בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם

סיכום

מחקרים ביואנרגטיים ומטבוליים על מיטוכונדריה חשפו את תפקידם הרב-גוני במחלות רבות, אך שיטות הבידוד של אברונים אלה משתנות. השיטה המפורטת כאן מסוגלת לטהר מיטוכונדריה באיכות גבוהה ממקורות רקמה מרובים. האיכות נקבעת על ידי יחסי בקרת נשימה ומדדים אחרים המוערכים עם רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

תקציר

בידוד מיטוכונדריאלי נהוג מזה עשרות שנים, בעקבות נהלים שנקבעו על ידי חלוצים בתחומי הביולוגיה המולקולרית והביוכימיה לחקר ליקויים מטבוליים ומחלות. איכות מיטוכונדריאלית עקבית נחוצה כדי לחקור כראוי פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית וביו-אנרגטיקה; עם זאת, שיטות בידוד רבות ושונות שפורסמו זמינות לחוקרים. למרות שאסטרטגיות ניסוי שונות דורשות שיטות בידוד שונות, העקרונות והנהלים הבסיסיים דומים. פרוטוקול זה מפרט שיטה המסוגלת לחלץ מיטוכונדריה מצומדים היטב ממגוון מקורות רקמה, כולל בעלי חיים קטנים ותאים. השלבים המתוארים כוללים דיסקציה של איברים, טיהור מיטוכונדריה, כימות חלבונים ובדיקות בקרת איכות שונות. מדד בקרת האיכות העיקרי המשמש לזיהוי מיטוכונדריה באיכות גבוהה הוא יחס בקרת הנשימה (RCR). RCR הוא היחס בין קצב הנשימה במהלך זרחן חמצוני לקצב בהיעדר ADP. נדונים מדדים חלופיים. בעוד ערכי RCR גבוהים ביחס למקור הרקמה שלהם מתקבלים באמצעות פרוטוקול זה, מספר שלבים יכולים להיות אופטימליים כדי להתאים לצרכים האישיים של החוקרים. הליך זה חזק והביא באופן עקבי למיטוכונדריה מבודדים עם ערכי RCR מעל הממוצע במודלים של בעלי חיים ובמקורות רקמות.

מבוא

מיטוכונדריה הם אברונים תת-תאיים המבססים תנאים אנרגטיים ציטופלזמיים המותאמים לתפקודי תאים ספציפיים. בעוד שמחקרים ברמת התא, הרקמות והאורגניזמים יכולים לספק תובנות לגבי תפקוד המיטוכונדריה, בידוד האבונים מציע רמה של שליטה ניסיונית שאינה אפשרית אחרת. בידודים מיטוכונדריאליים מבוצעים מאז שנות ה-40 של המאה ה-20, ומאפשרים מחקרים מכניסטיים של חילוף חומרים ונשימה במגוון תאים ורקמות ^1,2. הרלוונטיות ההיסטורית של המיטוכונדריה מתועדת היטב^גם 3. בתור היצרנים העיקריים של ATP, מיטוכונדריה ממלאים תפקידי מפתח רבים החיוניים לתפקוד מיטבי של התאים והאיברים⁴. בתוך המטריצה המיטוכונדריאלית, הסובסטרטים מחומצנים על ידי מחזור TCA, ומייצרים מקבילות מחזרים ונושאי אלקטרונים ניידים כגון NADH ו- UQH₂ ^5,6. ציטוכרום C הוא נשא האלקטרונים הנייד השלישי ברשת התגובה הביוכימית המיטוכונדריאלית⁷. מולקולות אלה מחומצנות לאחר מכן על ידי קומפלקסים טרנסממברנליים של מערכת הובלת האלקטרונים (ETS) המשובצים בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי⁸. תגובות חמצון-חיזור של ETS מצומדות לטרנסלוקציה של פרוטונים מהמטריצה למרחב הבין-ממברנלי. תהליכים אלה יוצרים שיפוע פרוטונים אלקטרוכימי המשמש לפוספורילט ADP עם Pi על ידי F₁F₀ ATP סינתאז לייצור ATP ^9,10. ניתן לחקור את התהליכים האינדיבידואליים המתרחשים בכל מתחם באמצעות ספירומטריה ברזולוציה גבוהה באמצעות אלקטרודות מסוג קלארק או מבחני צריכת חמצן של מיקרו-פלטות^11,12. בנוסף, מודלים של מחלות וטיפולים באמצעות מיטוכונדריה מבודדת יכולים לקבוע את ההשפעה או החשיבות של תפקוד המיטוכונדריה בהתקדמות של פתולוגיות מסוימות. זה הוכח פורה בתחום הקרדיולוגיה, שם שינויים באספקת דלק ומצע שימשו כדי להבהיר כיצד תפקוד לקוי של המיטוכונדריה משפיע על אי ספיקת לב 13,14,15,16. מיטוכונדריה ידועים גם כמשפיעים על התפתחות מצבי מחלה אחרים כגון סוכרת, סרטן, השמנת יתר, הפרעות נוירולוגיות ומיופתיות^17,18. לכן, השימוש במיטוכונדריה מבודדים או מטוהרים מאפשר חקירה מכניסטית של חילוף חומרים חמצוני וייצור ATP ברקמת המקור.

לא חסרים פרוטוקולים לבידוד מיטוכונדריאלי בשל חשיבותם במחקר הביו-אנרגטי. בנוסף, ניתן למצוא שיטות ספציפיות מאוד המותאמות לתת-אוכלוסיות של מיטוכונדריה בתוך רקמות ותאים^19,20. השלבים הפרוצדורליים הבסיסיים דומים בין שיטות בידוד, אך ניתן לבצע שינויים בהרכב החיץ, שלבי הומוגניזציה וסחרורי צנטריפוגות כדי לשפר את כמות ואיכות המיטוכונדריה. שינויים בהיבטים אלה מבוססים על הדרישה המטבולית של הרקמה, תפקוד איברים כללי, צפיפות מיטוכונדריה וגורמים אחרים. ברקמות כגון הכבד ושרירי השלד, הומוגנייזרים ידניים משמשים לשמירה על שלמות המיטוכונדריה ולהגבלת הנזק לקרומי המיטוכונדריה²¹. עם זאת, בעת בידוד מהכליות, פרוטוקולים מסוימים מציעים להשתמש בהומוגניזציה מונעת ידנית או ערכות מסחריות כדי להניב תוצאות טובות יותר²². למרות ששתי השיטות מניבות מיטוכונדריה פונקציונלית, איכות האברונים עלולה להיפגע בגלל הזמן הנוסף שלוקח להשלים בידודים באמצעות פרוטוקולים אלה. צנטריפוגה חיונית גם למיצוי חלבון מיטוכונדריאלי, שכן היא מפרידה רכיבים תאיים כגון גרעינים ואברונים אחרים מהמיטוכונדריה²³. בתהליך הבידוד מתלבטים האם יש ליישם צנטריפוגות דיפרנציאליות או מבוססות צפיפות כדי להשיג מבודדים טהורים יותר²⁴. בעוד שצנטריפוגת צפיפות יכולה להפריד מיטוכונדריה מאברונים בעלי כבידה סגולית דומה, כגון פרוקסיזומים, אין זה מבוסס היטב אם מיטוכונדריה משיטות אלה מייצגות טוב יותר את תפקוד אברוני האתר בהשוואה למיטוכונדריה שבודדו באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. בתחום הפיזיולוגיה של המיטוכונדריה, צנטריפוגה מבוססת צפיפות היא מועדפת וניתן לשנות אותה בקלות כדי להגביר את טוהר הבידוד. יש לשקול לפני הניסויים אם משולבים שינויים בכוחות הג'י, משך הצנטריפוגות ומספר סיבובי הצנטריפוגות בשל השפעתם על טיהור המיטוכונדריה. יתר על כן, תרחיף מיטוכונדריאלי, ככל הנראה השלב המכריע ביותר במהלך בידוד, שונה מאוד בין מחקרים, עם שימוש בגירוד, ערבוב מבוסס מערבולת, או הומוגניזציה 23,25,26. השעיה מכנית מסוג זה עלולה להיות שוחקת מדי ולפגוע בשלמות הממברנה של המיטוכונדריה. מסיבה זו, יש לבצע כביסה עדינה כדי לתקן זאת. למרות שפע המודולציות והמתודולוגיות המוצעות, ישנם פחות פרוטוקולים מקיפים עם יכולת שחזור והתאמה גבוהה למודלים של מכרסמים.

השיטות המתוארות כאן מתארות פרוטוקול מפורט, חזק וניתן לשחזור שמניב מיטוכונדריה מטוהרת ומצומדת היטב מרקמת לב של בעלי חיים קטנים. כפי שהוכח, ניתן להתאים שיטה זו בקלות כדי להתאים לצרכים הספציפיים של כל ניסוי ו / או סביבת מעבדה לבידוד מיטוכונדריה מכליות, כבד ותאים בתרבית. ניתן לבצע שינויים נוספים כדי לבודד מיטוכונדריה מרקמות ובעלי חיים אחרים שאינם מפורטים כאן. מתכוני חיץ המשמשים לכל הבידודים מסופקים וניתן לשנות אותם במידת הצורך. בדומה לפרוטוקולים אחרים שפורסמו, הומוגניזציה ממונעת וצנטריפוגה דיפרנציאלית מיושמות; עם זאת, מתבצעות התאמות הן לזמן הגזירה והן לכוח שבו הדגימות עוברות צנטריפוגה כדי לספק באופן עקבי מבודדים מיטוכונדריאליים באיכות גבוהה, בהתאם למקור הבידוד. יש לציין כי פרוטוקול זה שונה מאחרים בכך שהוא משתמש בשטיפה עדינה באמצעות פיפטינג כדי להשהות מחדש מיטוכונדריה כדורית, מה שעוזר לשמור על שלמות קרום המיטוכונדריה ולשמור על הפונקציונליות הכוללת של האברונים. חלבון מיטוכונדריאלי מכומת על ידי קביעת חלבון כולל או על ידי מדידת פעילות סינתאז ציטראט. התועלת והישימות הרחבה של שיטת בידוד זו נתמכות גם על ידי ערכי יחסי הבקרה הנשימתית (RCR) המושגים על פני אורגניזמים ומקורות רקמות שונים.

פרוטוקול

השימוש והטיפול בכל בעלי החוליות בוצעו בהתאם לפרוטוקולים מאושרים שנבדקו והתקבלו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת מישיגן. פרוטוקול זה תוכנן תוך שימוש בשרקנים לבקנים זכרים ונקבות כאחד של הארטלי וחולדות Sprague Dawley (SD). לצורך בידוד מיטוכונדריה לבבית משרקנים, הוקרבו בעלי חיים בגילאי 4-6 שבועות (300-450 גרם). מיטוכונדריה לבבית מחולדות SD משני המינים התקבלו בין הגילאים 10-13 שבועות (250-400 גרם). מתכונים למאגרים מתוארים בטבלה 1 ויש להכין אותם מראש. פרטים על הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה ניסיונית

1. לפני תחילת הבידוד, תייגו שני צינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל כ"ספינים 1 ו -2" ו"ספין 3".
2. מניחים צינורות, חיץ בידוד מופשר טרי (IB), מספריים טחונים חדים, בדיקת הומוגניזציה שהורכבה, וכוס 5 מ"ל או מיכל בגודל שווה ערך על קרח.
3. הניחו את חיץ הנשימה הטרי המופשר (RB) באינקובטור כדי להתחמם לקראת בדיקות הנשימה הבאות.
4. מצננים מראש צנטריפוגה בקירור ל-4°C.
5. ודא כי כל הציוד מסודר 20 μL של 7-15 U/mg פרוטאז מ Bacillus licheniformis נוסף לצינור שכותרתו "ספינים 1 ו 2".
6. הגדר מערכת לחץ תלוית כבידה לזילוח באמצעות קנולציה באמצעות חיץ Cardioplegia (CB, טבלה 1), צינורית זכוכית וצינורות פלסטיק עם שסתום סטופקוק מחובר.
7. סדרו את כלי הניתוח ושלבו מספריים ומלקחיים מתאימים לדיסקציה וקנולציה של הלב.
   הערה: כל המים צריכים להיות באיכות טהורה (18.2 MΩ·cm)

2. דיסקציה של רקמות

1. הזריקו לבעלי חיים הפרין סולפט סטרילי תוך צפקי במינון של 500 U/kg.
2. הניחו לבעל החיים לשבת בתא הזירוז למשך 15 דקות לאחר מתן הפרין. במהלך תקופה זו, ספקו 2 ליטר לדקה של גז O₂ טהור כדי לחמצן באופן מלא את בעלי החיים, להרגיע אותם ולמזער כל לחץ שעלול להיות בעל השלכות שליליות על רקמות עניין.
3. התחל השראת הרדמה על ידי זרימה רציפה של isoflurane ב 0.5%. לאחר דקה, להגדיל ל 1%. המשיכו להגדיל ב-1% בכל דקה עד שמגיעים ל-5%. פעם אחת ב 5%, לחכות 1 דקה ולפקח על דפוס הנשימה של החיה.
4. לאחר שהנשימה הואטה ונעשית מאומצת (בערך בסימן 6.5 דקות) כבו את זרימת האיזופלורן והחמצן.
5. הוציאו במהירות את בעל החיים מתא האינדוקציה ובדקו עומק הרדמה מתאים על ידי לחיצת כפה ובדיקת רפלקס הקרנית. אם בעל החיים מגיב לאחד הגירויים, החזירו אותו לתא הזירוז, קראו את ההרדמה וחזרו על בדיקת עומק ההרדמה.
6. ברגע שמגיעים לעומק הנכון של ההרדמה, ערפו במהירות את ראשו עם גיליוטינה כדי להחמיר את עמוד השדרה הצווארי והניחו את הגוף הנוטה על קרח.
7. בצע שני חתכים אנכיים מקבילים מעצם הבריח המתקדמים לאורך כלוב הצלעות הצידי לאורך בית החזה. ודא כי החתכים עמוקים מספיק כדי לחתוך דרך הצלעות על בית החזה לרוחב, אבל להימנע נזק מבנים intrathoracic כגון הלב או כלי גדול.
   הערה: גודל החתך האנכי תלוי בבעל החיים שבו משתמשים. אם אתם משתמשים בשרקנים וחולדות, חתכו לסרעפת (כ-6.35 ס"מ לחולדות ו-11 ס"מ לשרקנים). אם אתם משתמשים בעכברים, בצעו כריתת בית חזה סטנדרטית²⁷.
8. חשוף את הלב באמצעות hemostat כדי לעקור את בית החזה הקדמי ולארוז את חלל החזה החשוף עם קרח. צעד זה ממזער את זמן האיסכמיה החמה ומשפר את הכדאיות של האברונים המבודדים.
9. השתמשו בפינצטה כדי לנתח בבוטות את בלוטת התימוס וקרום הלב ולחשוף את הלב במלואו.
10. באמצעות מלקחיים, להחיל מתיחה נחותה עדינה על הלב כדי לחשוף ולזהות את אבי העורקים. אבי העורקים הוא הכלי הגדול העבה ביותר המסתעף מבסיס הלב. כלי דם גדולים אחרים, כגון וריד הריאתי, הם שקופים יותר באופן ניכר מאשר אבי העורקים.
11. חותכים את אבי העורקים כ-4-6 מ"מ מעל שורש אבי העורקים אך מתחת לנקודות ההסתעפות של התרדמה.
12. לערבב את אבי העורקים ולחורר את הלב^28,29 בתמיסת קרדיופלגיה קרה כקרח (CB) באמצעות ראש לחץ תלוי כבידה עד שהעורקים הכליליים מנוקים מדם והאיבר נראה מולבן.
    הערה: עבור מכרסמים גדולים, קוטר צינורית של 1.8-2.2 מ"מ עובד היטב, ואילו עבור מכרסמים קטנים יותר, טווח קוטר של 1.4-1.8 מ"מ מומלץ. רטרו זילוח צריך לקחת לא יותר מ 15-30 s עבור כלי הדם הכליליים לנקות דם.
13. בודדו את שריר הלב של החדר על ידי ניתוח האטריה, רקמת המסתם הסחוסית ורקמות השומן.
14. מניחים את החדרים בתוך 10 מ"ל צוננת מראש המכילה 0.1-0.2 מ"ל IB קר כקרח.
15. טחון רקמה עם מספריים כירורגיים חדים עד חתיכות הם כ 1 מ"מ³.

3. טיהור מיטוכונדריה וכימות חלבונים

1. מעבירים את הרקמה הטחונה לתוך צינור הצנטריפוגה המצונן מראש שכותרתו "ספינים 1 ו-2" המכיל את תמיסת הפרוטאז.
2. הוסף IB קר כקרח לנפח סופי של 25 מ"ל.
3. באמצעות הומוגנייזר רוטור-סטטור ידני ממונע, מפזרים את הרקמה ב-18,000 סל"ד על קרח למשך 20-25 שניות.
4. צנטריפוגה רקמה הומוגנית בצינור שכותרתו "ספינים 1 ו -2" ב 8,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
5. יש להשליך את הסופרנאטנט (המכיל פרוטאז) על ידי מזיגו לפח הפסולת ולשטוף בעדינות את הגלולה עם 5 מ"ל IB כדי להסיר שאריות פרוטאז.
6. לאחר השלכת השטיפה, יש להשהות מחדש את הגלולה עם IB טרי קר כקרח לנפח סופי של 25 מ"ל על ידי מערבולת עדינה.
7. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
8. הסר את supernatant (מכיל מיטוכונדריה) על ידי מזיגה עדינה לתוך צינור 50 מ"ל צונן מראש עם הכיתוב "ספין 3". בזמן המזיגה, יש להקפיד להימנע מפירוק החלק העליון הרופף של הכדורית. כחלופה, פיפטה העברה או סטריפט ניתן להשתמש כדי לאסוף את supernatant.
9. צנטריפוגה את supernatant ב 8000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
10. השליכו את הסופרנאטנט שנוצר ושמרו על הכדורייה המכילה מיטוכונדריה.
11. השתמשו במגבון ללא סיבים כדי לספוג עודפי סופרנאטנט מהדופן הפנימית של הצינור, תוך הקפדה שלא להפריע לכדורית. שמור את הגלולה ב 4 ° C על קרח ככל האפשר.
12. כדי להשהות מחדש את המיטוכונדריה, הוסיפו 80 μL של IB קר כקרח לתחתית הצינור. השהה מחדש בעדינות את הגלולה על ידי שטיפה חוזרת ונשנית של IB מעל הכדור.
13. כדי למנוע יצירת בועות, להגדיר micropipette לשאוף ולספק בין 40-60 μL של נפח.
14. ככל שהכדוריות המיטוכונדריאליות מתפזרות, הגדילו את נפח המיקרופיפטה כדי להשהות מחדש ביעילות את המיטוכונדריה הכדורית. הימנעו מלגעת בגלולה עם קצה הפיפטה, והימנעו מיצירת בועות.
15. לאחר השהייה מחדש, העבירו את המיטוכונדריה לצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש ותייגו אותו כמיטוכונדריה מלאי. רשום לעצמך את נפח המתלים הכולל.
16. כדי לקבוע את ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי בדגימה, יש לבצע בדיקת חלבון כוללת באמצעות בדיקות החלבון הידועות BCA או Bradford כפי שהוגדרו בהוראות היצרן.
    הערה: אסטרטגיה חלופית או משלימה להערכת התשואה היא לקבוע את פעילות הסינתאז ציטראט. לשם השוואה, ניתן לכמת את התוכן המיטוכונדריאלי על ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר ב- Vinnakota et ^al.30.

4. בדיקות בקרת איכות

1. בצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש, לדלל את מלאי המיטוכונדריה לריכוז העבודה הרצוי עם IB.
   הערה: מלאי המיטוכונדריה מדולל ל-40 מ"ג/מ"ל כדי לעבוד בריכוז הסופי של 0.1 מ"ג/מ"ל לבדיקות רספירומטריה בעת שימוש במבודדים מרקמת הלב.
2. יש לשטוף תאי אוקסיגרף, פקקים ומזרקי מיקרוליטר עשר פעמים במים מזוקקים כדי לנקות אותם לפני השימוש בבדיקות ספירומטריה.
3. כדי לבדוק את הכדאיות והאיכות של מבודדים מיטוכונדריאליים, יש להעמיס 2.3 מ"ל של חיץ נשימה (RB) לתוך תאי אוקסיגרף ולאפשר לאות צריכת החמצן להתאזן ב-37°C למשך כ-10 דקות או כאשר הקצב קרוב ל-0.
4. ברגע שהאות מאוזן יש לדחוף כלפי מטה את הפקקים ולשאוף את החיץ העודף שיוצא מהנימים של הפקק.
5. הוסף 1 mM EGTA באמצעות מזרק microliter כדי chelate כל שאריות סידן במאגרים או דגימה מיטוכונדריאלית.
6. כדי לתדלק את הנשימה, להוסיף 5 mM נתרן pyruvate ו 1 mM L-malate.
7. לאחר הוספת המצע, הוסיפו בולוס של מיטוכונדריה מדוללת כדי להשיג ריכוז עבודה ולאפשר נשימה למשך 5 דקות. תקופה זו נקראת LEAK או State 2 respiration.
8. בסימן 5 דקות, הוסיפו בולוס של 500 מיקרומטר ADP כדי להתחיל נשימה במצב 3, המכונה גם OXHPOS, ואפשרו למיטוכונדריה לנשום עד לאנוקסיה.
9. חישוב יחס בקרת הנשימה (RCR) על-ידי חלוקת הקצב המרבי של צריכת חמצן במצב 3 בקצב צריכת החמצן ממש לפני הוספת ADP במצב 2 (ראה איור 1).
   הערה: ביטוי RCR חלופי של 1 - 1/RCR יכול לשמש גם כמדד איכות, התחום בין 0 ל- 1; עם זאת, קשה להבדיל בין איכות באמצעות מדד זה כאשר RCR > 10 (ראה איור 2).
10. שטפו את התאים והפקקים 10 פעמים במים טהורים כדי לנקות את האוקסיגרף לבדיקות הבאות. אם הספירומטריה הושלמה, מלאו את התאים באתנול 70% והניחו פקקים בתאים עד לשימוש הבא.

תוצאות

עם השלמת בידוד המיטוכונדריה, יש לבדוק את האיכות והפונקציונליות של המבודדים באמצעות כימות קצב צריכת החמצן (J_O2) באמצעות ספירומטריה ברזולוציה גבוהה. כדי לעשות זאת, מלאי המיטוכונדריה דולל ל -40 מ"ג / מ"ל כדי לאפשר ריכוזי עבודה של 0.1 מ"ג / מ"ל ב -2 מ"ל RB עבור כל בדיקות הספירומטריה באמצעות מיטוכונדריה לב מבודדת. הנשימה תודלקה על ידי 5 mM נתרן פירובט ו 1 mM L-malate בנוכחות 1 mM EGTA, כלטור סידן, והורשה לאזן במשך 5 דקות כדי לבסס נשימה מצב 2. במצב זה, קצב צריכת החמצן צריך להיות בממוצע 45-55 pmol/mL/s או 27-33 nmol/mg/min. היו מודעים לקצב צריכת החמצן התלוי באלקטרודה ובצעו את תיקוני הרקע המתאימים בעת הצורך. זרחן חמצוני (מצב 3) מתחיל בסימן 5 דקות על ידי בולוס של 500 מיקרומטר ADP. תוספות מצע ומעקב מייצג מפורטים באיור 1. למיטוכונדריה פונקציונליים תהיה עלייה מיידית ב-J_O2 לאחר הוספת ADP, אשר משתנה בהתאם למקור הרקמה, כפי שמוצג באיור 2. ללא שימוש ב-EGTA, לשאריות הסידן יש השפעות משתנות על השיעורים המרביים של J_O2 במהלך OXPHOS, בהתאם לריכוז המיטוכונדריה, זמינות המצע וגורמים סביבתיים אחרים. הרכב החיץ חשוב לשמירה על שלמות ותפקוד הממברנה המיטוכונדריאלית. כל מתכוני החיץ המוזכרים לאורך הפרוטוקול מפורטים עוד יותר בטבלה 1 וניתן להשתמש בהם עבור כל התכשירים המיטוכונדריאליים המתוארים כאן.

בידוד מוצלח של מיטוכונדריה מסומן על-ידי קבלת ערכי RCR הנמצאים בטווח הנתון עבור כל מין ומקור רקמה, כפי שמוצג בטבלה 2. בהתבסס על הנתונים שנאספו באמצעות פרוטוקול זה, אם מבודדים מיטוכונדריה לבבית משרקנים, חולדות או עכברים, RCR צריך להיות ≥16, ≥8 ו- ≥5, בהתאמה. אם מבודדים מכבד או כליה של חולדה, RCR צריך להיות ≥6, בעוד RCR מתאים נחשב מקובל אם מעל 3.8. אם ערכי RCR נופלים מתחת לטווחים אלה או אם יש הבדלים איכותיים במעקב אחר הספירומטריה, מומלץ לבצע בדיקה נוספת עם RB ומצעים חדשים כדי לשלול בעיות מזיהום. למרות שהתמרת 1-1/RCR מגבילה ערכים בין 0 ל- 1, מדד זה אינו מומלץ כאשר משווים את איכות המיטוכונדריה בין מינים או מינים כאשר ערך RCR גדול מ- 10. מסיבה זו, ערכי RCR סטנדרטיים (מצב 3/מצב 2 או OXPHOS/LEAK) כומתו במהלך כל הניסויים. מידע לגבי אפנון שניתן לבצע בפרוטוקול זה כדי לבודד טוב יותר מיטוכונדריה מלבבות, כבד, כליות ותאים של עכברים מפורט בטבלה 3.

איור 1: אזורים בעלי עניין לבדיקות בקרת איכות באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. תאי הנשימה היו עמוסים ב -2 מ"ל של RB והורשו להתאזן ב -37 מעלות צלזיוס עד שקצב צריכת החמצן היה קרוב ל -0. לאחר האיזון, 1 mM EGTA, כלטור סידן, נוסף יחד עם 5 mM פירובט נתרן ו 1 mM L-malate. לאחר הוספת מצעים אלה, המיטוכונדריה נוספו בריכוז העבודה הרצוי (0.1 מ"ג/מ"ל) והורשו לנשום במשך 5 דקות כדי להגיע לנשימה במצב 2 (צהוב). בסימן 5 דקות, 500 מיקרומטר ADP נוסף כדי להתחיל נשימה מצב 3 (אדום). RCR נקבעו על ידי ממוצע הזמן של שיעורי צריכת החמצן המסומנים בתיבות האדומות והצהובות כדי להשוות את מצב 3 למצב 2. מצב 4 מסומן בקופסה הירוקה ומייצג את התקופה של הידרוליזה אקסטרה-מיטוכונדריאלית ATPase של ATP וניתן להשתמש בו כדי להעריך את שלמות הממברנה החיצונית בבדיקות ציטוכרום C. הנתונים המוצגים נאספו באמצעות מיטוכונדריה לבבית של חולדות SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מעקבים מייצגים של J_O2 ויחסי בקרה נשימתית בין מקורות של בעלי חיים ורקמות. איכות המיטוכונדריה המבודדים נבדקה על ידי כימות שיעורי צריכת החמצן באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. הנשימה תודלקה על ידי 5 mM נתרן פירובט ו 1 mM L-malate בנוכחות 1 mM EGTA. מיטוכונדריה ומצעים הורשו לנשום במשך 5 דקות כדי שנשימת מצב 2 תתייצב. שיעורים מרביים של צריכת חמצן לאחר הוספת ADP הושוו למצב 2 של צריכת חמצן לפני ADP כדי לחשב את יחסי בקרת הנשימה (RCR) עבור כל רקמה. איכות המיטוכונדריה הוערכה עוד יותר על ידי חישוב ערכי 1-1/RCR המאופיינים בתקני יעילות בקרת P-L. תרשימי עמודות מימין לכל עקיבה מציינים ערכי RCR ממוצעים של זכר (כחול) ונקבה (ירוק) וערכי RCR של 1-1/RCR ± SD עבור רקמה נתונה. (A), (B) ו-(C) מתייחסים לנתונים שנאספו באמצעות שרקנים, חולדות Sprague Dawley (SD) ולבבות עכברים מסוג Friend leukemia virus B (FVB), בהתאמה. (D) ו-(E) תוצאות מפורטות של כבד וכליות של חולדות SD, בעוד ש-(F) מתייחס לתאי HEK293. שלוש אונות הכבד הגדולות יותר נאספו, בעוד שתי הכליות שימשו לבידוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: מתכוני חיץ. יש להכין מראש חיץ קרדיופלגיה (CB), חיץ בידוד (IB) וחיץ נשימה (RB) המשמשים בתהליך הבידוד בהתאם להוראות המפורטות. CB יכול להיות מאוחסן עד חודש ב 4 ° C, בעוד IB ו RB ניתן לשמור במשך 4 חודשים ב -80 ° C. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: ניתוח יחס בקרת נשימה. בידוד מיטוכונדריאלי לצורך ניתוחים פונקציונליים נערך במגוון רחב של מינים ומקורות רקמות במכרסמים זכרים ונקבות כאחד, כמו גם בתאי HEK293. גודל הדגימה של כל מין, מקור רקמה ומינים מפורט יחד עם ערכי RCR ממוצעים וערכי 1-1/RCR ± SD. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: מודולציות מומלצות לפרוטוקול בידוד מיטוכונדריאלי עבור רקמות שונות כדי להגדיל את תפוקת החלבון. שינויים בכמויות של פרוטאז וצנטריפוגות מוצגים בהתאם למקור הרקמה. כמויות ממוצעות של חלבון כולל (מ"ג) חושבו מתוצאות בדיקת חלבון BSA ומנפח התרחיף של הגלולה המיטוכונדריאלית הסופית. הערכים מדווחים כממוצע ± SD. הוראות מודגשות הכלולות בעמודת הצנטריפוגה מייעצות אם להשליך, לשמור או לאגד את הסופרנאטנט. השלכה מתייחסת לסילוק הסופרנאטנט במיכל פסולת ביולוגית, בעוד ששמירה ואיגום מתייחסים להעברת הסופרנאטנט לצינור הצנטריפוגה הבא או איסופו לסחרור הסופי, בהתאמה. פרטים נוספים על שינויים בפרוטוקול ניתן למצוא בחלק הדיון. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

דיון

הקפדה על השיטות המתוארות בתמציתיות בפרוטוקול זה תבטיח בידוד של מיטוכונדריה מצומדת היטב מרקמת הלב של מכרסמים קטנים, בנוסף לסוגי רקמות ומקורות אחרים. בסך הכל, התהליך צריך לקחת בסך הכל 3-3.5 שעות, שבמהלכן כל רקמות בעלי החיים, הדגימות והמבודדים צריכים להישאר על קרח ב -4 מעלות צלזיוס ככל האפשר כדי להגביל את ההתפרקות. הליך זה הוא חזק וניתן לשנות אותו במספר דרכים כדי להתאים טוב יותר למטרות הניסוי ולמודלים המנוצלים. אפנון אחד שניתן לבצע בתהליך דיסקציה של רקמות הוא הרחקה של הפרין. הפרין ניתן כדי למנוע היווצרות של קרישי דם³¹ אבל הוא לא הכרחי אם הלב הוא cannulated ו perfused מהר מספיק (בתוך 1.5 דקות מן עריפת הראשי). יתר על כן, זילוח הלב באמצעות CB מומלץ למכרסמים גדולים יותר, ולכן כאשר עובדים עם לבבות עכבר או איברים אחרים מומלץ לכלול שטיפות IB לפני טחינה והומוגניזציה ראשונית. שלב זה מאפשר להשליך דם הנישא מתהליך הנתיחה. שינויים אחרים כוללים שינויים בהומוגניזציה ובמהירויות הצנטריפוגות כדי להגדיל את תפוקת החלבון במיטוכונדריה. אלה שתוארו לעיל נועדו לבידוד מיטוכונדריה לבבית משרקנים וחולדות. חשוב לציין שניתן להתאים את הפרוטוקול הזה לבידוד מיטוכונדריה מכבד, כליות, לבבות עכברים ותאים של מכרסמים. שינויים מומלצים בנפח הפרוטאז, ההומוגניזציה והצנטריפוגה בהתבסס על סוגי רקמות ובעלי חיים ספציפיים מפורטים בהרחבה בטבלה 3.

לאחר היווצרות הגלולה המיטוכונדריאלית המטוהרת משלב הצנטריפוגה הסופי, יש להשהות מחדש את המיטוכונדריה ב- IB מקורר מראש. נפח ה-IB הנוסף תלוי בגודל הגלולה המיטוכונדריאלית, אך הוא כ-80 מיקרוליטר עבור שרקנים וחולדות. אם מבודדים מלבבות עכבר, 60 μL של IB מתווסף להשעיה. כאשר מבודדים לראשונה מיטוכונדריה, מומלץ להוסיף כמויות קטנות יותר של IB כדי לא לדלל את תמיסת המלאי. בשל העקביות של כדורי המיטוכונדריה שנוצרו לאחר טיהור דגימות מהכבד והכליות, הרבה פחות IB (20 μL) יש להוסיף להשעיה. שיטות אחרות מציעות שימוש במתלה מכני באמצעות גירוד שיכול להיות שוחק לקרומים המיטוכונדריאליים ולהפחית את השלמות הכללית^32,33. בעת שימוש בפרוטוקול זה, מומלץ לשטוף בעדינות את הגלולה עם IB כדי לשפר את איכות המיטוכונדריה. במהלך תהליך זה, היזהרו להימנע מיצירת בועות או הפרעה לכדורית עם קצה הפיפטה, שכן הדבר עלול להוביל לקרע קרום ולקיפול שגוי של החלבון³⁴. רק דחיפה לתחנה הראשונה של פיפטה יכולה לעזור להפחית את הסבירות ליצירת בועות. יש לבצע שטיפת פיפטה עדינה עד שכל הגלולה נמצאת בהשעיה. תפוקת ההשעיה הכוללת צריכה להיות 150-200 μL עבור מיטוכונדריה לבבית משרקנים וחולדות ולהיראות בצבע חום בהיר. דגימות מרוכזות יותר יהיו בגוון חום כהה יותר וניתן לדלל אותן כך שיתאימו לטווח ריכוז העבודה הרצוי לאחר כימות החלבון המיטוכונדריאלי.

בדיקות חלבון סטנדרטיות באמצעות BSA הן אופטימליות לכימות חלבון מיטוכונדריאלי³⁵. יש לעכב את בדיקות החלבון ולדגור אותן לפרקי הזמן והטמפרטורות המומלצים כפי שהוגדרו בפרוטוקול היצרן. עבור מיטוכונדריה מבודדת, דגירה ב-37°C למשך 30 דקות מאפשרת פיתוח צבע מפוזר היטב וכימות חלבונים מדויק. בעת כימות הכמות הכוללת של חלבון, מומלץ תחילה לדלל את המיטוכונדריה המרחפת ואת IB ביחסים של 1:50, 1:100 ו- 1:200 כדי להבטיח שתוצאות בדיקת החלבון יהיו בטווח הכיול. פרטים נוספים לגבי אופן ביצוע בדיקות חלבון באמצעות BSA כתקן מסופקים לפי ערכת היצרן, כך שההמלצות המפורטות כאן עשויות שלא להיות ישימות. יש לבצע גם בדיקת ניתוח קיסרי כדי לקבוע את התוכן המיטוכונדריאלי בכל דגימה. בדיקה זו מבוססת היטב ומאפשרת נורמליזציה נוספת אם חוקרים הבדלים ביולוגיים בין תת-סוגים מיטוכונדריאליים³⁶.

לאחר קביעת החלבון, יש לדלל את מלאי המיטוכונדריה כדי להשיג את ריכוז העבודה הסופי הרצוי לבדיקות רספירומטריה. מיטוכונדריה שבודדו משרקנים ולבבות חולדות מדוללים ל-40 מ"ג/מ"ל, ו-5 מיקרוליטר ממלאי זה מתווסף לחדר הנשימה כדי לגרום לריכוז עבודה של 0.1 מ"ג/מ"ל. אם מבודדים מלבבות עכבר יחיד או מכליות וכבד, ייתכן שלא יהיה צורך בדילול של מלאי המיטוכונדריה. ניתן גם להוסיף כמויות גדולות יותר של מיטוכונדריה כדי להשיג את הריכוזים הרצויים. שיעורי צריכת החמצן במצב 2 שהם בין 35-55 pmol/mL/s מקובלים ברוב ניתוחי הספירומטריה²⁸. פרטים הנוגעים לאופן שבו RCR מתבצע ומנותח מוסברים באיור 1 ובסעיף התוצאות המייצגות; עם זאת, חשוב לציין כי הנשימה מונעת על ידי פירובט ומלאט. תנאי מצע אחרים, כגון סוקצינאט ורוטנון, יגרמו לערכי RCR שונים מכיוון שיחס P/O ומשתנים ביו-אנרגטיים אחרים שונים³⁷. השימוש בפירובט ומלאט כדלקים נשימתיים משיג מחזור TCA כמעט מקסימלי וייצור של שווה ערך לחיזור; עם זאת, פעילות מחזור TCA מקסימלית ופונקציית ETS מצומדת מתקבלות עם פירובט 5 mM, 1 mM L-malate ו- 20 mM succinate. כאשר מעוררים זרחן חמצוני כדי לכמת את שיעורי צריכת החמצן במהלך מצב 3, ADP מתווסף בריכוזים לפחות פי 10 מ-K_D המשוער עבור ADP של טרנסלוקטור אדנין נוקלאוטיד³⁸. ניתן להשיג זאת על ידי בולוסים גדולים מ- 350 מיקרומטר ADP, ולכן נעשה שימוש ב- 500 מיקרומטר בכל הבדיקות הניסיוניות. אם משך הזמן של מצב 3 קצר מדי, ניתן להשתמש בריכוזים מיטוכונדריאליים נמוכים יותר כדי להאריך אותו. לניתוח נוסף של הנשימה, ניתן לבצע אפנון לריכוז ADP המוכנס למערכת כדי להתאים טוב יותר פרמטרים ניסיוניים³⁹. כאשר מפתחים לראשונה פרוטוקול זה, נעשה שימוש בבדיקת ציטוכרום C כדי להעריך את שלמות הממברנה החיצונית של המבודדים המיטוכונדריאליים⁴⁰. אם ערכי RCR נמוכים מהטווחים הצפויים, בצע את בדיקת הציטוכרום C כדי להעריך אם הנזק לקרום החיצוני הוא משמעותי. כדי לעשות זאת, להוסיף 10 מיקרומטר של cytochrome C לחדר הנשימה ולאשר כי הגידול בנשימה הוא מתחת 5 או 10% של המדינה 4 שיעור. הטווחים הצפויים נמצאים ממחקרים קודמים שפורסמו והם ספציפיים למינים, רקמות ומצע. אם תוספת של ציטוכרום c מעוררת נשימה במצב 4 מעל 10%, ניתן לחזור על הספין האחרון של 8,000 x g כדי להסיר מיטוכונדריה פגומה. עם זאת, נזק לקרום החיצוני עשוי להיות חלק מפנוטיפ המחלה, ולכן יש לפרש את מבחן הציטוכרום C תוך התחשבות בכך⁴¹. לאחר קבלת ערכי RCR גבוהים באופן עקבי עם השפעות נמוכות (<10%) של ציטוכרום C, בדיקה זו הופכת להכרחית ומומלצת רק אם ערכי RCR נמצאים מחוץ לטווחים המקובלים. אם בדיקת הציטוכרום C היא <10% וערכי RCR נמצאים מחוץ לטווח הצפוי, כמפורט בטבלה 2, חזור על בדיקת הספירומטריה עם RB חדש לאחר שטיפה במים מזוקקים 10 פעמים. אם עדיין נצפים שיעורים נמוכים, יש לבצע ריאגנטים טריים (פירובט, מלאט, EGTA ו- ADP) כדי לאבחן את הבעיה. בנוסף, ניתן לבצע בדיקות ציטוכרום C באמצעות ELISAs ושימוש בצבעים מיטוכונדריאליים כגון TMRE^33,42. בהתאם לסוג הרקמה ולמקור, אפשרויות אלה עשויות להתאים יותר לקביעת שלמות הממברנה החיצונית.

אמנם אין מגבלות משמעותיות של פרוטוקול זה המשמש לבידוד מיטוכונדריה לבבית, אך חשוב לציין כי יש לקחת בחשבון שיקולים מסוימים בעת השימוש בשיטות אלה. איכות המבודדים של המיטוכונדריה מושפעת מאוד מהטמפרטורה ומהזמן שלוקח גם לחורר את הלב וגם להשהות מחדש את הגלולה המטוהרת. לפיכך, ייתכן שתידרש היכרות עם תהליכים אלה כדי להשיג RCR דומים לאלה המדווחים כאן. בנוסף, הרכב המאגרים והתמיסות המשמשים בתהליך הבידוד חשוב מכיוון שהוא משפיע ישירות על שלמות המיטוכונדריה ותפקודה⁴³. מאגרים המפורטים בטבלה 1 מסופקים כסימוכין ואפשרו בידוד של מיטוכונדריה מצומדים היטב במגוון מקורות רקמה, אך ניתן לבצע שינויים כדי להגביל את כמות הכלוריד בניתוחי נשימה, שכן הדבר עלול להפריע לטרנסלוקציה של אדנין נוקלאוטידים ולתפקוד ETS²⁸. ניתן גם לשנות את הרכב החיץ כדי לבודד טוב יותר את המיטוכונדריה בכבד. מכיוון שהכבד גבוה בריכוזי חומצות שומן, מומלץ לשטוף את האיבר והרקמה הטחונה עם חיץ המכיל ריכוזים גבוהים של BSA אם נצפים RCR מחוץ לטווח הצפוי. למרות שהאיכות של מבודדי מיטוכונדריה המתקבלים מחלקי כבד מצומדת היטב ועקבית, שינוי זה עשוי לגרום לשיפור בתפקוד האברונים. כמו כן, יש להכיר בכך שבידוד המיטוכונדריה מתאים המשתמשים בשיטות אלה דורש כמות גדולה של תאים בתרבית, מה שמהווה מגבלה פוטנציאלית. יתר על כן, פרוטוקול זה אינו מתוכנן במיוחד עבור מבודדים תאיים אך הוכח כמוצלח כאשר הוא מיושם. לכן, שיטות בידוד ממוקדות עבור תאים בתרבית עשויות להיות שימושיות יותר. לחלופין, כדי להעריך את איכות המיטוכונדריה, חוקרים עשויים לבחור בבדיקות פלואורסצנטיות כדי לחשב RCR. שיטות ספקטרופלואורומטריות הן בחירה פופולרית, במיוחד אם מופקים כמויות נמוכות יותר של חלבון^44,45.

באופן כללי, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לבודד באופן עקבי מיטוכונדריה לבבית מצומדת היטב מבעלי חיים קטנים כמו שרקנים וחולדות. ניתן לשנות אותו בקלות כדי להגדיל את תפוקת החלבונים על ידי שינוי מהירויות ההומוגניזציה, זמני הצנטריפוגה ומספר הסיבובים כדי לאפשר בידוד מיטוכונדריאלי מלבבות, כבד, כליות ותאים של עכברים. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא כללי וחזק מספיק כדי שהוא ישמש לחקר תפקוד המיטוכונדריה ממינים שאינם יונקים כגון צמדי ים⁴⁶, כמו גם לבצע ניתוח מבני באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים קלאסי וקריו-אלקטרונים^40,47. בעוד שמחקרים רבים שנעשו לאחרונה מתמקדים בחקר ההתנהגות המיטוכונדריאלית במערכות תאים ורקמות שלמות, רוחב ועומק המידע המופק ממיטוכונדריה מבודדים בשיטות אלה חושפים השפעות על מטבולומיקה, עקה חמצונית וייצור ATP שלעולם לא יהיו ללא כשרון. הבידוד של מיטוכונדריה מצומדים היטב מאפשר לחוקרים לחקור היבטים מרכזיים של התפתחות המחלה והתקדמותה, שאינם אפשריים אחרת במודלים של תאים שלמים. בשל הרבגוניות של פרוטוקול זה, ניתן לחקור שינויים באנרגיה מיטוכונדריאלית שנצפו בפתולוגיות כגון מחלות לב וכלי דם, סוכרת והפרעות נוירולוגיות באמצעות המתודולוגיה המתוארת כאן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה
10 מ"ל			לחיתוך איברים וטחינת 50
מ"ל צינורות			צנטריפוגה
אדנוזין 5'-דיפוספט מונופוטסיום מלח דיהידרט	סיגמא	A5285	מבחני רספירומטריה
ערכת בדיקת חלבון BSA תרמו	ריחני	PI23225	כימות חלבון מיטוכונדריאלי
דקסטרוז	סיגמא	DX0145	עבור חוצץ (CB)
אתילן גליקול-ביס(2-אמינו-אתילאתר)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית	סיגמא	E4378	למאגרים (CB ו-IB) ובדיקות רספירומטריה
צינורית זכוכית	Radnoti		חזיר ניסיונות וחולדה לב פרפוזיה
הפרין נתרן חזיר רירית	סיגמא	SRE0027-250KU	הזרקת IP של בעלי חיים
נשימה			אלקטרודה מסוג קלארק; אוקסיגרף עם תאים של 2 מ"ל
תא
Isoflurane	Sigma	792632	הרדמה
חומצה L-מאלית	סיגמא	02288-50G	מבחני רספירומטריה
מגנזיום כלוריד הקסהידרט	סיגמא	M9272	למאגר (RB)
מניטול	סיגמא	MX0214	למזרקי
		מיקרוליטר	גדלים הנעים בין 5– 50 ומיקרו; L
קורא			חייב להיות מסוגל לדגור ב-37 מעלות; C
MOPS	סיגמא	475898	לכל המאגרים
O2 מיכל
OMNI THQ Homogenizer	OMNI International	12-500	הומוגנייזרים דומים של סטטור רוטור יעבדו
פיפטות			נפחים של  2– 20 ומיקרו; L; 20– 200 ומיקרו; L; 200– 1000 ומיקרו; L
אשלגן כלורי	סיגמא	P3911	למאגרים (RB ו-CB)
אשלגן פוספט דו-בסיסי	סיגמא	795496	עבור חוצצים (IB ו-RB)
פרוטאז מ-Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
נתרן כלורי	סיגמא	S9888	עבור מאגר (CB)
נתרן פירובט	פישר ביו-ריאגנטים	BP356-100	בדיקות רספירומטריה
סוכרוז	סיגמה	8510-OP	עבור חיץ (IB)
		דיסקציה כירורגית	תלוי במקור בעלי חיים ורקמות
צנטריפוגה			חייבת להתקרר ל-4 מעלות; C