מאמר זה מפרט את התכנון, ההרכבה והפרוטוקול של מערכת הזנה אוטומטית יחד עם מכסה חלופי ושינוי כלוב שניתן ליישם בכלובי מכרסמים סטנדרטיים עם שינויים מינימליים לניסויים אופטוגנטיים או פוטומטריית סיבים קשורים. מערכת ההזנה מציעה כלי חסכוני להאכלה מתוזמנת ו/או הגבלת קלוריות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מערכת עשה זאת בעצמך להאכלה מתוזמנת של מכרסמי מעבדה בכלוב הביתי שלהם
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
צום לסירוגין ומחקרים סביב ההשפעה של הגבלת קלוריות מתוזמנת על ויסות משקל הגוף ותוצאות ההזדקנות הם מגמה, הן בחברה והן במעבדה. כדי לחקור האכלה מוגבלת בזמן ו/או הגבלת קלוריות במעבדה, כמויות המזון המוקצות מפוזרות במרווחי זמן קבועים. הטכנולוגיה הנוכחית להאכלה מתוזמנת של מכרסמים כוללת כלובים מיוחדים עם פתחי כניסת מזון מגודרים, קופסאות דיגיטליות נעולות בזמן או משלוח מזון ידני. ציוד מיוחד לניסויים כאלה יכול להיות יקר והאכלה ידנית דורשת לעתים קרובות מהחוקרים להגיע לשעות הלילה המאוחרות / הבוקר המוקדמות, מה שמונע מחקרים ממושכים. מערכת ההזנה האוטומטית המתוארת כאן מספקת כלי חסכוני להאכלה מתוזמנת ו/או הגבלת קלוריות שניתן ליישם בכלובי מכרסמים סטנדרטיים עם שינויים מינימליים. הפרוטוקול משתמש במזין אוטומטי מהמדף המצויד במכסה כלוב מיקרו-מבודד סטנדרטי (מכסי כלוב עכבר, אוגר, חולדה או שרקנים) ויכול לנהל את הקצאות המזון הרצויות במרווחי זמן מתוכנתים בכלוב הביתי של החיה. ניתן לשנות את העיצוב שלנו כדי לקבל מזינים שונים או שינויים קלים במידות הכלוב. אנו מספקים את התכנון, ההרכבה והפרוטוקול של מערכת ההזנה יחד עם שינוי מכסה וכלוב חלופי לניסויים אופטוגנטיים או פוטומטריית סיבים קשורים.
מבוא
צום לסירוגין הוא תחום חשוב במחקר מטבולי והזדקנות. התאמה נכונה של האכלה ושעון ביולוגי יכולה לשנות את השפעת התזונה על משקל הגוף 1,2,3,4. יתר על כן, צום לסירוגין ממושך קשור לאריכות ימים מוגברת ולשיפור בהפרעות הקשורות לגיל 5,6,7,8. מחקרים המיישמים פרוטוקולי צום ארוכי טווח (>20 יום) דורשים בדרך כלל ציוד מיוחד. אמנם ניתן לספק מזון באופן ידני לפרוטוקולי האכלה מתוזמנים, אך הדבר עשוי לדרוש מהחוקר להיות נוכח בנקודות זמן רבות מחוץ לשעות הפעילות לתקופה ממושכת. לדוגמה, שלושה זמני האכלה בהפרש של 4 שעות ידרשו אספקה ידנית בשעות 20:00, 00:00 ו-4:00 לפנות בוקר; סביר להניח שמדובר באתגר ציות שיימשך יותר מכמה ימים.
חלופות למשלוח מזון ידני למכרסמי מעבדה הן 1) כלובים מיוחדים עם גישה אוטומטית למזון או 2) מערכות הופר דיגיטליות המספקות גישה אוטומטית ומתוכנתת למזון, כגון FED39. מערכות כלובים עם גישה למזון מגודר הן יקרות וחלקן אינן מספקות סביבת כלוב ביתית מתאימה למחקרים ארוכי טווח. לדוגמה, קופסאות מיזוג אופרנטיות מסורתיות מסוגלות לספק מזון אוטומטי אך יש להן רצפה מגוררת חוט שאינה תורמת לדיור לטווח ארוך. מערכת BioDAQ מבית Research Diets מספקת מזון ומים דרך יציאות חיצוניות מגודרות. שערים אוטומטיים הניתנים לתכנות מאפשרים מחקרי האכלה או שתייה מתוכננים לטווח ארוך, עם זאת, המערכת היא השקעה יקרה. מערכות הופר ממוכנות הן כלי נוסף לפרוטוקולי הזנה מתוזמנים אוטומטיים 9,10. שני ההופרים הממוכנים שצוטטו מגיעים עם אזהרה של צמצום שטח המחיה בכלוב הביתי. בעלי חיים רעבים מוגבלים במזון עלולים ללעוס את מכשירי ההאכלה ו/או פסולת כלוב עלולה להפריע למכניקת המיכל למחקרים ארוכי טווח. לבסוף, הופר ממוכן שפותח על ידי קבוצת המחקר Takahashi יחד עם Phenome Technology תוכנן במיוחד למחקרי הזנה מתוכננים לטווח ארוך3. במערכת זו, הופר ממוכן ממוקם מעל מתלה התיל של כלוב סטנדרטי עם מצנח המספק מזון. מערכת הפנום, לעומת זאת, אינה מספקת גמישות לבעלי חיים הקשורים לכבל תיקון (ניסויים אופטוגנטיים/פוטומטריית סיבים), והיא יקרה יחסית למנגנון ההזנה האוטומטי המתואר כאן.
בתגובה לאתגרים הרווחים בפרוטוקולי האכלה מתוזמנים, אנו מציעים תרופה חסכונית. המערכת האוטומטית שלנו מאפשרת משלוח מזון מדויק במרווחי זמן קבועים מראש. עם שילוב של חלקים מודפסים בתלת מימד יחד עם מזין דגים אוטומטי זמין מסחרית, אנו מתכננים מערכת האכלה חיצונית עשה זאת בעצמך (עשה זאת בעצמך) הניתנת להתקנה על כלובי מכרסמים עצמאיים המשתמשים בצמרות מיקרו-מבודדים. ניתן ליישם את מערכת ההזנה והחלקים המתוארים כאן ישירות על כל אחד מכלובי המכרסמים הבאים: עכבר, חולדה, אוגר או שרקן, בתנאי שהכלובים העצמאיים משתמשים בצמרות מיקרו-מבודדות. מכיוון שהכלובים משתנים בגודלם, המיקומים עשויים להשתנות מעט, אך התושבות המודפסות בתלת מימד, מערכת ההזנה ועיצוב בקבוק המים החיצוני ישימים בדרך כלל על פני כלובי מכרסמים עצמאיים עם מכסי מיקרו-מבודדים.
אנו מציגים דוגמה אחת להזנה אוטומטית, אך קיימים מזינים אוטומטיים רבים אחרים מהמדף וניתן להתאים אותם למערכת המודולרית עם שינויים קלים בחלקים המודפסים בתלת מימד. כדי להקל על התאמת המחזיק המודפס בתלת מימד למזינים חלופיים או לשינויים קלים במידות הכלוב, אנו מוכיחים קובץ SolidWorks תלת מימדי הניתן לשינוי עם קובץ STL נלווה.
המיקום החיצוני של המזין האוטומטי מספק מקום מלא בתוך כלוב הבית ומאפשר ניתוק, עיקור וטעינה מחדש או החלפה של המזין ללא הפרעה לבעל החיים. מערכת ההזנה האוטומטית יעילה להקלטות ארוכות טווח, משתלמת וניתנת לפרוטוקולי האכלה ו/או הגבלת קלוריות מוגבלים בזמן. אנו מספקים שרטוטים טכניים מפורטים של מכלולי הכלוב, התכנון והפרוטוקול ליישום מערכת ההזנה, יחד עם נתוני דגימה. שנית, אנו מספקים סט של הוראות לשינוי כלוב סטנדרטי לשימוש במזין האוטומטי עם בעלי חיים הקשורים לכבל תיקון לניסויים אופטוגנטיים או פוטומטריית סיבים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מסצ'וסטס אמהרסט.
1. הרכבת מזין אוטומטי על מכסה כלוב מיקרו-מבודד סטנדרטי (איור 1)
- בעזרת כלי סיבובי עם גלגל חיתוך בגודל 1.5 אינץ', גזרו ריבוע בגודל 20X25 מ"מ למכסה כלוב מיקרו-מבודד. מקם את הפתח 2.75 ס"מ מקצה המכסה וממורכז מעל מתלה החוט (איור 1B, משמאל).
- הדפס בתלת מימד תושבת כדי לחבר את המזין האוטומטי למכסה הכלוב (איור 1A וקובץ משלים 1). הצמד את התושבת לחור מכסה הכלוב (שלב 1.1; איור 1B, מרכז) והחלק את המזין האוטומטי על החלק העליון של התושבת המאובטחת (איור 1B [מימין], C).
איור 1: שינוי והרכבה של תושבת המזין האוטומטי ומכסה הכלוב. (א) שרטוט טכני של תושבת המזין האוטומטי (ראה SolidWorks/STL files בקובץ משלים 1 לקנה מידה בתלת מימד). (B) משמאל לימין, כלוב עם חור של 20 x 25 מ"מ; תושבת מותקנת על החלק העליון של הכלוב ומותקנת עם מזין אוטומטי של Petbank. (ג) מזין אוטומטי מורכב של Petbank על כלוב עם כדור מזון שנפל על רשת רגילה עם בקבוק מים. מוטות קנה מידה = 25 ס"מ). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
2. תכנות ושימוש בדוגמה למזין אוטומטי מהמדף
- עבור ניסויים מתוזמנים, הגדר תחילה את זמני ההזנה ואת שעון ההזנה המסונכרן אחרון מכיוון שההתאמות הבאות ישנו את זמן השעון.
- ודא שהמזין טעון מספיק. לחץ והחזק את לחצן ההגדרות עד שהגדרת השעה על המסך מהבהבת.
- המשך להגדרת הזמן . בעזרת החצים למעלה ולמטה, התאם את הזמן לתקופת ההאכלה המתוזמנת הראשונה הרצויה.
- הגדר את מספר ההקצאות לנקודת זמן זו (מסומן על ידי מספר הנקודות ליד הגדרת ההזנה). חזור על שלבים 2.2-2.4, עבור עד שתי נקודות זמן נוספות.
- טען את תאי ההזנה האוטומטית עם הקצאות המזון הרצויות של ≤1.5 גרם צ'או מכרסמים סטנדרטי. אם יש צורך במזון נוסף, הגדר את המזין לספק הקצאות מרובות בנקודת זמן נתונה. למזין לדוגמה יש 16 תאים.
הערה: ניתן להזמין אוכל לפי גודל או לקצץ במספריים. - סמן תא אחד עם סרט או צבע כדי לאשר סיבוב תא מתוכנת ומשלוח מזון. בדוק מדי יום בזמן הפעלת המזינים.
3. מערכת כלוב שונה לבעלי חיים קשורים עם המזין האוטומטי
- תוספת מכסה חלופית אופציונלית עבור בעלי חיים הקשורים לכבל תיקון (איור 2)
- חתכו בלייזר חתיכה של אקריליק שקוף בעובי 3 מ"מ לפי המפרט של איור 2A (ראה גם קובץ משלים 2). התוספת האקרילית מעוצבת עם לשוניות להצמדה לחלק העליון של הכלוב. החריץ המרכזי (190 x 5 מ"מ) מאפשר מעבר של כבל התיקון. החור המרובע בגודל 20 x 25 מ"מ מתאים לתושבת המזין האוטומטי; 20 חורי אוורור מאפשרים זרימת אוויר צח.
- בעזרת מברג ראש שטוח או כלי טריז, חטפו את המכסה העליון של הכלוב המחורר של מכסה מיקרו-מבודד רגיל. עבדו כדי לשחרר את הלשוניות מחריצי הלשוניות והסירו גם את התוספת המחוררת וגם את נייר הסינון (איור 2C, משמאל ומרכז).
- מתחת לחלק העליון המחורר ונייר הסינון נמצאת רשת תמיכה מצולעת פנימית. השתמש בכלי סיבובי ובגלגל חיתוך בגודל 1.5 אינץ' כדי להסיר את רשת התמיכה; בעקבות מחווני החצים המוצגים במרכז איור 2C. לאחר החיתוך כדי להסיר את רשת התמיכה, הגש כדי להחליק את הקצה החתוך.
- הצמד את תוספת הצלחת האקרילית החלופית (שלב 3.1) לתוך החלק העליון של הכלוב. התחל את ההתקנה על ידי החלקת לשוניות הצלחת לתוך חריצי הלשונית לאורך אחד הקצוות הקצרים ולאחר מכן אחד הקצוות הארוכים ולחץ בעדינות עד שהצלחת תיכנס למקומה בנקישה (איור 2C [מימין], D).
- תושבת בקבוק מים חיצונית אופציונלית לבעלי חיים הקשורים לכבל תיקון (איור 3)
- קדחו פתח ללגימת בקבוק המים: חור בקוטר 11 מ"מ, 50 מ"מ מהרצפה, במרכזו בקצה הקצר של הכלוב (איור 3B וקובץ משלים 3).
- משני צידי החור המרכזי (± 27.5 מ"מ), קדחו שני חורים בקוטר 6 מ"מ. לחלופין, השתמש בכלי ניקוב מרובע 8 מ"מ כדי לקדוח חורים מרובעים (מוצג באיור 3B).
- הדפס בתלת מימד תושבת בקבוק מים חיצונית (איור 3A וקובץ משלים 4). התקן את תושבת בקבוק המים לתחתית הכלוב עם ברגי עגלה (אורך 2 ס"מ, 6 x 1 מ"מ או 0.75 אינץ' אורך 1/4 x 20; איור 2B,C).
- עבור בקבוק מים, התקן צינור חרוטי סטנדרטי של 50 מ"ל, מכוסה במכלול לגימה/פקק (#7 פקק עם לגימה מעוקלת בגודל 3-1/2 אינץ', ראה טבלת חומרים) על התושבת החיצונית. מלאו מים כל 2-3 ימים.
איור 2: הרכבת לוח אקרילי על החלק העליון של הכלוב. (א,ב) שרטוטים טכניים של צלחת אקרילית ותקע יציאת מזין. (C) חלק עליון של כלוב שמאלי סטנדרטי עם תוספת מחוררת ומסנן. מרכז, הסרת התוספת והמסנן המחוררים (יש לחתוך רשת מצולעת לאורך הקווים המצוינים בחץ). נכון, צלחת אקרילית נצמדה למקומה. (ד) מכלול מכסה שלם. פסי קנה מידה = 25 ס"מ. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מכלול תושבת בקבוק מים. (א) שרטוט טכני של תושבת בקבוק מים מודפסת בתלת מימד. (ב) שינויים בכלוב והרכבת תושבת בקבוק מים; (ג) תושבת מותקנת; (ד) מכלול כלוב מלא. פסי קנה מידה = 10 ס"מ. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סיכום של מכלול כלוב שלם עם המזין האוטומטי. (A) כלוב סטנדרטי עם מתלה תיל, (B) כלוב מותאם עבור בעלי חיים קשורים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מחקר הגבלת קלוריות (21 יום) לגרימת אי פוריות בעכברים נקבות (עיצוב מזין אוטומטי וכלוב, איור 4A)
מחסור כרוני באנרגיה מספיק כדי לעכב פוריות אצל יונקים, תגובה שנשמרת אצל מכרסמים ובני אדם כאחד11,12. במחקר זה, אנו משתמשים בהגבלת קלוריות כדי לגרום לירידה במשקל הגוף לטווח ארוך. נקבות עכברים בוגרות C57BL/6, בגילאי 15-18 שבועות, היו חד-ביתיים ובמחזור אור:חושך של 12:12 שעות, עם כיבוי אורות ב-Zeitgeber Time 12 (ZT12). מתלה הת...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים, הגבלת קלוריות היא כלי ניסיוני רב עוצמה למניפולציה מדויקת ולחקר חילוף החומרים. לירידה מתמשכת במשקל יש השלכות על השמנת יתר, סוכרת, הזדקנות, פוריות וגיל המעבר (סוג של הזדקנות רבייה), כולם נקודות קצה חשובות לתרגום. עם זאת, פרדיגמות הגבלת קלוריות יכולות להיות קשות לשמירה לאורך זמן. בכתב יד זה, אנו מציעים פתרון חסכוני להשגת הגבלה קלורית לטווח ארוך בסביבה מעבדתית. מסופקות הוראות לחיבור מזין אוטומטי מהמדף לכלוב מכרסמים עם מכסה מיקרו-מבודד סטנדרטי. המזין מורכב בכ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
תודות
ג'ייסון לי נתמך על ידי תוכנית החינוך המחקרי לאחר הבגרות במימון המכונים הלאומיים לבריאות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| #7 פקק W / 3-1/2 "צינור לגימה מעוקל ללא כדור | Labex | 2067 | |
| AN75 תחתית כלוב עכבר | Ancare | AN75HT | |
| מזין דגים אוטומטי לאקווריום | Petbank-tek.com | הפצת אמזון (#B0BRCWP16K) | |
| מכרסמים מיקרו-פילטר צמרות | Ancare | N10MBTPLF | |
| פקקי גומי, חור אחד | United Scientific | S24009 | |
| צ'או מכרסמים סטנדרטי | Prolab IsoPro 3000 |
מקורות
- Arble, D. M., Bass, J., Laposky, A. D., Vitaterna, M. H., Turek, F. W. Circadian timing of food intake contributes to weight gain. Obesity (Silver Spring). 17 (11), 2100-2102 (2009).
- Hatori, M., et al. Time-restricted feeding without reducing caloric intake prevents metabolic diseases in mice fed a high-fat diet. Cell Metab. 15 (6), 848-860 (2012).
- Acosta-Rodriguez, V. A., de Groot, M. H. M., Rijo-Ferreira, F., Green, C. B., Takahashi, J. S. Mice under caloric restriction self-impose a temporal restriction of food intake as revealed by an automated feeder system. Cell Metab. 26 (1), 267-277.e2 (2017).
- Gallop, M. R., Tobin, S. Y., Chaix, A. Finding balance: understanding the energetics of time-restricted feeding in mice. Obesity (Silver Spring). 31 (Suppl 1), 22-39 (2023).
- Hua, L., et al. Time-restricted feeding improves the reproductive function of female mice via liver fibroblast growth factor 21. Clin Transl Med. 10 (6), e195(2020).
- Strilbytska, O., Klishch, S., Storey, K. B., Koliada, A., Lushchak, O. Intermittent fasting and longevity: From animal models to implication for humans. Ageing Res Rev. 96, 102274(2024).
- Di Francesco, A., Di Germanio, C., Bernier, M., de Cabo, R. A time to fast. Science. 362 (6416), 770-775 (2018).
- Longo, V. D., Panda, S. Fasting, Circadian rhythms, and time-restricted feeding in healthy lifespan. Cell Metab. 23 (6), 1048-1059 (2016).
- Matikainen-Ankney, B. A., et al. An open-source device for measuring food intake and operant behavior in rodent home-cages. Elife. 10, e66173(2021).
- Sahasrabudhe, A., Guy, C. R., Greenwell, B. J., Menet, J. S. Manipulation of rhythmic food intake in mice using a custom-made feeding system. J Vis Exp. (190), (2022).
- Kreisman, M. J., Tadrousse, K. S., McCosh, R. B., Breen, K. M. Neuroendocrine basis for disrupted ovarian cyclicity in female mice during chronic undernutrition. Endocrinology. 162 (8), ebqab103(2021).
- Allaway, H. C., Southmayd, E. A., De Souza, M. J. The physiology of functional hypothalamic amenorrhea associated with energy deficiency in exercising women and in women with anorexia nervosa. Horm Mol Biol Clin Investig. 25 (2), 91-119 (2016).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Chen, Y., Lin, Y. C., Kuo, T. W., Knight, Z. A. Sensory detection of food rapidly modulates arcuate feeding circuits. Cell. 160 (5), 829-841 (2015).
- Mandelblat-Cerf, Y., et al. Arcuate hypothalamic AgRP and putative POMC neurons show opposite changes in spiking across multiple timescales. Elife. 4, e07122(2015).
- Kahnau, P., et al. A systematic review of the development and application of home cage monitoring in laboratory mice and rats. BMC Biol. 21 (1), 256(2023).
- Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. Phenotyping circadian rhythms in mice. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 271-281 (2015).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
