מאמר שיטה

ייצור ואפיון מדבקות מיקרו-מחטים להעמסה ואספקה של אקסוזומים

DOI:

10.3791/67109

⸱

12 ביולי 2024

 ,  , 
1Medical School, Faculty of Medicine, Tianjin University, 2Hangzhou Institute of Medicine, Chinese Academy of Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אקסוזומים הם בעלי פוטנציאל קליני משמעותי, אך היישום המעשי שלהם מוגבל בשל פינוי קל in vivo ויציבות ירודה. מיקרו-מחטים מציגות פתרון בכך שהן מאפשרות אספקה מקומית על ידי ניקוב מחסומים פיזיולוגיים ושימור מצב יבש, ובכך נותנות מענה למגבלות מתן האקזוזום ומרחיבות את התועלת הקלינית שלהן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אקסוזומים, כטיפולים ביולוגיים מתפתחים של "הדור הבא" ווקטורים של אספקת תרופות, טומנים בחובם פוטנציאל עצום בתחומים ביו-רפואיים מגוונים, החל ממתן תרופות ורפואה רגנרטיבית ועד אבחון מחלות ואימונותרפיה של גידולים. עם זאת, הפינוי המהיר על ידי הזרקת בולוס מסורתית ויציבות ירודה של אקסוזומים מגבילים את היישום הקליני שלהם. מיקרו-מחטים משמשות כפתרון המאריך את זמן השהייה של האקסוזומים באתר הניהול, ובכך שומר על ריכוז התרופה ומקל על השפעות טיפוליות מתמשכות. בנוסף, microneedles גם יש את היכולת לשמור על יציבות של חומרים ביו-אקטיביים. לכן, אנו מציגים מדבקת מיקרו-מחט לטעינה והעברה של אקסוזומים וחולקים את השיטות, כולל בידוד אקסוזומים, ייצור ואפיון של מדבקות מיקרו-מחטים עמוסות אקסוזומים. מדבקות המיקרו-מחטים יוצרו באמצעות טרהלוז וחומצה היאלורונית כחומרי קצה ופוליוויניל פירולידון כחומר הגיבוי בשיטת יציקה דו-שלבית. המיקרו-מחטים הפגינו חוזק מכני חזק, עם קצוות המסוגלים לעמוד ב-2 N. עור חזיר שימש להדמיית עור אנושי, וקצות המיקרו-מחטים נמסו לחלוטין תוך 60 שניות לאחר ניקוב העור. האקסוזומים ששוחררו מהמיקרו-מחטים הציגו מורפולוגיה, גודל חלקיקים, חלבוני סמן ותפקודים ביולוגיים דומים לאלה של אקסוזומים טריים, מה שאיפשר לתאים הדנדריטיים להיקלט ולקדם את הבשלתם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אקסוזומים, שהם שלפוחיות קטנות המשתחררות על ידי תאים לתוך המטריצה החוץ תאית, הוצעו כטיפולים ביולוגיים פוטנציאליים ווקטורים למתן תרופות לטיפול במספר מחלות וסרטן1. במהלך תהליך הביוגנזה שלהם, אקסוזומים עוטפים מולקולות ביולוגיות פעילות שונות מתוך התאים, כולל חלבונים פונקציונליים וחומצות גרעין2. כתוצאה מכך, כאשר הם נלקחים על ידי התאים המקבלים במהלך תהליך ההובלה, לאקסוזומים יש את היכולת לווסת את ביטוי הגנים ואת תפקודי התאים בתאי היעד3. כסוג של שליח מידע טבעי, אקסוזומים נוצלו במלואם בהתחדשות רקמות, ויסות חיסוני, וכמוביל משלוח4. באמצעות טכניקות הנדסיות, ליגנדות ספציפיות יכולות להיות מועשרות על פני השטח של אקסוזומים, מה שמאפשר אינדוקציה או עיכוב של אירועי איתות בתאי המקבל או מיקוד לסוגי תאים ספציפיים5. ניתן גם לטעון חומרים כימותרפיים לתוך אקסוזומים לטיפול בסרטן6. יתר על כן, אקסוזומים יש את היכולת לחצות את מחסום הדם-מוח עבור משלוח מטען טיפולי, מה שהופך אותם מבטיחים מאוד לטיפול בהפרעות מוח7. בהשוואה לליפוזומים, אקסוזומים מפגינים ספיגה תאית משופרת ותאימות ביולוגית משופרת8. הם מסוגלים להיכנס ביעילות לתאים אחרים תוך הפגנת סבילות טובה יותר ורעילות נמוכה יותר9. עם זאת, הזרקת הבולוס המסורתית של אקסוזומים מועדת לקיבוע ופינוי מהיר על ידי הכבד, הכליות והטחול בזרם הדם10. יתר על כן, לאקסוזומים יש יציבות נמוכה במבחנה והם רגישים לתנאי אחסון, המגבילים את היישומים הקליניים שלהם11.

מיקרו-מחטים, מערך של קצות מחטים בגודל מיקרומטרי, מסוגלים לחדור מחסומים פיזיולוגיים להעברת תרופות במולקולות קטנות12, חלבונים13, חומצות גרעין14 וננו-תרופות15. מיקרו-מחטים מהונדסות במדויק כדי להתמקד בנגעים על פני העור, והקצוות המפוזרים שלהן מבטיחים פיזור תרופות אחיד באתר הממוקד, ובכך מגבירים את השפעתם הטיפולית16. העיצוב והרכב החומר של מיקרו-מחטים מאפשרים אחסון יבש של חומרים ביו-אקטיביים כגון חלבונים וחומצות גרעין, ומשפרים את יציבותם17. לשיטות ההזרקה המסורתיות יש משך פעולה קצר יחסית והן עלולות לגרום לכאב, ולעורר פחד בקרב מטופלים18. אורך המיקרומטר של מיקרו-מחט ממזער טראומה לרקמות ומונע גירוי עצבי, ובכך מבטל כאב ומשפר את היענות המטופל19. בנוסף, האופי הידידותי למשתמש של מיקרו-מחטים מאפשר למטופלים לנהל את הטיפול באופן עצמאי ללא צורך בצוות מיוחד16. בנוסף לעור, מיקרו-מחטים יכולות לשמש גם ברקמות כגון העיניים20, רירית הפה21, הלב22 וכלי הדם23. היישום של microneedles עבור משלוח קליני של exosomes מספק אסטרטגיה מבטיחה ופוטנציאלית.

לפיכך, אנו מציגים תיקון מיקרו-מחט (exo@MN) עמוס אקסוזום וחושפים את שיטת הייצור שלו. מדבקות המיקרו-מחטים יוצרו בשיטת יציקה דו-שלבית, יחד עם צנטריפוגה וייבוש ואקום, המקדמים צבירה של אקסוזומים בקצות המיקרו-מחטים, ובכך משפרים את יעילות ההעברה. גם קצות המחט וגם הגב נבנו מחומרים המציגים תאימות ביולוגית מעולה ומסיסות במים. טרהלוז וחומצה היאלורונית (HA) שולבו כחומרי קצה כדי לספק הגנה לאקסוזומים, ופוליוויניל פירולידון (PVP) מומס באתנול מוחלט נבחר כחומר הגיבוי. המורפולוגיה של מדבקת המיקרו-מחט אופיינה באמצעות מיקרוסקופ ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). הבדיקה המכנית של המיקרו-מחט הוערכה באמצעות מד מתיחה כדי לאשר את יכולתם לחדור לעור, וקצב השחרור על עור חזיר נחקר כ-60 שניות. יתר על כן, המורפולוגיה, הגודל ותכולת החלבונים הן של אקסוזומים טריים והן של אקסוזומים exo@MN אופיינו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) וכתמים מערביים (WB). הפנמת האקסוזומים על ידי תאים דנדריטיים (DCs) אופיינה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM), והבשלת DCs הוערכה באמצעות ציטומטריית זרימה. האפיון המורפולוגי והתפקודים הביולוגיים של שני סוגי האקסוזומים עקביים במהותם.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה אינו דורש אישור אתי מכיוון שעור החזיר ששימש לניסויים המתוארים בסעיף 3 נרכש כאוזני חזיר אכילות מהשוק ולא מקורו בחיות ניסוי.

1. בידוד של אקסוזומים

  1. תרבית תאים
    1. טפחו תאי סרטן אפיתל בשחלות של עכברים ID8 במדיום תרבית מסוג DMEM (Modified Eagle Medium) של דולבקו המכיל 10% נסיוב בקר עוברי ותמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 1% (100×) (ראו טבלת חומרים) בצלחות פטרי בקוטר של 15 ס"מ.
    2. לדגור על תאי ID8 באינקובטורCO2 (ראה טבלת חומרים) ב 37 ° C ו 5% CO2 עד צפיפות התא מגיע 90%.
  2. בידוד אקסוזומים
    1. הסירו את מדיום התרבית מכלי הפטרי ושטפו פעמיים במי מלח חוצצי פוספט (DPBS) של Dulbecco. הוסף 20 מ"ל DMEM ללא נסיוב בקר עוברי (ראה טבלת חומרים) ותמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (ראה רשימת חומרים). המשך את הדגירה ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 48 שעות.
    2. אספו את תרבית התאים מ-20 צלחות פטרי בקוטר 15 ס"מ. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C ולאסוף את supernatant להסרת תאים חופשיים.
    3. צנטריפוגה ב 2000 x גרם במשך 10 דקות 4 ° C, ולאסוף את supernatant לסילוק פסולת תאית.
    4. חבר את מערכת סינון הוואקום החד-פעמית בגודל 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) למשאבת ואקום המים במחזור המים (ראה טבלת חומרים). צור ואקום כדי לאפשר לסופרנאטנט לעבור דרך קרום סולפון פוליאתר 0.22 מיקרומטר ולהיכנס לתא התחתון של מערכת הסינון, תוך הסרת בועיות או זיהומים גדולים מ- 0.22 מיקרומטר מהסופרנטנט.
      1. כדי לחבר את משאבת הוואקום, הפעל את מתג המשאבה ולאחר מכן חבר אותו לכניסת האוויר של מערכת סינון הוואקום. בעת הסגירה, נתק תחילה את החיבור עם המשאבה ולאחר מכן כבה את משאבת הוואקום. הליך זה מסייע למנוע זרימה חוזרת של משאבת ואקום וזיהום של נוזל התרבית.
    5. הוסף 15 מ"ל של supernatant לצינור הפנימי של צינור אולטרה-סינון 100 kDa (ראה טבלת חומרים). צנטריפוגה ב 3500 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C, ולהסיר את הנוזל מן הצינור החיצוני.
      הערה: שמור חלקיקים גדולים מ- 100 kDa על קרום הצינור הפנימי, בעוד חלבונים קטנים מ- 100 kDa יעברו צנטריפוגה לצינור החיצוני יחד עם התמיסה. האקסוזומים היו גדולים מ-100 kDa ונצברו על קרום הצינור הפנימי.
    6. חזור על השלבים לעיל עד שהנפח הכולל של הנוזל נמצא בטווח של 5 מ"ל. לאסוף את הנוזל מן הצינור הפנימי ולהוסיף 1 מ"ל של DPBS. השתמש פיפטה כדי פיפטה שוב ושוב בצינור הפנימי, הבטחת ההשעיה של exosomes מחובר DPBS, ולאחר מכן לאסוף אותם.
    7. צנטריפוגה ב 10000 x גרם במשך 60 דקות ב 4 ° C, ולהעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה 6 מ"ל הצמדה מהירה (ראה טבלה של חומרים). אטמו את הצינור עם אוטם חום.
    8. צנטריפוגה ב 100,000 x גרם במשך 2 שעות 4 ° C באמצעות אולטרה צנטריפוגה (ראה טבלה של חומרים). פתח את צינור הצנטריפוגה המהירה, הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של DPBS. זהו הפתרון האקזוזום.
      הערה: במהלך תהליך השעיית הכדור, יש צורך פיפטה ולהסעיר את דופן הצינור לפחות 200 פעמים באמצעות פיפטה.

2. ייצור exo@MN

  1. הכנת תבנית מאסטר
    1. בניית מודל מיקרו-מחט עם מערך של 10 x 10 באמצעות תוכנת CAD, הכולל קצוות בצורת חרוט עם הפרמטרים הבאים: גובה של 1200 מיקרומטר, קוטר בסיס של 400 מיקרומטר, וגובה (מרחק בין מיקרו-מחטים סמוכות) של 900 מיקרומטר.
    2. השתמש בשרף HTL כחומר והדפס את תבנית האב של המחט באמצעות מדפסת תלת ממד (ראה טבלת חומרים).
    3. לטבול את תבנית המאסטר אתנול מוחלט במשך 1 שעה כדי להסיר כל שרף נדבק על פני השטח.
    4. חשוף את התבנית לאור אולטרה סגול במשך 5 דקות כדי לרפא אותו.
    5. לטבול את התבנית שוב אתנול מוחלט במשך 1 שעה, ולאחר מכן לייבש אותו ב 60 ° C בתנור ייבוש במשך 1 שעה. תבנית המאסטר מוכנה.
  2. הכנת תבנית ייצור
    1. ערבבו רכיבי A ו-B של פולידימתילסילוקסאן (PDMS, ראו טבלת חומרים) ביחס של 10:1. מערבבים היטב ויוצקים את התערובת לתבנית מאסטר.
    2. הניחו את תבנית PDMS תחת לחץ של 1 psi למשך 15 דקות כדי להסיר בועות אוויר מתערובת PDMS.
    3. לרפא את תבנית PDMS ב 60 ° C במשך 2 שעות ולאחר מכן deold כדי לקבל את תבנית הייצור של microneedle.
    4. נקו את תבנית הייצור במים טהורים במיוחד לפני השימוש.
  3. הכנת פתרון
    1. כמת את תכולת החלבון של התמיסה האקזוזום באמצעות ערכת בדיקת BCA (ראה טבלת חומרים). הוסף כמות מתאימה של DPBS כדי להשיג ריכוז של 10 מיקרוגרם/μL עבור התמיסה האקזוזומית.
    2. הכינו תמיסה של 200 מ"ג/מ"ל טרהלוז (ראו טבלת חומרים) תוך שימוש ב-DPBS כממס. ערבבו במשך 20 דקות כדי להבטיח המסה מלאה.
    3. הכינו תמיסה של 200 מ"ג/מ"ל חומצה היאלורונית (HA, ראו טבלת חומרים) תוך שימוש ב-DPBS כממס. יש לערבב למשך הלילה כדי להבטיח המסה מלאה.
    4. הכינו תמיסה של 150 מ"ג/מ"ל פוליוויניל פירולידון (PVP, ראו טבלת חומרים) תוך שימוש באתנול מוחלט כממס. יש לערבב למשך הלילה כדי להבטיח המסה מלאה.
    5. ערבבו את התמיסה האקזוזום (10 מיקרוגרם/מיקרוליטר) ואת תמיסת הטרהלוז (200 מ"ג/מ"ל) ביחס נפח של 1:1. לאחר מכן, הוסף נפח שווה של תמיסת HA (200 מ"ג/מ"ל). ערבבו היטב לקבלת תמיסת הקצה.
  4. ייצור exo@MN
    1. עבד את פני השטח של תבנית PDMS באמצעות שואב פלזמה (ראה טבלת חומרים) במשך 30 שניות בדרגה נמוכה כדי לשפר את ההידרופיליות שלה.
    2. הוסף 40 μL של תמיסת קצה לתבנית PDMS. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר (RT) ו 3000 x גרם במשך 3 דקות כדי להבטיח שהנוזל ימלא את שכבת המחט של התבנית.
    3. מוציאים את עודפי הנוזלים בתבנית ומייבשים בתנור ייבוש בוואקום (ראו טבלת חומרים) למשך יום אחד.
    4. הוסף 200 μL של תמיסת PVP לתבנית PDMS. צנטריפוגה 3000 x גרם למשך 3 דקות ב- RT כדי להבטיח שהנוזל ימלא את שכבת הגב של התבנית.
    5. יבש את התבנית ב RT בתנור ייבוש במשך יום אחד, ולאחר מכן deold כדי לקבל את תיקון exo@MN.
      הערה: יש לאחסן את מדבקת exo@MN בתנור ייבוש עד שהיא מוכנה לשימוש.

תרשים תהליך הכנת אקסוזום; צנטריפוגה, ואקום יבש, תוספת פולימרית לייצוב.
איור 1: תהליך הייצור של exo@MN מדבקות. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. אפיון exo@MN טלאים

  1. תצפית במורפולוגיה
    1. הדביקו את גב המדבקה על משטח משופע של 45° ומקמו אותו תחת מיקרוסקופ סטריאו (ראו טבלת חומרים).
    2. הפעל את המאיר ולכוד את המורפולוגיה של הטלאי באמצעות מטרה 4x.
  2. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)
    1. יש להצמיד את המדבקה לשלב הדגימה באמצעות דבק מוליך ולטפל בה באמצעות ציפוי דק אוטומטי (ראה טבלת חומרים) למשך 30 שניות.
    2. צלם תמונות של תיקון exo@MN באמצעות SEM (ראה טבלת חומרים) עם מתח האצה של 1 kV.
  3. בדיקות מכניות
    1. גזרו מערך 3X3 מהמדבקה והניחו אותו כשהקצוות פונים כלפי מעלה על מצע קשיח של מד מתיחה (ראו טבלת חומרים). התאימו את גובה הבדיקה כדי לקרב אותה לקצות המחט מבלי לגעת בהם.
    2. הגדר את הפרמטרים כך שיפסיקו כאשר הלחץ מגיע ל- 20 N באופן אוטומטי. דחסו את קצות המחט אנכית במהירות של 0.5 מ"מ/דקה ותיעדו את פרופיל העומס לעומת התזוזה.
  4. פירוק
    1. רכשו אוזני חזיר טריות מהשוק וחתכו אותן לחתיכות (5 ס"מ x 5 ס"מ x 0.3 ס"מ). מורחים את עור החזיר על שולחן ומשתמשים בנייר כדי לייבש את לחות פני השטח.
    2. הכינו ארבע מדבקות מיקרו-מחט יבשות כשקצות המחט פונים כלפי מטה על עור החזיר, תוך ריווח כל טלאי מעט זה מזה. בעזרת האגודל והאצבע המורה, לחץ אנכית כלפי מטה על כל מדבקת מיקרו-מחט. הסר מדבקה אחת כל 15 שניות.
    3. מיד מניחים את המדבקה שהוסרה בתנור ייבוש ומייבשים במשך 5 דקות. חתכו עמוד של קצות מיקרו-מחטים, הניחו אותם אופקית מתחת למיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים), והשתמשו בעדשה אובייקטיבית 4x כדי לצפות בהמסת הקצוות.

4. אפיון אקסוזומים במדבקה exo@MN

הערה: קצות המיקרו-מחטים של exo@MN מומסים בתמיסת DPBS של 100 μL כדי לבצע את האפיון הבא על האקסוזומים ששוחררו.

  1. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)
    1. טפלו ברשת הנחושת (ראו טבלת חומרים) בטיפול הידרופילי באמצעות חומר ניקוי יונים (ראו טבלת חומרים) למשך 5 דקות.
    2. יש לפזר 10 μL של הדגימה על צד הפחמן של רשת הנחושת. תן לו לעמוד במשך 1 דקות, ולאחר מכן להסיר את הנוזל על ידי כתמים אותו עם נייר מסנן מן הקצוות.
    3. הוסף 10 μL של 3% אורניל אצטט (ראה טבלת חומרים) לדגימה. תן לו לעמוד במשך 10 שניות, ולאחר מכן להסיר את הנוזל על ידי כתמים עם נייר מסנן מן הקצוות.
    4. הוסף 10 μL של 3% אורניל אצטט לדגימה. תן לו לעמוד במשך 1 דקות, ולאחר מכן להסיר את הנוזל על ידי כתמים אותו עם נייר מסנן מן הקצוות לייבש באוויר ב RT.
    5. צלם תמונות של האקסוזומים באמצעות TEM (ראה טבלת חומרים) עם מתח מואץ של 80 kV.
  2. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA)
    1. דלל את התמיסה האקזוזום עם DPBS כדי להשיג ריכוז חלקיקים של 1 x 107 חלקיקים / מ"ל. יש להזריק באיטיות 1 מ"ל של התמיסה האקזוזום לתא הדגימה של נת"ע באמצעות מזרק 1 מ"ל (ראה טבלת חומרים).
    2. הגדר את סוג נוהל ההפעלה הסטנדרטי (SOP) של המכשיר ל- EV-488 כדי לזהות את התפלגות הגודל של האקסוזומים.
  3. כתם מערבי (WB)
    1. הכן את מאגר הליזיס על ידי ערבוב מאגר ליזה של בדיקת משקעים רדיואימונוגרפיים (RIPA): פנילמתאן סולפוניל פלואוריד (ראה טבלת חומרים) ביחס של 100:1. מפזרים את האקסוזומים על קרח במשך 20 דקות, מערבלים כל 10 דקות.
    2. צנטריפוגה את התמיסה ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. אספו את הסופרנאטנט כדי למדוד את ריכוז החלבון.
    3. הוסף מאגר טעינה של 5x SDS-PAGE (ראה טבלת חומרים) לסופרנאטנט ביחס נפח של 1:4 וערבב היטב. מחממים ב-100°C למשך 10 דקות כדי לנטרל את החלבונים.
    4. הוסף 5 μL של סמן חלבון מוכתם מראש 180 kDa (ראה טבלת חומרים) ו- 10 מיקרוגרם של דגימה מפורקת לג'ל פריקאסט 4%-20% (ראה טבלת חומרים). הפעל את מערכת האלקטרופורזה (ראה טבלת חומרים) ב- 60 V למשך 10 דקות ולאחר מכן ב- 140 V למשך 50 דקות.
    5. מעבירים את החלבונים מהג'ל לקרום PVDF (ראו טבלת חומרים) המופעל מראש עם מתנול. בצע את מערכת האלקטרופורזה ב 290 mA במשך 90 דקות על קרח.
    6. לדגור על קרום PVDF בתמיסת חלב רזה 5% למשך שעה אחת. יש לשטוף שלוש פעמים במי מלח חוצצים עם טווין (TBST, ראו טבלת חומרים) במשך 5 דקות כל אחת.
    7. גזרו את רצועות המטרה בהתבסס על מיקום החלבון. יש לדגור על הפסים עם נוגדן CD63 נגד עכבר ונוגדן Alix נגד עכבר (ראה טבלת חומרים) מדוללים לריכוז המתאים בהתאם להוראות היצרן, ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
    8. שטפו את הגומיות שלוש פעמים עם TBST. יש לדגור עם IgG נגד ארנבים מצומדים על ידי HRP (ראו טבלת חומרים) ב-RT למשך שעה אחת. לאחר מכן, שטפו שוב שלוש פעמים עם TBST.
    9. יש למרוח מגיב זיהוי סופר ECL (ראו טבלת חומרים) כדי לכסות את פני השטח של הפסים, ומיד לחשוף וללכוד את הפסים באמצעות מכונת צילום ג'ל (ראו טבלת חומרים).
  4. מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM)
    1. טפח 5 x 105 DCs בצלחת קונפוקלית באמצעות 2 מ"ל של Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) בינוני (ראה טבלת חומרים). מוסיפים אקסוזומים או exo@MN, ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 24 שעות.
    2. הוסיפו טיפה של Hoechst 33342 לכל מנה קונפוקלית ודגרו בחושך ב-37°C למשך 20 דקות.
    3. בצע הדמיה עם CLSM (ראה טבלת חומרים) באמצעות עדשה אובייקטיבית של 60x. מורחים טיפת שמן טבילה (ראו טבלת חומרים) על העדשה ומניחים את צלחת הקונפוקל על הבמה. התאם את צירי x/y/z כדי לאתר את מישור המוקד המתאים של התאים.
    4. התחל הדמיה עם ערוצי DAPI/TRITC/TD, בחר רזולוציה של 1024 פיקסלים והגדר את המצב המהיר ל- 1/8 שניות.
  5. ציטומטריית זרימה
    1. טפחו DCs בצלחת של 6 בארות, כל באר מכילה 5 x 105 תאים ו 2 מ"ל של 1640 בינוני. הוסף כמויות שוות של תמיסה של DPBS, אקסוזומים, מיקרו-מחטים ללא אקסוזומים ו-exo@MN, בהתאמה, ודגר בטמפרטורה של 37°C למשך 24 שעות.
    2. מעבירים את התווך מכל באר לצינורות צנטריפוגליים. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, ולהסיר את supernatant.
    3. הוסף 0.5 μL של נוגדן FITC-CD11c, 2.5 μL של נוגדן APC-CD80, ו- 0.5 μL של נוגדן I-A/I-E כחול פסיפי (ראה טבלת חומרים) ל- 100 μL של תמיסת 5% BSA (ראה טבלת חומרים). מערבבים היטב, מרחפים מחדש את התאים ודגורים על שייקר בקרח ובחושך במשך 20 דקות.
    4. הוסף 1 מ"ל של DPBS וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן להסיר את supernatant. חזור על השטיפה פעמיים כדי להסיר נוגדנים לא קשורים, ולאחר מכן המשך לנתח את התעלות הפלואורסצנטיות המתאימות באמצעות ציטומטריית זרימה (ראה טבלת חומרים).
      1. ראשית, בחלקת הפיזור FSC-A/SSC-A, שער אוכלוסיית התאים העיקרית כ-P1. בתרשים הפיזור SSC-A/SSC-H של אוכלוסיית תאי P1, שער אזור P2 ריבועי לאורך האלכסון כדי להסיר תאים מצטברים.
      2. בצע ניתוח פלואורסצנטי על אוכלוסיית תאי P2 באמצעות ערוצי FITC, APC ו- Pacific Blue. הגדר את תנאי העצירה כדי לאסוף 10,000 תאים בשער P2.

5. ניתוח סטטיסטי

  1. ביטוי נתונים כמותיים כאמצעי ± סטיות תקן (SD). הערך מובהקות סטטיסטית באמצעות ניתוח t-test באמצעות יישום תוכנה מתאים לניתוח נתונים. שקול ערכי p הנמוכים מ- 0.05 כדי לציין מובהקות סטטיסטית. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד אקסוזומים, ייצור ואפיון של טלאי exo@MN. איור 1 מדגים את תרשים הזרימה של התהליך לייצור טלאי exo@MN. האקסוזומים עורבבו עם טרהלוז וחומצה היאלורונית, ולאחר מכן הוסיפו את התערובת לתבנית המיקרו-מחטים והצנטריפוגות. תהליך זה הקל על הצטברות האקסוזומים בקצות המחטים, וקידם שחרור מהיר. לאחר הייבוש נוספה תמיסת PVP וצנטריפוגה כדי למלא את התבנית לחלוטין. לאחר הייבוש המלא, התבנית הוסרה כדי לקבל את exo@MN המדבקות. המורפולוגיה של המיקרו-מחטים אופיינה באמצעות מיקרוסקופיה ו-SEM, כפי שניתן לראות באיור 2. הקצוות במדבקה exo@MN הציגו צורה חרוטית מסודרת במערך של 10X10 עם קצות מחטים חדים ושלמים. קצה המחט יכול לעמוד בכוח של 2 N, המאפשר לו לחדור דרך מחסום העור. יתר על כן, עור חזירי שימש כתחליף לעור אנושי כדי לדמות את היישום של מדבקות exo@MN. המדבקות נלחצו על עור החזיר כדי לצפות בזמן השחרור, כאשר קצות המחטים נמסו לחלוטין תוך 60 שניות. exo@MN המדבקות הומסו ב-DPBS ואופיינו, כפי שניתן לראות באיור 3. תמונות TEM צילמו שלפוחיות עם מבנים טיפוסיים בצורת גביע, התואמים את המורפולוגיה של אקסוזומים. התפלגות גודל החלקיקים של תמיסת exo@MN על ידי נת"ע גילתה כי החלקיקים היו מרוכזים בעיקר בטווח של 50-250 ננומטר. עם זאת, היו גם כמה חלקיקים גדולים יותר, אשר ניתן לייחס את תכונות הדבק של חומר HA, גרימת הצטברות exosome. ניתוח WB של חלבוני CD63/Alix בתמיסת exo@MN הראה כי exo@MN מסוגל לשמור חלקית חלבונים של אקסוזומים. הפונקציונליות הביולוגית של אקסוזומים ששוחררו מה-exo@MN אומתה באיור 4, תוך התמקדות בספיגת אקסוזומים על-ידי תאים ובהפעלת תאים דנדריטיים בהשוואה לאקזוזומים טריים. תמונות CLSM אישרו את הספיגה היעילה הן של אקסוזומים טריים והן של אקסוזומים exo@MN על ידי DCs. תמונות מייצגות וסטטיסטיקות פרופורציונליות מציטומטריית זרימה מראות כי האקסוזומים exo@MN הם בעלי פונקציות ביולוגיות המקדמות את ההפעלה של DCs בדומה לאקזוזומים טריים.

תרשים ייצור מיקרו-מחטים, תמונת SEM, גרף לחץ-תזוזה, רצף בדיקת חדירה.
איור 2: אפיון טלאי exo@MN. (A) תמונות מיקרוסקופ סטריאו של exo@MN טלאיים. סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. (B) תמונת SEM של exo@MN טלאיים. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (C) פרופילי העומס לעומת התזוזה של תיקון exo@MN. (D) תמונות מיקרוסקופיות של exo@MN טלאים שהוחדרו לעור החזיר בזמנים שונים. סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מיקרוסקופ אלקטרונים של אקסוזומים; גרף התפלגות גודל; כתם מערבי של סמני חלבון.
איור 3: אפיון אקסוזומים ואקסוזומים טריים ב-exo@MN. (A) מורפולוגיה של אקסוזומים על-ידי TEM. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. (B) התפלגות גודל חלקיקים של אקסוזומים על ידי נת"ע. (C) CD63 ואליקס של אקסוזומים על ידי WB. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות מיקרוסקופיה אקסוזומית וזרימה ציטומטרית; צביעת תאים, ניתוח זרימה, ביטוי CD80 MHCII.
איור 4: בדיקה ביולוגית של אקסוזומים ואקסוזומים טריים ב-exo@MN. (A) תמונות CLSM של אקסוזומים שצולמו על-ידי DCs. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) חלקות מייצגות של הפעלת DCs על-ידי ציטומטריית זרימה. (C) כימות אחוז DCs CD11c + CD80 + MHCII+ DC. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נכון לעכשיו, השיטות העיקריות לבידוד אקסוזומים כוללות אולטרה-צנטריפוגה, צנטריפוגה הדרגתית צפיפות, אולטרה-סינון, משקעים, חרוזים מגנטיים של זיקה חיסונית ומיקרופלואידיקה24. בשל יכולת ההעמסה המוגבלת של מיקרו-מחטים הנגרמת על ידי שטח קצה המחט הקטן שלהם, יש צורך להגדיל את ריכוז האקסוזומים כדי לטעון יותר. לכן, בחרנו באולטרה-סינון כדי לרכז את תרבית התא ולאחר מכן השתמשנו באולטרה-צנטריפוגה כדי לבודד את האקסוזומים. ריכוז האקסוזומים הוגדל על ידי כמות קטנה של תרחיף נוזלי כך שניתן היה לטעון את המיקרו-מחטים בעשרות עד מאות מיקרוגרמים של אקסוזומים. עם זאת, שיטה זו גורמת לנוכחות משמעותית של חלבונים בתמיסה האקזוזום המבודדת. בנוסף, אובדן משמעותי של אקסוזומים מתרחש במהלך תהליך הצנטריפוגה. כיום, אחת המגבלות של היישום הטיפולי של אקסוזומים היא היעדר שיטות יעילות לבודד אקסוזומים עם טוהר גבוה ובכמויות גדולות. ככל שהפוטנציאל הקליני של אקסוזומים נחקר יותר ויותר, יש צורך לפתח טכניקות מתקדמות יותר בעתיד כדי להתמודד עם האתגרים הקשורים למיצוי שלהם.

טכנולוגיית המפתח במחקר זה היא תכנון של מיקרו-מחטים מבוססות אקסוזומים. על מנת למזער את בזבוז האקסוזומים ולהשיג השפעות טיפוליות חזקות יותר, אומצה שיטת יציקה דו-שלבית לייצור טלאים exo@MN. טרהלוז דווח בעבר כחומר מתאים לשימור ליופילי של אקסוזומים25, בעוד שחומצה היאלורונית מפגינה תאימות ביולוגית מצוינת, הידרופיליות ותפקודה בעיכוב דלקת וקידום תיקון העור26. ייצור קצות מחטים עמוסי אקסוזום באמצעות שני חומרים אלה מסייע לשמור על הפעילות הביולוגית של האקסוזומים, ומאפשר את פירוקם המהיר ושחרורם בתוך העור. יתר על כן, גישה זו ממזערת את הסיכון לזיהום ותורמת להחלמה מהירה של העור. באמצעות צנטריפוגה וייבוש ואקום, האקסוזומים התרכזו בקצות המחטים. בהתחשב בחוסר התאימות של אתנול וטרהלוז, PVP מומס באתנול מוחלט נבחר כחומר הגיבוי. שיטת ייצור שכבתית זו שיפרה ביעילות את יעילות המסירה של האקסוזומים.

היציבות הירודה של אקסוזומים במבחנה, בין אם היא מאוחסנת ב-4°C, 37°C או -80°C, עלולה להוביל לשינויים במבנה האקזוזום או להתדרדרות11. על מנת לפתור בעיה זו, מספר מחקרים בחנו את שיטות האחסון של אקסוזומים, כגון ייבוש בהקפאה. טכנולוגיית מיקרו-מחטים מספקת אסטרטגיה חדשנית נוספת. על ידי ייבוש ב- RT, טכנולוגיית מיקרו-מחטים יכולה לשפר את יציבות האקסוזומים וניתן להשתמש בה ישירות למשלוח אקסוזום ללא טיפולים אחרים. יתר על כן, תהליך המיצוי של אקסוזומים הוא מורכב ונוטה להתכלות, מה שהופך יישומים בקנה מידה גדול למאתגרים. אחסון אקסוזומים שחולצו באמצעות טכנולוגיית מיקרו-מחטים אינו מפשט את שלבי המיצוי אלא מפחית את מספר העקירות הנדרשות. מיצוי בודד יכול לייצר כמות גדולה של exo@MN טלאי, אשר ניתן לאחסן לתקופה ממושכת. שימוש במיקרו-מחטים אקסוזום מאותה אצווה עבור כל טיפול ממזער את ההשפעה הפוטנציאלית של שינויים בין אצוות שונות על התוצאות הטיפוליות, ובכך משפר את החזרתיות והאמינות של ננו-פלטפורמה אקסוזום27. זה מספק אפשרויות נוספות ליישום קליני של אקסוזומים.

במחקר עתידי כדאי לבחון שיטות המאפשרות שליטה מדויקת במטען וממזערות את השונות התרופתית בין קצות המחטים. ניתן להשיג זאת באמצעות אופטימיזציה של תהליכים, יישום אמצעי בקרת איכות ושימוש בטכניקות מתקדמות. טיפול בהיבטים אלה יתרום באופן משמעותי לפיתוח מערכות אספקת תרופות אמינות ועקביות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

H. C., F.L.Q ו- S.J.M הם ממציאים בבקשת פטנט שהוגשה על סמך הנתונים בכתב יד זה. H.C. הוא המייסד המדעי של Medcraft Biotech. בע"מ

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פ.ל.ק. מעריכה את התמיכה הנתמכת על ידי תוכנית המחקר והפיתוח החלוצית של ג'ג'יאנג (2022C03031), תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2021YFA0910103), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (22274141, 22074080), הקרן למדעי הטבע של מחוז שאנדונג (ZR2022ZD28) ותוכנית המלגות טאישאן של מחוז שאנדונג (tsqn201909106). H.C. מכירה בתמיכה הכספית מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82202329). המחברים מודים על השימוש במכשירים במתקן הליבה של המכשור המשותף במכון האנגג'ואו לרפואה (HIM), האקדמיה הסינית למדעים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100x תמיסות פניצילין-סטרפטומיציןJrunbioScientific MA0110תרבית תאים
180 kDa סמן חלבון צבוע מראשThermo26616Western Blotting
3% אורניל אצטטהנאן Ruixin אספקה ניסיוניתGZ02625אפיון מורפולוגי של אקסוזומים
מדפסת תלת מימדטכנולוגייתBMF עובש nanoArch S130 הכנה
4%– 20% ג'ל טרומיGenscriptExpressPlus PAGE GELWestern Blotting
5× מאגר טעינה SDS-PAGETitan04048254Western blotting
נגד עכבר Alix נוגדןBiolegend12422-1-APWestern blotting
נגד עכבר CD63 נוגדןBiolegendab217345Western blotting
APC נגד עכבר CD80 נוגדןBiolegend104713נוגדן
ציפוי עדין אוטומטיZIZHUJBA5-100אפיון מורפולוגי של
ערכת בדיקת BCABeyotimeP0012בדיקת ריכוז חלבון
צנטריפוגהתרמו פישרMuitifuge X1R proצנטריפוגת תאים
משאבת ואקום מים במחזורYuhua InstrumentSHZ-D(III)
חממת CO2EppendorfCellXpert C170תרבית
תאיםמיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליNikonA1HD25הדמיה פלואורסצנטית
רשת נחושתבייג'ינג Zhongjingkeyi טכנולוגיה JF-ZJKY/300אפיון מורפולוגי של אקסוזומים
D- (+) -טרהלוז דיהידראטאלאדין5138-23-4ייצור מיקרו-מחטים 
דולבקו s שונה Eagle' s mediumMeilunbioMA0212תרבית תאים
Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספטMeilunbioMA0010
מערכת אלקטרופורזהBio-radPowerPac-basicWestern Blotting
סרום בקר עובריJrunbio ScientificJR100תרבית תאים
FITC אנטי עכבר CD11c נוגדןBiolegend117305
ציטומטריית זרימתBDLSR Fortessaזיהוי פלואורסצנטי
מצלמת ג'לCytivaAmersham ImageQuant 800Western blotting
HRP מצומד אנטי ארנב IgGCST7074SWestern blotting
HTL שרףטכנולוגיית BMFהכנת עובש
חומצה היאלורונית (MW = 300 kDa)Bloomage Biotechnology9004-61-9ייצור מיקרו-מחט 
שמן טבילהNikonMXA22168הדמיה פלואורסצנטית
מנקה יוניםJEOLEC-52000ICאפיון מורפולוגי של אקסוזומים
מיקרוסקופאולימפוסCKX53התבונן בתהליך המסת קצה המיקרו-מחט
תא סרטן השחלות של העכבר ID8MeisenCTCC  CC90105 תרבית תאים
ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקיםחלקיק MetrixZetaהצגניתוח גודל של אקסוזומים
פסיפיק כחול נגד עכבר נוגדן I-A/I-EBiolegend107619
פנילמתאן סולפוניל פלואורידBeyotimeST507מעכבי פרוטאז
מנקה פלזמהHefei Kejing טכנולוגיית חומריםPDC-36Gייצור מיקרו-מחט 
פולידימתילסילוקסןדאו קורנינג9016-00-6הכנת עובש
פוליוויניל פירולידון (MW = 40 kDa)אלאדין9003-39-8ייצור מיקרו-מחט 
פריזמה GraphPadגרסה 9ניתוח סטטיסטי
ממברנת PVDFMilliporeIPVH00010Western Blotting
צנטריפוגה מהירהבקמן344619מיצוי אקסוזומים
RIPA מאגר ליזהApplygenC1053קרום ליזה
מכון הנצחה רוזוול פארק 1640MeilunbioMA0548תרבית
תאיםמיקרוסקופ אלקטרונים סורקJEOLJSM-IT800אפיון מורפולוגי של מיקרוסקופ סטריאו מיקרו-מחט
אולימפוסSZX16אפיון מורפולוגיה
מגיב זיהוי סופר ECLApplygenP1030מד
מתיחהInstron68SC-05בדיקה מכנית
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורJEOLJEM-2100plusאפיון מורפולוגי של אקסוזומים
Tris חוצץ מלחסנגון ביוטקJF-A500027-0004Western blotting
Tween-20BeyotimeST825Western blotting
Ultracentrifugeבקמןאופטימה XPN-100אקסוזומים מיצוי
צינור אולטרה-סינוןMilliporeUFC910096ריכוז אקסוזומים
תנור ייבוש ואקוםשנחאי Yiheng TechnologyDZF-6024ייצור של מיקרו-מחט
מערכת סינון ואקוםBiosharpBS-500-XTסינון
מיקרו-מחט סינון תרבית תאים נוגדנים נוגדן מערבי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (640), 6977(2020).
  3. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nat Cell Biol. 21 (1), 9-17 (2019).
  4. Nair, A., et al. Hybrid nanoparticle system integrating tumor-derived exosomes and poly(amidoamine) dendrimers: Implications for an effective gene delivery platform. Chem Mater. 35 (8), 3138-3150 (2023).
  5. Lu, Z., et al. Dendritic cell-derived exosomes elicit tumor regression in autochthonous hepatocellular carcinoma mouse models. J Hepatol. 67 (4), 739-748 (2017).
  6. Oskouie, M. N., Aghili Moghaddam, N. S., Butler, A. E., Zamani, P., Sahebkar, A. Therapeutic use of curcumin-encapsulated and curcumin-primed exosomes. J Cell Physiol. 234 (6), 8182-8191 (2019).
  7. Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
  8. Liao, W., et al. Exosomes: The next generation of endogenous nanomaterials for advanced drug delivery and therapy. Acta Biomater. 86, 1-14 (2019).
  9. Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from hek293t cells. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1324730(2017).
  10. Wen, S., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a radiation injury bone marrow murine model. Int J Mol Sci. 20 (21), 5468-5482 (2019).
  11. Cheng, Y., Zeng, Q., Han, Q., Xia, W. Effect of pH, temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes. Protein Cell. 10 (4), 295-299 (2019).
  12. Jana, B. A., Shivhare, P., Srivastava, R. Gelatin-PVP dissolving microneedle-mediated therapy for controlled delivery of nifedipine for rapid antihypertension treatment. Hypertens Res. 47 (2), 427-434 (2024).
  13. Zheng, Y., et al. A rapidly dissolvable microneedle patch with tip-accumulated antigens for efficient transdermal vaccination. Macromol Biosci. 23 (12), e2300253(2023).
  14. Huang, D., et al. Efficient delivery of nucleic acid molecules into skin by combined use of microneedle roller and flexible interdigitated electroporation array. Theranostics. 8 (9), 2361-2376 (2018).
  15. Zhou, Z., et al. Reverse immune suppressive microenvironment in tumor draining lymph nodes to enhance anti-pd1 immunotherapy via nanovaccine complexed microneedle. Nano Res. 13 (6), 1509-1518 (2020).
  16. Kim, Y. C., Park, J. H., Prausnitz, M. R. Microneedles for drug and vaccine delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (14), 1547-1568 (2012).
  17. Bui, V. D., et al. Dissolving microneedles for long-term storage and transdermal delivery of extracellular vesicles. Biomaterials. 287, 121644(2022).
  18. Nir, Y., Potasman, I., Sabo, E., Paz, A. Fear of injections in young adults: Prevalence and associations. Am J Trop Med Hyg. 68 (3), 341-344 (2003).
  19. Zhang, Y., Jiang, G., Yu, W., Liu, D., Xu, B. Microneedles fabricated from alginate and maltose for transdermal delivery of insulin on diabetic rats. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 85, 18-26 (2018).
  20. Roy, G., Garg, P., Venuganti, V. V. K. Microneedle scleral patch for minimally invasive delivery of triamcinolone to the posterior segment of eye. Int J Pharm. 612, 121305(2022).
  21. Creighton, R. L., Woodrow, K. A. Microneedle-mediated vaccine delivery to the oral mucosa. Adv Healthc Mater. 8 (4), 1801180(2019).
  22. Hu, S., Zhu, D., Li, Z., Cheng, K. Detachable microneedle patches deliver mesenchymal stromal cell factor-loaded nanoparticles for cardiac repair. ACS Nano. 16 (10), 15935-15945 (2022).
  23. Yang, W., Zheng, H., Lv, W., Zhu, Y. Current status and prospect of immunotherapy for colorectal cancer. Int J Colorectal Dis. 38 (1), 266-276 (2023).
  24. Zhang, M., et al. Methods and technologies for exosome isolation and characterization. Small Methods. 2 (9), 1800021(2018).
  25. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162(2016).
  26. Bhattacharyya, M., Jariyal, H., Srivastava, A. Hyaluronic acid: More than a carrier, having an overpowering extracellular and intracellular impact on cancer. Carbohydr Polym. 317, 121081(2023).
  27. Chang, H., et al. Cryomicroneedles for transdermal cell delivery. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1008-1018 (2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים