsonR ו-Gcamp6m התבטאו מאוד באזורי המטרה במוח (איור 3C) 4 שבועות לאחר מכן. עכברים הפגינו התנהגויות התקפים כלליות לאחר פוטו-טימולציה קצרה של 10 שניות ב-20 הרץ כדי להפעיל נוירונים חיוביים ל-ChrimsonR. אספנו את פעילויות הסידן ואת אותות ה-LFP מה-ROI בעכברים שנעים בחופשיות על-ידי שימוש בטכניקות פוטומטריה ואלקטרופיזיולוגיה רב-סיביות בו-זמנית (איור 3D). הפרשות חזקות לאחר הפרשות, יחד עם עלייה יוצאת דופן בפעילויות Ca2+ , נוצרו באזורים האלה על-ידי גירוי אופטוגנטי קצר (איור 3E). תגובה של 30 הרץ נצפתה באזור המגרה אופטו, הנגרמת על ידי הפעלת חלבונים אופטוגנטיים באמצעות נורית אור כחול בתדר דגימה של 30 הרץ. לא נצפתה הפרעה לקו החשמל של 50 הרץ בערוצי ההקלטה. תוצאות אלה הדגימו רישום אמין של תגובות איתות אלקטרופיזיולוגיות וסידן מסונכרנות באזורים מרובים תחת גירוי אופטוגנטי.

figure-results-1
איור 1: תכנון סכמטי של אופטרודה גמישה. (A) הכנת חוטי טונגסטן בצורת "L" וסיבים אופטיים. (B) הסיבים האופטיים וחוטי הטונגסטן מוקמו על סרט ההדבקה. (C) הסיב האופטי וחוט הטונגסטן הודבקו זה לזה באמצעות דבק. (ד,ה) חוטי הטונגסטן רותכו למחבר. (ו) הברגים רותכו למחבר, והמחבר היה עטוף בדבק מותך חם. (ז) נערכו בדיקות איכות במכלול האופטרודה. G מייצג את חור הסיכה של אלקטרודת הקרקע; R מייצג חור סיכה עבור אלקטרודת הייחוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תהליך העבודה של ניתוח השתלה. (A) העכבר היה מאובטח על מכשיר סטריאוטקסי. (B) הקרקפת הוסרה, והגולגולת נחשפה כראוי. (ג) צינור זכוכית ההזרקה חובר למשאבה. (D) ראשו של העכבר הותאם למצב אופקי. (ה,ו) נקדחו חורים, והנגיף הוזרק. (ז) האופטרודה נתפסה על ידי המחזיק. (ח) האופטרודה הושתלה באזור קרוב והודקה במלט דנטלי. (I) התאמה מחדש של מיקום האפס לפני כל השתלה. (J) אלקטרודות EEG הושתלו לאחר השתלת אופטרוד. G/R: אלקטרודת הארקה ואלקטרודת הייחוס קוצרו במיקומי הפינים. (K) החוטים סודרו לפי הסדר, והמחבר תוקן. (יב) מכשיר האלקטרודות היה עטוף ומקובע במלט דנטלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: רישום אלקטרופיזיולוגי וסידן סינכרוני In vivo . (A) תכנון ניסיוני לזריקות ויראליות. (B) תוכנית ניסיונית של השתלת אופטרוד. (C) תמונות קונפוקליות מראות ביטוי וירוסים באזורי המטרה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (D) סכמטי של גירוי אופטוגנטי, אלקטרופיזיולוגי סינכרוני ורישום סידן במצב תנועה חופשית. (E) עקבות מייצגים של אותות סידן (למעלה), אותות LFP (באמצע), EEG (למטה) וספקטוגרמות הספק מתאימות. קו אדום: אור 10 שניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: קבצי קידוד לאות סידן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: קבצי קידוד עבור אות LFP. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, השתמשנו במכשיר optrode מתוצרת עצמית עבור הקלטת אותות עצביים in vivo על פני אזורים מרובים. ההיתכנות של מערכת זו לגירוי אופטוגנטי סימולטני, רישום אות סידן ורישום אלקטרופיזיולוגי אומתה. שיטת הכנת האלקטרודות המתוארת כאן היא יעילה וחסכונית. על פי תכנון הניסוי, אנו יכולים להקליט אותות מאזורי מוח רלוונטיים. הסידור האסטרטגי של האופטרודים מאפשר חילוץ פוטנציאלי של מידע רב מאזורים רבים ברחבי המוח. השילוב של פרדיגמות זיהוי רב-מודאליות מספק הזדמנויות לנתח מעגלים עצביים מורכבים, ומבהיר את היחסים בין אזורי המוח.

בנתונים המייצגים של המחקר הנוכחי, אותות סידן ואותות אלקטרופיזיולוגיים מנוירונים רחבי-טווח של כל אזור המוח המקומי נרשמו בו זמנית. בעקבות ההתקדמות בטכנולוגיית הבנייה של בעלי חיים טרנסגניים19,20, השילוב של עכברי Cre-עכברים ועכברי FlpO-עם וירוס Gcamp מבטא מאפשר רישום של פעילות עצבית מתאי עצב ספציפיים. לפיכך, שיטה זו מאפשרת לנו לפענח את התגובות של תאי עצב מסוימים על פני אזורי מוח שונים באמצעות גישות משולבות אלה. בנוסף, שיטות אנליטיות מגוונות יועילו בניתוח האותות האלקטרופיזיולוגיים והסידן שנאספו מאזורי מוח מרובים. לדוגמה, ניתוח קוהרנטיות וניתוח סיבתיות גריינג'ר יכולים לשמש להשגת מאפייני תקשורת תיאורטיים חדשים בין אזורי מוח שונים 21,22,23. חוץ מזה, התקדמות בטכניקות מעקב מעגלים מסייעת בחשיפת הקשרים המבניים בין אזורי המוח24. טכנולוגיות משולבות אלה שיפרו את הבנת התגובות הקשורות באזורים שונים במוח וחוללו מהפכה בהבנת הקשר והאינטראקציה במעגלים וברשתות.

במחקר זה השתמשנו במודלים אופטוגנטיים של אפילפסיה. אופטוגנטיקה מציעה לא רק רזולוציה טמפורלית גבוהה יותר, אלא גם ספציפיות תאים משופרת בהשוואה לגירוי חשמלי במודל ההצתה של אפילפסיה25,26. בנוסף, הוא מאפשר העברת אור והקלטת סידן להתבצע דרך אותו סיב אופטי. זיהוי הפעילות הרב-אזורית והאפנון האופטוגנטי ישלימו את שיטות ההתערבות באפילפסיה בלולאה סגורה, ויאפשרו התערבויות ויסות על פני אזורי מוח מרובים באמצעות אפנון מעכב, ובכך יגבירו את ההשפעות האנטי-אפילפטיות. חשוב גם לשלב מכשירים אלה עם טכנולוגיות נוירומודולציה קיימות אחרות לזיהוי והתערבות בלולאה סגורה של כאב כרוני29,30. מלבד זאת, גישה זו עשויה להתרחב להפרעות נוירולוגיות אחרות כגון הפרעות שינה31 ומחלת אלצהיימר, שם תופעות כמו תנודות 40 הרץ ועיבוד מידע בעקבות קלט חושי דורשות הבהרה באמצעות רישום multi-region in vivo 32. לכן, יישום מיומן של גישה רב-גונית זו יעמיק את הבנתנו את יחסי הגומלין בין אזורים מרובים ויספק תובנות יקרות ערך לטיפולים מדויקים במחלות שונות.

קיימות מגבלות בשיטת זיהוי אופטרודה זו, אשר ניתן לשפר במחקר עתידי. בעוד שאותות LFP נקלטו בקלות, זיהוי פעילויות ספייק נותר מאתגר בשיטה33 הנוכחית. אנו שואפים להחליף חוט טונגסטן באלקטרודות גמישות רב ערוציות. יש לשקול היטב את עובי הסיב ואת בטיחות דבק הדבק.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31871085), הקרן למדעי הטבע של שנחאי (21ZR1407300), הפרויקט העירוני למדע וטכנולוגיה של שנגחאי (2018SHZDZX01), מעבדת ZJ ומרכז שנגחאי למדעי המוח וטכנולוגיה בהשראת המוח.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
8-32 מתאםPlexonבהזמנה מותאמת אישיתחבר את המחבר הנקבה ואת ה-headstage
AAV-CaMKIIα-ChrimsonR-mcherryTaitool BioscienceS0371-94 x 1012 VG/mL 
AAV-hsyn-Gcamp6mTaitool BioscienceS0471-94 x 1012 VG/mL 
DAPISigma236276Titered 1:500
צמנטשיניים New Century Dental430205
מערכת הקלטות אלקטרופיזיולוגיותPlexonOmniplex
חוט אמיילN/Aקוטר בהזמנה אישית= 0.2 מ"מ
מחבר נקבהN / Aבהזמנה אישית1.25 מ"מ
גובה דבקלוקטיט45282
לייזרצ'אנגצ'ון תעשיות חדשותBH81563635 ננומטר 
MATLABMathWorksR2021b
MicrodrillRWD78001
פוטומטריית סיבים רב-ערוציתThinkerTechFPS-SS-MC-LED
סיבים אופטייםשיאן בוגאוL-200UMבחר את אורך הסיבים המתאים על סמך עומק אזורי המוח הממוקדים.
חוט טונגסטן מצופה PFAמערכת AM,795500חשוף, 0.002 אינץ'; מד כוח מצופה 0.0040 אינץ'
ThorlabsPM100D
סטריאוטקסי FxrameRWD68807
דבק רקמות3M1469SB
,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Devinsky, O., et al. Epilepsy. Nat Rev Dis Primers. 4, 18024(2018).
  2. Piper, R. J., et al. Towards network-guided neuromodulation for epilepsy. Brain. 145 (10), 3347-3362 (2022).
  3. Bertram, E. H. Neuronal circuits in epilepsy: Do they matter. Exp Neurol. 244, 67-74 (2013).
  4. Goodman, A. M., Szaflarski, J. P. Recent advances in neuroimaging of epilepsy. Neurotherapeutics. 18 (2), 811-826 (2021).
  5. Caciagli, L., Bernhardt, B. C., Hong, S. J., Bernasconi, A., Bernasconi, N. Functional network alterations and their structural substrate in drug-resistant epilepsy. Front Neurosci. 8, 411(2014).
  6. Dai, Y., et al. In vivo microelectrode arrays for detecting multi-region epileptic activities in the hippocampus in the latent period of rat model of temporal lobe epilepsy. Micromachines (Basel). 12 (6), 659(2021).
  7. Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A. Electrophysiological biomarkers of epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 334-346 (2014).
  8. Grienberger, C., Giovannucci, A., Zeiger, W., Portera-Cailliau, C. Two-photon calcium imaging of neuronal activity. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 67(2022).
  9. Akerboom, J., et al. Optimization of a gcamp calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  10. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive gcamp calcium indicators for imaging neural populations. Nature. 615 (7954), 884-891 (2023).
  11. Wu, Z., Lin, D., Li, Y. Pushing the frontiers: Tools for monitoring neurotransmitters and neuromodulators. Nat Rev Neurosci. 23 (5), 257-274 (2022).
  12. Vierock, J., et al. Bipoles is an optogenetic tool developed for bidirectional dual-color control of neurons. Nat Commun. 12 (1), 4527(2021).
  13. Luo, W., et al. Acquiring new memories in neocortex of hippocampal-lesioned mice. Nat Commun. 13 (1), 1601(2022).
  14. Armstrong, C., Krook-Magnuson, E., Oijala, M., Soltesz, I. Closed-loop optogenetic intervention in mice. Nat Protoc. 8 (8), 1475-1493 (2013).
  15. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The open field test for measuring locomotor activity and anxiety-like behavior. Methods Mol Biol. 1916, 99-103 (2019).
  16. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  17. Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Front Neural Circuits. 9, 27(2015).
  18. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  19. Birling, M. C., Dierich, A., Jacquot, S., Herault, Y., Pavlovic, G. Highly-efficient, fluorescent, locus directed cre and flpo deleter mice on a pure c57bl/6n genetic background. Genesis. 50 (6), 482-489 (2012).
  20. Huang, T., et al. Identifying the pathways required for coping behaviours associated with sustained pain. Nature. 565 (7737), 86-90 (2019).
  21. Likhtik, E., Stujenske, J. M., Topiwala, M. A., Harris, A. Z., Gordon, J. A. Prefrontal entrainment of amygdala activity signals safety in learned fear and innate anxiety. Nat Neurosci. 17 (1), 106-113 (2014).
  22. Tavares, L. C. S., Tort, A. B. L. Hippocampal-prefrontal interactions during spatial decision-making. Hippocampus. 32 (1), 38-54 (2022).
  23. Lu, Y., et al. Optogenetic dissection of ictal propagation in the hippocampal-entorhinal cortex structures. Nat Commun. 7, 10962(2016).
  24. Liu, Q., Wu, Y., Wang, H., Jia, F., Xu, F. Viral tools for neural circuit tracing. Neurosci Bull. 38 (12), 1508-1518 (2022).
  25. Christenson Wick, Z., Krook-Magnuson, E. Specificity, versatility, and continual development: The power of optogenetics for epilepsy research. Front Cell Neurosci. 12, 151(2018).
  26. Paschen, E., et al. Hippocampal low-frequency stimulation prevents seizure generation in a mouse model of mesial temporal lobe epilepsy. Elife. 9, e54518(2020).
  27. Gummadavelli, A., Zaveri, H. P., Spencer, D. D., Gerrard, J. L. Expanding brain-computer interfaces for controlling epilepsy networks: Novel thalamic responsive neurostimulation in refractory epilepsy. Front Neurosci. 12, 474(2018).
  28. Vandekerckhove, B., et al. Technological challenges in the development of optogenetic closed-loop therapy approaches in epilepsy and related network disorders of the brain. Micromachines (Basel). 12 (1), 38(2020).
  29. Li, Z. J., Zhang, L. B., Chen, Y. X., Hu, L. Advancements and challenges in neuromodulation technology: Interdisciplinary opportunities and collaborative endeavors. Sci Bull (Beijing). 68 (18), 1978-1982 (2023).
  30. Zhang, Q., et al. A prototype closed-loop brain-machine interface for the study and treatment of pain. Nat Biomed Eng. 7 (4), 533-545 (2023).
  31. Varela, C., Wilson, M. A. Mpfc spindle cycles organize sparse thalamic activation and recently active ca1 cells during non-rem sleep. Elife. 9, e48881(2020).
  32. Adaikkan, C., et al. Gamma entrainment binds higher-order brain regions and offers neuroprotection. Neuron. 102 (5), 929-943.e8 (2019).
  33. Muthmann, J. O., et al. Spike detection for large neural populations using high density multielectrode arrays. Front Neuroinform. 9, 28(2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Electrophysiological OptrodesIn Vivo RecordingLocal Field PotentialMulti Region RecordingOptogenetic StimulationCalcium SignalingFiber PhotometryEEG RecordingNeural Circuit AnalysisEpilepsy Models

Related Articles