מאמר שיטה

נהלי הפעלה והכלה ביולוגית של מתקן לעכברי מעבדה עם מיקרוביום טבעי: נוהל אימונופנוטיפ

DOI:

10.3791/67100

⸱

13 בדצמבר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1BIH QUEST Center for Responsible Research, Berlin Institute of Health (BIH) at Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R), 3Institute of Microbiology, Infectious Diseases and Immunology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 4Experimental and Clinical Research Center (ECRC) & Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft (MDC), 5Department of Experimental Neurology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, Klinik und Hochschulambulanz für Neurologie, 6Center for Stroke Research Berlin, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 7Einstein Center for Neuroscience, 8German Center for Cardiovascular Research (DZHK), partner site Berlin, 9Department of Neuropathology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 10Cluster of Excellence, NeuroCure, 11German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Berlin, 12Department of Hepatology and Gastroenterology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 13Institute of Animal Welfare, Animal Behavior and Laboratory Animal Science, Freie Universität Berlin, 14Forschungseinrichtungen für Experimentelle Medizin/FEM, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 15Department of Pediatric Respiratory Medicine, Immunology and Critical Care Medicine, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 16German Center for Lung Research (DZL), associated partner site, Berlin, 17Department of Infectious Diseases, Respiratory Medicine and Critical Care, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 18Division of Toxicology, Institute of Clinical Pharmacology and Toxicology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 19Institute of Immunology, Charité-Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 20German Cancer Research Center, 21German Cancer Consortium, partner site Berlin, 22Department of Radiology (including Pediatric Radiology), Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 23Department of Microbiome Research, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), 24Department of Medicine II, Faculty of Medicine, Medical Center - University of Freiburg

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים את המבנה ונהלי ההפעלה, כולל אמצעי בלימה מיקרוביאליים של מתקן ל"עכברי פרא" באמצעות דגימת דם לאימונופנוטיפ כדוגמה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש בעכברי מעבדה בעלי מיקרוביום טבעי, כגון "עכברי פרא", מציע כלי מחקר מבטיח הן למדע בסיסי והן למדע יישומי בשל הדמיון הרב שלהם לסופראורגניזם האנושי. עם זאת, הרבייה והתחזוקה של עכברים אלה, המכילים מיקרוביום מגוון הכולל חיידקים, וירוסים וטפילים, מציבים אתגרים משמעותיים למתקני גידול בעלי חיים במוסדות מחקר. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פותח קונספט של מתקן מיוחד לשיכון "עכברי פרא" ב-Charité - Universitätsmedizin Berlin. גישה זו כללה תכנון מתקן עם מאפיינים מבניים ספציפיים ופרוטוקולים תפעוליים כדי להכיל ביעילות את המיקרוביום הטבעי, ובכך להגן על אזורים עם תקני היגיינה גבוהים יותר.

מודגמת מתודולוגיה לדגימת דם הן מ-SPF והן מ"עכברי פרא" לאימונופנוטיפ, המדגישה את זרימת העבודה ואמצעי ההכלה הביולוגית המיושמים במתקן. תוצאות יוצאות דופן מגלות כי "עכברי פרא" שנחשפו למיקרוביום טבעי מפתחים אוכלוסיות תאי חיסון מובהקות, אשר מופחתות משמעותית בעכברים שגודלו ומתוחזקים בתנאי היגיינה מחמירים.

חשיבותו של מחקר זה טמונה בפוטנציאל שלו לספק לחוקרים גישה לעכברים בעלי מיקרוביום טבעי ומערכת חיסון בוגרת הדומה לזו של בני אדם בוגרים. גישה זו יכולה לשפר את יכולת התרגום של ממצאים פרה-קליניים לפרקטיקה קלינית, ובכך לקדם את תחום המחקר הביו-רפואי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויים בעכברים עדיין הכרחיים במדע בסיסי ויישומי, כגון מחקר פרה-קליני וטוקסיקולוגי. עם זאת, הסטנדרטיזציה של ההיגיינה בסביבות מעבדה, שמטרתה להפחית את הרעש הביולוגי ולמזער את השונות בתוצאות הניסוי, הובילה להחרגה של מיקרוביוטה טבעית במידה רבה. לפיכך, התנאים שבהם נולדים ומוחזקים עכברי מעבדה סטנדרטיים היגייניים ונטולי פתוגנים (SPF) שונים מהתנאים בעולם האמיתי שאליהם נחשפים בני אדם ובעלי חיים בדרך כלל. חוסר ההתאמה הזה בין תנאי המעבדה לסביבות הטבעיות שבהן מתרחשות מחלות אנושיות מוליד את "כשל הסטנדרטיזציה": ההנחה שמזעור השונות בתנאי הניסוי משפר את תוצאות התרגום. עם זאת, במציאות, זה מגביל את הרלוונטיות הביולוגית של הממצאים 1,2. לדוגמה, מחקרים הראו כי היעדר מגוון מיקרוביאלי וסביבתי בעכברי SPF יכול לגרום למערכת חיסון לא מפותחת, ולערער את תוקפם של מחקרים אימונולוגיים ופרה-קליניים3.

הוצעו מספר גישות לטיפול בשונות ביולוגית במודלים של עכברים, שלכל אחת מהן יתרונות ומגבלות משלה, כולל מגורים משותפים עם עכברי פרא ועכברי חיות מחמד 3,4,5,6,7,8, חשיפה רציפה לקומנסל 9, החזקת בעלי החיים במכלאות חיצוניות10 או על מצעים מבעלי חיים גדולים11, והשתלות צואה מעכברי בר12. מודל עכברי חדש ומבטיח למחקר פרה-קליני וטוקסיקולוגי הוא מודל "עכברי פרא", המורכב מזני עכברי מעבדה סטנדרטיים המכילים מיקרוביום טבעי13. "עכברי פרא" אלה נוצרים על ידי השתלת עוברים מזני עכברי מעבדה לעכברים שנלכדו בטבע. במהלך הלידה, זני עכברי המעבדה רוכשים את המיקרוביום הטבעי של אמהותיהם הפונדקאיות, ומחקים את החיסון הטבעי המתרחשבמהלך הלידה האנושית. ניתן לגדל "עכברי פרא" כמו כל זן אחר של עכברי מעבדה, כאשר המיקרוביום הטבעי שלהם נשמר לאורך דורות.

"עכברי פרא" מארחים מיקרוביוטה מגוונת - כולל חיידקים, וירוסים וטפילים - שבדרך כלל אינם נכללים במתקני עכברי SPF. כתוצאה מכך, שמירה על מיקרוביום טבעי במתקני מחקר מציבה אתגרים, שכן יש להכיל את החיידקים הללו מבלי לפגוע בתקני ההיגיינה הכוללים של SPF.

ב-Charité - Universitätsmedizin Berlin, הוקם מתקן ייעודי ל"עכברי פרא", המופרד מאזורי ה-SPF על ידי אמצעי הכלה ביולוגית קפדניים. המתקן כולל חדרי רבייה וניסויים, שמבטיחים שהמיקרוביום הטבעי של "עכברי פרא" נשמר בזמן שאזורי SPF מוגנים (איור 1).

הזוגות המייסדים של המושבה של שאריטה יובאו ממושבת "עכברי הבר" שהוקמה במחלקה לחקר המיקרוביום, בית החולים האוניברסיטאי ארלנגן, פרידריך-אלכסנדר-אוניברסיטת ארלנגן-נירנברג (FAU), גרמניה. הם מקבלים תעודת בריאות ומנוטרים באמצעות פאנל מורחב לפתוגנים זואונוטיים לפני ייבוא מייסדי המושבה. זקיפים ישמשו לניטור המיקרוביום לאורך זמן. גם SPF וגם "עכברי פרא" שוכנים באותם תנאים. העכברים מגודלים ומוחזקים באופן מועדף בכלובים מאווררים בנפרד (IVC) סוג II ארוך בקבוצות של חמישה עכברים. הטמפרטורה בתוך המתקן היא 22 מעלות צלזיוס, ומחזור האור/חושך הוא 12 שעות. העכברים מקבלים צ'או סטנדרטי על בסיס דגנים ומי ברז. עיקור מצעים ופריטי העשרה מיותרים עבור "עכברי פרא". עם זאת, חיטוי פריטים אלה מונע ערבוב של חומרים באזורים שבהם מאוחסנים עכברי SPF.

בפרוטוקול זה, מודגמים הליכי האימונופנוטיפ הן עבור SPF והן עבור "עכברי פרא", המדגישים את פרוטוקולי ההכלה המיקרוביאלית המחמירים במתקן "עכבר פרא". אמצעים אלה מבטיחים את שלמות סביבות SPF תוך מתן היתרונות של עבודה עם עכברים הנושאים מיקרוביום טבעי.

figure-introduction-1
איור 1: פריסת המתקן עבור עכברי Wildling. E1 = גישה למתקן. החצים מציינים את נתיב הכניסה למתקן. E2 = גישה לתא זרימת האוויר הלמינרי מחוץ למתקן. PA = נעילת אוויר לכוח אדם עם מקלחת אוויר. AS = מקלחת אוויר. R1, R2 = חדרים לגידול עכברי פרא. R3 = מקום להחזקת עכברי פרא. R4 = מקום להחזקת עכברי SPF. PR1 = חדר פרוצדורות לעכברי SPF. PR2 = חדר פרוצדורות לעכברי פרא. SB = ספסל עבודה סטרילי. EE = יציאות חירום. CR = חדר הלבשה מול תא ה-LAF. LAF = תא זרימת אוויר למינרי להתערבויות תחת זרימת אוויר מגן. A = אוטוקלאב. ER = חדר ציוד. חיצים ירוקים מייצגים מסלולים נגישים בעת עבודה עם בעלי חיים SPF, וחצים צהובים מציינים נתיבים זמינים לעבודה עם עכברי Wildling לאחר מקלחת אווירית. חיצים כחולים מציינים גישה לצוות החקלאות בלבד. הקו האדום מסמן את קיר הזכוכית בתוך תא ה-LAF, המחלק את החלל לשני חלקים שניתן לגשת אליהם מ-E1 דרך PR2 או מ-E2 דרך CR. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המתקן ל"עכברי בר" והנהלים הקשורים לבעלי חיים אושרו על ידי המשרד הממשלתי האחראי לניסויים בבעלי חיים, "Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin" (LAGeSo). השלבים החשובים ביותר של הפרוטוקול מסוכמים באיור 2.

1. קבלת גישה למתקן Wilding

  1. קבל היכרות אישית עם נהלי ההפעלה וההכלה הביולוגית של המתקן מהממונה האחראי על רווחת בעלי החיים.
  2. קבל את מפתח המשדר כדי להיכנס למתקן עבור "עכברים פראיים" ולהזמין את חדרי ההליכים באמצעות מערכת ההזמנות המקוונת.

2. כניסה למתקן ל"עכברי פרא"

  1. הפקידו את הבגדים בחדר ההלבשה.
  2. החליפו לבגדים באזור: מכנסיים, קסאק וכיסויי נעליים חד פעמיים (איור 3).

3. דגימת דם מעכברי SPF באזור ה-SPF

  1. העבירו את עכברי ה-SPF (זכר ונקבה, 8-20 שבועות) מהחדר בו הם מוחזקים (R4) לחדר ההליכים לבעלי חיים SPF (PR1) בכלוב IVC סגור.
  2. הפעל את ספסל הזרימה הלמינרית וחטא את משטח סביבת העבודה עם 70% אתנול נפח. עבדו בתוך הספסל.
  3. בדוק את הצינורות הנימים לאיתור חלקים שבורים או סדוקים כדי למנוע סיכון מוגבר לשבירה או נזק.
  4. בהרדמה כללית קצרה עם איזופלורן (אינדוקציה ב-5% איזופלורן באוויר רפואי מועשר בחמצן, ואחריו 1.5%-2.0% לתחזוקה), לאחר אובדן רפלקס נסיגת הדוושה (כפי שמצוין באמצעות צביטת הבוהן), דחסו את ורידי הצוואר של העכברים על ידי אחיזה בשרוול הצוואר.
  5. בעזרת יד אחת, אבטח את ראש החיה באמצעות האגודל והאצבע. הכנס נימים טריים לתוך הקנתוס המדיאלי של העין מתחת לקרום המניק בזווית של 45 מעלות. ודא שהנימים ממוקמים בין גלגל העין למסלול הגרמי של העין.
    הערה: כדי למנוע טראומה, אל תתנו לקצה הצינור הנימי לגעת במשטח העין.
  6. הכנס את הנימים דרך קרום הסינוס בתנועה סיבובית צירית עדינה. המשך לסובב את הצינור בחלק האחורי של המסלול עד לזרימת הדם. אסוף לפחות 15 מיקרוליטר דם בצינור איסוף דם המכיל חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) (כטיפה אחת).
  7. לפני הסרת הנימים, שחרר את האחיזה על קשקוש הצוואר כדי לשמור על דימום לתוך הרקמה למינימום. כדי להבטיח המוסטזיס טוב, השתמש בפד גזה נקי או ספוגית כדי לעצור את הדימום.
  8. סובב מעט את הצינור כדי לערבב דם ו-EDTA. אין לנער את הצינור. אחסן את דגימת הדם על קרח.
  9. יש לחטא את משטח העבודה ולכבות את ספסל הזרימה הלמינרית. החזר עכברי SPF ב- IVC סגור לחדר הדיור SPF (R4).

4. כניסה לאזור עבור "עכברי פרא"

  1. הסר נעליים וגרביים בחדר הכניסה של מקלחת האוויר (PA). לבשו גרבי שטח וציוד מגן אישי לכל הגוף (PPE) המורכב מסרבל Tyvek, רשת לשיער, במידת הצורך, כפפות כותנה, כפפות ניטריל ומסכות פנים (איור 3).
  2. היכנסו למקלחת האוויר בגרביים דרך כיסוי הרצפה הדביק. בזמן מקלחת אוויר, הרימו את הזרועות ובצעו סיבוב של 360 מעלות.
  3. צא ממקלחת האוויר ונעל נעלי אזור בצד השני.

5. דגימת דם מ"עכברי פרא"

  1. העבירו "עכברי פרא" (זכר ונקבה, 8 - 20 שבועות) מהחדר בו הם מוחזקים (R3) בכלוב IVC סגור לחדר ההליכים (PR2).
  2. הפעל את ספסל הזרימה הלמינרית וחטא את משטח סביבת העבודה.
  3. בצע את ההליכים המתוארים לדגימת עכברי SPF בסעיף 3, שלבים 2-8.
  4. לאחר השלמת דגימת הדם, החלף כפפות. חיטוי כל החומרים והמשטחים. כבה את ספסל הזרימה הלמינרית.

6. ייצוא דגימות דם מאזור "עכברי פרא" דרך ארון זרימת האוויר הלמינרית (LAF)

הערה: חדר ההליכים (PR2) מכיל ארון LAF, המשמש כמנעול חומרים וחדר התערבות סטרילי. הדגימות מועברות החוצה דרך תא ה-LAF. החלק הפנימי נגיש הן מבפנים (דרך E1 ו-PR2) והן מבחוץ (דרך E2 ו-CR) של אזור Wildling ומחולק באמצע על ידי קיר זכוכית עם דלת הזזה (איור 1). שני אנשים נדרשים לייצא חומרים: אדם 1 (בתוך אזור הפרא [דרך PR2]) יבצע את שלבים 6.1 ו-6.2. אדם 2 (מחוץ לאזור Wildling [דרך E2]) יבצע את שלבים 6.3-6.5.

  1. חיטוי מיכלי דגימה. הסירו דוגמאות מיכלים דרך דלת ההזזה בקיר הזכוכית של תא ה-LAF.
  2. לאחר השלמת העברת מיכלי הדגימה לאדם 2, קבל ביגוד מגן מאדם 2 (לובש ביגוד מגן במנעול הסמוק של התא) בצד השני של תא הנוסעים והשליך אותו. חיטוי כל המשטחים.
  3. לבש ביגוד מגן ב-LAF הגישה מול תא ה-LAF (CR, איור 1).
  4. קבל מיכלי דגימה מחוטאים מאזור Wildling ללא מגע דרך דלת ההזזה בקיר הזכוכית של תא ה-LAF.
  5. הסירו את בגדי המגן והעבירו אותם דרך דלת ההזזה לאזור הפנימי של תא ה-LAF לסילוק.

7. יציאה מהמתקן ל"עכברי פרא"

  1. השאירו אוברול חד פעמי ונעלי שטח בתוך האזור. יש להשליך רשת לשיער, כפפות גומי ומסכת פנים.
    הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בנעליים ואוברולים.
  2. היכנס מיד למקלחת האוויר בגרבי האזור. הרימו ידיים ובצעו סיבוב של 360 מעלות בזמן מקלחת אוויר.
  3. צאו ממקלחת האוויר והניחו גרבי אזור בקולט הכביסה. לבשו את הגרביים והנעליים וכיסויי נעליים חד פעמיים. הפקידו בגדים בחדר ההלבשה באספן הכביסה. החלפה לבגדים בחדר ההלבשה

8. עיבוד וניתוח דגימות דם

  1. הביאו דגימות דם למעבדה.
    1. הכן קוקטייל מכתים נוגדנים מצומד פלואורופור: לכל דגימה, הוסף 0.25 מיקרוליטר של Alexa Fluor 700 נגד עכבר CD45, 0.25 מיקרוליטר של שרשרת TCR-β נגד עכבר Brilliant Violet 605, 0.25 מיקרוליטר של APC נגד עכבר CD4, 0.25 מיקרוליטר של Brilliant Violet 785 נגד עכבר CD8, 0.25 מיקרוליטר של FITC נגד עכבר CD44 ו-0.25 מיקרוליטר של נוגדן CD62L נגד עכבר PerCP/Cyanine5.5 ל-50 מיקרוליטר של מאגר ציטומטריית זרימה (מי מלח עם חוצץ פוספט, 2 מ"מ EDTA, 0.1% אלבומין בסרום בקר, 4 מעלות צלזיוס). שמור בחושך על קרח עד שלב 8.8.
      הערה: ניתן להתאים את הפלואורופורים המשמשים לתצורת ציטומטר הזרימה שישמש לרכישת דגימה.
  2. חיטוי צינורות איסוף דם. הוסף 2 מ"ל של מאגר ציטומטריה בזרימה קרה כקרח לצינור פוליסטירן תחתון עגול של 5 מ"ל. הניחו את הצינור על קרח.
  3. צינור איסוף דם פתוח. הוסף 10 מיקרוליטר דם לצינור המכיל את מאגר ציטומטריית הזרימה ומערבולת הדופק.
  4. יש להסתובב בטמפרטורה של 400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  5. שאפו את הסופרנטנט. הוסף 1 מ"ל של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות (RBC), מערבולת דופק ודגירה למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  6. הוסף 100 מיקרוליטר של 10x PBS. יש להסתובב בטמפרטורה של 400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  7. חזור על שלבים 8.5-8.6.
  8. שאפו את הסופרנטנט. הוסף 50 מיקרוליטר של קוקטייל מכתים נוגדנים, מערבולת, ודגירה למשך 20 דקות על קרח בחושך.
  9. הוסף 1 מ"ל של מאגר ציטומטריית זרימה. יש להסתובב בטמפרטורה של 400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  10. שאפו את הסופרנטנט. הוסף 180 מיקרוליטר של מאגר ציטומטריית זרימה.
  11. הוסף 20 מיקרוליטר של כתם תאים מתים כחולים של SYTOX (ריכוז סופי 1:1000) להבחנה בין חיים / מתים.
  12. רכוש דגימות על ציטומטר זרימה ונתח את הנתונים באמצעות תוכנת רכישת ציטומטר זרימה או תוכנית ניתוח נתוני ציטומטריית זרימה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"עכברי בר" עלולים להכיל מיקרואורגניזמים שאינם נכללים בדרך כלל במתקני SPF, מה שמציב אתגר לשיטות גידול בעלי חיים במוסדות מחקר המקיימים תקני היגיינה מחמירים. במהלך 4 השנים האחרונות, מדענים ווטרינרים ב-Charité - Universitätsmedizin Berlin והמרכז הגרמני להגנה על חיות מעבדה (Bf3R) פיתחו מתקן המוקדש לעכברים עם מיקרוביום טבעי, המשלב אמצעי הכלה ביולוגית מחמירים באמצעות מאמץ משותף (איור 1). כדי לממש את התכנון הזה, מתקן עכברים קיים עבר שחזור נרחב, כולל התקנת מקלחת אוויר ותא זרימת אוויר למינרית. האזורים שבהם מגדלים ומוחזקים עכברי "עכברי פרא" ו-SPF מופרדים על ידי מקלחת האוויר ובשני האזורים יש חדרי פרוצדורות ייעודיים. חומר יציב בחום עוזב את האזור עבור "עכברי פרא" רק דרך החיטוי, בעוד שחומרים תרמו-לביליים, כגון דגימות, ניתנים לייצא דרך ארון ה-LAF להמשך עיבוד באזורי מעבדה (איור 2). הקפדה על כל אמצעי ההכלה הביולוגית חיונית למניעת זיהום של אזורים בהם נשמרים תנאי ההיגיינה של מקדם הגנה SPF (איור 3). ביחד, אמצעי התכנון וההכלה הביולוגית של המתקן ל"עכברי בר" ב-Charité - Universitätsmedizin Berlin מספקים למדענים את ההזדמנות לערוך מחקר עם עכברים המכילים מיקרוביום טבעי תוך מניעת התפשטות של מיקרואורגניזמים לאזורים במתקן בעלי החיים עם רמות היגיינה גבוהות יותר.

זרימה ציטומטרית היא שיטת תקן הזהב באימונולוגיה תאית ומשמשת לחקירת אוכלוסיות תאי חיסון בדם וברקמות בתגובה לתנאי סביבה משתנים. לדוגמה, לבני אדם בוגרים יש מספר ניכר של תאי זיכרון T המסתובבים בדם, המתפתחים עם חשיפה למיקרואורגניזמים מהסביבה3. כאן, זרימה ציטומטרית שימשה כדי לחקור תאי זיכרון T בדם של עכברים שגודלו ונשמרו בתנאי SPF ובדם של "עכברים פראיים" (איור 4). "עכברי פרא" המתיישבים במיקרוביום טבעי, מציגים אוכלוסייה מובחנת של תאי T זיכרון. לעומת זאת, עכברים שגודלו והוחזקו בתנאי SPF הפחיתו מאוד את תאי הזיכרון T במחזור הדם. לפיכך, זרימה ציטומטרית יכולה לאפיין את ההשפעה של סביבות מיקרוביאליות שונות על תא החיסון. ניתן להגדיל את גרנולציה של הנתונים על ידי הכללת סמנים נוספים של תאי חיסון. גישות שפותחו לאחרונה בזרימה ציטומטרית, כגון ציטומטריה לפי זמן טיסה (CyTOF) וציטומטריית זרימה ספקטרלית, מאפשרות רכישת מידע על מספר רב של פרמטרים ובכך להרחיב את מספר אוכלוסיות התאים החיסוניים (תת-) שניתן לכמת באותה דגימת דם ורקמות. יתר על כן, ניתן להעריך את ייצור הציטוקינים התאיים גם על ידי זרימה ציטומטרית, המספקת תובנות לגבי תפקוד התאים בתגובה למיקרוביום טבעי.

figure-results-1
איור 2: זרימת עבודה במתקן Wildling. דגימת דם ועיבוד דגימות הן דוגמאות אך ניתן להחליף אותן בהליכים אחרים, כגון התערבויות כירורגיות עם דגימת רקמות והיסטולוגיה. לקיצורים, ראה מקרא איור 1 . אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 3: השוואה בין דרישות ציוד מגן אישי (PPE) עבור אזורי SPF ו-Wildling. באזור ה- SPF (משמאל), PPE סטנדרטי מורכב משכבה אחת של ביגוד מגן. לעומת זאת, אזור הפרא (מימין) דורש תהליך PPE בן שלושה שלבים לפני הכניסה למקלחת האוויר: קאסאק (תחתון מגן = שלב 1) נלבש מתחת לאוברול (שלב 2). שכבה נוספת זו מסייעת בשמירה על היגיינה ומניעת זיהום צולב בין אזורים. לאחר מקלחת האוויר, יש לנעול נעליים ייעודיות לאזור Wildling (שלב 3). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 4: אימונופנוטיפ של "עכברי פרא". דגימות דם מעכברי SPF זכרים (n = 5 עכברים ו"עכברי פרא" (n = 5 עכברים), בני 14 שבועות, הוכתמו בקוקטייל של נוגדנים מצומדים פלואורופור כנגד CD45, שרשרת TCR-β, CD4, CD8, CD44 ו-CD62L. מספרים הם היחס בין שער ההורים ± סטיית התקן. אסטרטגיית השער מוצגת עבור עכברי SPF, למעט שני הכתמים האחרונים מ-SPF ו-"Wildling mee". ב"עכברים פראיים" תאי T מרכזיים ואפקטיביים גדלים בהשוואה לעכברים שגדלים ומתוחזקים בתנאי SPF. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברים עם מיקרוביום טבעי הם כלי מחקר מבטיח למדע בסיסי ויישומי בגלל הדמיון הרב יותר שלהם לסופראורגניזם האנושי 3,9,10,11,12. ניסיונות לשלב מורכבות ביולוגית במודלים של עכברים הובילו לפיתוח גישות שונות, שלכל אחת מהן יתרונות ומגבלות משלה 3,7,8,9,10,11,12. "עכברי פרא" משלבים את היתרונות של סביבת מעבדה מבוקרת עם מיקרוביום טבעי. גישה זו שומרת על יציבות בתנאי ניסוי תוך שמירה על המגוון המיקרוביאלי הטבעי הדרוש לחקר אינטראקציות ביולוגיות מורכבות. כתוצאה מכך, טיפולים ביו-רפואיים שפותחו ונבדקו ב"עכברי פרא" טומנים בחובם פוטנציאל רב לתרגום מוצלח ליישומים קליניים.

עם זאת, עדיין יש לקבוע באילו מודלים של מחלה פרה-קלינית "עכברי פרא", עדיפים על עכברי SPF. יתר על כן, עכברים עם מיקרוביום טבעי מכילים מיקרואורגניזמים כגון תולעים מדבקות מאוד שבדרך כלל אינן נכללות במתקנים מוסדיים. לכן, גידול ועבודה עם עכברים אלה מציבים אתגרים לשיטות גידול בעלי חיים במוסדות מחקר.

הקמת מתקן ל"עכברי פרא" הייתה כרוכה במאמץ משותף של מדענים, וטרינרים ופקידי מוסדות ב-Charité - Universitätsmedizin, המרכז הגרמני להגנה על חיות מעבדה (Bf3R) ואוניברסיטת פרידריך-אלכסנדר-ארלנגן-נירנברג (FAU). לאחר פיתוח קונספט המתקן, מתקן עכברים קיים עבר שחזור נרחב כדי לשלב אמצעי הכלה ביולוגית מחמירים. המתקן מוסמך לפעולות בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL-2) בנוגע למחקר עם פתוגנים אנושיים.

כאן, נהלי הפעלה והכלה ביולוגית במתקן עבור "עכברי פרא" מתוארים באמצעות דגימת דם לאימונופנוטיפ על ידי זרימה ציטומטרית כדוגמה. הקפדה על אמצעי הכלה ביולוגית בזמן העבודה במתקן עבור "עכברי פרא" היא חובה כדי למנוע התפשטות של מיקרואורגניזמים לאזורים אחרים במתקן בעלי החיים. זה כולל הגבלת הגישה למתקן לכמה שפחות אנשים לפי קבוצת המחקר. בנוסף, נדרשת פגישת היכרות חובה הנערכת על ידי קצין רווחת בעלי החיים המוסדיים לפני קבלת גישה ראשונית למתקן. מידע כללי ונהלי הפעלה סטנדרטיים (SOP) לעבודה בתוך מתקן Wildling זמינים גם באתר פנימי ("Wildling wiki")14,15.

בזמן העבודה בתוך המתקן, יש ללבוש PPE כראוי. לדוגמה, חיוני לוודא שלא ייחשף שיער מחוץ לרשת השיער, מכיוון שביצים של טפילים עלולות להיצמד אליה. אם הניסוי כולל גם "עכברי פרא" וגם עכברי SPF, יש לטפל תחילה בעכברי SPF. האזורים עבור "עכברי פרא" ועכברי SPF בתוך המתקן מופרדים על ידי מקלחת אוויר, וכל אזור מצויד בחדרי פרוצדורות ייעודיים. ניתן להזמין חדרים אלה באמצעות מערכת הזמנות מקוונת, המבטיחה תהליכי עבודה חלקים ומספר מוגבל של אנשים בתוך המתקן. מקסימום שני אנשים לכל אזור בחדר הליכים (PR1, PR2, LAF) רשאים לעבוד בכל מחסום בו זמנית. חריגים חלים על ניסויים הדורשים כוח אדם נוסף כדי להבטיח ביצוע אתי ומיומן של ההליכים. עכברים מועברים בין חדרים באזורם בכלובי IVC סגורים, אותם ניתן לפתוח רק מתחת לספסל זרימה למינרי כדי להבטיח הכלה מיקרוביאלית ובטיחות בעבודה. חדר ההליכים באזור "עכברי פרא" מכיל גם תא זרימת אוויר למינרית (LAF). יש להשתמש בתא LAF זה לנתיחה וניתוח של "עכברי פרא", כולל העברת עוברים. העברת עוברים היא הליך קריטי בהקשר של "עכברי פרא", מכיוון שהיא משמשת ליצירת מודלים חדשים של "עכבר פרא". לדוגמה, העברת עוברים מזני עכברים מהונדסים גנטית (GMO) ל"עכברי פרא" מסוג פרא משמשת ליצירת זנים מהונדסים גנטית פראיים. תא ה-LAF משמש גם לייצוא דגימות, מה שדורש תיאום עם אדם מחוץ לאזור "עכברי הפרא". עיבוד דגימות נוסף יכול להתבצע בחלל מעבדה סמוך, מה שמאפשר לחוקרים לטפל בחומרים רגישים לזמן באתר תוך הגבלת המיקומים שבהם מעובדות דגימות מ"עכברי פרא".

כל שאר החומרים חייבים להישאר בתוך מתקן Wildling או שצריך לעבור חיטוי לפני היציאה מהמתקן. לאחר העבודה, כל החומרים והמשטחים מחוטאים בחומרי חיטוי המתאימים לתנאי BSL2. אנשים שנכנסו למתקן עבור "עכברי פרא" אינם מורשים להיכנס לכל מתקן אחר לבעלי חיים באותו היום.

המחקר במתקן מתנהל במסגרת הקונסורציום המדעי "The Wildling Mouse Model in Health and Disease (Wildling HeaD)" המאפשר תקשורת בין מדענים העובדים עם "עכברי פרא", כמו גם חילופי שיטות ומומחיות. הקונסורציום נתמך על ידי Responsible PrecliniX במרכז QUEST למחקר אחראי במכון הבריאות של ברלין (BIH), המסייע בהליכי רישום מוקדם של מחקר בבעלי חיים, תכנון ניסוי חזק וניהול איכות (www.bihealth.org/en/quest/service/service/responsible-preclinix).

לסיכום, נוצר מתקן חדיש, המצויד באמצעי הכלה ביולוגית מחמירים, כדי לתמוך במחקר פרה-קליני בטוח ואתי. מתקן זה מאפשר את המחקר של "עכברי פרא", המכילים מיקרוביום טבעי, ומגשרים ביעילות על הפער בין תנאי מעבדה מבוקרים לסביבות מיקרוביאליות דמויות העולם האמיתי. לבניית מתקן כמו זה שתואר, חיוני לתת עדיפות למדע הצוות ולשיתוף פעולה בין-תחומי, תוך שילוב מומחיות של מדענים, וטרינרים ופקידי מוסדות כדי להבטיח תכנון ותפעול יעילים של סביבות הכלה ביולוגית גבוהה. בנוסף, יישום אמצעי הכלה ביולוגית מחמירים, מתן הכשרה מקיפה ופיתוח נהלי הפעלה סטנדרטיים ברורים (SOPs) הם קריטיים. הקמת מבנה תקשורת יעיל, כגון ויקי פנימי, וניטור ואימות רציף של תנאי הניסוי ישפרו עוד יותר את היעילות והבטיחות של המתקן בניהול מודלים מורכבים כמו "עכברי פרא".

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי Charité 3R| החלף - הפחית - חדד. S.P.R. נתמך על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית), Emmy Noether-Programm RO 6247/1-1 (מזהה פרויקט 446316360), DFG SFB1160 IMPATH (מזהה פרויקט 256073931) ו-TRR 359 PILOT (מזהה פרויקט 491676693). S.J. נתמך על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) JO 1216/2-1 והאגודה הגרמנית לטרשת נפוצה (DMSG e.V).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Alexa Fluor 700 נגד עכבר CD45 נוגדןBioLegend103127שיבוט 30F-11
בעלי חיים צ'אואלטרומין1324
APC נגד עכבר CD4 נוגדןBioLegend100515שיבוט RM4-5
צינור איסוף דםגריינר450475MiniCollect K3E, K3EDTA
סרום בקר אלבומיןסיגמא-אולדריץ'A9647-100G
סגול מבריק 605 נוגדן שרשרת TCR-beta נגד עכברBioLegend109241שיבוט H57-597
סגול מבריק 785 נגד עכבר CD8 נוגדןBioLegend100749שיבוט 53-6.7
נימיHirschmann9000210Hirschmann minicaps, נוגדן
EDTACorning46-034-CI
FITC נגד עכבר CD44BioLegend103021Clone IM7
PerCP/Cyanine5.5 נוגדן CD62L נגד עכברBioLegend104431שיבוט MEL-14
מי מלח חוצץ פוספט (10x)Gibco12579099
מאגר פוספט (1x)Gibco14190094
RBC מאגר ליסינגBioLegend420302
צינור פוליסטירן תחתון עגולSarstedt55.476.005
SYTOX כחול כתם תאים מתיםInvitrogenS34852
Tyvek בסך הכל (DuPont)Fisher Scientific11371633

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Voelkl, B., Wurbel, H., Krzywinski, M., Altman, N. The standardization fallacy. Nat Methods. 18 (1), 5-7 (2021).
  2. Voelkl, B., et al. Reproducibility of animal research in light of biological variation. Nat Rev Neurosci. 21 (7), 384-393 (2020).
  3. Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
  4. Caruso, R., Ono, M., Bunker, M. E., Nunez, G., Inohara, N. Dynamic and asymmetric changes of the microbial communities after cohousing in laboratory mice. Cell Rep. 27 (11), 3401-3412.e3 (2019).
  5. Labuda, J. C., Fong, K. D., Mcsorley, S. J. Cohousing with dirty mice increases the frequency of memory T cells and has variable effects on intracellular bacterial infection. Immunohorizons. 6 (2), 184-190 (2022).
  6. Martin, M. D., et al. Cd115(+) monocytes protect microbially experienced mice against e. Coli-induced sepsis. Cell Rep. 42 (11), 113345(2023).
  7. Burger, S., et al. Natural microbial exposure from the earliest natural time point enhances immune development by expanding immune cell progenitors and mature immune cells. J Immunol. 210 (11), 1740-1751 (2023).
  8. Tabilas, C., et al. Early microbial exposure shapes adult immunity by altering cd8+ t cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (49), e2212548119(2022).
  9. Reese, T. A., et al. Sequential infection with common pathogens promotes human-like immune gene expression and altered vaccine response. Cell Host Microbe. 19 (5), 713-719 (2016).
  10. Leung, J. M., et al. Rapid environmental effects on gut nematode susceptibility in rewilded mice. PLoS Biol. 16 (3), e2004108(2018).
  11. Sbierski-Kind, J., et al. Distinct housing conditions reveal a major impact of adaptive immunity on the course of obesity-induced type 2 diabetes. Front Immunol. 9, 1069(2018).
  12. Rosshart, S. P., et al. Wild mouse gut microbiota promotes host fitness and improves disease resistance. Cell. 171 (5), 1015-1028.e13 (2017).
  13. Rosshart, S. P., et al. Laboratory mice born to wild mice have natural microbiota and model human immune responses. Science. 365 (6452), eaaw4361(2019).
  14. Dirnagl, U., Kurreck, C., Castanos-Velez, E., Bernard, R. Quality management for academic laboratories: Burden or boon? Professional quality management could be very beneficial for academic research but needs to overcome specific caveats. EMBO Rep. 19 (11), e47143(2018).
  15. Dirnagl, U., Kurreck, C., Bernard, R., Przesdzing, I. Premier. , https://premier-qms.org/ (2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים