ברגמאייר כימות גלוקוז לדגימות מיקרוביולוגיות

Summary

כימות גלוקוז ברגמאייר היא טכניקה אנזימטית ספקטרופוטומטרית המשמשת בעיקר לבדיקות קליניות המודדות באופן מדויק ורגיש את כמות הגלוקוז. כאן אנו מציגים פרוטוקול לשימוש בשיטה זו עבור דגימות מיקרוביולוגיות.

Abstract

ריכוז הגלוקוז הוא אינדיקטור מרכזי למטבוליזם תאי והוא יכול להצביע על קצב חילוף החומרים הכולל, סטייה במטבוליזם של גלוקוז, ובמקרים מסוימים, כיצד תאים מחברים מטבוליזם של גלוקוז למטבוליזם אנרגטי. בנוסף, רמות גלוקוז תוך תאיות וחוץ תאיות מעידות על המצב המטבולי התאי. טכניקות אנזימטיות, כגון כימות גלוקוז ברגמאייר, מדויקות ורגישות יותר מטכניקות אחרות, כגון חומצה דיניטרוזליצילית או שיטות פלואורסצנטיות, המשמשות בדרך כלל במיקרוביולוגיה. למרות השימוש העיקרי בתחום הקליני, כימות גלוקוז ברגמאייר יכול להיות מיושם גם על כל תא, אך לא דווח בפירוט עבור חיידקים, פטריות, שמרים או מיקרואורגניזמים אחרים.

במאמר זה אנו מציגים מתודולוגיה לכימות גלוקוז מדגימות חיידקים ושמרים בשיטת כימות הגלוקוז האנזימטית ברגמאייר. ההליך כלל את האנזימים גלוקוז אוקסידאז, peroxidase, ו o-dianisidine dihydrochloride מודגר ב 37 ° C במשך 20 דקות, ואחריו תוספת של חומצה גופרתית. לאחר מכן נמדדת הספיגה ב-545 ננומטר. חשוב להדגיש כי למרות שטכניקה זו מציגה קשיים במדידת ריכוזים גבוהים של גלוקוז (מעל 60 גרם לליטר), ניתן למדוד ריכוזים מתחת ל-50 גרם/ליטר באמצעות גורמי דילול. גישה אנזימטית זו היא בעלת ערך למחקר וניתוח במיקרוביולוגיה ובתחומים מדעיים אחרים. הדיוק והרגישות של השיטה הופכים אותה למועילה לאיתור אפילו ריכוזים נמוכים של גלוקוז בדגימות מיקרוביולוגיות.

Introduction

גלוקוז משמש כמקור האנרגיה והפחמן העיקרי עבור מיקרואורגניזמים רבים, כולל חיידקים, שמרים ופטריות. מיקרואורגניזמים אלה קולטים גלוקוז באמצעות טרנספורטרים הממוקמים על הממברנה החוץ-תאית, שם הוא עובר סדרה של תגובות ביוכימיות בתוך המסלול המטבולי של גליקוליזה כדי להפוך לפירובט¹. ישנן טכניקות שונות לכימות הפחתת סוכרים כגון גלוקוז. לדוגמה, מגיב² של בנדיקט, השימוש בחומצה 3,5-dinitrosalicylic (DNS)^3,4, שיטת anthrona⁵, או חומצה פנול-גופרתית⁶ שיטות ניתן להשתמש. עם זאת, שיטות אלה מזהות כל הפחתת סוכר נוכח בדגימה, כגון פרוקטוז ומלטוז, אשר יכול לתרום את האות ולסבך את הכימות המדויק של סוכר מסוים.

בנוסף, הם דורשים בקרת טמפרטורה קפדנית וטיפול בחומרים מסוכנים, אשר יכול לסבך את התהליך ולהשפיע על הדיוק. שיטות אלה יכולות גם לסבול מהפרעות של תרכובות אחרות הקיימות בדגימה, מה שמקשה על כימות מדויק של גלוקוז. לעומת זאת, כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) מציעה חלופה מדויקת יותר, המאפשרת הבחנה בין גלוקוז לסוכרים מפחיתים אחרים, אם כי עם עלויות תפעול גבוהות יותר. שיטות מנוגדות אלה מדגישות את הצורך המתמשך בפיתוח טכניקות כימות גלוקוז מדויקות וחסכוניות⁷.

שיטת גלוקוז אוקסידאז-פרוקסידאז-חומצה גופרתית (GOX-H₂SO₄) משתמשת בשני אנזימים, גלוקוז אוקסידאז (GOD) ופרוקסידז (POD). GOD הוא אנזים אוקסידורדוקטאז שהוא סלקטיבי מאוד לחמצון של β-D-גלוקוז⁸. קומפלקס זה פועל כזרז במהלך התגובה המתרחשת כאשר גלוקוז נמצא בנוכחות חמצן, המייצר חומצה גלוקונית ומי חמצן (H₂O₂). H₂O₂ מזוהה באמצעות מקבל חמצן כרומוגני, o-dianisidine, אשר, באינטראקציה עם POD, גורם לחמצון שלו ולשחרור H₂O₂, ומונע המרה חזרה של חומצה גלוקונית לגלוקוז (ראו איור 1). הצבע המתקבל מיוצב על ידי תוספת של חומצה גופרתית (H₂SO₄), אשר גם מפסיק את התגובה האנזימטית, ובכך למנוע הפרעה אפשרית שעלולה להתרחש אם התגובה נמשכת⁹.

איור 1: סקירה כללית של שיטת כימות הגלוקוז באמצעות האנזים גלוקוז אוקסידאז. אשר מגיב עם גלוקוז לייצור מי חמצן (H₂O₂) וחומצה גלוקונית. לאחר מכן, האנזים peroxidase מגיב עם H₂O₂ בנוכחות O-dianisidine dihydrochloride. בשלב האחרון, חומצה גופרתית (H₂SO₄) מתווספת כדי לעצור את התגובה האנזימטית, וכתוצאה מכך צבע ורוד שנמדד ב 529 ננומטר. קיצורים: POD = peroxidase; אלוהים = גלוקוז אוקסידאז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

השיטה האנזימטית GOX-H₂SO₄ היא טכניקה בשימוש נרחב למדידת ריכוז הגלוקוז בדגימות ביולוגיות, שרובן בעלות עניין קליני. עם זאת, מחקרים מעטים חקרו טכניקה המאפשרת לכמת את כמות הגלוקוז במדיום צמיחה כדי להעריך את צריכתו. לכן, בפרוטוקול הנוכחי, המתודולוגיה לכימות גלוקוז באמצעות התגובה האנזימטית של גלוקוז אוקסידאז, peroxidase, o-dianisidine dihydrochloride, ו- H₂SO₄ בדגימות נוזל מיקרוביולוגיות מוצגת, אשר עולה כשינוי של העבודה שנעשתה על ידי Bergmeyer⁹, באמצעות 50% (v/v) H₂SO₄ וכמויות נמוכות יותר של ריאגנטים.

Protocol

1. הכנת פתרון

1. הכן 100 מ"ל של חיץ פוספט 0.1 M. שוקלים 1.28 גרם אשלגן דימימן פוספט (KH₂PO₄) ו-0.1304 גרם פוספט דיפוטסיום (K₂HPO₄) ומוסיפים אותם לכוס זכוכית. כעת, הוסיפו 70 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה (H₂Odi) וכווננו את ה-pH ל-5.5 באמצעות חומצה הידרוכלורית (HCl) או אשלגן הידרוקסידי (KOH). מעבירים את התמיסה לבקבוק נפחי ומתאימים את הנפח הסופי ל -100 מ"ל. לאחר מכן, העבירו את התמיסה למיכל ענבר ואחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
   אזהרה: יש ללבוש כפפות ניטריל לאורך כל תהליך ההכנה כדי למנוע מגע בעור וזיהום פוטנציאלי, שכן O-dianisidine dihydrochloride הוא מסרטן פוטנציאלי.
2. הכינו תמיסת 1% w/v של o-dianisidine dihydrochloride. שוקלים 0.01 גרם של o-dianisidine dihydrochloride ומניחים אותו בצינור צנטריפוגה 2.0 מ"ל. בעזרת מיקרופיפטה של 1,000 מ"ל, מוסיפים 1.0 מ"ל של H₂Odi כדי להמיס את התרכובת, ואז מערבבים לאט על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. הגן על התמיסה מפני אור על ידי עטיפת המיכל ברדיד אלומיניום ואחסן אותו בטמפרטורה של -20°C כדי לשמור על יציבות.
   הערה: כדי להקל על התמיכה בצינור במהלך המדידה על האיזון האנליטי, ניתן להשתמש בכוס של 10 מ"ל כתמיכה נוספת. זה עוזר לייצב את הצינור, הבטחת מדידה מדויקת על ידי מזעור הסיכון של עקירה או הטיה שעלולה לשנות את התוצאות המתקבלות על האיזון.
3. בצלוחית נפחית של 100 מ"ל, הוסף 10 מ"ל של תמיסת חיץ פוספט ואחריה 1 מ"ל של תמיסת 1% v/v o-dianisidine dihydrochloride. לאחר מכן, התאם את הנפח הסופי ל -100 מ"ל עם חיץ פוספט כדי לקבל ריכוז סופי של תערובת חיץ 0.01% o-dianisidine. מעבירים את התמיסה לבקבוק ענבר ועוטפים אותו ברדיד אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4-8°C למשך עד 3-4 חודשים.
   הערה: קירור חיוני למניעת הירקבות, אשר עלולה לסכן את שלמות המדידות הניסיוניות. כדי למנוע התפרקות של תערובת חיץ o-dianisidine, חלק קטן של 13 מ"ל (מספיק עבור 12 דגימות) ניתן להציב בתוך צינור פלסטיק 14 מ"ל על קרח עד לשימוש.
4. הכינו פתרון 50% H₂SO₄ . מניחים בקבוק נפח של 100 מ"ל עם 30 מ"ל של H₂Odi באמבט קרח ומניחים לו להתקרר במשך 10 דקות. לאחר מכן, לשפוך באיטיות 51 מ"ל של H₂SO₄ (98% v/v) במורד קירות הצלוחית, רועד בזהירות כדי הומוגניזציה של התמיסה. המתן עד שהתערובת תתקרר, מכיוון שהתגובה היא אקסותרמית (יוצרת חום). כוונן את עוצמת הקול הסופית ל -100 מ"ל עם H₂Odi והעבר את התמיסה לצלוחית ענבר זכוכית.
   הערה: השתמש במכסה אדים ופעל לפי כל פרוטוקולי הבטיחות, הקפד ללבוש ציוד מגן מתאים. הכינו 50 מ"ל של תמיסת 40% סידן פחמתי כדי לנטרל כל שפיכה אפשרית שעלולה להתרחש.
5. הכן 50 mM נתרן אצטט פתרון על ידי המסת 0.04 גרם של נתרן אצטט ב 5 מ"ל של H₂אודי בכד. התאם את ה- pH ל- 5.1 באמצעות חומצה אצטית קרחונית. לבסוף, התאם את עוצמת הקול ל -10 מ"ל עם H₂Odi.

2. הכנת אנזימים

1. במיקרו-צינורית סטרילית של 2.0 מ"ל, שוקלים 0.01 גרם גלוקוז אוקסידאז ומערבבים עם 1 מ"ל של 50 מ"מ נתרן אצטט, pH 5.0, כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל. מכסים את הצינור ברדיד אלומיניום ומאחסנים ב-20°C-.
   הערה: ניתן לאחסן את התמיסה עד חודשיים בטמפרטורה של -20°C.
2. חשב את נפח תמיסת האנזים V₂ הדרוש להשגת פעילות האנזים הרצויה בכל קובטה פלסטית (עם נפח כולל של 1.5 מ"ל) באמצעות Eq (1): V₁C₁ = V₂C₂, כאשר V₁ הוא 1,500 μL, C₁ הוא 28.5 U של פעילות האנזים, ו- C₂ (ריכוז תמיסת האנזים) הוא 12,970 U/mL (10 מ"ג של האנזים [129,000 יחידות / גרם] ב 1 מ"ל של H₂Odi).
   V₂ = (1,500 μL × 28.5 U)/12,970 U = 3.29 μL (1)
   הערה: לקבלת פיפטינג מדויק יותר, ניתן לעגל את הערך ל- 3.3 μL.
3. במיקרו-צינורית חדשה של 2 מ"ל, שקלו 0.0031 גרם של אנזים פרוקסידאז והוסיפו 1 מ"ל של מאגר פוספט, pH 5.5, כדי להשיג ריכוז סופי של 3.1 מ"ג/מ"ל. כסו את המיקרו-צינור ברדיד אלומיניום ואחסנו בטמפרטורה של -20°C.
4. חשב את נפח תמיסת הפרוקסידז הנדרשת להשגת פעילות האנזים הרצויה לכל קובטה באמצעות Eq (1). התחל עם נפח קובטה כולל של 1,500 μL ופעילות אנזים מטרה של 1.25 U. לאחר מכן, לקבוע את הנפח הדרוש של תמיסת האנזים, בהתחשב בריכוז שלה של 1,551 U.
   V₂ = (1,500 μL × 1.25 U)/1,551 U = 1.208 μL
   הערה: לקבלת צנרת מדויקת יותר, הערך עוגל ל- 1.20 μL.

3. תקן גלוקוז

1. הכינו תקן D-גלוקוז של 1 גרם/ליטר על ידי הוספת 0.01 גרם של D-גלוקוז ל-10 מ"ל של H₂Odi בצלוחית נפחית. כדי לדלל את הריכוז ל 0.5 גרם / ליטר, לקחת 500 μL של תמיסת מלאי ולערבב אותו עם 500 μL של H₂Odi כדי להשיג נפח סופי של 1 מ"ל.
   הערה: תהליך דילול זה חיוני ליצירת פתרונות סטנדרטיים מדויקים.

4. הכנת עקומה סטנדרטית

1. באמצעות מיקרו-צינור חדש של 2 מ"ל, הוסף את נפח החיץ והגלוקוז המצוין בטבלה 1.
2. הגדר את thermobath יבש ל 37 °C. ברגע שהטמפרטורה יציבה, הוסף 3.3 מיקרוליטר של גלוקוז אוקסידאז לכל הצינורות ולאחר מכן הוסף 1.2 מיקרוליטר של פרוקסידאז לכל צינור. לדגור את הצינורות ב 37 ° C במשך 20 דקות.
3. לאחר הדגירה, יש להוסיף מיד 750 μL של 50% H₂SO₄ (v/v) לכל מיקרו-צינור ולתת לתערובת להתקרר באמבט קרח למשך 2 דקות. התוצאה היא נפח סופי של 1,500 μL. לבסוף, להעביר את הפתרון לקובט פלסטיק ולמדוד את הספיגה ב 529 ננומטר.

טבלה 1: עקומת כיול גלוקוז עבור שיטת GOX-H₂SO₄ . קיצורים: אלוהים = גלוקוז אוקסידאז; POD = peroxidase; H₂SO₄ = חומצה גופרתית. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

5. בדיקת דגימות מיקרוביולוגיות

1. קבל את הדגימה על ידי גידול חיידקים או שמרים בתווך תרבית נוזלית בתנאים מסוימים, כולל טמפרטורה, מהירות תסיסה וזמן הדגירה. ברגע שהתרבית מגיעה לצפיפות האופטית הרצויה (OD) או לריכוז התא, אספו את התרבית לעיבוד נוסף.
   הערה: Pseudomonas reptilivora תורבת במהירות תסיסה קבועה של 300 סל"ד ו 28 ° C, בעוד Debaryomyces hansenii היה תרבית עם מהירות תסיסה של 200 סל"ד ב 30 ° C ב shaker מסלולית. במקרה הספציפי של D. hansenii, שמן קנולה אכיל שימש גם כגורם לייצור ליפאז.
2. נקו את אזור העבודה עם תמיסת 70% אלכוהול או חומר ניקוי מתאים על פי פרוטוקולי בטיחות ביולוגית. הדליקו מבער כדי להבטיח אספסיס.
3. העבר 100 μL של מדיה תרבותית לתוך 1.5 מ"ל או 2 מ"ל מיקרו צינור באמצעות קצוות סטריליים.
4. צנטריפוגה הדגימות ב 7,500 × גרם במשך 7 דקות ב 4 ° C, או ב 10,000 × גרם במשך 7 דקות ללא בקרת טמפרטורה. לאחר הצנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant, אשר מכיל גלוקוז בתמיסה, ולהשליך את הכדור.
5. השתמש 0.5 μL של supernatant עבור ריכוזי גלוקוז הנעים בין 1 ל 20 גרם / ליטר, ולאחר מכן לערבב עם 749.5 μL של o-dianisidine-buffer, 3.3 μL של אלוהים, ולאחר מכן 1.2 μL של POD. לדגור את microtubes במשך 20 דקות ב 37 ° C, כמפורט בשלב 4.2 ומיד להוסיף 750 μL של 50% H₂SO₄ ולתת לו להתקרר באמבט קרח במשך 2 דקות.
   1. עבור ריכוזים מעל 20 גרם / ליטר, בצע דילול 1:1 עם H₂Odi סטרילי לפני שתמשיך.
   2. אם דגימות הסופרנאטנט הוקפאו בעבר בטמפרטורה של -80°C או -20°C, הפשירו אותן בטמפרטורת החדר ומערבולות במשך 30 שניות לפני השימוש. אם יש צורך בדילול, השתמש סטרילי H₂Odi.
   3. עבור דגימות עם ריכוז גלוקוז מעל 30 גרם / ליטר, לבצע דילול 1: 1 עם סטרילי H₂Odi, וכתוצאה מכך גורם דילול של 2.
6. חשב את ריכוז הגלוקוז הכולל בכל דגימה באמצעות Eq (2) בתוכנית גיליון אלקטרוני.
   (2)
   איפה:
   x = ריכוז גלוקוז (גר'/ל') δ = נפח התגובה הסופי (0.0015 ליטר)
   y = ספיגה M.S. = כמות הדגימה בשימוש*
   הערה: הערכים b ו - m הם מהמשוואה המדמה את קו המגמה של עקומת הכיול עבור השיטה (y = mx + b). *ערך MS חייב להתבסס על כמות הדגימה המשמשת לקבלת היחס בדילול המתאים (כלומר, אם לוקחים 0.5 μL של הסופרנטנט, M.S. = 0.0000005 L = 0.5 × ^10-6 L); אם נעשה שימוש בגורם דילול (DF), הכפל את הספיגה המתקבלת על ידי DF.
   לדוגמה, אם מתקבל ספיגה של 0.5 ונעשה שימוש ב- DF של 2, התוצאה תהיה 1.0. לכן, y = 1.0, ויש להזין ערך זה ב- Eq (2), כפי שתואר קודם לכן.

6. אימות אנליטי

1. חישוב פרמטרי האימות האנליטיים של שיטת GOX-H₂SO₄ על פי מה שנקבע על ידי המרכז הלאומי למטרולוגיה וישות ההסמכה המקסיקנית¹⁰ (CENAM-ema).
   1. חישוב דיוק כאחוז ממקדם השונות או %CV = (S/x) × 100, כאשר x הוא ממוצע קבוצת המדגם ו - S הוא סטיית התקן עם ערך קבלה של ≤10%.
   2. קבע ליניאריות על-ידי התאמת העקומה הסטנדרטית לדגם ליניארי R² מעל 0.995.
   3. חשב את גבול הכימות (LOQ) באמצעות המשוואה: LOQ = yB + 10sB, כאשר yB מייצג את ריכוז האנליטה המפיק אות שווה ערך לאות המטרה, ו- 10sB מציין פי 10 את סטיית התקן של הריק
   4. חשב את השגיאה השיטתית באמצעות משוואה זו: Slant = x - m, כאשר x = ממוצע ריכוז הניסוי ו- m הוא הריכוז התיאורטי.
   5. לקבוע דיוק כמידת ההסכמה בין ערך ממשי לערך תיאורטי.
      התאוששות% = (CR/CV) × 100
      כאשר CR הוא הממוצע של ריכוז הניסוי ו- CV הוא מקדם השונות של הריכוז התיאורטי.

7. התערבות על ידי הפחתת סוכרים אחרים

1. העריכו בנפרד ארבעה סוכרים מפחיתים: גלוקוז, פרוקטוז, גלקטוז וקסילוז מתמיסת ציר של 0.5 גרם/ליטר. בנוסף, השתמש בטרהלוז כבקרה שלילית. עקוב אחר הפרוטוקול עבור כל הדגימות ומדוד את הספיגה ב- 545 ו- 529 ננומטר.

Results

הניתוח הספקטרופוטומטרי של GOX-H₂SO₄ חשף בליעה מקסימלית אחת של 529 ננומטר (λmax) (איור 2A), עם ערכי בליעה נוספים שנצפו ב-545 ננומטר. על-ידי ניתוח ערכי הספיגה בריכוזי גלוקוז שונים, קיבלנו ליניאריות (R²) של 0.9977 עבור λ529 ננומטר ו-R² של 0.9967 עבור λ545 ננומטר (איור 2B). לינאריות, בטווח נתון, מתייחסת ליכולת לספק תוצאות ביחס ישר לריכוז הגלוקוז בדגימות. זה הוערך באמצעות מקדם הקביעה, המשקף את הדיוק של מודל הרגרסיה (איור...

Discussion

כימות גלוקוז באמצעי תרבית חיוני להבנת גדילה מיקרוביאלית ופעילות מטבולית, שכן גלוקוז משמש כמקור אנרגיה עיקרי עבור מיקרואורגניזמים רבים. במחקר זה השתמשנו בשיטת GOX-H₂SO₄ כדי למדוד במדויק את רמות הגלוקוז בתרבית, במטרה למטב תהליכים מיקרוביאליים בתסיסה של חיידקים או שמרים. הממצאים שלנו עולים בקנה אחד עם אלה של יואן ומקניל¹¹; עם זאת, בניגוד אליהם, הממצאים שלנו מצביעים על כך שהקריאות מדויקות ברמות גלוקוז גבוהות יותר. שלב קריטי בניסוי הוא העיתוי לאחר...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 מ"ל מיקרו-צינור	Eppendorf		-
2.0 מ"ל מיקרו-צינור	Eppendorf	-	-
CaCO3	Meyer	471-34-1	סידן פחמתי
D-גלוקוז	מאייר	50-99-7	D-גלוקוז
Drybath	FisherScientific	11-718-4	סידורי 911NO251. בלוק רוחב x עומק x גובה מ"מ/אינץ': 124 x 76 x 39 / 4.9 x 3.0 x 1.5
גלוקוז אוקסידאז	Sigma Aldrich	G6125-50KU	אבקת אנזים
H2O	-		-מים נטולי יונים
H2SO4	Meyer	7664-93-9	חומצה גופרתית
HCl	Meyer	7647-01-0	חומצה הידרוכלורידרית
K2HPO4	Meyer	7758-11-4	דיפוטסיום פוספט
KH2PO4	Meyer	7778-77-0	מונופוטסיום פוספט
KOH	Meyer	1310-58-3	אשלגן הידרוקסיד
למבדה 35	PerkinElmer-ספקטרופוטומטר
מיקרו-צינור צנטריפוגה	-		--
O-Dianisidine dihydrochloride	Sigma Aldrich	D3252	Chromogenic
Peroxidase	Sigma Aldrich	P8125-50KU	אבקת אנזים
pH-meter	Hanna	1131	Hanna 1170
נתרן אצטט	מאייר	127-09-3	מאייר
מרית שקילה	-	-	-