הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67093

⸱

23 באוגוסט 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Michigan State University, 2Department of Kinesiology, Michigan State University

במאמר זה

סיכום

מחקרים ביואנרגטיים ומטבוליים על מיטוכונדריה חשפו את תפקידם הרב-גוני במחלות רבות, אך שיטות הבידוד של אברונים אלה משתנות. השיטה המפורטת כאן מסוגלת לטהר מיטוכונדריה באיכות גבוהה ממקורות רקמה מרובים. האיכות נקבעת על ידי יחסי בקרת נשימה ומדדים אחרים המוערכים עם רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

תקציר

בידוד מיטוכונדריאלי נהוג מזה עשרות שנים, בעקבות נהלים שנקבעו על ידי חלוצים בתחומי הביולוגיה המולקולרית והביוכימיה לחקר ליקויים מטבוליים ומחלות. איכות מיטוכונדריאלית עקבית נחוצה כדי לחקור כראוי פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית וביו-אנרגטיקה; עם זאת, שיטות בידוד רבות ושונות שפורסמו זמינות לחוקרים. למרות שאסטרטגיות ניסוי שונות דורשות שיטות בידוד שונות, העקרונות והנהלים הבסיסיים דומים. פרוטוקול זה מפרט שיטה המסוגלת לחלץ מיטוכונדריה מצומדים היטב ממגוון מקורות רקמה, כולל בעלי חיים קטנים ותאים. השלבים המתוארים כוללים דיסקציה של איברים, טיהור מיטוכונדריה, כימות חלבונים ובדיקות בקרת איכות שונות. מדד בקרת האיכות העיקרי המשמש לזיהוי מיטוכונדריה באיכות גבוהה הוא יחס בקרת הנשימה (RCR). RCR הוא היחס בין קצב הנשימה במהלך זרחן חמצוני לקצב בהיעדר ADP. נדונים מדדים חלופיים. בעוד ערכי RCR גבוהים ביחס למקור הרקמה שלהם מתקבלים באמצעות פרוטוקול זה, מספר שלבים יכולים להיות אופטימליים כדי להתאים לצרכים האישיים של החוקרים. הליך זה חזק והביא באופן עקבי למיטוכונדריה מבודדים עם ערכי RCR מעל הממוצע במודלים של בעלי חיים ובמקורות רקמות.

מבוא

מיטוכונדריה הם אברונים תת-תאיים המבססים תנאים אנרגטיים ציטופלזמיים המותאמים לתפקודי תאים ספציפיים. בעוד שמחקרים ברמת התא, הרקמות והאורגניזמים יכולים לספק תובנות לגבי תפקוד המיטוכונדריה, בידוד האבונים מציע רמה של שליטה ניסיונית שאינה אפשרית אחרת. בידודים מיטוכונדריאליים מבוצעים מאז שנות ה-40 של המאה ה-20, ומאפשרים מחקרים מכניסטיים של חילוף חומרים ונשימה במגוון תאים ורקמות 1,2. הרלוונטיות ההיסטורית של המיטוכונדריה מתועדת היטבגם 3. בתור היצרנים העיקריים של ATP, מיטוכונדריה ממלאים תפקידי מפתח רבים החיוניים לתפקוד מיטבי של התאים והאיברים4. בתוך המטריצה המיטוכונדריאלית, הסובסטרטים מחומצנים על ידי מחזור TCA, ומייצרים מקבילות מחזרים ונושאי אלקטרונים ניידים כגון NADH ו- UQH2 5,6. ציטוכרום C הוא נשא האלקטרונים הנייד השלישי ברשת התגובה הביוכימית המיטוכונדריאלית7. מולקולות אלה מחומצנות לאחר מכן על ידי קומפלקסים טרנסממברנליים של מערכת הובלת האלקטרונים (ETS) המשובצים בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי8. תגובות חמצון-חיזור של ETS מצומדות לטרנסלוקציה של פרוטונים מהמטריצה למרחב הבין-ממברנלי. תהליכים אלה יוצרים שיפוע פרוטונים אלקטרוכימי המשמש לפוספורילט ADP עם Pi על ידי F1F0 ATP סינתאז לייצור ATP 9,10. ניתן לחקור את התהליכים האינדיבידואליים המתרחשים בכל מתחם באמצעות ספירומטריה ברזולוציה גבוהה באמצעות אלקטרודות מסוג קלארק או מבחני צריכת חמצן של מיקרו-פלטות11,12. בנוסף, מודלים של מחלות וטיפולים באמצעות מיטוכונדריה מבודדת יכולים לקבוע את ההשפעה או החשיבות של תפקוד המיטוכונדריה בהתקדמות של פתולוגיות מסוימות. זה הוכח פורה בתחום הקרדיולוגיה, שם שינויים באספקת דלק ומצע שימשו כדי להבהיר כיצד תפקוד לקוי של המיטוכונדריה משפיע על אי ספיקת לב 13,14,15,16. מיטוכונדריה ידועים גם כמשפיעים על התפתחות מצבי מחלה אחרים כגון סוכרת, סרטן, השמנת יתר, הפרעות נוירולוגיות ומיופתיות17,18. לכן, השימוש במיטוכונדריה מבודדים או מטוהרים מאפשר חקירה מכניסטית של חילוף חומרים חמצוני וייצור ATP ברקמת המקור.

לא חסרים פרוטוקולים לבידוד מיטוכונדריאלי בשל חשיבותם במחקר הביו-אנרגטי. בנוסף, ניתן למצוא שיטות ספציפיות מאוד המותאמות לתת-אוכלוסיות של מיטוכונדריה בתוך רקמות ותאים19,20. השלבים הפרוצדורליים הבסיסיים דומים בין שיטות בידוד, אך ניתן לבצע שינויים בהרכב החיץ, שלבי הומוגניזציה וסחרורי צנטריפוגות כדי לשפר את כמות ואיכות המיטוכונדריה. שינויים בהיבטים אלה מבוססים על הדרישה המטבולית של הרקמה, תפקוד איברים כללי, צפיפות מיטוכונדריה וגורמים אחרים. ברקמות כגון הכבד ושרירי השלד, הומוגנייזרים ידניים משמשים לשמירה על שלמות המיטוכונדריה ולהגבלת הנזק לקרומי המיטוכונדריה21. עם זאת, בעת בידוד מהכליות, פרוטוקולים מסוימים מציעים להשתמש בהומוגניזציה מונעת ידנית או ערכות מסחריות כדי להניב תוצאות טובות יותר22. למרות ששתי השיטות מניבות מיטוכונדריה פונקציונלית, איכות האברונים עלולה להיפגע בגלל הזמן הנוסף שלוקח להשלים בידודים באמצעות פרוטוקולים אלה. צנטריפוגה חיונית גם למיצוי חלבון מיטוכונדריאלי, שכן היא מפרידה רכיבים תאיים כגון גרעינים ואברונים אחרים מהמיטוכונדריה23. בתהליך הבידוד מתלבטים האם יש ליישם צנטריפוגות דיפרנציאליות או מבוססות צפיפות כדי להשיג מבודדים טהורים יותר24. בעוד שצנטריפוגת צפיפות יכולה להפריד מיטוכונדריה מאברונים בעלי כבידה סגולית דומה, כגון פרוקסיזומים, אין זה מבוסס היטב אם מיטוכונדריה משיטות אלה מייצגות טוב יותר את תפקוד אברוני האתר בהשוואה למיטוכונדריה שבודדו באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. בתחום הפיזיולוגיה של המיטוכונדריה, צנטריפוגה מבוססת צפיפות היא מועדפת וניתן לשנות אותה בקלות כדי להגביר את טוהר הבידוד. יש לשקול לפני הניסויים אם משולבים שינויים בכוחות הג'י, משך הצנטריפוגות ומספר סיבובי הצנטריפוגות בשל השפעתם על טיהור המיטוכונדריה. יתר על כן, תרחיף מיטוכונדריאלי, ככל הנראה השלב המכריע ביותר במהלך בידוד, שונה מאוד בין מחקרים, עם שימוש בגירוד, ערבוב מבוסס מערבולת, או הומוגניזציה 23,25,26. השעיה מכנית מסוג זה עלולה להיות שוחקת מדי ולפגוע בשלמות הממברנה של המיטוכונדריה. מסיבה זו, יש לבצע כביסה עדינה כדי לתקן זאת. למרות שפע המודולציות והמתודולוגיות המוצעות, ישנם פחות פרוטוקולים מקיפים עם יכולת שחזור והתאמה גבוהה למודלים של מכרסמים.

השיטות המתוארות כאן מתארות פרוטוקול מפורט, חזק וניתן לשחזור שמניב מיטוכונדריה מטוהרת ומצומדת היטב מרקמת לב של בעלי חיים קטנים. כפי שהוכח, ניתן להתאים שיטה זו בקלות כדי להתאים לצרכים הספציפיים של כל ניסוי ו / או סביבת מעבדה לבידוד מיטוכונדריה מכליות, כבד ותאים בתרבית. ניתן לבצע שינויים נוספים כדי לבודד מיטוכונדריה מרקמות ובעלי חיים אחרים שאינם מפורטים כאן. מתכוני חיץ המשמשים לכל הבידודים מסופקים וניתן לשנות אותם במידת הצורך. בדומה לפרוטוקולים אחרים שפורסמו, הומוגניזציה ממונעת וצנטריפוגה דיפרנציאלית מיושמות; עם זאת, מתבצעות התאמות הן לזמן הגזירה והן לכוח שבו הדגימות עוברות צנטריפוגה כדי לספק באופן עקבי מבודדים מיטוכונדריאליים באיכות גבוהה, בהתאם למקור הבידוד. יש לציין כי פרוטוקול זה שונה מאחרים בכך שהוא משתמש בשטיפה עדינה באמצעות פיפטינג כדי להשהות מחדש מיטוכונדריה כדורית, מה שעוזר לשמור על שלמות קרום המיטוכונדריה ולשמור על הפונקציונליות הכוללת של האברונים. חלבון מיטוכונדריאלי מכומת על ידי קביעת חלבון כולל או על ידי מדידת פעילות סינתאז ציטראט. התועלת והישימות הרחבה של שיטת בידוד זו נתמכות גם על ידי ערכי יחסי הבקרה הנשימתית (RCR) המושגים על פני אורגניזמים ומקורות רקמות שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

השימוש והטיפול בכל בעלי החוליות בוצעו בהתאם לפרוטוקולים מאושרים שנבדקו והתקבלו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת מישיגן. פרוטוקול זה תוכנן תוך שימוש בשרקנים לבקנים זכרים ונקבות כאחד של הארטלי וחולדות Sprague Dawley (SD). לצורך בידוד מיטוכונדריה לבבית משרקנים, הוקרבו בעלי חיים בגילאי 4-6 שבועות (300-450 גרם). מיטוכונדריה לבבית מחולדות SD משני המינים התקבלו בין הגילאים 10-13 שבועות (250-400 גרם). מתכונים למאגרים מתוארים בטבלה 1 ויש להכין אותם מראש. פרטים על הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה ניסיונית

  1. לפני תחילת הבידוד, תייגו שני צינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל כ"ספינים 1 ו -2" ו"ספין 3".
  2. מניחים צינורות, חיץ בידוד מופשר טרי (IB), מספריים טחונים חדים, בדיקת הומוגניזציה שהורכבה, וכוס 5 מ"ל או מיכל בגודל שווה ערך על קרח.
  3. הניחו את חיץ הנשימה הטרי המופשר (RB) באינקובטור כדי להתחמם לקראת בדיקות הנשימה הבאות.
  4. מצננים מראש צנטריפוגה בקירור ל-4°C.
  5. ודא כי כל הציוד מסודר 20 μL של 7-15 U/mg פרוטאז מ Bacillus licheniformis נוסף לצינור שכותרתו "ספינים 1 ו 2".
  6. הגדר מערכת לחץ תלוית כבידה לזילוח באמצעות קנולציה באמצעות חיץ Cardioplegia (CB, טבלה 1), צינורית זכוכית וצינורות פלסטיק עם שסתום סטופקוק מחובר.
  7. סדרו את כלי הניתוח ושלבו מספריים ומלקחיים מתאימים לדיסקציה וקנולציה של הלב.
    הערה: כל המים צריכים להיות באיכות טהורה (18.2 MΩ·cm)

2. דיסקציה של רקמות

  1. הזריקו לבעלי חיים הפרין סולפט סטרילי תוך צפקי במינון של 500 U/kg.
  2. הניחו לבעל החיים לשבת בתא הזירוז למשך 15 דקות לאחר מתן הפרין. במהלך תקופה זו, ספקו 2 ליטר לדקה של גז O2 טהור כדי לחמצן באופן מלא את בעלי החיים, להרגיע אותם ולמזער כל לחץ שעלול להיות בעל השלכות שליליות על רקמות עניין.
  3. התחל השראת הרדמה על ידי זרימה רציפה של isoflurane ב 0.5%. לאחר דקה, להגדיל ל 1%. המשיכו להגדיל ב-1% בכל דקה עד שמגיעים ל-5%. פעם אחת ב 5%, לחכות 1 דקה ולפקח על דפוס הנשימה של החיה.
  4. לאחר שהנשימה הואטה ונעשית מאומצת (בערך בסימן 6.5 דקות) כבו את זרימת האיזופלורן והחמצן.
  5. הוציאו במהירות את בעל החיים מתא האינדוקציה ובדקו עומק הרדמה מתאים על ידי לחיצת כפה ובדיקת רפלקס הקרנית. אם בעל החיים מגיב לאחד הגירויים, החזירו אותו לתא הזירוז, קראו את ההרדמה וחזרו על בדיקת עומק ההרדמה.
  6. ברגע שמגיעים לעומק הנכון של ההרדמה, ערפו במהירות את ראשו עם גיליוטינה כדי להחמיר את עמוד השדרה הצווארי והניחו את הגוף הנוטה על קרח.
  7. בצע שני חתכים אנכיים מקבילים מעצם הבריח המתקדמים לאורך כלוב הצלעות הצידי לאורך בית החזה. ודא כי החתכים עמוקים מספיק כדי לחתוך דרך הצלעות על בית החזה לרוחב, אבל להימנע נזק מבנים intrathoracic כגון הלב או כלי גדול.
    הערה: גודל החתך האנכי תלוי בבעל החיים שבו משתמשים. אם אתם משתמשים בשרקנים וחולדות, חתכו לסרעפת (כ-6.35 ס"מ לחולדות ו-11 ס"מ לשרקנים). אם אתם משתמשים בעכברים, בצעו כריתת בית חזה סטנדרטית27.
  8. חשוף את הלב באמצעות hemostat כדי לעקור את בית החזה הקדמי ולארוז את חלל החזה החשוף עם קרח. צעד זה ממזער את זמן האיסכמיה החמה ומשפר את הכדאיות של האברונים המבודדים.
  9. השתמשו בפינצטה כדי לנתח בבוטות את בלוטת התימוס וקרום הלב ולחשוף את הלב במלואו.
  10. באמצעות מלקחיים, להחיל מתיחה נחותה עדינה על הלב כדי לחשוף ולזהות את אבי העורקים. אבי העורקים הוא הכלי הגדול העבה ביותר המסתעף מבסיס הלב. כלי דם גדולים אחרים, כגון וריד הריאתי, הם שקופים יותר באופן ניכר מאשר אבי העורקים.
  11. חותכים את אבי העורקים כ-4-6 מ"מ מעל שורש אבי העורקים אך מתחת לנקודות ההסתעפות של התרדמה.
  12. לערבב את אבי העורקים ולחורר את הלב28,29 בתמיסת קרדיופלגיה קרה כקרח (CB) באמצעות ראש לחץ תלוי כבידה עד שהעורקים הכליליים מנוקים מדם והאיבר נראה מולבן.
    הערה: עבור מכרסמים גדולים, קוטר צינורית של 1.8-2.2 מ"מ עובד היטב, ואילו עבור מכרסמים קטנים יותר, טווח קוטר של 1.4-1.8 מ"מ מומלץ. רטרו זילוח צריך לקחת לא יותר מ 15-30 s עבור כלי הדם הכליליים לנקות דם.
  13. בודדו את שריר הלב של החדר על ידי ניתוח האטריה, רקמת המסתם הסחוסית ורקמות השומן.
  14. מניחים את החדרים בתוך 10 מ"ל צוננת מראש המכילה 0.1-0.2 מ"ל IB קר כקרח.
  15. טחון רקמה עם מספריים כירורגיים חדים עד חתיכות הם כ 1 מ"מ3.

3. טיהור מיטוכונדריה וכימות חלבונים

  1. מעבירים את הרקמה הטחונה לתוך צינור הצנטריפוגה המצונן מראש שכותרתו "ספינים 1 ו-2" המכיל את תמיסת הפרוטאז.
  2. הוסף IB קר כקרח לנפח סופי של 25 מ"ל.
  3. באמצעות הומוגנייזר רוטור-סטטור ידני ממונע, מפזרים את הרקמה ב-18,000 סל"ד על קרח למשך 20-25 שניות.
  4. צנטריפוגה רקמה הומוגנית בצינור שכותרתו "ספינים 1 ו -2" ב 8,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  5. יש להשליך את הסופרנאטנט (המכיל פרוטאז) על ידי מזיגו לפח הפסולת ולשטוף בעדינות את הגלולה עם 5 מ"ל IB כדי להסיר שאריות פרוטאז.
  6. לאחר השלכת השטיפה, יש להשהות מחדש את הגלולה עם IB טרי קר כקרח לנפח סופי של 25 מ"ל על ידי מערבולת עדינה.
  7. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  8. הסר את supernatant (מכיל מיטוכונדריה) על ידי מזיגה עדינה לתוך צינור 50 מ"ל צונן מראש עם הכיתוב "ספין 3". בזמן המזיגה, יש להקפיד להימנע מפירוק החלק העליון הרופף של הכדורית. כחלופה, פיפטה העברה או סטריפט ניתן להשתמש כדי לאסוף את supernatant.
  9. צנטריפוגה את supernatant ב 8000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  10. השליכו את הסופרנאטנט שנוצר ושמרו על הכדורייה המכילה מיטוכונדריה.
  11. השתמשו במגבון ללא סיבים כדי לספוג עודפי סופרנאטנט מהדופן הפנימית של הצינור, תוך הקפדה שלא להפריע לכדורית. שמור את הגלולה ב 4 ° C על קרח ככל האפשר.
  12. כדי להשהות מחדש את המיטוכונדריה, הוסיפו 80 μL של IB קר כקרח לתחתית הצינור. השהה מחדש בעדינות את הגלולה על ידי שטיפה חוזרת ונשנית של IB מעל הכדור.
  13. כדי למנוע יצירת בועות, להגדיר micropipette לשאוף ולספק בין 40-60 μL של נפח.
  14. ככל שהכדוריות המיטוכונדריאליות מתפזרות, הגדילו את נפח המיקרופיפטה כדי להשהות מחדש ביעילות את המיטוכונדריה הכדורית. הימנעו מלגעת בגלולה עם קצה הפיפטה, והימנעו מיצירת בועות.
  15. לאחר השהייה מחדש, העבירו את המיטוכונדריה לצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש ותייגו אותו כמיטוכונדריה מלאי. רשום לעצמך את נפח המתלים הכולל.
  16. כדי לקבוע את ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי בדגימה, יש לבצע בדיקת חלבון כוללת באמצעות בדיקות החלבון הידועות BCA או Bradford כפי שהוגדרו בהוראות היצרן.
    הערה: אסטרטגיה חלופית או משלימה להערכת התשואה היא לקבוע את פעילות הסינתאז ציטראט. לשם השוואה, ניתן לכמת את התוכן המיטוכונדריאלי על ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר ב- Vinnakota et al.30.

4. בדיקות בקרת איכות

  1. בצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש, לדלל את מלאי המיטוכונדריה לריכוז העבודה הרצוי עם IB.
    הערה: מלאי המיטוכונדריה מדולל ל-40 מ"ג/מ"ל כדי לעבוד בריכוז הסופי של 0.1 מ"ג/מ"ל לבדיקות רספירומטריה בעת שימוש במבודדים מרקמת הלב.
  2. יש לשטוף תאי אוקסיגרף, פקקים ומזרקי מיקרוליטר עשר פעמים במים מזוקקים כדי לנקות אותם לפני השימוש בבדיקות ספירומטריה.
  3. כדי לבדוק את הכדאיות והאיכות של מבודדים מיטוכונדריאליים, יש להעמיס 2.3 מ"ל של חיץ נשימה (RB) לתוך תאי אוקסיגרף ולאפשר לאות צריכת החמצן להתאזן ב-37°C למשך כ-10 דקות או כאשר הקצב קרוב ל-0.
  4. ברגע שהאות מאוזן יש לדחוף כלפי מטה את הפקקים ולשאוף את החיץ העודף שיוצא מהנימים של הפקק.
  5. הוסף 1 mM EGTA באמצעות מזרק microliter כדי chelate כל שאריות סידן במאגרים או דגימה מיטוכונדריאלית.
  6. כדי לתדלק את הנשימה, להוסיף 5 mM נתרן pyruvate ו 1 mM L-malate.
  7. לאחר הוספת המצע, הוסיפו בולוס של מיטוכונדריה מדוללת כדי להשיג ריכוז עבודה ולאפשר נשימה למשך 5 דקות. תקופה זו נקראת LEAK או State 2 respiration.
  8. בסימן 5 דקות, הוסיפו בולוס של 500 מיקרומטר ADP כדי להתחיל נשימה במצב 3, המכונה גם OXHPOS, ואפשרו למיטוכונדריה לנשום עד לאנוקסיה.
  9. חישוב יחס בקרת הנשימה (RCR) על-ידי חלוקת הקצב המרבי של צריכת חמצן במצב 3 בקצב צריכת החמצן ממש לפני הוספת ADP במצב 2 (ראה איור 1).
    הערה: ביטוי RCR חלופי של 1 - 1/RCR יכול לשמש גם כמדד איכות, התחום בין 0 ל- 1; עם זאת, קשה להבדיל בין איכות באמצעות מדד זה כאשר RCR > 10 (ראה איור 2).
  10. שטפו את התאים והפקקים 10 פעמים במים טהורים כדי לנקות את האוקסיגרף לבדיקות הבאות. אם הספירומטריה הושלמה, מלאו את התאים באתנול 70% והניחו פקקים בתאים עד לשימוש הבא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עם השלמת בידוד המיטוכונדריה, יש לבדוק את האיכות והפונקציונליות של המבודדים באמצעות כימות קצב צריכת החמצן (JO2) באמצעות ספירומטריה ברזולוציה גבוהה. כדי לעשות זאת, מלאי המיטוכונדריה דולל ל -40 מ"ג / מ"ל כדי לאפשר ריכוזי עבודה של 0.1 מ"ג / מ"ל ב -2 מ"ל RB עבור כל בדיקות הספירומטריה באמצעות מיטוכונדריה לב מבודדת. הנשימה תודלקה על ידי 5 mM נתרן פירובט ו 1 mM L-malate בנוכחות 1 mM EGTA, כלטור סידן, והורשה לאזן במשך 5 דקות כדי לבסס נשימה מצב 2. במצב זה, קצב צריכת החמצן צריך להיות בממוצע 45-55 pmol/mL/s או 27...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הקפדה על השיטות המתוארות בתמציתיות בפרוטוקול זה תבטיח בידוד של מיטוכונדריה מצומדת היטב מרקמת הלב של מכרסמים קטנים, בנוסף לסוגי רקמות ומקורות אחרים. בסך הכל, התהליך צריך לקחת בסך הכל 3-3.5 שעות, שבמהלכן כל רקמות בעלי החיים, הדגימות והמבודדים צריכים להישאר על קרח ב -4 מעלות צלזיוס ככל האפשר כדי להגביל את ההתפרקות. הליך זה הוא חזק וניתן לשנות אותו במספר דרכים כדי להתאים טוב יותר למטרות הניסוי ולמודלים המנוצלים. אפנון אחד שניתן לבצע בתהליך דיסקציה של רקמות הוא הרחקה של הפרין. הפרין ניתן כדי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין מה לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לדניאל א. בירד ולקליאן ס. וינקוטה על תרומתם הבסיסית לפרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי NSF CAREER grant MCB-2237117.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה
10 מ"ללחיתוך איברים וטחינת 50
מ"ל צינורותצנטריפוגה
אדנוזין 5'-דיפוספט מונופוטסיום מלח דיהידרטסיגמא A5285מבחני רספירומטריה
ערכת בדיקת חלבון BSA תרמוריחניPI23225כימות חלבון מיטוכונדריאלי
דקסטרוזסיגמא DX0145עבור חוצץ (CB)
אתילן גליקול-ביס(2-אמינו-אתילאתר)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית סיגמא E4378למאגרים (CB ו-IB) ובדיקות רספירומטריה
צינורית זכוכיתRadnotiחזיר ניסיונות וחולדה לב פרפוזיה
הפרין נתרן חזיר ריריתסיגמא SRE0027-250KUהזרקת IP של בעלי חיים
נשימהאלקטרודה מסוג קלארק; אוקסיגרף עם תאים של 2 מ"ל
תא
IsofluraneSigma 792632הרדמה 
חומצה L-מאליתסיגמא 02288-50Gמבחני רספירומטריה
מגנזיום כלוריד הקסהידרטסיגמא M9272למאגר (RB)
מניטולסיגמא MX0214למזרקי
מיקרוליטרגדלים הנעים בין 5– 50 ומיקרו; L
קוראחייב להיות מסוגל לדגור ב-37 מעלות; C 
MOPSסיגמא 475898לכל המאגרים
O2 מיכל
OMNI THQ HomogenizerOMNI International 12-500הומוגנייזרים דומים של סטטור רוטור יעבדו
פיפטותנפחים של  2– 20 ומיקרו; L; 20– 200 ומיקרו; L; 200– 1000 ומיקרו; L
אשלגן כלוריסיגמא P3911למאגרים (RB ו-CB)
אשלגן פוספט דו-בסיסיסיגמא 795496עבור חוצצים (IB ו-RB)
פרוטאז מ-Bacillus licheniformisSigma P5459
נתרן כלוריסיגמא S9888עבור מאגר (CB)
נתרן פירובטפישר ביו-ריאגנטיםBP356-100בדיקות רספירומטריה
סוכרוזסיגמה 8510-OPעבור חיץ (IB)
דיסקציה כירורגיתתלוי במקור בעלי חיים ורקמות
צנטריפוגהחייבת להתקרר ל-4 מעלות; C 
זכוכית צנטריפוגה מד ברזולוציה גבוהה אינדוקציה חוצץ (IB) מיקרופלייט ערכת שולחנית

מקורות

  1. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  2. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: Ii. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  3. Ernster, L., Schatz, G. Mitochondria: A historical review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  4. Martinez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial tca cycle metabolites control physiology and disease. Nat Commun. 11 (1), 102(2020).
  5. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation, and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  6. Fernie, A. R., Carrari, F., Sweetlove, L. J. Respiratory metabolism: Glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 254-261 (2004).
  7. Kalpage, H. A., et al. Cytochrome C phosphorylation: Control of mitochondrial electron transport chain flux and apoptosis. Int J Biochem Cell Biol. 121, 105704(2020).
  8. Sousa, J. S., D'imprima, E., Vonck, J. Mitochondrial respiratory chain complexes. Subcell Biochem. 87, 167-227 (2018).
  9. Mitchell, P., Moyle, J. Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation. Nature. 213 (5072), 137-139 (1967).
  10. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).
  11. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods Mol Biol. 837, 63-72 (2012).
  12. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  13. Bisaccia, G., Ricci, F., Gallina, S., Di Baldassarre, A., Ghinassi, B. Mitochondrial dysfunction and heart disease: Critical appraisal of an overlooked association. Int J Mol Sci. 22 (2), 614(2021).
  14. Zhou, B., Tian, R. Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure. J Clin Invest. 128 (9), 3716-3726 (2018).
  15. Holzem, K. M., et al. Mitochondrial structure and function are not different between nonfailing donor and end-stage failing human hearts. FASEB J. 30 (8), 2698-2707 (2016).
  16. Cordero-Reyes, A. M., et al. Freshly isolated mitochondria from failing human hearts exhibit preserved respiratory function. J Mol Cell Cardiol. 68, 98-105 (2014).
  17. Norat, P., et al. Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation. NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).
  18. Diaz-Vegas, A., et al. Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases. Endocr Rev. 41 (3), bnaa005(2020).
  19. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).
  20. Holmuhamedov, E. L., Oberlin, A., Short, K., Terzic, A., Jahangir, A. Cardiac subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria display distinct responsiveness to protection by diazoxide. PLoS One. 7 (9), e44667(2012).
  21. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: Functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  22. Micakovic, T., et al. Isolation of pure mitochondria from rat kidneys and western blot of mitochondrial respiratory chain complexes. Bio Protoc. 9 (19), e3379(2019).
  23. Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods Cell Biol. 155, 3-31 (2020).
  24. Hubbard, W. B., et al. Fractionated mitochondrial magnetic separation for isolation of synaptic mitochondria from brain tissue. Sci Rep. 9 (1), 9656(2019).
  25. Zhou, D., et al. Protocol for mitochondrial isolation and sub-cellular localization assay for mitochondrial proteins. STAR Protoc. 4 (1), 102088(2023).
  26. Hernandez-Camacho, J. D., et al. Isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays. J Vis Exp. (180), e63336(2022).
  27. Farrugia, G. E., et al. A protocol for rapid and parallel isolation of myocytes and non-myocytes from multiple mouse hearts. STAR Protoc. 2 (4), 100866(2021).
  28. Wollenman, L. C., Vander Ploeg, M. R., Miller, M. L., Zhang, Y., Bazil, J. N. The effect of respiration buffer composition on mitochondrial metabolism and function. PLoS One. 12 (11), e0187523(2017).
  29. Vinnakota, K. C., et al. Open-loop control of oxidative phosphorylation in skeletal and cardiac muscle mitochondria by ca(2). Biophys J. 110 (4), 954-961 (2016).
  30. Vinnakota, K. C., Bazil, J. N., Van Den Bergh, F., Wiseman, R. W., Beard, D. A. Feedback regulation and time hierarchy of oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria. Biophys J. 110 (4), 972-980 (2016).
  31. Warnock, L. B., Huang, D. Heparin. Statpearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).
  32. Sercel, A. J., et al. Generating stable isolated mitochondrial recipient clones in mammalian cells using mitopunch mitochondrial transfer. STAR Protoc. 2 (4), 100850(2021).
  33. Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. J Vis Exp. (97), e52076(2015).
  34. Sobolewski, P., Kandel, J., Eckmann, D. M. Air bubble contact with endothelial cells causes a calcium-independent loss in mitochondrial membrane potential. PLoS One. 7 (10), e47254(2012).
  35. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  36. Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. A colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster. J Vis Exp. (155), e59454(2020).
  37. Tomar, N., et al. Substrate-dependent differential regulation of mitochondrial bioenergetics in the heart and kidney cortex and outer medulla. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1863 (2), 148518(2022).
  38. Ter Veld, F., Jeneson, J. A., Nicolay, K. Mitochondrial affinity for ADP is twofold lower in creatine kinase knock-out muscles. Possible role in rescuing cellular energy homeostasis. FEBS J. 272 (4), 956-965 (2005).
  39. Gouspillou, G., et al. Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20709(2011).
  40. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-em reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Sci Rep. 11 (1), 1037(2021).
  41. Zhou, Z., et al. Diverse functions of cytochrome C in cell death and disease. Cell Death Differ. 31 (4), 387-404 (2024).
  42. Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic bcl-2 family members. Cancer Cell. 9 (5), 351-365 (2006).
  43. Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: Multiple roles of inorganic phosphate. J Biol Chem. 278 (40), 39155-39165 (2003).
  44. Motawe, Z. Y., Abdelmaboud, S. S., Breslin, J. W. Evaluation of glycolysis and mitochondrial function in endothelial cells using the seahorse analyzer. Methods Mol Biol. 2711, 241-256 (2024).
  45. Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat Protoc. 1 (6), 2563-2572 (2006).
  46. Huerta, B., et al. Sea lamprey cardiac mitochondrial bioenergetics after exposure to TFM and its metabolites. Aquat Toxicol. 219, 105380(2020).
  47. Malyala, S., Zhang, Y., Strubbe, J. O., Bazil, J. N. Calcium phosphate precipitation inhibits mitochondrial energy metabolism. PLoS Comput Biol. 15 (1), e1006719(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

טיהור מיטוכונדריהיחס בקרת נשימהכימות חלבוניםנתיחה של איבריםליקוי ביו-אנרגטיגרנולות סידן-פוספטאי-ספיקת לבפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית
בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.