הפרוטוקול כולל ייצור מתמרים, דיווח פרמטרים, הליך כירורגי והקלטת אותות עבור כל זרימת העבודה התפעולית של נוירומודולציית אולטרסאונד ממוקדת בו זמנית והקלטת פוטומטריית סיבים בעכברים הנעים בחופשיות.
מאמר שיטה
נוירומודולציית אולטרסאונד ממוקדת בו זמנית והקלטת פוטומטריית סיבים בעכבר הנע בחופשיות
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
נוירומודולציית אולטרסאונד ממוקדת (FUN) מייצגת גישה מבטיחה להפרעה לא פולשנית של מעגלים עצביים באזורי מוח עמוקים. זה תואם את רוב השיטות הקיימות לניטור תפקודי המוח in vivo. אינטגרציה עם שיטות רישום של תפקודי המוח לא רק מאפשרת לנו לטפל בפקודות ובהפרעות של תפקודי מוח ספציפיים באמצעות משוב בלולאה סגורה, אלא גם מספקת לנו תובנות מכניסטיות על FUN עצמו. כאן, אנו מספקים פרוטוקול שונה, פשוט, אמין וחזק ליישום סימולטני של FUN ופוטומטריית סיבים GCaMP6s הקלטת פלואורסצנטיות בעכברים הנעים בחופשיות. זה כרוך בייצור של מתמר יחיד בגודל טוב ומיקומו הזמני על העכברים, יחד עם קיבוע מאובטח של שתל סיב אופטי כדי להקל על המעבר החלק של המתמר. השילוב של FUN ופוטומטריית סיבים מספק הקלטה אופטית של תגובות מעגלים עצביים על FUN בזמן אמת באזורי מוח עמוקים. כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול זה, עכברי Thy1-GCaMP6s שימשו כדוגמה לרישום הנוירואקטיביות בגרעין התלמוס הקדמי במהלך FUN בזמן שהעכברים נעים בחופשיות. אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יכול לקדם את השימוש הנרחב ב- FUN הן בתחום מדעי המוח והן בתחום האולטרסאונד הביו-רפואי.
מבוא
נוירומודולציה ממוקדת אולטרסאונד (FUN) התפתחה ככלי נוירומודולציה מבטיח ורב-תכליתי, המאפשר לחקור את תפקוד המוח וארגונו עם פוטנציאל גדול1. FUN מסוגלת לספק אנרגיה אקוסטית באופן לא פולשני לכל מיקום ברקמת המוח בדיוק נקודתי2. יכולתו לווסת באופן ארעי והפיך את הנוירואקטיביות במבנה המוח העמוק, עם ספציפיות מרחבית-טמפורלית גבוהה, באופן בטוח ולא פולשני, מציגה תכונה מושכת המשלימה את טכניקת הנוירומודולציה הקלינית הקיימת3. הדגמה של FUN יעיל אושרה הן בבני אדם 4,5,6 והן במודלים שונים של בעלי חיים, הכולליםמינים קטנים 7,8,9,10 ומינים גדולים 11,12,13,14,15,16,17.
על ידי התבוננות בהשפעה של FUN על סוגים עצביים ספציפיים באמצעות ניטור נוירואקטיביות במהלך FUN, אנו יכולים להתעמק במנגנון שמאחורי תהליך זה18,19. פוטומטריית סיבים המבוססת על מדדי סידן מקודדים גנטית (GECIs) הפכה בשימוש נרחב בעשור האחרון כשיטה רב-תכליתית למעקב אחר פעילות אוכלוסייה ספציפית לסוג התא in vivo 20,21,22,23,24. לפיכך, היישום הסימולטני של FUN ופוטומטריית סיבים יכול להעשיר באופן משמעותי את ההבנה המקיפה שלנו של FUN. עם זאת, השימוש במתמרים בודדים מגושמים מחייב קיבוע למסגרת, בעוד בעלי חיים צריכים לעבור הרדמה ולהיות משותקים במסגרת סטריאוטקסית 7,19,25,26. גישה זו עשויה שלא להתאים לסוגים מסוימים של ניסויים הקשורים לתפיסה, קוגניציה והערכת התנהגות. חיוני לקבוע פרוטוקול המאפשר מיזוג של FUN ופוטומטריית סיבים מבלי לפגוע בניוד העכברים7.
במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול מעודן ששימש במחקרים הקודמים שלנו כדי להשלים בצורה חלקה וחיננית את השיטה ליצירת מתמר יחיד וקיבוע זמני שלו על העכברים, כמו גם קיבוע מאובטח של שתל סיב אופטי כדי להקל על המעבר החלק של המתמר 7,19,26. זה מאפשר לחוקרים להקליט את הנוירואקטיביות המווסתת על ידי אולטרסאונד בעכברים בלתי מרוסנים. בחרנו במעטפה חלקה יותר, כגון מעטפה סינוסואידית, כדי להקטין את בלבול השמע27. היתכנות פרוטוקול זה מאושרת באמצעות רישום סימולטני של נוירואקטיביות בגרעין התלמי הקדמי של עכברים הנעים בחופשיות במהלך FUN. הוא מדגים כי אנרגיית המתמר מספיקה להשגת נוירומודולציה, ושיטות הקיבוע של שתל הסיב האופטי והמתמר יכולות להבטיח את יציבותם.
פרוטוקול
כל הנהלים והטיפול בבעלי חיים עמדו בהנחיות האתיקה של NSFC ובדרישות פרוטוקול מאושרות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכון גואנגדונג למודיעין, מדע וטכנולוגיה.
1. הכנת מתמרים
- הכינו צלחת פיאזואלקטרית בקוטר פנימי של 3 מ"מ, קוטר חיצוני של 7 מ"מ ותדר מרכזי של 500 קילוהרץ.
הערה: ניתן לכוונן את הקוטר החיצוני בהתבסס על האזור הספציפי במוח הממוקד ויש למקסם אותו תוך שמירה על דיוק הגירוי ומבלי לחרוג מגבול גולגולת העכבר. - חברו את החוט לשני הצדדים של הלוח הפיזואלקטרי באמצעות משחת כסף אפוקסי (איור 1). לאחר שמשחת הכסף האפוקסי התמצקה, השתמש במולטימטר כדי למדוד את ההתנגדות בשני קצוות החוט כדי לוודא שהיא בערך 0.
- יש למרוח שכבה של סרט דו-צדדי על משטח זכוכית נקי. היצמדו לצלחת הפיזואלקטרית ולטבעת הנחושת, בגובה של 8 מ"מ, קוטר חיצוני של 8 מ"מ וקוטר פנימי של 7.6 מ"מ, צמוד ליריעת הזכוכית.
הערה: הקוטר הפנימי של טבעת הנחושת נקבע על ידי גודל הלוח הפיזואלקטרי כדי להבטיח שהלוח מכוסה על ידי טבעת הנחושת. - הכניסו היטב את צינור הפוליפרופילן בקוטר חיצוני של 3 מ"מ למרכז הלוח הפיזואלקטרי והדביקו אותו היטב ליריעת הזכוכית (איור 1).
- הכינו כמות מתאימה של דבק שרף אפוקסי ושאבו אותו. מוציאים את האפוקסי בעזרת מזרק חד פעמי ומזריקים אותו לאט לאט לתוך טבעת הנחושת. המתינו כ-10 שעות עד שהאפוקסי יתמצק (איור 1).
- הלחמת את הקצוות הרופפים של שני חוטים על מחבר אום הכידון באמצעות מגהץ הלחמה אלקטרוני. הסירו את יריעת הזכוכית. נקו את פני השטח של המתמר עם אלכוהול (איור 1).
2. פרמטרי דיווח עבור FUN
- הניחו את ההידרופון והמתמר במיכל מים מלא במים שעברו דה-יוניזציה (איור 2A). ודא שהקרן המרכזית (ציר Z) של מערכת המיקום מיושרת עם ציר המתמר. יישור זה יכול להיות מושג על ידי ראשית, גילוי שדה מקסימלי במישור המוקד באמצעות סריקה דו-ממדית; שנית, זיהוי שדה מקסימלי במישור אחר עם מקסימום ברור; שלישית, השוואת קואורדינטות X ו- Y של שתי המקסימום ולאחר מכן התאמה איטרטיבית של המיקום ו / או הכיוון של המתמר במידת הצורך28.
- כוונן את קצה ההידרופון עם פני השטח של המתמר במרחק של 1 מ"מ, תוך שמירה על מרחק קבוע תוך מיקום ההידרופון באמצע הקצה הימני של המתמר. הפעל את תוכנית הסריקה כדי ללכוד את השדה האקוסטי החופשי במישור XZ (איור 2B).
הערה: ניתן למצוא את שיטת הבנייה של ההידרופון https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control. - הזיזו את ההידרופון לאורך ציר Z כדי לקבוע את העומקים הקשורים ללחץ השיא המרחבי. בניסוי זה, לחץ השיא המרחבי מופיע במרחק של 3.4 מ"מ מפני השטח של המתמר; שמור על מרחק זה בעת הזזת ההידרופון לפינה הימנית התחתונה של המתמר במישור XY. הפעל והפעל את תוכנית הסריקה כדי ללכוד את השדה האקוסטי החופשי במישור XY (איור 2B).
- הניחו את המתמר על גולגולת של עכבר שעבר ניתוח כמתואר בשלב 4. רכשו את השדה האקוסטי הטרנס-גולגולתי במישור XZ ובמישור XY (איור 2D) באמצעות סריקה הידרופונית כמתואר ב-2.1-2.3.
- קרא את אמפליטודות הלחץ בנקודת המוקד, שהיא אזור השיא המרחבי בשדה האקוסטי החופשי ובשדה האקוסטי הטרנס-גולגולתי. משרעת הלחץ בנקודת המוקד בשדה האקוסטי החופשי היא 730k Pa, ובשדה האקוסטי הטרנס-גולגולתי היא 580k Pa. קראו את ממדי המוקד ב-3- dB (איור 2C,E), ואת המיקום במישורי XY ו-XZ בתוך השדה האקוסטי הטרנס-גולגולתי כדי להעריך אם השדה האקוסטי של המתמר הזה יכול לכסות את אזורי המטרה במוח.
- חשב את המדד המכני (MI), אשר מוגבל על ידי מסמך הנחיות ה- FDA להיות מתחת 1.9 על מנת להפחית cavitation. חישוב MI נתון על ידי המשוואה:
(1)
כאשר pr,.3 מייצג את שיא הלחץ הרפרפקציוני ב- MPa המותאם על ידי מקדם הנחתה של 0.3 dB cm-1 MHz-1, ו - f0 הוא תדר הפעולה ב- MHz. הלחץ הרפרפקציוני של שיא השדה הטרנס-גולגולתי שנמדד הוא 580 kPa, , 3.4 מ"מ מהמתמר, f0 הוא 500 kHz, כך שה- pr,.3 המנוטרל הוא 576.6 kPa. ה-MI הוא 0.82. - חשב את עוצמת הדופק הממוצעת של שיא מרחבי (Isppa), הנדרשת להיות מתחת ל -190 W/cm2 בכיוון המישור על פי מסמך הנחיות ה- FDA. חישוב העוצמה נתון על ידי המשוואה:
(2)
כאשר psp (t) הוא הלחץ האקוסטי המשתנה בזמן במיקום הפסגה המרחבית, Z הוא העכבה האקוסטית האופיינית של התווך (בערך 1.5 x 106 קרניים לרקמות רכות), ופרקינסון הוא משך הדופק. במקרה של המעטפה הריבועית, זה מצטמצם למשוואה:
(3)
כאשר A היא משרעת הלחץ המרחבית-שיא. ה-A שנמדד במיקום ממוקד האולטרסאונד הוא 580 kPa, וה-Z של המוח הוא בערך 1.58 x 106 קרניים, כך שה-Isppa של המעטפת הריבועית הוא 10.65 W/cm2 וה-Isppa של המעטפת הסינוסואידית הוא 10.65 W/cm2. - חשב את העוצמה המרחבית-שיא הזמן-ממוצעת (Ispta), אשר מוגבלת על ידי מסמך ההנחיות של ה- FDA להיות מתחת 430 mW / cm2 בכיוון המטוס. חישוב העוצמה נתון על ידי המשוואה:
(4)
כאשר T הוא פרק הזמן שבו מחושב הממוצע. במקרה של המעטפה הריבועית, זה מצטמצם למשוואה:
(5)
כאשררכבת דופק DC היא מחזור העבודה של הדופק. כאן, רכבת הדופק DC היא 1% מכיוון שנעשה שימוש בגלים רציפים, כך שה- I spta שווה לעוצמת הדופק הממוצעת של שיא מרחבי, 106.5 mW / cm2 עבור מעטפת מרובעת. ניתן לחשב את MI, Isppa ו-Ispta באמצעות התוכנה (איור 3A). קוד מבוסס MATLAB לשימוש קל ניתן למצוא בכתובת https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation. - דווחו על פרמטרי תזמון הדופק, כולל Aמקסימום, משך הדופק, מרווח חזרת הדופק, משך רכבת הדופק והמעטפה (איור 3B).
3. הכנת החיה לניתוח
- שוקלים עכברים טרנסגניים זכרים בני 8 שבועות מסוג GCaMP6s, שמשקלו משוער הוא כ-20 גרם. הכינו תמיסה המכילה קטמין ב-10 מ"ג/מ"ל וקסילזין ב-2 מ"ג/מ"ל במי מלח סטריליים. יש לתת את תמיסת הקטמין/קסילזין בהזרקה תוך צפקית במינון של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-20 מ"ג/ק"ג קסילזין באמצעות מחט 26 גרם ומזרק חד פעמי בנפח 1 מ"ל. התחל הכנה כירורגית ברגע שבעל החיים אינו מגיב לגירויים כואבים, כגון צביטת בוהן.
- השתמש fader כדי לקצץ את השיער על הראש של החיה ולחטא את האזור עם 70% אתנול ו povidone-יוד לפני ההליך הכירורגי.
- מקם את העכבר במצב נוטה על המסגרת הסטריאוטקסית וודא שהגולגולת ישרה. הניחו משחת עיניים מגנה על עיני בעל החיים כדי לשמור על לחות.
4. הליך כירורגי
- בצע חתך לאורך התפר sagittal, החל מן העצם העורפית לתחילת עצם האף. השתמש מספריים כירורגיים כדי להסיר את העור המכסה את שתי ההמיספרות.
- השתמש מלוחים סטריליים כדי לנקות את הגולגולת ולחסל כל periosteum שנותר.
- יש למרוח 3% מי חמצן על הגולגולת החשופה באמצעות צמר גפן למשך כ-2-3 שניות ליצירת מיקרו-נקבוביות. יש לשטוף היטב במי מלח סטריליים ולוודא שהאזור יבש לחלוטין.
- צור קרניוטומיה של חור בור בקוטר 0.6 מ"מ באמצעות מקדח סטרילי ואוטוקלאבי מעל מיקום אזור המוח כפי שנקבע על ידי האטלס הסטריאוטקסי המיושר לברגמה וללמדא. שטפו את כל הלכלוך במי מלח סטריליים והבטיחו ייבוש יסודי. היזהר לא לפגוע בשום רקמה.
- הכנס את הסיב האופטי (שתל) למחזיק הבדיקה וחבר אותו לזרוע הסטריאוטקסית.
- יישרו את השתל ישירות מעל אזור העניין באמצעות הזרוע הסטריאוטקסית. בעת החדרת הסיב האופטי לרקמת המוח, יש לקדם את הסיב באיטיות בקצב של כ-2 מ"מ/דקה.
- ערבבו את הצמנט הדנטלי כדי להשיג צמיגות המאפשרת מריחה קלה על פני הגולגולת. השתמש בקיסם סטרילי כדי לפזר שכבה דקה של מלט דנטלי על הגולגולת ועל החלק התחתון של השתל. הניחו לו להתייבש לחלוטין.
- נתק את בעל הבדיקה בזהירות. הכינו צינור פוליפרופילן בגובה של 3 מ"מ, קוטר חיצוני של 3 מ"מ וקוטר פנימי של 2.6 מ"מ, ולאחר מכן חתכו את הצינור לכל אורכו.
- חברו את הצינור לתחתית השתל באמצעות פינצטה. שפכו את אבקת המלט הדנטלית לתוך הצינור כדי להבטיח אורך מספיק מעל השתל להקלטת אות הסיב האופטי. מוסיפים את הנוזל הדרוש ומאפשרים מספר דקות עד שהמלט הדנטלי יתמצק.
- אתר את פתח הצינור ומהדק אותו בזהירות כדי להסיר את הצינור באמצעות פינצטה. הכינו את תערובת הצמנט הדנטלי למריחה, וודאו ששכבה אחידה ודקה נפרסת על פני הגולגולת. כסו שטח פנים רב ככל האפשר על הגולגולת במלט דנטלי. המתן מספר דקות עד שבית הקברות הדנטלי יתמצק.
הערה: אין לתת למלט הדנטלי לבוא במגע עם עור העכבר. - קדחו שלושה חורים (קוטר 1 מ"מ) לתוך הטבעת המודפסת בתלת-ממד, מחולקת באופן שווה באופק, בגובה של 7 מ"מ, קוטר חיצוני של 10 מ"מ וקוטר פנימי של 8.4 מ"מ. אבטחו את הברגים (באורך 1 מ"מ) לתוך החורים שלהם.
- הכנס את החלק העליון של השתל לתוך החור של המתמר שיוצר מראש. ודא שהדופן הפנימית של הטבעת המודפסת בתלת-ממד חלקה, ולאחר מכן מקם אותה סביב המתמר הממוקם על גולגולת העכבר. ודא שהמתמר ממורכז בתוך הטבעת.
- מרחו צמנט דנטלי על הצומת שבין הטבעת לגולגולת, ואז המתינו מספר דקות עד שהמלט הדנטלי יתמצק. הימנעו מהנחת המלט הדנטלי על החיבור בין המתמר לגולגולת.
- הסר בזהירות את המתמר והדק היטב את הברגים. העבירו את העכבר לכלוב חם וודאו שהוא מנוטר עד להחלמה מלאה לפני החזרתו לכלוב המקורי.
- לאחר הניתוח, לנהל Carprofen תת עורית (2 מ"ג / ק"ג) עבור שיכוך כאבים ולהמשיך כל 24 שעות במשך 3 ימים כדי לנהל דלקת וכאב. יש לעקוב אחר בעלי החיים מדי יום לאיתור סימני מצוקה, ירידה חריגה במשקל, כאב או זיהום. בדרך כלל,עד היום השלישי לאחר הניתוח, כל העכברים צריכים להפגין התנהגות נורמלית. אם סימני מצוקה או מחלה כלשהם נצפים בעכבר לאחר היוםהשלישי , פעל בהתאם להנחיות המוסדיות להמתת חסד.
5. גירוי והקלטת אותות
- לאחר 7 ימים לאחר הניתוח, הפעל את אספקת החמצן למכונת הרדמת הגז וכוונן את וסת זרימת החמצן כדי להגדיר את זרימת הגז ל 300-500 מ"ל / דקה.
- הניחו את העכבר בתא האינדוקציה וסגרו את הזרמת גז ההרדמה למסכה. סובב את חוגת הוופורייזר כדי להתאים את ריכוז ההרדמה המתאים (2%-2.5%).
- לאחר שהעכבר מורדם, הניחו אותו על המסגרת הסטריאוטקסית עם מסכת הרדמה. סגור את קו הזירוז כדי לאפשר לגז ההרדמה לזרום לתוך מסיכת ההרדמה. התאמת ריכוז ההרדמה התחזוקתית המתאימה (1%-1.5%).
- נקו את המשטח העליון של השתל באלכוהול, ולאחר מכן הכניסו את כבל התיקון של הסיב האופטי למרכז המתמר המוכן.
- הזריקו מים לרווח שבין השתל לטבעת המודפסת בתלת-ממד באמצעות מחט 26G ומזרק חד פעמי בנפח 1 מ"ל כדי להרטיב את הגולגולת. השתמשו במגבות נייר כדי לספוג עודפי מים.
- הזריקו חומר צימוד לחלל שבין השתל לטבעת המודפסת בתלת-ממד באמצעות מחט 26G ומזרק חד פעמי בנפח 1 מ"ל כדי להקל על התפשטות קלה של אולטרסאונד מהמתמר למוח.
- חבר את השתל לכבל התיקון של הסיב האופטי. הכניסו בזהירות את המתמר לאזור המלא בחומר צימוד והדקו היטב את הברגים.
- מקם את העכבר בשדה פתוח ואפשר לו להתעורר. חבר את המתמר למערכת העירור העל-קולי וחבר את כבל התיקון של הסיב האופטי למערכת הקלטת הסיב האופטי, מה שמאפשר חופש תנועה לעכבר.
הערה: כבל התיקון של הסיב האופטי הוא באורך של 2 מ' וקוטר של 1.25 מ"מ. עוצמת האור עבור ערוץ 405 היא 20 μW, ועבור ערוץ 470 היא 40 μW. - הפעל הן את מכשיר העירור העל-קולי והן את מערכת הקלטת הסיב האופטי על מנת לסנכרן אפנון עצבי על-קולי עם הקלטת אות סיב אופטי.
תוצאות
התפלגות הלחץ האקוסטי בשדה האקוסטי החופשי במישור XY ובמישור XZ הממוקם במרחק של 3.4 מ"מ מפני השטח של המתמר, בהתאם למיקום הגרעין התלמי הקדמי של העכבר, מוצגת באיור 2B,C. מדידות אלה נרכשו באמצעות סריקה הידרופונית בתחום XY ותחום XZ. התפלגות הלחץ האקוסטי בשדה האקוסטי הטרנס-גולגולתי במישור XY ובמישור XZ הממוקם במרחק של 3.4 מ"מ מפני השטח של המתמר מוצגת באיור 2D,E. הלחץ האקוסטי החופשי שנמדד הוא 730 kPa, והלחץ האקוסטי התוך גולגולתי שנמדד הוא 580 kPa עבור תדר מרכזי של 500 kHz. עובי הגולגולת שנמדד הוא כ-0.2 מ"מ בממוצע. אנו מניחים שיחס הפיזור הוא ליניארי בקירוב, ולכן לגולגולת יש מקדם הנחתה של 19.98 dB/cmMHz. המתמר קל המשקל, השוקל כ-1.66 גרם, מאפשר לעכבר לנוע בקלות, ומקל על התבוננות בהתנהגות התגובה של העכבר תחת FUN ושובל התנועה.
אותות הסיב האופטי נקלטו תחת FUN (איור 4B,D), כאשר המעטפת הייתה מרובעת וסינוסואידית, בהתאמה. חמישה עכברים זכרים שימשו בניסוי. הריבוע נמשך 300 מילישניות, בעוד שהסינוסואידל הרציף נמשך 471 מילישניות, מה שיכול להבטיח שהאנרגיה הכוללת תהיה זהה בשני FUNs שונים (איור 4A,C). שיפור באות הסיב האופטי מצביע על עלייה בפעילות העצבית. התגובה העצבית מהירה תחת FUN, מה שמרמז על כך שלמתמר יש מספיק אנרגיה ויכולות מיקוד מצוינות.
איור 1: תהליך הייצור של המתמר. זה כרוך, בתורו, חיבור יריעה פיאזואלקטרית לחוט ולאחר מכן אריזת אותו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הגדרת ואפיון שדה אולטרסאונד למתמר אולטרסוני. (A) ההגדרה למדידת שדה אולטרסאונד כוללת הידרופון, מערכת מנועים, תוכנת בקרה, מחולל אותות ואוסילוסקופ. (ב, ד) תרשים סכמטי של מדידות מתמרים על-קוליים בשדות אקוסטיים חופשיים וטרנס-גולגולתיים ותוצאות מדידות שדה קול רוחבי ואורכי. (ג, ה) דיאגרמה של שדה הקול הרוחבי במיקום מוקד המתמר, כאשר הקו האדום מציין את שדה הקול במיקום -3 dB. (ו, ז) דיאגרמת צורת גל של הפלט שנמדד על ידי ההידרופון עבור המתמר. השטח בתוך התיבה המקווקו האדום והשטח בתוך התיבה המקווקו הכחולה מייצגים את התקופות לפני שצורת הגל מגיעה למשרעת יציבה ואת תקופת הצלצול של המתמר בסוף, בהתאמה. האזור בתוך התיבה המקווקו הכתום מייצג את החלק היציב של צורת הגל, המשמש לחישוב משרעת הלחץ, המסומנת כ-p. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוכנת חישוב ופרמטר אולטרסאונד. (A) ממשק חישוב פרמטר אולטרסאונד ביתי. MI, אניsppa, ואניspta מחושבים. ניתן היה להשיג את הממשק https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation. (B) סכמות של צורות גל לחץ אולטרסאונד. נעשה שימוש במעטפת דופק סינוסואידלית ובמעטפת דופק מלבנית. התקופה (T) מייצגת את משך הזמן של מחזור יחיד של תדירות ההפעלה. פולס, המכונה סוניקציה רציפה יחידה, נמשך משך זמן מוגדר הנקרא משך הדופק (PD). בדרך כלל, פולסים חוזרים על עצמם ברצף המכונה רכבת דופק. מרווח הזמן בין שתי פעימות רצופות ברכבת פולס מכונה מרווח חזרה על הדופק (PRI), המחושב כגומלין של תדירות חזרת הדופק (PRF). לכל רצף הפעימות, המכונה רכבת הדופק, יש משך זמן מסוים המכונה משך רכבת הדופק. זמן מרווח הזמן פירושו משך הניסיון היחיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אות של פוטומטריית סיבים במהלך FUN. (א, ג) פרמטרים של אולטרסאונד עטופים בריבוע (B) וסינוסואידלי (D). (ב, ד) אות הפוטומטריה של הסיב בהתאמה במהלך FUN של (A) ו-(C). הצל הירוק הוא משך הזמן של FUN. הקו המוצק הוא הממוצע, והגוונים של כחול ואדום הם הממוצע וסטיית התקן של אותות מוקלטים. חמישה עכברים זכרים שימשו בניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
דיון
גישה זו משלבת FUN עם הקלטת פוטומטריה אופטית, ומאפשרת לחקור את תפקוד המוח של העכבר ואת מנגנון in vivo FUN. התהליך התפעולי המלא, החל מייצור מתמרים ועד להליכים כירורגיים, מתואר, ומאפשר לחוקרים לבצע FUN באופן עצמאי מחוץ לשטח.
היבט חיוני אחד של הפרוטוקול הוא לוודא שהשתל האופטי מוכנס בצורה חלקה לתוך המתמר, הצמנט הדנטלי לאורך הגולגולת דק מספיק לחדירת אולטרסאונד למוח, השתל האופטי מחובר היטב לגולגולת כדי למנוע תזוזה במהלך הניסוי, ותפוקת האנרגיה של המתמר מספיקה לנוירומודולציה יעילה. עובי הצמנט הדנטלי המקיף את השתל צריך להיות שווה או קטן מקוטר חור המתמר. לכן, מומלץ להשתמש באותו צינור פוליפרופילן הן לתהליך ייצור המתמרים והן לניתוח. מכיוון שצינור פוליפרופילן אינו נדבק לצמנט דנטלי, הוא נבחר לעצב את המלט הדנטלי סביב השתל, עם חתך צדדי, כדי להקל על הסרה קלה של צינור הפוליפרופילן.
הקלטה אלקטרופיזיולוגית והקלטת פוטומטריה אופטית הן טכנולוגיות נפוצות לניטור פעילות המוח in vivo, המציעות רזולוציה טמפורלית מרחבית גבוהה. עם זאת, הקלטה אלקטרופיזיולוגית לוכדת את אות פעילות הירי מתאי עצב המחוברים ישירות לאלקטרודות. גלי האולטרסאונד יכלו להרטיט ישירות את האלקטרודות, ולגרום להשפעות מבלבלות מיותרות. למרבה המזל, טכנולוגיית פוטומטריית הסיבים, שהיא פחות פולשנית, לוכדת את פעילות הנוירונים שמתחתיה, מה שיכול להפחית את ההשפעה המבלבלת של רטט אולטרסאונד על השתל 7,19,26. כתוצאה מכך, הטכנולוגיה של נוירומודולציית אולטרסאונד ממוקדת בו זמנית ורישום פוטומטריה של סיבים בעכברים הנעים בחופשיות מאפשרת לחקור מנגנוני in vivo של נוירומודולציה על-קולית ומאפשרת תצפית על התגובות ההתנהגותיות של העכברים ללא הפרעה של הרדמה.
עם זאת, הרזולוציה המרחבית של פוטומטריית סיבים מוגבלת מכיוון שהיא אינה מסוגלת לנטר את פעילותם של תת-תאיים ומיקרו-מעגלים24. יתר על כן, הוא מספק ייצוג עקיף של פעילות עצבית שכן הוא אינו רושם ישירות את האותות החשמליים המיוצרים על ידי פעילות עצבית.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32371151), מכון המחקר גואנגדונג לחדשנות ברמה גבוהה (2021B0909050004), קרן המחקר השיתופית של מועצת מענקי המחקר של הונג קונג (C5053-22GF), קרן המחקר הכללית (15224323 ו- 15104520), קרן טכנולוגיית החדשנות של הונג קונג (MHP/014/19), מימון פנימי מהאוניברסיטה הפוליטכנית של הונג קונג (G-SACD ו- 1-CDJM), והקרן למדעי הטבע של מחוז ליאונינג - הקרן הפתוחה המשותפת של מעבדת המפתח הממלכתית לרובוטיקה (2022-KF-22-03). המחברים רוצים להודות למתקן ולתמיכה הטכנית ממתקן המחקר האוניברסיטאי במדעי החיים (ULS) וממתקן המחקר האוניברסיטאי במדעי המוח ההתנהגותיים והמערכות (UBSN) של האוניברסיטה הפוליטכנית של הונג קונג.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מזרק חד פעמי 1 מ"ל | DOUBLE-DOVE | 1 מ"ל | מחטי הזרקה |
| 26 מד מחט | Jin mao | JM-J02 | מחטי הכנה |
| 70% אתנול | דונג דה אלכוהול | 0.7 | חיטוי |
| אלכוהול | דונג דה אלכוהול | 0.75 | נקה את משטח המתמר |
| מחבר אגוז כידון Risym | 75-5 | הקצה השני של חוט החיבור מחובר למכשיר העירור האולטראסוני | |
| טבעת נחושת | Guowei חומרי מתכת | קוטר חיצוני, עובי דופן, גובה (8 מ"מ, 0.2 מ"מ, 8 מ"מ) | מארז המגן החיצוני של |
| המזרק החד פעמי | DOUBLE-DOVE | 1 מ"ל | שאיפת שרף אפוקסי מאפשרת להזריק כמויות קטנות ומדויקות לתוך צינור הנחושת |
| סרט דו צדדי | 3M | 3M55236 | הוא משמש לקיבוע המתמר והחוט כדי להבטיח שדבק הכסף אפוקסי לא יזוז לפני ייבוש |
| מלחם אלקטרוני | Victor | 868A+ | החוטים המולחמים מחוברים |
| לדבק שרף אפוקסי | Kraft | K 9741 | אטום את החלק האחורי של המתמר |
| משחת כסף אפוקסי | Vonroll | CB-052 | החוט מחובר לקוטב החיובי והשלילי של יריעת הקרמיקה הפיזואלקטרית וההתנגדות נשמרת נמוכה |
| פיידר | JOQO | YP-7021 | הסר את שיער הראש של |
| מכונת הרדמת גז | RWD | R500 | הוא משמש להרדמה ביריעת זכוכית עכברים |
| זכוכית מרובעת | 80 מ"מ*80 מ"מ | ניתן להשתמש במשטח הפעלה זמני להנחת קרמיקה וחוטים פיזואלקטריים לציפוי פני לוח הזכוכית בסרט דו צדדי | |
| קטמין/קסילזין | Shutai/shengxin | Zoletil 50/2 מ"ל*10 | להרדים את חומר הצימוד הרפואי של העכבר |
| Bestman | 120 גרם | המצמד משמש כמדיום להובלת עכבר אות האולטרסאונד | |
| Bai shi tong | GCaMp6 | נבדק | |
| משחת עיניים | יון ג'י | 0.5% x 2.5 גרם x1 | מרטיב את אזור העיניים למניעת עיוורון |
| צלחת פיזואלקטרית | Jiaming Electronics מפעל | קוטר, נקבוביות, עובי (7 מ"מ, 3 מ"מ, 3.56 מ"מ) | האנרגיה החשמלית נפלטת בצורה של צינור פוליפרופילן אולטרסאונד |
| מפעל צינורות Baihao | קוטר חיצוני, קוטר פנימי, אורך (3 מ"מ, 2 מ"מ, 500 מ"מ) | מנע משרף האפוקסי לסתום את החורים ולהשאיר את החורים | |
| povidone-iodine | lefeke | 500ml | לחטא |
| שיא אות של סיבים | Thinker Tech Nanjing Biotech | מערכת הקלטת סיבים אופטיים חד-ערוצית בשלושה צבעים | הקלט אותות פוטומטריית סיבים |
| מסגרת סטריאוטקסית | RWD | 68805 | תקן את ראש העכבר ומקם את אזור המוח |
| מלח סטרילי | Shijiazhuang si yao | 500ML, 4.5g | כממס, ממיס את גירוי התרופות |
| של אולטרסאונד | טכנולוגיית מוח עמוק | DB-USNM | מספק קלט יציב למכונת השקילה של המתמר |
| Qin bo shi | 1718 | שקול את חוט העכבר | |
| Jinpeng Cable Factory | 0.3 מ"מ2 | מתח מסופק למתמר |
מקורות
- Wang, J. B., et al. Focused ultrasound for noninvasive, focal pharmacologic neurointervention. Front Neurosci. 14, 514541(2020).
- Bystritsky, A., et al. A review of low-intensity focused ultrasound pulsation. Brain stimulation. 4 (3), 125-136 (2011).
- Di Ianni, T., et al. High-throughput ultrasound neuromodulation in awake and freely behaving rats. Brain stimulation. 16 (6), 1743-1752 (2023).
- Legon, W., et al. Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans. Nat Neurosci. 17 (2), 322-329 (2014).
- Badran, B. W., et al. Sonication of the anterior thalamus with mri-guided transcranial focused ultrasound (tfus) alters pain thresholds in healthy adults: A double-blind, sham-controlled study. Brain stimulation. 13 (6), 1805-1812 (2020).
- Yaakub, S. N., et al. Transcranial focused ultrasound-mediated neurochemical and functional connectivity changes in deep cortical regions in humans. Nat Comm. 14 (1), 5318(2023).
- Murphy, K. R., et al. A tool for monitoring cell type-specific focused ultrasound neuromodulation and control of chronic epilepsy. Proc Natl Acad Sci. 119 (46), e2206828119(2022).
- Niu, X., Yu, K., He, B. Transcranial focused ultrasound induces sustained synaptic plasticity in rat hippocampus. Brain Stimulation. 15 (2), 352-359 (2022).
- Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
- Yang, Y., et al. Induction of a torpor-like hypothermic and hypometabolic state in rodents by ultrasound. Nat Metabol. 5 (5), 789-803 (2023).
- Kubanek, J., et al. Remote, brain region-specific control of choice behavior with ultrasonic waves. Sci Adv. 6 (21), 4193(2020).
- Deffieux, T., et al. Low-intensity focused ultrasound modulates monkey visuomotor behavior. Curr Biol. 23 (23), 2430-2433 (2013).
- Gaur, P., et al. Histologic safety of transcranial focused ultrasound neuromodulation and magnetic resonance acoustic radiation force imaging in rhesus macaques and sheep. Brain stimulation. 13 (3), 804-814 (2020).
- Fouragnan, E. F., et al. The macaque anterior cingulate cortex translates counterfactual choice value into actual behavioral change. Nat Neurosci. 22 (5), 797-808 (2019).
- Folloni, D. Ultrasound neuromodulation of the deep brain. Science. 377 (6606), 589-589 (2022).
- Verhagen, L., et al. Offline impact of transcranial focused ultrasound on cortical activation in primates. Elife. 8, e40541(2019).
- Yang, P. -F., et al. Neuromodulation of sensory networks in monkey brain by focused ultrasound with mri guidance and detection. Sci Rep. 8 (1), 7993(2018).
- Yu, K., Niu, X., Krook-Magnuson, E., He, B. Intrinsic functional neuron-type selectivity of transcranial focused ultrasound neuromodulation. Nat Comm. 12 (1), 2519(2021).
- Zhu, J., et al. The mechanosensitive ion channel piezo1 contributes to ultrasound neuromodulation. Proc Natl Acad Sci. 120 (18), e2300291120(2023).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Shen, W., et al. M4 muscarinic receptor signaling ameliorates striatal plasticity deficits in models of l-dopa-induced dyskinesia. Neuron. 88 (4), 762-773 (2015).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nat Meth. 16 (7), 649-657 (2019).
- Inoue, M., et al. Rational engineering of xcamps, a multicolor geci suite for in vivo imaging of complex brain circuit dynamics. Cell. 177 (5), 1346-1360 (2019).
- Legaria, A. A., et al. Fiber photometry in striatum reflects primarily nonsomatic changes in calcium. Nat Neurosci. 25 (9), 1124-1128 (2022).
- Kamimura, H. A., et al. Focused ultrasound neuromodulation of cortical and subcortical brain structures using 1.9 mhz. Med Phys. 43 (10), 5730-5735 (2016).
- Xian, Q., et al. Modulation of deep neural circuits with sonogenetics. Proc Natl Acad Sci. 120 (22), e2220575120(2023).
- Mohammadjavadi, M., et al. Elimination of peripheral auditory pathway activation does not affect motor responses from ultrasound neuromodulation. Brain stimulation. 12 (4), 901-910 (2019).
- Harris, G. R., et al. Hydrophone measurements for biomedical ultrasound applications: A review. IEEE Trans Ultrasonics Ferroelect Freq Cont. 70 (2), 85-100 (2022).
הדפסות חוזרות והרשאות
