מחקרים ביואנרגטיים ומטבוליים על מיטוכונדריה חשפו את תפקידם הרב-גוני במחלות רבות, אך שיטות הבידוד של אברונים אלה משתנות. השיטה המפורטת כאן מסוגלת לטהר מיטוכונדריה באיכות גבוהה ממקורות רקמה מרובים. האיכות נקבעת על ידי יחסי בקרת נשימה ומדדים אחרים המוערכים עם רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
בידוד מיטוכונדריאלי נהוג מזה עשרות שנים, בעקבות נהלים שנקבעו על ידי חלוצים בתחומי הביולוגיה המולקולרית והביוכימיה לחקר ליקויים מטבוליים ומחלות. איכות מיטוכונדריאלית עקבית נחוצה כדי לחקור כראוי פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית וביו-אנרגטיקה; עם זאת, שיטות בידוד רבות ושונות שפורסמו זמינות לחוקרים. למרות שאסטרטגיות ניסוי שונות דורשות שיטות בידוד שונות, העקרונות והנהלים הבסיסיים דומים. פרוטוקול זה מפרט שיטה המסוגלת לחלץ מיטוכונדריה מצומדים היטב ממגוון מקורות רקמה, כולל בעלי חיים קטנים ותאים. השלבים המתוארים כוללים דיסקציה של איברים, טיהור מיטוכונדריה, כימות חלבונים ובדיקות בקרת איכות שונות. מדד בקרת האיכות העיקרי המשמש לזיהוי מיטוכונדריה באיכות גבוהה הוא יחס בקרת הנשימה (RCR). RCR הוא היחס בין קצב הנשימה במהלך זרחן חמצוני לקצב בהיעדר ADP. נדונים מדדים חלופיים. בעוד ערכי RCR גבוהים ביחס למקור הרקמה שלהם מתקבלים באמצעות פרוטוקול זה, מספר שלבים יכולים להיות אופטימליים כדי להתאים לצרכים האישיים של החוקרים. הליך זה חזק והביא באופן עקבי למיטוכונדריה מבודדים עם ערכי RCR מעל הממוצע במודלים של בעלי חיים ובמקורות רקמות.
מבוא
מיטוכונדריה הם אברונים תת-תאיים המבססים תנאים אנרגטיים ציטופלזמיים המותאמים לתפקודי תאים ספציפיים. בעוד שמחקרים ברמת התא, הרקמות והאורגניזמים יכולים לספק תובנות לגבי תפקוד המיטוכונדריה, בידוד האבונים מציע רמה של שליטה ניסיונית שאינה אפשרית אחרת. בידודים מיטוכונדריאליים מבוצעים מאז שנות ה-40 של המאה ה-20, ומאפשרים מחקרים מכניסטיים של חילוף חומרים ונשימה במגוון תאים ורקמות 1,2. הרלוונטיות ההיסטורית של המיטוכונדריה מתועדת היטבגם 3. בתור היצרנים העיקריים של ATP, מיטוכונדריה ממלאים תפקידי מפתח רבים החיוניים לתפקוד מיטבי של התאים והאיברים4
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
השימוש והטיפול בכל בעלי החוליות בוצעו בהתאם לפרוטוקולים מאושרים שנבדקו והתקבלו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת מישיגן. פרוטוקול זה תוכנן תוך שימוש בשרקנים לבקנים זכרים ונקבות כאחד של הארטלי וחולדות Sprague Dawley (SD). לצורך בידוד מיטוכונדריה לבבית משרקנים, הוקרבו בעלי חיים בגילאי 4-6 שבועות (300-450 גרם). מיטוכונדריה לבבית מחולדות SD משני המינים התקבלו בין הגילאים 10-13 שבועות (250-400 גרם). מתכונים למאגרים מתוארים בטבלה 1 ויש להכין אותם מראש. פרטים על הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנה ניסיונית....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עם השלמת בידוד המיטוכונדריה, יש לבדוק את האיכות והפונקציונליות של המבודדים באמצעות כימות קצב צריכת החמצן (JO2) באמצעות ספירומטריה ברזולוציה גבוהה. כדי לעשות זאת, מלאי המיטוכונדריה דולל ל -40 מ"ג / מ"ל כדי לאפשר ריכוזי עבודה של 0.1 מ"ג / מ"ל ב -2 מ"ל RB עבור כל בדיקות הספירומטריה באמצעות מיטוכונדריה לב מבודדת. הנשימה תודלקה על ידי 5 mM נתרן פירובט ו 1 mM L-malate בנוכחות 1 mM EGTA, כלטור סידן, והורשה לאזן במשך 5 דקות כדי לבסס נשימה מצב 2. במצב זה, קצב צריכת החמצן צריך להיות בממוצע 45-55 pmol/mL/s או 27.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הקפדה על השיטות המתוארות בתמציתיות בפרוטוקול זה תבטיח בידוד של מיטוכונדריה מצומדת היטב מרקמת הלב של מכרסמים קטנים, בנוסף לסוגי רקמות ומקורות אחרים. בסך הכל, התהליך צריך לקחת בסך הכל 3-3.5 שעות, שבמהלכן כל רקמות בעלי החיים, הדגימות והמבודדים צריכים להישאר על קרח ב -4 מעלות צלזיוס ככל האפשר כדי להגביל את ההתפרקות. הליך זה הוא חזק וניתן לשנות אותו במספר דרכים כדי להתאים טוב יותר למטרות הניסוי ולמודלים המנוצלים. אפנון אחד שניתן לבצע בתהליך דיסקציה של רקמות הוא הרחקה של הפרין. הפרין ניתן כדי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין מה לחשוף.
תודות
ברצוננו להודות לדניאל א. בירד ולקליאן ס. וינקוטה על תרומתם הבסיסית לפרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי NSF CAREER grant MCB-2237117.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה | |||
| 10 מ"ל | לחיתוך איברים וטחינת 50 | ||
| מ"ל צינורות | צנטריפוגה | ||
| אדנוזין 5'-דיפוספט מונופוטסיום מלח דיהידרט | סיגמא | A5285 | מבחני רספירומטריה |
| ערכת בדיקת חלבון BSA תרמו | ריחני | PI23225 | כימות חלבון מיטוכונדריאלי |
| דקסטרוז | סיגמא | DX0145 | עבור חוצץ (CB) |
| אתילן גליקול-ביס(2-אמינו-אתילאתר)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית | סיגמא | E4378 | למאגרים (CB ו-IB) ובדיקות רספירומטריה |
| צינורית זכוכית | Radnoti | חזיר ניסיונות וחולדה לב פרפוזיה | |
| הפרין נתרן חזיר רירית | סיגמא | SRE0027-250KU | הזרקת IP של בעלי חיים |
| נשימה | אלקטרודה מסוג קלארק; אוקסיגרף עם תאים של 2 מ"ל | ||
| תא | |||
| Isoflurane | Sigma | 792632 | הרדמה |
| חומצה L-מאלית | סיגמא | 02288-50G | מבחני רספירומטריה |
| מגנזיום כלוריד הקסהידרט | סיגמא | M9272 | למאגר (RB) |
| מניטול | סיגמא | MX0214 | למזרקי |
| מיקרוליטר | גדלים הנעים בין 5– 50 ומיקרו; L | ||
| קורא | חייב להיות מסוגל לדגור ב-37 מעלות; C | ||
| MOPS | סיגמא | 475898 | לכל המאגרים |
| O2 מיכל | |||
| OMNI THQ Homogenizer | OMNI International | 12-500 | הומוגנייזרים דומים של סטטור רוטור יעבדו |
| פיפטות | נפחים של 2– 20 ומיקרו; L; 20– 200 ומיקרו; L; 200– 1000 ומיקרו; L | ||
| אשלגן כלורי | סיגמא | P3911 | למאגרים (RB ו-CB) |
| אשלגן פוספט דו-בסיסי | סיגמא | 795496 | עבור חוצצים (IB ו-RB) |
| פרוטאז מ-Bacillus licheniformis | Sigma | P5459 | |
| נתרן כלורי | סיגמא | S9888 | עבור מאגר (CB) |
| נתרן פירובט | פישר ביו-ריאגנטים | BP356-100 | בדיקות רספירומטריה |
| סוכרוז | סיגמה | 8510-OP | עבור חיץ (IB) |
| דיסקציה כירורגית | תלוי במקור בעלי חיים ורקמות | ||
| צנטריפוגה | חייבת להתקרר ל-4 מעלות; C |
מקורות
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
- Claude, A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
