מאמר שיטה

הדמיה אורכית in vivo של תאי רשתית עם סרוטיפים מותאמים של וירוסים הקשורים לאדנו, באמצעות סריקה קונפוקלית לייזר אופטלמוסקופיה

955 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67106

⸱

11 באוקטובר 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Sciences Key Laboratory, 2Second Clinical Medical School, Capital Medical University, 3Beijing Institute of Brain Disorders, Collaborative Innovation Center for Brain Disorders, Capital Medical University, 4Beijing Key Laboratory of Fundamental Research on Biomechanics in Clinical Application, Capital Medical University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בווקטורים של נגיף הקשור לאדנו (AAV) לתיוג ספציפי לתא והדמיה in vivo באמצעות אופתלמוסקופ לייזר סורק קונפוקלי (CSLO). שיטה זו מאפשרת לחקור סוגים שונים של תאי רשתית ותרומתם לתפקוד הרשתית ולמחלות.

תקציר

האופי הדינמי של תהליכים תאי ברשתית מחייב התקדמות בהעברת גנים וטכניקות ניטור חיות כדי לשפר את ההבנה והטיפול במחלות עיניים. מחקר זה מציג גישה אופטימלית של נגיף הקשור לאדנו-(AAV), תוך שימוש בסרוטיפים ומקדמים ספציפיים כדי להשיג יעילות טרנספקציה אופטימלית בתאי רשתית ממוקדים, כולל תאי גנגליון רשתית (RGCs) וגליה מולר. תוך מינוף הדיוק של אופטלמוסקופיה בלייזר סריקה קונפוקלית (CSLO), עבודה זו מציגה שיטה לא פולשנית להדמיה in vivo הלוכדת את הביטוי האורכי של חלבון פלואורסצנטי ירוק בתיווך AAV (GFP). גישה זו מבטלת את הצורך בהליכים סופניים, תוך שמירה על המשכיות התצפית ורווחת הנבדק. יתר על כן, ניתן לעקוב אחר אות ה-GFP ב-RGCs נגועים ב-AAV לאורך נתיב הראייה לקוליקולוס העליון (SC) ולגרעין הגניקולט הרוחבי (LGN), מה שמאפשר את הפוטנציאל למיפוי מסלול ראייה ישיר. ממצאים אלה מספקים פרוטוקול מפורט ומדגימים את היישום של כלי רב עוצמה זה למחקרים בזמן אמת של התנהגות תאי הרשתית, פתוגנזה של מחלות ויעילות התערבויות ריפוי גנטי, ומציעים תובנות חשובות לגבי הרשתית החיה והקשרים שלה.

מבוא

בהיותה החלק היחיד הנגיש אופטית של מערכת העצבים המרכזית, הרשתית משמשת כמודל רב ערך למחקר במדעי המוח1. תאי גנגליון רשתית (RGCs), נוירוני הפלט של הרשתית המעבירים מידע חזותי למוח, ממלאים תפקיד מכריע בתפקוד הראייה. אובדן או תפקוד לקוי שלהם מובילים לליקוי ראייה ולעיוורון בלתי הפיך, כפי שניתן לראות בגלאוקומה ונוירופתיות אופטיות אחרות2. Müller glia, תאי הגליה העיקריים ברשתית, חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס ברשתית, מתן תמיכה מבנית ומטבולית לנוירונים, ויסות רמות נוירוטרנסמיטורים ותרומה לתיקון והתחדשות הרשתית3. תפקודם הלקוי מעורב במחלות רשתית שונות, כולל רטינופתיה סוכרתית4, ניוון מקולרי הקשור לגיל5 ותסמונת איסכמית עינית6. RGCs ו-Müller glia מציגים אינטראקציות קרובות ותלות הדדית; Müller glia מספק תמיכה חיונית ל-RGCs, בעוד שפעילות RGC יכולה להשפיע על פונקציית Müller glia 3,7. חקר RGCs ו-Müller glia הוא חיוני להבנת תפקוד הרשתית ולפיתוח טיפולים יעילים למחלות רשתית מרובות.

ההערכות הנוכחיות בחקר הרשתית משתמשות בעיקר בטכניקות כמו טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) כדי למדוד את עובי שכבת סיבי העצב ברשתית או את המסלולים של צרורות אקסונים 8,9. בעוד ששיטות אלו לא יסולא בפז לאיתור אובדן RGC, הן אינן מספקות תצוגה מפורטת של מורפולוגיה של RGC ותאי גליה עקב רזולוציה מוגבלת. באופן דומה, למרות שטכניקות מתקדמות כמו אופטיקה אדפטיבית סורקת לייזר אופטלמוסקופיה (AO-SLO) מאפשרות הדמיה ברמת התא של RGCs, קולטני אור ותאי גליה ברשתית האנושית החיה, המורכבות הטכנית והנגישות המוגבלת שלהם מגבילות את השימוש בהם בעיקר למסגרות מחקר מיוחדות. בהתחשב באילוצים אלה, קיים צורך מתמשך בפיתוח שיטות נגישות ואמינות יותר למחקר מעמיק של אוכלוסיות תאי רשתית ספציפיות in vivo.

בהתאם לכך, פרוטוקול זה נועד להציג גישת הדמיה חלופית המתאימה ליישומי מחקר בתאי רשתית. הוא משלב את העוצמה של תיוג ספציפי לסוג תא בתיווך AAV עם האופי הלא פולשני של הדמיית CSLO. נגיפים הקשורים לאדנו (AAVs) הם וקטורים רב-תכליתיים להעברת גנים הידועים באימונוגניות הנמוכה שלהם וביכולתם להמיר מגוון רחב של סוגי תאים, כולל תאים מתחלקים ולא מתחלקים11. זה הופך אותם לכלים אידיאליים למיקוד אוכלוסיות תאים ספציפיות בסביבת הרשתית המורכבת. על ידי שימוש בווקטורי AAV עם סרוטיפים ומקדמים שנבחרו בקפידה, ניתן להשיג ביטוי סלקטיבי של חלבונים פלואורסצנטיים במספר סוגי תאים מעניינים, כגון RGCs ו-Müller glia. לדוגמה, AAV2 ידוע ביעילות ההתמרה הגבוהה יותר שלו ב-RGCs12,13, בעוד ש-AAV8 יעיל באופן ניכר בהתמקדות בקולטני אור14, ו-AAV9 מדגים יכולות טרנספקציה חזקות ב-Müller glia15, המראה יעילות רחבה על פני שכבות תאי רשתית שונות. חשוב לציין כי היעילות של AAV מסתמכת לא רק על בחירת הסרוטיפ אלא גם על המקדמים, המכתיבים את העוצמה והספציפיות של התא של ביטוי טרנסגנים, ומדגישים את החשיבות של בחירה קפדנית להשגת התמרה אופטימלית.

עבור תיוג RGC, פרוטוקול זה משתמש ב-AAV2 עם מקדם הסינפסין האנושי (hSyn). AAV2 מציג התמרה יעילה של RGCs לאחר הזרקה תוך-זגוגית13, ומקדם hSyn, מקדם עצבי בכל מקום, מניע ביטוי טרנסגנים חזק וספציפי בתוך תאים אלה16. עבור Müller glia, הפרוטוקול משתמש בווקטורים AAV9 המונעים על ידי מקדם GfaABC1D17, המדגים ביטוי טרנסגנים חזק בתאים אלה15. גישת תיוג ממוקדת זו מאפשרת לחוקרים להבחין בין תאים אלה לבין רקמת הרשתית הסובבת אותם ולעקוב אחריהם לאורך זמן, ומספקת בסיס למעקב in vivo של תאי הרשתית ותגובותיהם לשינויים ביו-סביבתיים.

אופטלמוסקופיה בלייזר סריקה קונפוקלית (CSLO) היא טכניקת הדמיה לא פולשנית המספקת תמונות ברזולוציה גבוהה של הרשתית החיה, ומאפשרת הדמיה בזמן אמת של אוכלוסיות תאי רשתית המסומנות פלואורסצנטית 18,19,20. קרן לייזר ממוקדת סורקת את הרשתית, לוכדת אור הנפלט שעובר דרך חור סיכה כדי למנוע אותות שאינם ממוקדים, וכתוצאה מכך תמונות חדות יותר עם ניגודיות משופרת. פרוטוקול זה משתמש במערכת CSLO של היידלברג ספקטרליס, שהייתה בשימוש נרחב להדמיית תאי רשתית בבעלי חיים חיים, כולל מחקרים המדמים RGCs21,22 ומיקרוגליה23 עם תווית טרנסגנית. על ידי שימוש ביחידת HRA CSLO עם לייזר 488 ננומטר ומסננים מתאימים, חוקרים יכולים לדמות RGCs או Müller glia המסומנים פלואורסצנטית בבעלי חיים לאחר הזרקה תוך-זגוגית של וקטורים AAV הנושאים גנים מדווחים פלואורסצנטיים. פרוטוקול ההדמיה האורכי, עם מפגשים שבועיים המכסים את הרשתית המרכזית וההיקפית, עוקב אחר שינויים לאורך זמן. כדי לתעדף את רווחת בעלי החיים, הפרוטוקול משתמש במערכת מעקב העיניים האוטומטית (ART) של יחידת HRA CSLO, המאפשרת קליטת תמונה מדויקת ללא צורך בהרדמה כללית או עדשות מגע.

פרוטוקול זה רותם את הכוח המשולב של AAV ו-CSLO כדי לאפשר ניטור אורך של סוגי תאי רשתית ספציפיים in vivo. על ידי זיווג הספציפיות של סוג התא של תיוג בתיווך AAV עם יכולות ההדמיה הלא פולשניות ברזולוציה גבוהה של CSLO, שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את השינויים הדינמיים ב-RGCs וב-Müller glia בתגובה לגירויים או התערבויות שונות. תובנות אלו טומנות בחובן פוטנציאל משמעותי לפיתוח אסטרטגיות אבחון וטיפול חדשות למחלות רשתית.

פרוטוקול

כל הניסויים נערכו בהתאם להצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית קפיטל, בייג'ינג. עכברים זכרים בוגרים בני ארבעה שבועות C57BL/6J (במשקל של בין 15-20 גרם) שימשו לכל הניסויים ושוכנו בחדרים מבוקרי טמפרטורה עם מחזור אור/חושך של 12/12 שעות. צ'או מכרסמים סטנדרטיים ומים היו זמינים אד ליביטום. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. טרנספקציה של תאי רשתית בתיווך AAV

הערה: עבור התמרה ממוקדת של RGCs, פרוטוקול זה משתמש ב-AAV2-hSyn-eGFP, המשלב את מקדם hSyn כדי להניע ביטוי חזק של GFP משופר. Müller glia ממוקד באמצעות AAV9-GfaABC1D-eGFP. כדי להשיג יעילות טרנסדוקציה אופטימלית וביטוי טרנסגנים חזק, מומלץ טיטר AAV מינימלי של 1 x 1012 גנומים נגיפיים (vg)/mL להזרקות תוך זגוגיות בעכברים13.

  1. הקפידו על פרוטוקולי בטיחות מחמירים בעת ביצוע הליכי העברת תאי רשתית בתיווך AAV כדי למנוע חשיפה מקרית ולהבטיח סביבת עבודה בטוחה.
  2. בצע את כל ההליכים הכוללים וקטורים נגיפיים בתוך ארון בטיחות ביולוגית מוסמך (BSC). צייד את הצוות בציוד מגן אישי מתאים (PPE), כולל מעילי מעבדה, כפפות והגנה על העיניים, לאורך כל ההליך.
  3. השלך את כל החדים והחומרים המסוכנים כראוי בהתאם לפרוטוקולי הבטיחות המוסדיים כדי לשמור על תאימות ולהגן על כל אנשי המעבדה.

2. הכנת וקטורים ויראליים ובעלי חיים

  1. השג AAV2-hSyn-eGFP או וקטורי AAV9-GfaABC1D-eGFP המאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס. יש להפשיר וקטורים על קרח מיד לפני השימוש כדי לשמור על שלמות הנגיף.
  2. יש להרדים את העכברים בהזרקה תוך-צפקית של נתרן פנטוברביטל במינון של 50 מ"ג/ק"ג. אשר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת הרפלקסים של כף הרגל האחורית לפני פעולות נוספות.
  3. חתוך את השפם כדי למנוע הפרעה לאזור הניתוח במהלך ההליך. יש לחטא את המסלול בתמיסת פובידון-יוד של 20% למשך 2 שניות, ואז לשטוף היטב במי מלח רגילים סטריליים.
  4. יש למרוח טיפה של 0.5% פרופרקאין באופן מקומי כדי למזער את אי הנוחות ולמנוע תנועות עיניים לא רצוניות.

3. טיפול והזרקה תוך זגוגית של וקטורים ויראליים

  1. העבר 1 מיקרוליטר של תמיסת AAV נבחרת (AAV2-hSyn-eGFP או AAV9-GfaABC1D-eGFP) לחתיכת סרט פרפין נקי ומקורר מראש כדי למנוע תנודות טמפרטורה שעלולות להשפיע על הפעילות הוויראלית.
  2. שאפו את תמיסת ה-AAV באמצעות מזרק זכוכית המילטון עם מחט משופעת 33 G מתחת למיקרוסקופ כירורגי עיניים.
  3. הנח את העכבר בשכיבה גחונית מתחת למיקרוסקופ. הטה מעט את הראש כדי להרים את צד העין המיועד להזרקה. התאם ובצע אופטימיזציה של ההגדלה של המיקרוסקופ כדי לזהות בבירור את האזור העליון של מסלול העכבר.
  4. הכנס את המחט 1-2 מ"מ אחורי הלימבוס בשוליים הסקלרליים העליונים של העין לתוך חלל הזגוגית. הזרקו את תמיסות ה-AAV לאט כדי למנוע זרימה חוזרת או נזק הנגרם על ידי לחץ.
    הערה: מיקום מקום ההזרקה: בצע את ההזרקה ברבע הטמפורלי העליון של העין, כ-1 מ"מ אחורי הלימבוס. בחר מיקום זה כדי להימנע מכלי דם גדולים ולמזער את הסיכון לנזק לעדשות. הימנע מאתרי הזרקה קרובים מדי ללימבוס כדי למנוע חדירת קשתית או שחיקה של העדשה. הימנעות מכלי דם: השתמש במיקרוסקופ ניתוח כדי לבחון היטב את אתר ההזרקה המתוכנן לאיתור כלי דם גלויים לפני ההזרקה. אם יש כלי שיט, התאימו מעט את נקודת הכניסה כדי להימנע מהם. הכנס את המחט בזווית רדודה, במקביל לקשתית, כדי להפחית עוד יותר את הסיכון לנזק לכלי הדם. הימנע מזריקות חוזרות ונשנות באותו אזור כדי להפחית את הסיכון לדימום תת-רשתית.
  5. שמור את המחט במקומה למשך 30 שניות כדי לאפשר לווקטורים להתפזר בתוך תא הזגוגית ולהתיישב על פני הרשתית, ובכך למקסם את הסיכויים להתמרה מוצלחת.
  6. משוך את המחט לאט כדי למזער את הסיכון לזרימה חוזרת של הזגוגית.
  7. מרחו משחה אנטיביוטית מקומית על מקום ההזרקה מיד לאחר ההזרקה. ודא שהמשחה נמרחת באופן אחיד כדי לכסות את פני העין במלואם, ולמנוע זיהום ודלקת בעיניים.
    הערה: המשחה האנטיביוטית מכילה 1 מ"ג/גרם דקסמתזון, 3500 יחב"ל/גרם ניאומיצין סולפט ו-6000 יחב"ל/גרם פולימיקסין B סולפט.
  8. הנח את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך ההתאוששות מההרדמה, ועקוב אחריהם מקרוב לאיתור סימני מצוקה או חריגות. לאחר שהתאוששו לחלוטין ולא הראו סיבוכים, החזירו אותם לכלובים שלהם עם גישה למזון ומים רגילים.

4. הדמיה in vivo עם CSLO

  1. הכנת בעלי חיים
    1. בחר את העכבר הנגוע ב-AAV2-hSyn-eGFP או AAV9-GfaABC1D-eGFP לאחר 4 שבועות של הזרקה תוך זגוגית. יש למרוח טיפה אחת של תמיסת עיניים המכילה 0.5% טרופיקמיד ו-0.5% פנילפרין על פני העין כדי להרחיב את האישון לקוטר של כ-2 מ"מ22.
      הערה: מומלץ מינימום של 4 שבועות של מרווח זמן התמרת AAV עבור תיוג פלואורסצנטי אופטימלי של תאי רשתית לאחר הזרקה תוך זגוגית13. בנוסף, בניסויי ריסוק עצב הראייה (ONC) שלנו, הרשתית צולמה 4 שבועות לאחר ההדבקה, כמו גם ביום 7 ו-14 לאחר פגיעת הריסוק. נקודות זמן אלה נבחרו כדי ללכוד הן את ביטוי ה-AAV הראשוני והן את התקדמות השינויים ברשתית לאחר ONC.
    2. כסו את פלטפורמת ההדמיה בחתיכה מהרפידה הנקייה כדי למנוע זיהום אפשרי של צואת בעלי חיים במהלך תהליך הפעולה.
      הערה: פלטפורמת ההדמיה המותאמת אישית מספקת מספיק מקום לבעל החיים לשכב על הקרקע, מבטיחה יציבות וממזערת את התנועה במהלך ריסון ידני לקליטת תמונה מיטבית.
    3. העבר בזהירות את העכבר לפלטפורמת ההדמיה ואפשר תקופת הסתגלות של 2-5 דקות לפני ההדמיה כדי למזער את הלחץ ולהקל על ההסתגלות לסביבת ההדמיה.
    4. בעזרת טכנאי שני, רסנו בעדינות את בעל החיים תוך שמירה על מצב הכרה לאורך כל ההליך. ספק מרווח מנוחה של 10 שניות לאחר 15 שניות של הדמיה כדי לאפשר מצמוץ עיניים ולשמור על לחות הקרנית.
      הערה: שפשפו בעדינות את עור הקרקפת כדי לגרום להרמת עפעפיים ספונטנית, הימנעו משימוש בריסון עפעפיים מאולץ או במכשירים נוספים כגון קליפסים, ובכך הפחיתו את הסיכון לפגיעה בעיניים. הרדמה כללית אינה משמשת לשמירה על בהירות אופטית במהלך מפגשי הדמיה ממושכים, מכיוון שיש לה פוטנציאל להחמיר את אטימות העדשה החולפת. איזון בין רכישת תמונה באיכות גבוהה לבין נוחות ובטיחות של בעלי חיים לאורך כל ההליך. השלם את ההליך כולו תוך 5 דקות כדי להבטיח את רווחת בעלי החיים ולשמור על איכות ההדמיה.
    5. כוונן את תנוחת הראש ויישר את עדשת המצלמה על ידי כוונון עדין של כפתור המיקוד (איור 1B) והמיקרומניפולטור (איור 1C) כדי לכוון את אזור העניין (ROI) להדמיה עוקבת in vivo .
  2. תצורת מערכת
    1. חבר עדשת זווית רחבה ללא מגע של 55° על המצלמה כדי להרחיב את שדה הראייה של אזור הפונדוס.
    2. הגדר את גלגל המסנן למיקום A (אנגיוגרפיה) כדי לאפשר רכישה של אופן הדמיה אינפרה-אדום (IR) ואנגיוגרפיה פלואורסצנטית (FA) (איור 1A). הפעל את הלייזר ואת ספק הכוח כדי להפעיל את מערכת ההדמיה CSLO.
    3. פתח את התוכנה Heidelberg Eye Explorer וצור בדיקה חדשה על ידי לחיצה על סמל המטופל החדש בחלק העליון של שורת התפריטים. הזן את פרטי החיה הרלוונטיים וקבל את עקמומיות הקרנית המוגדרת כברירת מחדל של 7.7 מ"מ בחלון המוקפץ.
    4. בחר בלחצן התחל הצהוב (איור 1E) במסך לוח הבקרה כדי להפעיל את מצב ההדמיה החיה.
  3. הדמיית CSLO in vivo
    1. בחר את אופן ה-IR (איור 1G) עם אופלואורסצנציה אוטומטית באורך גל עירור של 820 ננומטר בלוח הבקרה. כדי להשיג הדמיה ברזולוציה גבוהה, הרזולוציה הגבוהה. מצב (HR) מופעל דרך ממשק החלון או לוח הבקרה הידני (איור 1F).
      הערה: הדמיית רפלקציה אינפרא אדום (IR) היא בדרך כלל הצעד הראשון בהדמיית עיניים CLSO, הנרכשת לפני אנגיוגרפיה פלואורסצאין (FA), כדי לספק תצוגה בסיסית. אפילו תאורה, חפצים מינימליים ומיקוד חד בכלי רשתית עיקריים הם חיוניים לאמינות מיקוד מישור z והשגת תמונות IR באיכות גבוהה.
    2. הזז את העדשה לכיוון עין העכבר באמצעות הג'ויסטיק עם המיקרומניפולטור XYZ להתאמה עדינה. בדוק את השקיפות האופטית וסובב את כפתור הרגישות (איור 1D) נגד כיוון השעון כדי להפחית את בהירות תמונת הפונדוס ל-40%-60%, ובכך להימנע מחשיפת יתר של הפונדוס ולשפר את ההדמיה של פרטי הרשתית.
    3. כוונן את כפתור המיקוד והמיקרומניפולטור עד שהדיסק האופטי וכלי הרשתית מזוהים באופן חד משמעי על הפונדוס.
      הערה: קריטריונים של מישור המוקד האופטימלי: (1) מבט על פונדוס מואר באופן שווה ללא פינות כהות. (2) תאורה אחידה המקיפה את הדיסק האופטי ללא כתמים כהים מוקדיים או עיוותים. (3) צורת לומן ברורה של כלי הרשתית הגדולים עם התנועה הנראית לעין של זרימת הדם.
    4. עבור לאופן FA (איור 1H) עם לייזר כחול מצב-מוצק באורך גל עירור של 488 ננומטר ומסנן מחסום ב- 500 ננומטר. סובב את כפתור הרגישות (איור 1D) בכיוון השעון כדי להגדיל את בהירות תמונת הפונדוס ל-50%-107% כדי להאיר את אזור הרשתית הממוקד.
    5. הגדר את הערך הממוצע של ART (פס כחול בפינה השמאלית התחתונה של ממשק התוכנה) ל-15 לפחות כדי לשפר את יחס האות לרעש. פונקציה זו מבצעת ממוצע של סדרה של סריקות B שנרכשו באותו מיקום, ומשפרת את איכות התמונה.
      הערה: בעוד שערך ממוצע ART גבוה יותר משפר בדרך כלל את איכות התמונה באמצעות חישוב ממוצע, הוא גם מאריך את משך הסריקה. משך זמן ממושך זה עלול להגביר את הסיכון להתייבשות בקרנית ועייפות בעלי חיים, גורמים שיש לקחת בחשבון בקפידה, במיוחד בהדמיה ערה של בעלי חיים.
    6. יישור מחדש למישור הפנימי של הרשתית, תוך התמקדות ספציפית ב-GFP המבטא RGCs או בתאי הגליה של מולר. התאמות עדינות נעשות כדי להבטיח תאורה חדה של אוכלוסיית התאים הרצויה, כגון RGC סומה ואקסונים, או גוף התא מולר. רגישות ההדמיה מאוזנת כדי להשיג הדמיה אופטימלית ולמנוע רוויה יתר של התאים החיוביים ל-GFP.
      הערה: כדי להשיג את התמונות עם בהירות ובהירות דומות של אות ה-GFP, רכישת הרגישות צריכה להיות קבועה עבור כל העכברים בניסוי.
    7. לחץ כלפי מטה על כפתור הרגישות (איור 1D) כדי להפעיל את מצב ART, שיוצר תמונה ממוצעת חיה באינטרנט. המתן עד שהפס הכחול (המייצג את ערך ה-ART Mean) בפינה השמאלית התחתונה של ממשק התוכנה יגיע לערך ה-ART שנקבע (≥-20 פריימים) והקש על כפתור הרכישה בממשק הבקרה כדי ללכוד את תמונות הפונדוס.
      הערה: עבור מצב ART, מעקב אחר תנועות עיניים משולב כדי לפצות באופן אוטומטי על תנועות עיניים קלות במהלך הדמיה in vivo , מה שמאפשר מיקוד עקבי במישור המוקד של הרשתית שנבחר.
    8. לאחר רכישת התמונות הרצויות, צא ממצב ART על ידי לחיצה על כפתור הרגישות בלוח המגע.
      הערה: כדי למנוע התייבשות בקרנית ולאפשר מצמוץ עיניים ספונטני, יושמו הפסקות של 10 שניות כל 15 שניות במהלך תהליך ההדמיה.
    9. כדי לנווט באזורי הרשתית של האף והטמפורל, הזז את ראש המצלמה אופקית תוך התבוננות בתמונה החיה על המסך. לאחר הגעה לאזור היעד, כוונן את המיקוד והתחל את תהליך ההדמיה כמתואר בשלבים 2.3.1-2.3.8.
      הערה: שמור על תנועות מצלמה איטיות ומבוקרות תוך הקפדה על תאורה עקבית ובהירה של הפונדוס. אם מופיעים אזורים כהים, השתמש במיקרומניפולטור כדי לכוונן את מיקום המצלמה אנכית ולמרכז מחדש את הרשתית.
    10. כדי לדמות את הרשתית העליונה, כוונן בעדינות את תנוחת ראש העכבר למצב עם הפנים כלפי מעלה. הטה בעדינות את ראש המצלמה כלפי מעלה כדי ליישר קו עם אזור הרשתית העליון. כוונן מחדש את המיקוד לפי הצורך והמשך בהדמיה.
    11. עם השלמת ההדמיה, כל אזורי הרשתית הרצויים, יוצאים מחלון הרכישה, והתמונות נשמרות אוטומטית. יש למרוח חומר סיכה מקומי על העין המצולמת כדי לשמור על לחות הקרנית.
    12. כדי ליזום את בדיקת העין הנגדית, מקם מחדש את החיה לצד הנגדי של הפלטפורמה וחזור על שלבים 2.3.1-2.3.11.

5. עיבוד וניתוח תמונה

  1. ייצוא והכנה של תמונות
    1. פתח את תוכנת Heidelberg Eye Explorer ובחר את הפעלת ההדמיה הרצויה של CSLO באיכות טובה. בחר תמונות בודדות או עוקבות של אותו מיקום רשתית עם הגדרות רגישות עקביות לאורך זמן.
    2. אל תכלול תמונות מטושטשות עם מיקוד גרוע או בהירות קרנית, וודא שרק תמונות עם הדמיה ברורה של מבני רשתית משמשות לניתוח. ייצא תמונות אלה בתבנית TIFF להמשך עיבוד.
  2. יישור וחיתוך תמונה
    1. קבץ תמונות לכל עין עכבר בהתבסס על אותו אזור רשתית.
      הערה: התמונות המקוריות שהתקבלו ממערכת CSLO נשמרות בפורמט הבא: TIFF, עם ממד של 1536 x 1536 פיקסלים, רזולוציה של 5.69 אום/פיקסל וערך ART של ≥15.
    2. לבדיקות המשך, ייבא תמונות לתוכנת עיבוד תמונה מתאימה. סובבו ויישרו את התמונות בהתאם לצורך, כך שיתאימו לכיוון של תמונת קו הבסיס. בשעת שמירה או ייצוא של התמונות המעובדות, השתמשו בקביעות השומרות על איכות התמונה הגבוהה ביותר האפשרית כדי למזער פריטי דחיסה פוטנציאליים.
    3. יישר את תמונות ה-CSLO מסדרת זמן של אותה עין על ידי סיבובם כך שיתאימו לתמונת הבסיס המתאימה באמצעות כלי הדם והדיסק האופטי כציוני דרך.
      הערה: בדוק בקפידה כל תמונה מיושרת, ולפני שתמשיך לחתוך, ודא שהיא עומדת בקריטריונים הבאים: (1) לכידת אזור רשתית מלא: התמונה חייבת להקיף במלואה את אזור העניין המיועד ברשתית, כולל ציוני דרך מרכזיים כמו הדיסק האופטי וכלי הדם העיקריים; (2) היעדר חפצי תנועה: התמונה צריכה להיות נקייה מטשטוש, פסים או שכפול של מבנים הנגרמים מתנועת עיניים במהלך ההדמיה; (3) עיוות מינימלי: התמונה צריכה לייצג במדויק את מבנה הרשתית ללא עיוות, מתיחה או דחיסה של חפצים שעלולים לנבוע מזוויות הדמיה או אפקטים של עדשות. (4) מדדי איזון איכות התמונה: הערכות של רמות רעשי רקע (סטיית תקן של עוצמות פיקסלים באזורים נטולי מבנה < 5 (סולם 0-255)); יחס אות לרעש (SNR >20), עקביות תאורה (מקדם שונות בין שישה רבעי תמונה <10%) ואחידות תמונה (מקדם שונות באזורים הומוגניים <15%).
    4. בחר את התמונה המסובבת וייצא אותה בפורמט TIFF. עבור כל נקודת זמן, השתמש בכלי החיתוך כדי לבחור ולחתוך באופן אקראי 5-10 אזורים (300 x 300 פיקסלים כל אחד) המכילים תאים חיוביים ל-GFP מהתמונות שאושרו באיכות. ייצא כל תמונה שנחתכה בנפרד בתבנית TIFF להמשך ניתוח.
  3. מדידת עוצמת הקרינה
    1. פתחו את תמונות CSLO שנחתכו (גווני אפור של 8 סיביות, 300 x 300 פיקסלים) ב- ImageJ/Fiji.
    2. כדי לבחון את השינויים הכוללים באותות פלואורסצנטיים, מדוד את עוצמת הקרינה הכוללת לכל תמונה שנחתכה באמצעות ניתוח > מדידה (או Ctrl + M). רשום את הערך "Mean", המייצג את עוצמת הקרינה הממוצעת של GFP של כל התמונה שנחתכה.
  4. כימות RGC
    1. ב-ImageJ/Fiji, התאם את סף העוצמה של תמונות CSLO שנחתכו באמצעות Image > Adjust > Brightness/Contrast כדי להשיג תצוגה חזותית מיטבית של גופי סומה לבנים בודדים על הרקע השחור.
      הערה: קבע סף אישי לאחר סקירת אצווה של תמונות שנחתכו, או החל אלגוריתם סף עקבי (למשל, שיטה5 של הואנג ב-ImageJ/Fiji). לשיטה של הואנג: (1) המרת תמונות לגווני אפור של 8 סיביות (Image > Type > 8 סיביות). (2) גש לכלי הסף (תמונה > התאם > סף). (3) בחר בהואנג כשיטת הסף. (4) תצוגה מקדימה של הפילוח ולחץ על החל. הסף יחושב באופן אוטומטי ויוצג בהיסטוגרמה של התמונה.
    2. הפעל את התוסף Cell Counter ולחץ על כל סומה RGC חיובית ל-GFP לספירה. רשום את המספר הכולל של תאים המסומנים באזור המנותח. חזור על תהליך זה עבור כל התמונות שנחתכו מכל נקודת זמן המשך.
  5. ניתוח נתונים
    1. ייצא את נתוני ספירת התאים ועוצמת הקרינה לגיליון אלקטרוני או לתוכנה סטטיסטית (למשל, GraphPad Prism).
    2. לבצע בדיקות סטטיסטיות מתאימות על סמך תכנון הניסוי וההשערות המתאימות. פרש את התוצאות והסכם.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול שהוצג, תאי רשתית שונים הודגמו בהצלחה ועקבו אחר in vivo באמצעות שילוב של העברת גנים בתיווך AAV ו-CSLO. AAV2-hSyn-eGFP התמיר ביעילות RGCs, וכתוצאה מכך ביטוי eGFP חזק בכל הרשתית, כפי שאושר על ידי CSLO וקו-לוקליזציה עם הסמן הספציפי ל-RGC, חלבון קושר RNA עם שחבור מרובה (RBPMS), שנמצא במיוחד בשכבת תאי הגנגליון (איור 2 ואיור 3). הפרוטוקול גם אישר את היכולת לפגוע בגליה של מולר באמצעות AAV9-GfaABC1D-eGFP. הדמיה של CSLO חשפה ביטוי eGFP נרחב, במיוחד בתוך שכבות הרשתית הפנימיות, התואם את מקטע ההתפלגות העיקרי הידוע של Müller glia. האות החיובי של GFP גם מאוד קו-לוקאלי עם סמן הגליה של מולר גלוטמין סינתטאז (GS), מה שמאשר עוד יותר את הספציפיות של גישה זו (איור 2E,F ואיור 3B). ממצאים אלה אישרו מחדש את הרבגוניות של העברת גנים בעזרת AAV לחקר סוגי תאי רשתית שונים. כדי לאשר את היכולת לכוון ל-Müller glia, נעשה שימוש ב-AAV9-GfaABC1D-eGFP. הדמיית CSLO חשפה ביטוי eGFP נרחב, במיוחד בתוך שכבות הרשתית הפנימיות, התואם את ההתפלגות הידועה של Müller glia (איור 2E,F). דפוס ביטוי סלקטיבי זה אומת עוד יותר על ידי דרגת הקולוקליזציה הגבוהה שנצפתה בין אות ה-GFP לסמן הגליה של מולר גלוטמין סינתטאז (GS) (איור 3B).

כדי לכמת את הספציפיות והיעילות של גישת המיקוד הנגיפי הן עבור RGCs והן עבור Müller glia, בוצע ניתוח קו-לוקליזציה כדי להשוות את הקרינה של GFP עם סמנים סטנדרטיים מסוג תא (איור 3B,D). בסך הכל נותחו 6 עיני עכבר. עבור RGCs הממוקדים ב-AAV2-hSyn-GFP, יעילות ההתמרה הייתה 64% ±-3%, בעוד שסגוליות ההתמרה הייתה 68% ±-3%. עבור גליה של מולר המיועדת ל-AAV9-GfaABC1D-GFP, יעילות ההתמרה הייתה 58% ±-2%, וסגוליות ההתמרה הייתה 71% ±-2%. תוצאות אלה מדגימות כי גישה זו של העברת גנים בתיווך AAV מאפשרת תיוג סלקטיבי של סוגי תאי רשתית מובחנים, ומדגישה את הרבגוניות שלה לחקר תהליכים תאיים ומולקולריים ברשתית.

כדי להעריך את ההתאמה של CSLO לניטור אורך של הפרעות בתאי הרשתית, בוצע מודל ONC חולף בעכברים נגועים ב-AAV2-hSyn-eGFP. ירידה הדרגתית באותות eGFP ובמספרי RGC נצפתה במשך שבועיים (איור 4). הישרדות RGC כומתה באמצעות שלושה מדדים: עוצמת הקרינה של CSLO, ספירת תאים in vivo עבור תמונות CSLO, וספירת RGC ex vivo של תאים חיוביים ל-RBPMS. לאחר עיבוד תמונה כמתואר בשלב 4, לפחות 10 אזורי עניין (ROI) נחתכו מכל רשתית (6 עיניים בסך הכל), מה שמבטיח שכל החזר ROI מקיף את אותו מיקום רשתית ומציג אותות תאים ברורים בכל נקודת זמן. לאחר מכן כומתו עוצמת הקרינה של CSLO על ידי מדידת העוצמה הממוצעת בתוך כל החזר ROI שנחתך בכל נקודת זמן. in vivo, ספירת תאים הושגה על ידי ספירה ידנית של RGCs חיוביים ל-GFP בודדים באותו החזר ROI שנחתך בכל נקודת זמן. לבסוף, רשתית נקצרה לצביעה חיסונית של RBPMS, ותאים חיוביים ל-RBPMS נספרו ב-24 אזורים מוגדרים שצולמו לכל מגזר רשתית עבור כל רשתית. נמצאו מתאמים שליליים מובהקים בין כל שלושת מדדי ההישרדות של RGC (עוצמת הקרינה של CSLO, ספירת תאים in vivo וספירת תאים חיוביים ל-RBPMS ex vivo ) לבין הזמן שלאחר ONC (p < 0.001 לכולם, איור 4C), מה שמדגים אובדן וניוון RGC מתקדם. חשוב לציין, לא נצפו הבדלים משמעותיים בין קבוצות הניסוי השונות מבחינת צפיפות ה-RGC הראשונית או קצב הירידה, מה שמעיד על עקביות גסה במודל ה-ONC ובגישת ההדמיה. ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם מחקרים קודמים על נזק ל-RGC לאחר ONC ומאמתים את היעילות של פרוטוקול מבוסס CSLO זה ככלי לא פולשני ואמין לניטור בריאות RGC.

כדי להמשיך לחקור הקרנות אקסונליות של RGC בתוך מסלול הראייה, נעשה שימוש בגישת תיוג כפול עם שילוב של תיוג eGFP בתיווך AAV עם תת-יחידה B של רעלן כולרה (CTB)24. עכברים קיבלו זריקה תוך זגוגית של CTB והוקרבו יומיים לאחר מכן לניתוח היסטולוגי. קולוקליזציה של אותות eGFP ו-CTB בעצבי הראייה אישרה את המעקב החיובי של אקסוני RGC (איור 5A). כדי להמשיך לחקור את השינויים באותות לאחר פגיעה אקסונלית, עכברים נחשפו לריסוק עצב ראייה חד צדדי (ONC), מודל של נזק חריף ל-RGC25. לזמן קצר, עכברים הורדמו, ועצב ראייה אחד נחשף ונמעך כ-1 מ"מ מאחורי כדור הארץ באמצעות מלקחיים עדינים למשך 5 שניות, מה שגרם לאקסוטומיה משמעותית של RGC ולניוון לאחר מכן. בעקבות פגיעה ב-ONC, נצפתה ירידה ניכרת בעוצמת ה-eGFP וה-CTB, מה שמעיד על אובדן משמעותי של סיבי עצב והפרעה בהובלה אקסונלית. ניתוח נוסף של חלקי המוח חשף הקרנות RGC לקוליקולוס העליון (SC), מבנה מוח אמצעי המעורב באינטגרציה סנסורית-מוטורית ותנועות עיניים, ולגרעין הגניקולט הצדדי (LGN), מרכז הממסר העיקרי למידע חזותי לקליפת המוח הראייה. אחרי ONC, התגלתה ירידה בעוצמת ה-GFP בצד הנגדי של הפציעה (איור 5B-E). ממצאים אלה מדגימים את התועלת של שיטה זו לחקר ניוון אקסונלי של RGC ומיפוי דפוסי ההקרנה שלהם in vivo, ומציעים חלופה פוטנציאלית לשיטות מעקב פולשניות מסורתיות.

figure-results-1
איור 1: מערכת הדמיית אופתלמוסקופ לייזר סריקה קונפוקלית (CSLO) וממשק לוח בקרה עבור הדמיית רשתית חיה. (A-D) רכיבי מערכת הדמיה: תמונות אלו מתארות את מרכיבי המפתח של התקן HRA CSLO. (A) ידית המסנן מוגדרת למצב "A" עבור הדמיית החזר אינפרא אדום משולב (IR) ואנגיוגרפיה פלואורסצאין (FA). (B) כפתור המיקוד מכוון את המיקוד העדין של עדשת האובייקטיב. (C) המיקרומניפולטור מאפשר מיקום, יישור והארה מדויקים של אלומת האור לרשתית באמצעות דרגות חופש מרובות (למשל, צירי X, Y, Z) וסיבוב. (D) כפתור הרגישות שולט בבהירות של תמונות IR ו-FA על ידי התאמת ה-ampשל אות האור שזוהה. לחיצה על הכפתור יוזמת מיצוע תמונה, המשלב מספר פריימים כדי להפחית רעש ולשפר את יחס האות לרעש. (א-ה) ממשק לוח הבקרה: צילומי המסך מציגים את לוח הבקרה של CSLO עם ההגדרות המשמשות לרכישת תמונות חיות והדמיה. (ה) לוח הבקרה של הרכישה מופעל. (F) מומלץ להשתמש במצב רזולוציה גבוהה לקבלת איכות תמונה מיטבית. (G) הגדרות הדמיית האינפרא-אדום מודגשות, מה שמאפשר הדמיה של מבני רשתית וכלי דם. (H) הגדרות הדמיית FA מציגות אפשרויות להדמיה פלואורסצנטית חד-נקודתית ורב-נקודתית, מה שמאפשר זיהוי של אותות פלואורסצנטיים בתוך תאי הרשתית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הדמיית CSLO in vivo של תאי רשתית המסומנים פלואורסצנטית לאחר טרנספקציה של AAV בעכברי C57. (A) ציר הזמן הניסיוני של הדמיה אורכית בעזרת CSLO לאחר טרנספקציה של AAV בעין העכבר. (B) תמונות CSLO מייצגות של האזורים העליונים והמרכזיים של רשתית עכבר C57 לאחר 4 שבועות של ביטוי AAV2-hSyn-eGFP. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (C) מונטאז' רשתית תפור ידנית מ-(B) מציג את התפלגות תאי הרשתית המבטאים eGFP. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (D) תמונת CSLO מוגדלת של האזור הקופסה ב-(C) ותמונת המיקרוסקופיה הקונפוקלית המתאימה של תושבת שטוחה ברשתית. הקו-לוקליזציה של eGFP (ירוק) עם סמן RGC RBPMS (אדום) מאשרת ביטוי בתיווך AAV בתאי גנגליון רשתית (דוגמאות מוקפות בעיגול). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (E) מונטאז' תפור ידנית של רשתית עכבר C57 4 שבועות לאחר ההזרקה עם AAV9-GfaABC1D-eGFP, המדגים ביטוי eGFP ספציפי לגליה של מולר. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (F) תמונת CSLO מוגדלת של האזור הקופסה ב-(E) ותמונת המיקרוסקופיה הקונפוקלית המתאימה של תושבת שטוחה ברשתית. הקולוקליזציה של eGFP (ירוק) עם סמן גליה של מולר גלוטמין סינתטאז (GS, אדום) מאשרת ביטוי בתיווך AAV בתאי גליה של מולר (דוגמאות מוקפות בעיגול). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: ספציפיות סוג התא של העברת גנים בתיווך AAV ברשתית העכבר. (A) אימונוהיסטוכימיה של חתך רשתית ושטוח מעכברי C57 לאחר 4 שבועות של זיהום AAV2-hSyn-eGFP. הקולוקליזציה של GFP (ירוק) עם RBPMS (אדום) מאשרת ביטוי ספציפי ל-RGC. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (B) כימות של יעילות התמרה AAV2-hSyn-GFP וסגוליות ב-RGCs. היעילות מיוצגת כאחוז ה-RGCs החיוביים ל-RBPMS המבטאים גם GFP בהרכבה השטוחה של הרשתית. הספציפיות מיוצגת כאחוז התאים החיוביים ל-GFP שהם גם חיוביים ל-RBPMS בחלק הרשתית (n = 6 עיניים מ-4 עכברים). (C) צביעה אימונופלואורסצנטית של קטע רשתית והרכבה שטוחה מעכברי C57 לאחר 4 שבועות של זיהום AAV9-GfaABC1D-eGFP. הקולוקליזציה של GFP (ירוק) עם GS (אדום) מאשרת ביטוי ספציפי לגליה של מולר. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (D) כימות של יעילות התמרה AAV9-GfaABC1D-GFP וספציפיות בגליה של מולר. היעילות מיוצגת כאחוז גליית Müller חיובית ל-GS המבטאת גם GFP בהרכבה השטוחה של הרשתית. הספציפיות מיוצגת כאחוז התאים החיוביים ל-GFP שהם גם חיוביים ל-GS בקטע הרשתית (n = 6 עיניים מ-3 עכברים). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ניטור CSLO אורכי של הישרדות RGC לאחר ריסוק חריף של עצב הראייה (ONC) בעכברי AAV2-hSyn-eGFP. (A) תרשים סכמטי של ציר הזמן הניסיוני של פגיעה חריפה בעצב הראייה לאחר זיהום AAV. (B) הדמיית CSLO אורכית של אותה רשתית בעכבר AAV2-hSyn-eGFP בנקודת ההתחלה, 7 ימים ו-14 ימים לאחר ONC, הדמיה של RGCs המבטאים אותות GFP. תמונות מוגדלות של האזורים הקופסאות מוצגות מימין, לצד תמונות מיקרוסקופיה קונפוקליות מייצגות של תושבות שטוחות ברשתית המדגימות מורפולוגיה ותפוצה של RGC. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. (C) כימות הישרדות RGC במשך שבועיים לאחר ONC הוערך על ידי מדידת אחוז השינוי הן במספר התאים והן בעוצמת הפלואורסצנט של CSLO ביחס לקו הבסיס (ממוצע ± SEM). לא נצפו הבדלים משמעותיים בין הקבוצות בכל נקודת זמן (ANOVA חד כיווני). ניתוח רגרסיה ליניארית חשף מתאמים שליליים משמעותיים בין זמן לאחר הפציעה לבין מדדי הישרדות RGC בהתבסס על פלואורסצנטיות GFP (r² = 0.945, p < 0.001), צביעת RBPMS (r² = 0.888, p < 0.001), ספירת תאי CSLO (r² = 0.511, p < 0.001) ועוצמת פלואורסצנטיות CSLO (r² = 0.7486, p < 0.001). n = 6 עכברים/קבוצה/נקודת זמן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: מיפוי בעזרת AAV של הקרנות אקסונליות RGC לאורך נתיב הראייה. (A) תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות מייצגות של זוג עצבי ראייה מעכבר AAV2-hSyn-eGFP, המדגימות אקסוני RGC עם תווית GFP (ירוק) וקולוקליזציה עם רעלן כולרה אקסונלי אנטרוגרדי B (CTB, מג'נטה). הפאנל העליון מספק סקירה כללית של כל עצבי הראייה (סרגל קנה מידה: 1000 מיקרומטר), ואילו הפאנל התחתון מציע תצוגות מוגדלות של האזורים הקופסאות (סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר). שבועיים לאחר פציעת ONC, אותות GFP ו-CTB מראים ירידה ניכרת בכל עצב הראייה (צד שמאל), מה שמעיד על אובדן אקסונלי RGC והפרעה לאורך מסלול הראייה. (B) הקרנות אקסונליות RGC לקוליקולוס העליון (SC). קטעי מוח קורונליים מעכבר AAV2-hSyn-eGFP שבועיים לאחר ONC מדגישים אקסוני RGC מסומנים ב-GFP (ירוק) וצביעה CTB (מג'נטה) בתוך ה-SC. שמאל (L): SC נגדית; ימין (R): SC איפסילטרלי (צד פצוע ONC). סרגל קנה מידה: 1000 מיקרומטר. (C) תצוגה מוגדלת של האזור הקופסה ב-(B) מדגימה את הקו-לוקליזציה של אותות GFP ו-CTB (תמונה ממוזגת), המדגישה צרורות אקסונליים של RGC ודפוסי ההקרנה שלהם בתוך ה-SC. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (D) הקרנות אקסונליות של RGC לגרעין הגניקולט הצדדי (LGN) בעקבות ONC, חושפות אקסוני RGC עם תווית GFP (ירוק) וצביעה CTB (מגנטה) בתוך ה-LGN. שמאל (L): LGN נגדי; ימין (R): LGN איפסילטרלי (צד פצוע ONC). סרגל קנה מידה: 1000 מיקרומטר. (E) תצוגה מוגדלת של האזור הקופסה ב-(D) מדגישה צרורות אקסונליים של RGC ואת דפוסי ההקרנה שלהם בתוך ה-LGN. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

הפרוטוקול המוצג מפרט שיטה חזקה ונגישה למעקב in vivo של אוכלוסיות תאי רשתית ספציפיות, תוך רתימת הכוח של העברת גנים בתיווך AAV והדמיית CSLO. גישה זו מציעה מספר יתרונות על פני שיטות מסורתיות, המאפשרת מחקרי אורך של דינמיקת תאי הרשתית ותגובותיהם לפציעה או מחלה בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים.

הצלחת שיטה זו תלויה בכמה שלבים קריטיים. ראשית, השגת יעילות התמרה אופטימלית של AAV היא חיונית לביטוי חזק וספציפי של המדווח הפלואורסצנטי באוכלוסיית תאי היעד. זה יכול להיות מושפע מגורמים כמו בחירת סרוטיפ AAV, טיטר ויראלי וטכניקת הזרקה 13,15,16. שנית, טיפול נכון בבעלי חיים וריסון במהלך הדמיית CSLO חיוניים כדי למזער חפצי תנועה ולשמור על איכות התמונה. שימוש בפלטפורמת הדמיה מותאמת אישית והימנעות מהרדמה כללית תורמים להשגת הדמיה ברורה ועקבית של מבני הרשתית. שלישית, יש צורך באופטימיזציה זהירה של פרמטרי הדמיה של CSLO, כולל הגדרות מיקוד, רגישות וממוצע, כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה עם רעש מינימלי ויחס אות לרעש אופטימלי26. לבסוף, כדי לטפל במגבלות הפוטנציאליות ולהבטיח אמינות נתונים, יישמנו אמצעי בקרת איכות תמונה מחמירים והגדלנו את מספר בעלי החיים בתכנון המחקר שלנו.

מערכת Spectralis HRA CSLO כוללת מעקב עיניים אוטומטי המשפר את הדמיית האורך הקלינית. פונקציית המעקב האוטומטית בזמן אמת (ART) שלו יכולה להינעל על אזור רשתית ספציפי במהלך ההדמיה, ולהפחית חפצי תנועה. עבור הדמיה קלינית אנושית, המערכת כוללת גם אלגוריתם למעקב ארוך טווח אחר אותו מיקום רשתית אנטומי27. עם זאת, טכנולוגיות אלו אינן מותאמות למחקרי מכרסמים בשל הבדלים אנטומיים משמעותיים בין עיניים אנושיות למכרסמים. עיניים של מכרסמים קטנות בהרבה (קוטר 3-4 מ"מ בהשוואה ל-24 מ"מ בבני אדם) וחסרות ציוני דרך מסוימים כמו המקולה, מה שמציב אתגרים ייחודיים למעקב אוטומטי28. כתוצאה מכך, חוקרים החוקרים מודלים של מכרסמים מסתמכים בעיקר על שיטות ידניות, תוך שימוש בציוני דרך אנטומיים כגון דפוסי כלי דם וראש עצב הראייה כדי לאתר אזורים ספציפיים ברשתית ולשמור על מישורי הדמיה עקביים לאורך מפגשים13,22. גישה זו נחוצה לא רק בשל ציוני דרך מוגבלים בעיני מכרסמים אלא גם בגלל שינויים משמעותיים ברשתית הנגרמים על ידי מניפולציות ניסיוניות, שעלולות לבלבל מערכות אוטומטיות שאינן מתוכננות לאתגרים ספציפיים אלה. לפיכך, פיתוח אלגוריתמים מיוחדים למעקב אחר עיניים ויישור להדמיית רשתית מכרסמים מייצג כיוון עתידי מכריע. במיוחד, התאמת אלגוריתמי מעקב ארוכי טווח לשימוש בבעלי חיים קטנים יכולה לשפר משמעותית את הדיוק והשחזור של מחקרי אורך.

בעוד שטכניקות היסטולוגיות מסורתיות דורשות הקרבת בעלי חיים ומונעות מחקרי אורך, שיטת הדמיה CSLO בסיוע AAV מציעה גישה לא פולשנית לניטור דינמיקת תאי הרשתית in vivo. גישה זו מתבססת על עבודות קודמות שהדגימו את התועלת של הדמיית cSLO למעקב אחר שינויים אורכיים בתאי רשתית ספציפיים לאחר פציעה, במיוחד במודלים של בעלי חיים המשתמשים בתיוג חלבון פלואורסצנטי טרנסגני 19,21,22,29. מחקרים אלה הדגישו את היכולת של CSLO לדמיין מגוון אירועי תאי רשתית in vivo, כולל מוות של תאים, הישרדות ואולי אפילו נדידה או צמיחת תהליכים. פרוטוקול זה מרחיב את היישום של טכניקה זו לחקר התמרה בתיווך AAV של אוכלוסיות תאי רשתית ספציפיות, ומאפשר לנו לעקוב אחר ההשפעות ארוכות הטווח של העברת AAV וביטוי טרנסגנים בתוך הרשתית ומספק תובנות מכריעות לגבי התקדמות מחלות רשתית ויעילות ההתערבויות הטיפוליות. ההערכות הקליניות הנוכחיות המשתמשות ב-OCT מתמקדות בעיקר באובדן אקסון RGC על ידי מדידת עובי שכבת סיבי עצב ברשתית9, אך חסרה להן הרזולוציה להעריך מורפולוגיה של RGC בודד או מעורבות תאי גליה. למרות ש-AO-SLO מאפשר הדמיה ברמת התא ברשתית האנושיתהחיה, מורכבותו וזמינותו המוגבלת מגבילים את השימוש בו בעיקר במסגרות מחקר. בנוסף, הבחנה בין סוגי תאי גליה בתוך AO-SLO דורשת לעתים קרובות שיטות תיוג נוספות30. שיטה זו מתגברת על מגבלות אלה על ידי מתן גישה מקיפה ונגישה יותר להדמיה ומעקב אחר RGCs בודדים ואוכלוסיות תאי רשתית אחרות המסומנות פלואורסצנטית לאורך זמן. זה פותח דרכים לחקירת תגובות תאיות בתנאים שונים, ומסייע בפיתוח טיפולים ממוקדים. יתרה מכך, שילוב של הדמיית CSLO בעזרת AAV עם אופטוגנטיקה31 או הדמיית סידן32 יכול להעמיק עוד יותר את ההבנה של תפקוד תאי הרשתית ותפקידיו בעיבוד חזותי, פיתוח מעגלים והתחדשות.

למרות עוצמתה של גישה זו, יש להכיר במגבלות מסוימות ובשיקולים פוטנציאליים לפתרון בעיות. שונות ביעילות התמרת AAV יכולה להתרחש, מה שמחייב אופטימיזציה של פרמטרי הזרקה או טיטר ויראלי עבור סוגי תאים ספציפיים או תנאי ניסוי. הדמיית CSLO יכולה להיות מושפעת מגורמים כמו אטימות קרנית, חוסר יציבות של סרט הדמעות ותנועות עיניים, הדורשים ניטור והתאמות קפדניות במהלך רכישת התמונה. בנוסף, עומק החדירה המוגבל של CSLO מגביל את ההדמיה לשכבות הרשתית הפנימיות, ועלול להוציא מבנים עמוקים יותר כמו קולטני אור33. מערכת Spectralis cSLO מאפשרת הדמיה ברורה של תכונות ודפוסים תאיים מובהקים בתוך הרשתית34. בעוד ששיטת הדמיה זו יכולה להקל על תצפית של תא בודד בתנאים מסוימים, כפי שהודגם בעבודה קודמת הדמיה של RGCs בודדים בעכברי Thy1-YFP22 בעלי תווית דלילה, היא יכולה להציב אתגרים לכימות תאים בודדים בתרחישים מסומנים בצפיפות. לדוגמה, במחקר זה, תיוג המוני של RGCs עם eGFP בעקבות זיהום רשתית בתיווך AAV יכול לפעמים לעכב את ההדמיה הברורה של תאים בודדים, במיוחד באזורים עם שינויים ברמות הביטוי וחפיפת התאים. אתגר זה מורכב עוד יותר בעת הדמיית גליה של מולר, שכן המורפולוגיה המוארכת שלהם, המשתרעת על פני כל עובי הרשתית35, מקשה על לכידת תא בודד במישור מוקד יחיד באמצעות cSLO. הערכת יעילות הזיהום של Müller glia בתיווך AAV9, אם כן, מסתמכת בעיקר על הערכת דפוסי התמרה והתפלגות כוללים באמצעות הדמיית CSLO.

יתר על כן, בעוד שממוצע ART במערכת HRA משפר את איכות התמונה, משך הסריקה המוגבר מציג מגבלות מעשיות, במיוחד בהדמיה של בעלי חיים ערים. הערך הממוצע של ART שנבחר של 15 הוא איזון איכות התמונה עם זמן הסריקה, ומספק הפחתת רעש מספקת תוך שמירה על משך סריקה סביר. כדי למזער את אי הנוחות והלחץ של בעלי החיים, יש לייעל את הליכי ההדמיה ליעילות, להעסיק צוות מיומן המיומן בטיפול והדמיה של בעלי חיים ערים, ולפקח בקפידה על בעלי חיים לאיתור סימני אי נוחות או יובש בקרנית במהלך מפגשי ההדמיה. מדדים אלה היו חיוניים להבטחת איכות הנתונים ורווחת בעלי החיים, והדגישו את החשיבות של התחשבות בשני הגורמים בעת שימוש בממוצע ART להדמיית רשתית in vivo במודלים של בעלי חיים ערים.

על ידי הכרה במגבלות הללו ובמקורות השונות הפוטנציאליים, חוקרים יכולים לנקוט בצעדים מתאימים כדי לייעל את פרוטוקולי ההדמיה, למזער חפצים ולהבטיח את האמינות והשחזור של הנתונים שלהם.

בסך הכל, שיטה נגישה וניתנת ליישום זו מציעה אמצעי רב עוצמה לחקור את יחסי הגומלין המורכבים בין RGCs ו-Müller glia, במיוחד בתגובה לפציעה או מחלה. על ידי מתן אפשרות לחוקרים לדמיין ולכמת את האינטראקציות הדינמיות הללו, גישה זו מקלה על גילוי מנגנונים תאיים ומולקולריים חדשים העומדים בבסיס פתולוגיות הרשתית. זה, בתורו, שופך אור על פיתוח אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות ואמצעי נגד משופרים למחלות.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82130029). איור 2A ואיור 4A נוצרו עם BioRender.com.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
33 GaugeNeedle Hamilton Corp., Reno, NV, ארה"ב7803-05להזרקה תוך זגוגית
0.5% פרופרקאין Santen פרמצבטיקה ושות', בע"מחומרי הרדמה מקומיים
AAV2-hSyn-eGFP OBiO Technology Corp., סיןטיטר וירוסים: 2.7 x 1012 גנומים נגיפיים (vg)/mL 
AAV9-GfaABC1D-eGFPWZ Biosciences Inc., סיןטיטר וירוסים: 4.5 x 1012 גנומים נגיפיים (vg)/mL 
Betadine חברה רפואית בריאה001651חומרי חיטוי מקומיים
מלקחיים של הקרנית (שיניים)מכשירי עיניים מינגרן, סיןMR-F301Aלאבטחת העפעפיים במהלך הזרקה תוך זגוגית
Dumont 05# מלקחייםFST51-AGT5385לריסוק עצב הראייה
Graphpadפריזמה GraphPad פריזמה, ארה"בציור גרפים וניתוח סטטיסטי
HRA SpectralisHeidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, גרמניהמצב "IR" ו-"FA" להדמיית CSLO
Image J/FijiNational Institutes of Health, ארה"בעיבוד תמונה
משחה אנטיביוטית MaxitrolAlcon, INC. ארה"ב0065-0631אנטיביוטיקה מקומית
מזרק מיקרוליטרHamilton Corp., רינו, נבדה, ארה"ב7633-01להזרקה תוך זגוגית
Mydrin-P תמיסת עינייםSanten Pharmaceutical Co., Ltd, יפןהרחבת אישון
מיקרוסקופ כירורגי עיניים Leica AG, Heerbrugg, שוויץM220לפעולות כירורגיות
Pentorbarbitol נתרןסיגמא אולדריץ', ארה"ב57-33-0Genereal Aneasthetics
PowerpointMicrosoft Corporation, ארה"ביישור וחיתוך תמונה
VISCOTEARS ג'ל נוזלי (קרבומר)ד"ר גרהרד מאן, כימיה-פארם. Fabrik, גרמניהחומר סיכה מקומי 

מקורות

  1. Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. Imaging retina to study dementia and stroke. Prog Retin Eye Res. 57, 89-107 (2017).
  2. Ju, W. K., et al. Glaucomatous optic neuropathy: Mitochondrial dynamics, dysfunction and protection in retinal ganglion cells. Prog Retin Eye Res. 95, 101136(2023).
  3. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  4. Llorián-Salvador, M., Cabeza-Fernández, S., Gomez-Sanchez, J. A., De La Fuente, A. G. Glial cell alterations in diabetes-induced neurodegeneration. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 47(2024).
  5. Zhao, N., Hao, X. N., Huang, J. M., Song, Z. M., Tao, Y. Crosstalk between microglia and müller glia in the age-related macular degeneration: Role and therapeutic value of neuroinflammation. Aging Dis. 15 (3), 1132-1154 (2023).
  6. Minhas, G., Sharma, J., Khan, N. Cellular stress response and immune signaling in retinal ischemia-reperfusion injury. Front Immunol. 7, 444(2016).
  7. Miao, Y., Zhao, G. L., Cheng, S., Wang, Z., Yang, X. L. Activation of retinal glial cells contributes to the degeneration of ganglion cells in experimental glaucoma. Prog Retin Eye Res. 93, 101169(2023).
  8. Leung, C. K. S., et al. Diagnostic assessment of glaucoma and non-glaucomatous optic neuropathies via optical texture analysis of the retinal nerve fibre layer. Nat Biomed Eng. 6 (5), 593-604 (2022).
  9. Hood, D. C., et al. Detecting glaucoma with only OCT: Implications for the clinic, research, screening, and AI development. Prog Retin Eye Res. 90, 101052(2022).
  10. Burns, S. A., Elsner, A. E., Sapoznik, K. A., Warner, R. L., Gast, T. J. Adaptive optics imaging of the human retina. Prog Retin Eye Res. 68, 1-30 (2019).
  11. Dinculescu, A., Glushakova, L., Min, S. H., Hauswirth, W. W. Adeno-associated virus-vectored gene therapy for retinal disease. Hum Gene Ther. 16 (6), 649-663 (2005).
  12. Nickells, R. W., Schmitt, H. M., Maes, M. E., Schlamp, C. L. AAV2-mediated transduction of the mouse retina after optic nerve injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (14), 6091-6104 (2017).
  13. Cao, X., Yung, J., Mak, H., Leung, C. K. S. Factors governing the transduction efficiency of adeno-associated virus in the retinal ganglion cells following intravitreal injection. Gene Ther. 26 (3-4), 109-120 (2019).
  14. Vandenberghe, L. H., et al. Dosage thresholds for AAV2 and AAV8 photoreceptor gene therapy in monkey. Sci Transl Med. 3 (88), 88ra54(2011).
  15. Gao, Y., et al. Develop an efficient and specific AAV-based labeling system for Muller glia in mice. Sci Rep. 12 (1), 22410(2022).
  16. Nieuwenhuis, B., et al. Improving adeno-associated viral (AAV) vector-mediated transgene expression in retinal ganglion cells: Comparison of five promoters. Gene Ther. 30 (6), 503-519 (2023).
  17. Kawabata, H., et al. Improving cell-specific recombination using AAV vectors in the murine CNS by capsid and expression cassette optimization. Mol Ther Methods Clin Dev. 32 (1), 101185(2024).
  18. Smith, C. A., Chauhan, B. C. In vivo imaging of adeno-associated viral vector labelled retinal ganglion cells. Sci Rep. 8 (1), 1490(2018).
  19. Smith, C. A., Chauhan, B. C. Imaging retinal ganglion cells: Enabling experimental technology for clinical application. Prog Retin Eye Res. 44, 1-14 (2015).
  20. Leung, C. K. S., et al. Longitudinal profile of retinal ganglion cell damage after optic nerve crush with blue-light confocal scanning laser ophthalmoscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (11), 4898(2008).
  21. Leung, C. K. S., et al. In vivo imaging of murine retinal ganglion cells. J Neurosci Methods. 168 (2), 475-478 (2008).
  22. Mak, H. K., Ng, S. H., Ren, T., Ye, C., Leung, C. K. S. Impact of PTEN/SOCS3 deletion on amelioration of dendritic shrinkage of retinal ganglion cells after optic nerve injury. Exp Eye Res. 192, 107938(2020).
  23. Kokona, D., Jovanovic, J., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. In Vivo imaging of Cx3CR1GFP/GFP reporter mice with spectral-domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy. J Vis Exp. (129), e55984(2017).
  24. Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
  25. Levkovitch-Verbin, H., et al. RGC death in mice after optic nerve crush injury: Oxidative stress and neuroprotection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (13), 4169-4174 (2000).
  26. LaRocca, F., et al. Optimization of confocal scanning laser ophthalmoscope design. J Biomed Opt. 18 (7), 076015(2013).
  27. Vienola, K. V., et al. Real-time eye motion compensation for OCT imaging with tracking SLO. Biomed Opt Express. 3 (11), 2950-2963 (2012).
  28. Geng, Y., et al. Optical properties of the mouse eye. Biomed Opt Express. 2 (4), 717-738 (2011).
  29. Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: Confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731(2015).
  30. Joseph, A., Power, D., Schallek, J. Imaging the dynamics of individual processes of microglia in the living retina in vivo. Biomed Opt Express. 12 (10), 6157-6170 (2021).
  31. Chaffiol, A., et al. A new promoter allows optogenetic vision restoration with enhanced sensitivity in macaque retina. Mol Ther. 25 (11), 2546-2560 (2017).
  32. Li, L., et al. Longitudinal in vivo Ca2+ imaging reveals dynamic activity changes of diseased retinal ganglion cells at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (48), e2206829119(2022).
  33. Bille, J. F. Optical Coherence Tomography (OCT): Principle and technical realization. High-resolution imaging in microscopy and ophthalmology: New Frontiers in Biomedical Optics. , Springer International Publishing. 59-85 (2019).
  34. Spaide, R. F., et al. Lateral resolution of a commercial optical coherence tomography instrument. Transl Vis Sci Technol. 11 (1), 28(2022).
  35. Franze, K., et al. Muller cells are living optical fibers in the vertebrate retina. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8287-8292 (2007).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

AAVGFP

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.