שיטת פזילה אוטומטית לסנכרון זמן התנהגות ודינמיקה מוחית במחקרי כאב עכברים

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטה למעקב אחר פזילה אוטומטית של העיניים במכרסמים לאורך זמן באופן התואם נעילת זמן למדדים נוירופיזיולוגיים. פרוטוקול זה צפוי להיות שימושי לחוקרים החוקרים מנגנונים של הפרעות כאב כגון מיגרנה.

Abstract

כאב ספונטני היה מאתגר לעקוב בזמן אמת ולכמת באופן שמונע הטיה אנושית. זה נכון במיוחד עבור מדדים של כאבי ראש, כמו בהפרעות כגון מיגרנה. פזילה בעיניים התפתחה כמדד משתנה רציף שניתן למדוד לאורך זמן והוא יעיל לחיזוי מצבי כאב בבדיקות כאלה. מאמר זה מספק פרוטוקול לשימוש ב- DeepLabCut (DLC) כדי להפוך ולכמת פזילה בעיניים (מרחק אוקלידי בין עפעפיים) בעכברים מרוסנים עם תנועות ראש מסתובבות בחופשיות. פרוטוקול זה מאפשר לכמת באופן בלתי משוחד את פזילה בעין ולהשוות אותה ישירות מול מדדים מכניסטיים כגון נוירופיזיולוגיה. אנו מספקים הערכה של פרמטרים לאימון AI הדרושים להשגת הצלחה כפי שהוגדרו על ידי תקופות פזילה ואי פזילה מפלות. אנו מדגימים יכולת לעקוב באופן אמין ולהבדיל פזילה בפנוטיפ דמוי מיגרנה המושרה על ידי CGRP ברזולוציה של פחות משנייה.

Introduction

מיגרנה היא אחת מהפרעות המוח הנפוצות ביותר בעולם, המשפיעה על יותר ממיליארד אנשים¹. מודלים פרה-קליניים של מיגרנה בעכברים התפתחו כדרך אינפורמטיבית לחקור את מנגנוני המיגרנה, שכן מחקרים אלה ניתנים לשליטה בקלות רבה יותר מאשר מחקרים בבני אדם, ובכך מאפשרים מחקר סיבתי של התנהגות הקשורה למיגרנה². מודלים כאלה הדגימו תגובה פנוטיפית חזקה וחוזרת על עצמה לתרכובות הגורמות למיגרנה, כגון פפטיד הקשור לגן קלציטונין (CGRP). הצורך במדידות חזקות של התנהגויות רלוונטיות למיגרנה במודלים של מכרסמים נותר בעינו, במיוחד אלה שעשויות להיות משולבות עם מדדים מכניסטיים כגון דימות וגישות אלקטרופיזיולוגיות.

מצבים מוחיים דמויי מיגרנה התאפיינו פנוטיפית בנוכחות של סלידה מאור, אלודיניה של כפות הרגליים, שיכוך כאבים בפנים לגירויים מזיקים ועווית פנים³. התנהגויות כאלה נמדדות על ידי הזמן הכולל המושקע באור (סלידה מאור) ובספי רגישות למגע כפות או פנים (אלודיניה של כפות רגליים ושיכוך יתר בפנים) והן מוגבלות לקריאה אחת על פני פרקי זמן גדולים (דקות או יותר). ניתן לעורר התנהגויות דמויות מיגרנה בבעלי חיים על ידי מתן מינון של תרכובות הגורמות למיגרנה כגון CGRP, המחקות תסמינים שחווים מטופלים אנושיים עם מיגרנה³ (כלומר, הוכחת תוקף הפנים). תרכובות כאלה מייצרות גם תסמיני מיגרנה כאשר הן ניתנות בבני אדם, ומדגימות את תוקף המבנה של מודלים אלה⁴. מחקרים שבהם פנוטיפים התנהגותיים נחלשו מבחינה פרמקולוגית הובילו לתגליות הקשורות לטיפול במיגרנה ומספקים אישוש נוסף למודלים אלה (כלומר, הוכחת תוקף ניבוי)^5,6.

לדוגמה, נוגדן חד-שבטי נגד CGRP (ALD405) הוכח כמפחית התנהגות מרתיעה לאור⁵ ועווית פנים בעכברים⁶ שטופלו ב-CGRP, ומחקרים אחרים הראו כי תרופות נוגדות CGRP מפחיתות התנהגויות דמויות מיגרנה המושרות על ידי תחמוצת החנקן בבעלי חיים ^7,8. ניסויים קליניים שנערכו לאחרונה הראו הצלחה בטיפול במיגרנה על ידי חסימת CGRP ^9,10, מה שהוביל למספר תרופות שאושרו על ידי ה- FDA המכוונות ל- CGRP או לקולטן שלו. הערכה פרה-קלינית של פנוטיפים הקשורים למיגרנה הובילה לפריצות דרך בממצאים קליניים ולכן היא חיונית להבנת כמה מההיבטים המורכבים יותר של מיגרנה שקשה לבדוק ישירות בבני אדם.

למרות יתרונות רבים, ניסויים המשתמשים בקריאות התנהגותיות אלה של מכרסמים של מיגרנה מוגבלים לעתים קרובות ביכולות הדגימה שלהם בנקודת הזמן שלהם ויכולים להיות סובייקטיביים ומועדים לטעויות ניסוי בבני אדם. מבדקים התנהגותיים רבים מוגבלים ביכולתם ללכוד פעילות ברזולוציות זמן עדינות יותר, מה שמקשה לעתים קרובות על לכידת אלמנטים דינמיים יותר המתרחשים בסקאלת זמן של תת-שנייה, כגון ברמת הפעילות המוחית. הוכח כי קשה לכמת את מרכיבי ההתנהגות הספונטניים יותר, המתרחשים באופן טבעי לאורך זמן, ברזולוציה זמנית משמעותית לחקר מנגנונים נוירופיזיולוגיים. יצירת דרך לזהות פעילות דמוית מיגרנה בטווחי זמן מהירים יותר תאפשר אימות חיצוני של מצבים מוחיים דמויי מיגרנה. זה, בתורו, יכול להיות מסונכרן עם פעילות המוח כדי ליצור פרופילי פעילות מוחית חזקים יותר של מיגרנה.

פנוטיפ אחד כזה הקשור למיגרנה, עווית פנים, משמש בהקשרים שונים כמדד לכאב בבעלי חיים שניתן למדוד באופן מיידי ולעקוב אחריו לאורך זמן¹¹. עווית פנים משמשת לעתים קרובות כאינדיקטור לכאב ספונטני בהתבסס על הרעיון שבני אדם (במיוחד בני אדם לא מילוליים) ומיני יונקים אחרים מציגים שינויים טבעיים בהבעות הפנים כאשר הם חווים כאב¹¹. מחקרים שמדדו עווית פנים כאינדיקציה לכאב בעכברים בעשור האחרון השתמשו בסולמות כגון סולם גרימס עכבר (MGS) כדי לתקנן את אפיון הכאב במכרסמים¹². משתני הבעת הפנים של MGS כוללים הידוק אורביטלי (פזילה), בליטת אף, בליטת לחיים, מיקום אוזניים ושינוי שפם. למרות שהוכח כי MGS מאפיין כאב באופן אמין בבעלי חיים¹³, הוא ידוע לשמצה כסובייקטיבי ומסתמך על ניקוד מדויק, שיכול להשתנות בין הנסיינים. בנוסף, MGS מוגבל בכך שהוא משתמש בקנה מידה לא רציף וחסר את הרזולוציה הטמפורלית הדרושה כדי לעקוב אחר התנהגות טבעית לאורך זמן.

אחת הדרכים להילחם בכך היא על ידי כימות אובייקטיבי של תווי פנים עקביים. פזילה היא תכונת הפנים העקבית ביותר שניתן לעקוב אחריה⁶. פזילה מהווה את רוב השונות הכוללת בנתונים כאשר מביאים בחשבון את כל משתני MGS (פזילה, בליטת אף, בליטת לחי, מיקום אוזניים ושינוי שפם)⁶. מכיוון שפזילה תורמת במידה הרבה ביותר לציון הכולל המתקבל באמצעות MGS ועוקבת באופן אמין אחר התגובה ל- CGRP ^6,14, זוהי הדרך האמינה ביותר לעקוב אחר כאב ספונטני במודלים של עכברי מיגרנה. זה הופך את הפזילה להתנהגות לא הומיאוסטטית הניתנת לכימות הנגרמת על ידי CGRP. מספר מעבדות השתמשו בתווי הבעת פנים, כולל פזילה, כדי לייצג כאב ספונטני פוטנציאלי הקשור למיגרנה ^6,15.

נותרו מספר אתגרים בנוגע לביצוע פזילות אוטומטיות באופן שניתן לשלב עם מחקרים מכניסטיים של מיגרנה. לדוגמה, היה קשה לעקוב באופן אמין אחר פזילה מבלי להסתמך על מיקום קבוע שיש לכייל באותו אופן בין הפעלות. אתגר נוסף הוא היכולת לבצע ניתוח מסוג זה בקנה מידה רציף במקום בקנה מידה בדיד כמו MGS. כדי להקל על אתגרים אלה, שאפנו לשלב למידת מכונה, בצורה של DeepLabCut (DLC), בצנרת ניתוח הנתונים שלנו. DLC הוא מודל למידת מכונה להערכת פוזות שפותח על ידי מאתיס ועמיתיו ויושם על מגוון רחב של התנהגויות¹⁶. באמצעות תוכנת הערכת התנוחה שלהם, הצלחנו לאמן מודלים שיכולים לחזות במדויק נקודות על עין עכבר בדיוק כמעט אנושי. זה פותר את הבעיות של ניקוד ידני חוזר תוך הגדלת הרזולוציה הזמנית באופן דרסטי. יתר על כן, על-ידי יצירת המודלים האלה, יצרנו אמצעי שניתן לחזור עליו כדי לפזול ולהעריך פעילות מוחית דמוית מיגרנה על פני קבוצות ניסוי גדולות יותר. כאן, אנו מציגים את הפיתוח והאימות של שיטה זו למעקב אחר התנהגויות פזילה באופן שיכול להיות נעול בזמן למדידות מכניסטיות אחרות כגון נוירופיזיולוגיה. מטרת העל היא לזרז מחקרים מכניסטיים הדורשים התנהגויות פזילה נעולות בזמן במודלים של מכרסמים.

Protocol

הערה: כל בעלי החיים ששימשו בניסויים אלה טופלו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת איווה.

1. הכנת ציוד לאיסוף נתונים

1. ודא את הזמינות של כל הציוד הדרוש: ודא כי החומרה המומלצת להפעלת DLC כוללת לפחות 8 GB של זיכרון. עיין בטבלת החומרים לקבלת מידע הקשור לחומרה ותוכנה.
   הערה: ניתן לאסוף נתונים בכל תבנית, אך יש להמיר אותם לתבנית הניתנת לקריאה על-ידי DLC לפני הניתוח. הפורמטים הנפוצים ביותר הם AVI ו- MP4.
2. הגדר לפחות מצלמה אחת כך שניתן יהיה לזהות עין אחת של בעל חיים. אם שתי העיניים גלויות, בצע סינון נוסף, מכיוון שהוא עלול לגרום להפרעה במעקב. ראה סעיף 10 כדוגמה לסינון כזה עבור הנתונים המובאים כאן.
3. התקן DLC באמצעות החבילה שנמצאת ב- Deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/installation.
4. בהגדרת המצלמה, כלול מצלמה יחידה בזווית צדדית (~90°) לעכבר. כדי לעקוב אחר דוגמה זו, דגמו במהירות של 10 הרץ, כאשר העכברים מרוסנים אך חופשיים לגשת לטווח המלא של תנועות הראש שלהם ביחס לגוף. יש לשמור מרחק של בין 2 ל-4 אינץ' מהמצלמה לחיה.

2. הגדרת DLC

1. לאחר התקנת DLC, צור את הסביבה שברצונך לעבוד ממנה. לשם כך, נווט אל התיקיה שבה תוכנת ה- DLC הורדה באמצעות ספריית השינוי באמצעות הפקודה הבאה.
   CD folder_name
   הערה: כאן נמצא הקובץ DEEPLABCUT.yaml.
2. הפעל את הפקודה הראשונה כדי ליצור את הסביבה ולהפוך אותה לזמינה על-ידי הקלדת הפקודה השנייה.
   conda env create -f DEEPLABCUT.yaml
   conda להפעיל Deeplabcut
   הערה: ודא שהסביבה מופעלת לפני כל שימוש ב- DLC.
   לאחר הפעלת הסביבה, פתח את ממשק המשתמש הגרפי (GUI) עם הפקודה הבאה והתחל ליצור את המודל.
   Python -M DeepLabcut

3. צור את המודל

1. לאחר פתיחת ממשק המשתמש הגרפי, התחל ליצור מודל על ידי לחיצה על צור פרויקט חדש בתחתית.
2. תן שם לפרויקט משהו משמעותי וייחודי כדי לזהות אותו מאוחר יותר והזן שם כנסיין. בדוק את המקטע מיקום כדי לראות היכן הפרויקט יישמר.
3. בחר עיון בתיקיות ומצא את הסרטונים כדי לאמן את המודל. בחר העתק סרטונים לתיקיית הפרויקט אם אין להעביר את הסרטונים מהספרייה המקורית שלהם.
4. בחר צור כדי ליצור פרוייקט חדש במחשב.
   הערה: הסרטונים חייבים לכסות את כל טווח ההתנהגות שתבחין בה (כלומר, פזילה, אי-פזילה וכל ההתנהגויות שביניהן). המודל יוכל לזהות רק התנהגות דומה לזו שבנתוני האימון, ואם חסרים רכיבים מסוימים של ההתנהגות, ייתכן שהמודל יתקשה לזהות אותה.

4. הגדר את ההגדרות

הערה: כאן ניתן להגדיר פרטים כמו אילו נקודות לעקוב, כמה פריימים לחלץ מכל סרטון אימון, גודל נקודת התיוג המוגדר כברירת מחדל ומשתנים הקשורים לאופן שבו המודל יתאמן.

1. לאחר יצירת הדגם, ערוך את הגדרות התצורה על-ידי בחירה באפשרות Edit config.yaml. בחר Edit כדי לפתוח את קובץ הגדרות התצורה כדי לציין הגדרות מפתח הקשורות לדגם.
2. שנו את חלקי הגוף כך שיכללו את כל חלקי העין למעקב, ולאחר מכן שנו את numframes2pick למספר הפריימים הדרושים לכל סרטון אימון כדי לקבל 400 פריימים בסך הכל. לבסוף, שנו את גודל הנקודות לשש כך שגודל ברירת המחדל בעת התיוג יהיה קטן מספיק כדי שניתן יהיה למקם אותו במדויק סביב קצוות העין.

5. חלצו מסגרות אימון

1. לאחר קביעת התצורה, נווט אל הכרטיסיה חלץ מסגרות בחלק העליון של ממשק המשתמש הגרפי ובחר חלץ מסגרות בפינה השמאלית התחתונה של הדף.
2. עקוב אחר ההתקדמות באמצעות פס הטעינה בתחתית ממשק המשתמש הגרפי.

6. תייגו מסגרות אימון

1. נווט אל הכרטיסיה מסגרות תוויות בממשק המשתמש הגרפי ובחר מסגרות תוויות. מצאו את החלון החדש שמציג תיקיות עבור כל אחד מסרטוני ההדרכה שנבחרו. בחר את התיקיה הראשונה, וממשק משתמש גרפי חדש לעיצוב תוויות ייפתח.
2. תייג את הנקודות שהוגדרו במהלך קביעת התצורה עבור כל פריים של הווידאו שנבחר. לאחר שכל המסגרות מתויגות, שמור אותן וחזור על התהליך עבור הסרטון הבא.
3. לתיוג הולם של פזילה, השתמש בשתי נקודות קרובות ככל האפשר לשיא הגדול ביותר של העין (מרכז) וציין את המיקום למעלה/למטה עבור כל נקודה. פזילה משוערת כממוצע של שני אורכים אלה.
   הערה: בעת הוספת תוויות, DLC אינו שומר התקדמות באופן אוטומטי. שמירה תקופתית מומלצת כדי למנוע אובדן של נתונים מתויגים.

7. צרו מערך נתוני אימון

1. לאחר תיוג ידני, נווט אל הכרטיסיה רשת רכבת ובחר רשת רכבת כדי לבקש מהתוכנה להתחיל לאמן את הדגם.
2. עקוב אחר ההתקדמות בחלון הפקודה.

8. הערך את הרשת

1. לאחר השלמת אימון הרשת, נווט אל הכרטיסיה הערכת רשת ובחר הערכת רשת. המתן מספר רגעים עד שעיגול הטעינה הכחול ייעלם ויודיע שהוא סיים את ההערכה העצמית והדגם מוכן לשימוש.

9. נתח נתונים / צור סרטונים מתויגים

1. כדי לנתח סרטוני וידאו, נווט אל הכרטיסיה נתח סרטונים . בחר הוסף סרטונים נוספים ובחר את הסרטונים לניתוח.
2. בחר שמור תוצאות כ- csv אם פלט csv של הנתונים מספיק.
3. לאחר שכל הסרטונים נרכשו, בחר נתח סרטונים בתחתית כדי להתחיל בניתוח הסרטונים.
   הערה: יש להשלים שלב זה לפני יצירת סרטונים מתויגים בשלב 9.5
4. לאחר ניתוח סרטוני הווידאו, נווט אל צור סרטונים לשונית ובחר את הסרטונים שניתחו.
5. בחר צור סרטונים והתוכנה תתחיל ליצור סרטונים מתויגים המייצגים את הנתונים המוצגים .csv המתאים.

10. עיבוד נתונים סופיים

1. החל את פקודות המאקרו שנמצאות ב- https://research-git.uiowa.edu/rainbo-hultman/facial-grimace-dlc כדי להמיר נתונים גולמיים לתבנית המשמשת לניתוח זה (כלומר, מרחק אוקלידי).
2. יבא והחל פקודות מאקרו המסומנות בשלב 1 ושלב 2 על קובץ ה- csv כדי לסנן את כל נקודות הנתונים התת-אופטימליות ולהמיר את הנתונים למרחק אוקלידי ממוצע עבור הנקודות המרכזיות ביותר בחלק העליון והתחתון של העין.
3. הפעל מאקרו שנקרא שלב 3 כדי לסמן כל נקודה כ- 0 ללא פזילה ו - 1 פזילה בהתבסס על ערך הסף בסקריפט, המוגדר על 75 פיקסלים.
   הערה: הפרמטרים עבור פקודות מאקרו אלה עשויים לדרוש התאמה בהתאם להגדרת הניסוי (ראה דיון). סף הפזילה והמסנן האוטומטי לערך המקסימלי של העין הם פרמטרים שניתן לשנות בהתאם לגודל החיה ולמרחק מהמצלמה. באפשרותך גם להתאים את הערכים המשמשים להסרת נקודות תת-אופטימליות בהתאם לאופן שבו יש לסנן את הנתונים באופן סלקטיבי.

Results

כאן, אנו מספקים שיטה לזיהוי אמין של פזילה ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות DeepLabCut. ביצענו אופטימיזציה של פרמטרי האימון, ואנו מספקים הערכה של נקודות החוזק והחולשה של שיטה זו (איור 1).

לאחר אימון המודלים שלנו, וידאנו שהם מסוגלים להעריך נכונה את הנקודות העליונות והתחתונות של העפעף (איור 2), אשר משמשות כנקודות הקואורדינטות של מדידת המרחק האוקלידי. המרחק האוקלידי מוגדר כאורך הממוצע של המרחקים בין שתי הנקודות העליונות והתחתונות של העין. המודל שלנו הצליח לזהות מקרים של אי-פזילה (איור 2A) ופזילה (איור 2B). הנקודות הכחולות מציינות נקודות המשמשות לקביעת המרחק האוקלידי לכל מסגרת. הנקודות הירוקות, הצהובות, הכתומות והסגולות שימשו כדי לסייע למודל להעריך נכונה את המרחק האוקלידי ולהקטין את ערך הסבירות כאשר הראש נמצא במצב לא אופטימלי (כלומר, לקחת בחשבון את תנועת הראש ושינויים בתנוחה בין מפגשים). לאחר מכן תיקפנו את דיוק המודל באמצעות מספר שיטות שונות.

כדי לאמת את המספר האידיאלי של מסגרות המשמשות עבור הדגם, אימנו ובדקנו ארבעה דגמים בגודל מסגרת מדגם משתנה (איור 3). תחילה השווינו את ערכי שגיאת הריבוע של ממוצע הבסיס (RMSE) בין נתוני הבדיקה והאימון כדי לאמת עד כמה המודלים יכולים לחזות במדויק נתוני בדיקה שהם לא הוכשרו עליהם. השוואה זו הראתה כי השונות בין הנקודות המסומנות ידנית לבין הנקודות המסומנות בדגם מתיישרת לאחר 300 פריימים. מגמה זו תאמה את ממוצעי הסבירות המדווחים שגם הם התייצבו לאחר 300 מסגרות מתויגות. השתמשנו בערכי סבירות מדווחים אלה כדי לסנן נקודות שהיו נמוכות מ- 0.92. ערכי סבירות אלה מציינים עד כמה המודל בטוח שנקודה נתונה תויגה כראוי בהתבסס על נתוני האימון. ערכנו ממוצעים של ערכים אלה עבור הנקודות התורמות למדד המרחק האוקלידי כדי לבחון את הביצועים של המודלים ביחס זה לזה. אמנם לא היה הבדל משמעותי בין 300 ל-400 פריימים, אך השתמשנו ב-400 פריימים מכיוון שהם היו בממוצע מעל ערך הסבירות של 0.95, שמתקרב לסף שלנו לסינון ידני ומיישר קו עם הסף המשמש במודלים דומים להערכת תנוחה¹⁶.

דרך נוספת שבה אימתנו את דיוק המודל הייתה באמצעות מטריצת בלבול שהשווה מסגרות עם ביאורים ידניים למסגרות עם תווית DLC. שני עיוורים הוסיפו הערות ידניות ל-300 פריימים של אותה עין בשמונה סרטונים. השתמשנו בנתונים האלה כדי לבנות מטריצת בלבול כדי להעריך תוצאות חיוביות ושליליות אמיתיות ושגויות (איור 4), כאשר נתונים שקיבלו ניקוד ידני שימשו כאמת הקרקעית. עבור DLC, ערך פזילה חיובי נרשם כאשר המרחק האוקלידי נרשם כקטן מ- 75 פיקסלים (כלומר, החיה מצמצמת), וערך שלילי נרשם עבור ערכים גדולים מ- 75 פיקסלים (כלומר, החיה אינה ממצמצת). מצאנו ערך ניבוי חיובי של 96.96%, שהוא אחוז הזמן שהמודל מנבא במדויק פזילה ביחס לפזילה עם הערות ידניות. מצאנו ערך ניבוי שלילי של 99.66%, שהוא אחוז הזמן שהמודל מנבא במדויק אי פזילה ביחס לפזילה עם הערות ידניות. אלה מציגים את חלקם של ערכים שליליים וחיוביים שתויגו כראוי. מצאנו גם שיעור חיובי אמיתי של 98.1% ושיעור שלילי אמיתי של 99.46%, המייצגים את הניבוי המדויק של המודל של ערכים חיוביים ושליליים ביחס לכל הערכים החיוביים והשליליים, בהתאמה. מקדם המתאם של מתיוס שלנו, או MCC, היה 93.8%, מה שמצביע על מקדם המתאם בין הערכים הנצפים והחזויים.

ברגע שהיינו בטוחים שהמודל שלנו עוקב באופן אמין אחר פזילה, השווינו את שיטת DLC זו לשיטת מעקב פזילה שפורסמה בעבר באמצעות מערך נתונים פרה-קליני של מיגרנה¹⁴. אנו נתייחס לשיטה אחרת זו בשם "מודל פזילה שטח (ASM)" מכיוון שהיא פותחה באמצעות שטח עיניים פתוח כמשתנה רציף המודד פזילה¹⁴. מודל פזילה השטח משתמש בתוכנה מאומנת לזיהוי פנים בשילוב עם סקריפט MATLAB מותאם אישית כדי לנתח את אזור הפיקסלים הממוצע של העין, תוך אי הכללת מסגרות עם שיעור שגיאות מעקב של >15%¹⁴. מגבלה עיקרית אחת היא כי "ASM" אינו קוד פתוח, ולכן, לא נגיש באופן נרחב. DLC מאפשר אופטימיזציה ויכולת הסתגלות משופרות ללא צורך ברכישה משמעותית של תוכנה וחומרה.

השתמשנו במערך נתונים של 10 עכברים נקבות ו-10 עכברי CD1 זכרים. באופן ניסיוני, כל בעלי החיים התאקלמו באיזוק עדין במשך 30 דקות במשך 3 ימים בסך הכל לפני תחילת ההקלטות. כל חיה הוקלטה במשך 5 דקות של קו הבסיס ולאחר מכן 5 דקות עבור הקלטות טיפול. במהלך הטיפולים, בעלי חיים טופלו ב- PBS (רכב) או 0.1 מ"ג / ק"ג CGRP (טיפול) תוך צפקי כדי לגרום למצב דמוי מיגרנה. הנתונים נאספו בחדר מואר היטב באמצעות מצלמות המצוידות באור אינפרא אדום כדי להאיר את הפנים ולהבטיח זיהוי מדויק של ציוני דרך. מצלמת האינפרא אדום כללה עדשת Kowa LM35JC בגודל 2/3 אינץ' 35 מ"מ F1.6 ידנית עם מרחק מוקד של 254 מ"מ וצמצם מותאם בהתאם. לאחר שאספנו את הנתונים, השתמשנו ב- ASM וב- DLC כדי לנתח את הנתונים. מכיוון שהניקוד הידני שימש באופן קונבנציונלי בתחום לכימות עווית פנים, כאשר פזילה היא מרכיב אחד של עווית הפנים¹⁴, השווינו גם את הנתונים שלנו לנתונים שקיבלו ניקוד ידני.

בהתבסס על ממצאים קודמים שהזרקה היקפית של CGRP גורמת לתגובת פזילה בעכברים, ציפינו לראות הבדלים משמעותיים בתגובת הפזילה בין טיפול ברכב לטיפול ב-CGRP ^6,14. השווינו בין שיטות ASM, שיטות ידניות ושיטות DLC ומצאנו שהמודל שלנו זיהה פנוטיפ פזילה, כמו גם שיטות ידניות ושיטות ASM (איור 5). חשוב לציין כי מודל ASM שימש להערכת כאב הנגרם על ידי CGRP ופזילה. במחקר זה, Rea et al. השוו את תגובת הפזילה לאחר CGRP לתגובת פזילה לאחר הזרקת פורמלין של הכף האחורית כבדיקת השראת כאב "מסורתית יותר"¹⁴. יתר על כן, CGRP מתועד היטב כגורם לרגישות יתר למגע בעכברים באמצעות שימוש בפון פריי ^3,17. בהתאם לשטח, נרמלנו את הפזילה הממוצעת במהלך הטיפול לקו בסיס של 5 דקות לפני הטיפול עבור כל בעל חיים והשווינו PBS (n = 10) לעומת בעלי חיים שטופלו ב- CGRP (n = 11). להלן ניתוחים סטטיסטיים של PBS לעומת קבוצות שטופלו ב-CGRP. מצאנו שחיות שטופלו ב-CGRP הציגו שטח פיקסלים ממוצע מופחת באמצעות שיטת פזילה של שטח למעקב (p = 0.012, איור 5A) והציגו מרחק אוקלידי מופחת כאשר קיבלו ניקוד ידני (p = 0.0007, איור 5B) והשתמשו במודל ה-DLC שלנו (p = 0.007, איור 5C). כאשר השווינו כל שיטה לאורך זמן בחיה מייצגת אחת, נצפתה אותה תבנית (איור 5). חיה זו הראתה פנוטיפ פזילה ברור מאוד בתגובה לטיפול CGRP אך לא PBS. כל המודלים היו מסוגלים לזהות את ההבדלים האלה, אולם הנתונים היו מיוצגים בצורה הברורה ביותר במודל ה-DLC שלנו (איור 5). מדדים מדויקים ומדויקים חשובים במיוחד כאשר יש לנתח נתונים ברזולוציות עדינות יותר, כאשר הממוצע אינו מעיד על קריאה התנהגותית מלאה (למשל, פעילות מוחית). שיטת DLC לזיהוי פזילה בעכברים מאפשרת לנו לאסוף נתונים בסקאלת זמן של אלפית שנייה ולנעול אותם בזמן למדדים של פעילות מוחית (למשל, פוטנציאלי שדה מקומיים), המתרחשת בסקאלת זמן של אלפיות השנייה. לאחר מכן אנו יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי לבנות פרופיל חזק יותר של מצב מוחי המעיד על כאב ספונטני בהקשר של מיגרנה והפרעות מוחיות מורכבות אחרות.

איור 1: סקירה כללית של ההליך ליצירת רשת מאומנת עם DLC. סכמה כללית של התהליך שבו עוקבים אחר תווי עיניים של בעל חיים ולאחר מכן מנותחים באמצעות למידת מכונה. קיצור: DLC = DeepLabCut. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דוגמה למעקב פזילה אוטומטי בעכבר CD1 מייצג. (A) דוגמה למסגרת המציגה פזילה למעקב DLC (נקודות צבעוניות) על קווי המתאר של העין במהלך יום הטיפול כאשר העכבר אינו ממצמץ. (B) דוגמה למסגרת המציגה זיהוי אוטומטי של פזילה ביום הטיפול, באמצעות מודל DLC שלנו. המרחק האוקלידי נמדד באמצעות המרחק הממוצע בין B ל-C, הנקודות הכחולות, בחלק העליון והתחתון של העין. קבוצות הכחולות של נקודות בחלק העליון והתחתון של העין משמשים בעת מעקב אחר מרחק אוקלידי. הנקודות האחרות (ירוק, צהוב, כתום, סגול) הן נקודות ציון מסגוריות המשמשות הן כדי לסייע למודל להעריך את נקודות המרחק האוקלידי והן כדי לסנן מיקום ראש תת-אופטימלי לאחר איסוף הנתונים. קיצור: DLC = DeepLabCut. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הצדקה למספר המסגרות המשמשות לאימון המודל. (A) ניתוח שגיאות בריבוע ממוצע שורש מציין את המרחק הממוצע בין ערכים חזויים לערכים נצפים עבור ערכות נתונים של בדיקה ורכבת. ערכת נתוני האימון מייצגת את המסגרות שנדגמו בעת אימון המודל, וערכת נתוני הבדיקה מייצגת את המסגרות שאינן אימון המשמשות לאימות מידת היכולת של המודל לזהות תמונות דומות אך שונות. השתמשנו בחמש קבוצות של נתוני אימון ובדיקה ומצאנו שערכי RMSE התיישבו סביב 300 פריימים עבור קבוצת הבדיקה. (B) הסבירות שנקודה נתונה מסומנת נכון (ממוצע + SEM). זה הראה כי 400 מסגרות המסומנות ידנית היו אידיאליות מכיוון שמערכי הנתונים הגולמיים היו בממוצע מעל סבירות של 0.95, בעוד שציון RMSE היה הקרוב ביותר לזה של נתוני האימונים. משמעות הדבר היא שהמודל היה מסוגל להתקרב לנקודות עליהן אומן תוך דיווח על רוב הפריימים בסבירות גבוהה. קיצור: RMSE = שגיאת שורש ממוצע בריבוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מטריצת בלבול עבור מדידות פזילה DLC. דגמנו 300 שניות משמונה סרטונים (חמישה CGRP ושלושה PBS) והשווינו את הנקודות האלה לציון בינארי ידני של כן או לא עבור פזילה. כימתנו ערכים חזויים כערכים שזוהו על-ידי DLC וערכים בפועל כערכים שאדם הבקיע ידנית. לאחר מכן השווינו זאת לנתונים שקיבלו ניקוד ידני כדי לראות באיזו תדירות הפזילה זוהתה נכון ביחס לניקוד הבינארי של הפזילה הבינארית כן או לא. קיצורים: DLC = DeepLabCut; CGRP = פפטיד הקשור לגן קלציטונין; PBS = מלח חוצץ פוספט; TP = חיובי אמיתי; FP = תוצאות חיוביות שגויות; FN = שליליות שגויות; TN = שליליות אמיתיות; PPV = ערך ניבוי חיובי; NPV = ערך ניבוי שלילי; TPR = שיעור חיובי אמיתי; TNR = שיעור שלילי אמיתי; MCC = מקדם המתאם של מתיו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: פנוטיפ פזילה בשלושה מודלים שונים לזיהוי פזילה. שתי השורות העליונות מכילות את אותה חיה מייצגת עם כל מצב (PBS או CGRP) בשלושה מודלים שונים לזיהוי פזילה. השורה התחתונה משקפת ממוצעים בכל בעלי החיים. (A) חלה ירידה בשטח הפיקסלים הממוצע (שטח הפיקסלים הכולל הממוצע/קו הבסיס) בעכברים שטופלו ב-CGRP לעומת עכברים שטופלו ב-PBS (t(18) = 2.805, p = 0.012) לאחר עיבוד כל הנתונים באמצעות מודל פזילה¹⁴ שפורסם ואומת בעבר. (B) הייתה תגובה דומה בנתונים שקיבלו ניקוד ידני (t(18) = 4.064, p = 0.0007). (C) עכברים שטופלו ב-CGRP הראו ירידה במרחק ממוצע בין העפעף לעפעפיים (מרחק אוקלידי טיפולי/מרחק אוקלידי לפני הטיפול, קו בסיס) בהשוואה לעכברים שטופלו ב-PBS (t(18) = 3.040, p = 0.007 בעת שימוש ב-DLC לעיבוד כל הנתונים. N = 20 (10 נקבות, 10 זכרים). קווי שגיאה מציינים ממוצע ±- SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

פרוטוקול זה מספק שיטה מעמיקה נגישה לשימוש בכלים מבוססי למידת מכונה שיכולים להבדיל בין פזילה לדיוק כמעט אנושי תוך שמירה על אותה רזולוציה זמנית (או טובה יותר) של גישות קודמות. בראש ובראשונה, זה הופך את ההערכה של פזילה אוטומטית לזמינה יותר לקהל רחב יותר. השיטה החדשה שלנו להערכת פזילה אוטומטית כוללת מספר שיפורים בהשוואה לדגמים קודמים. ראשית, הוא מספק מדד חזק יותר מאשר ASM על ידי ניצול פחות נקודות שתורמות למעשה לכימות הפזילה. זה מקטין את הסבירות של תוצאות חיוביות ושליליות שגויות על ידי הפיכת הניתוח להסתמך על פחות נקודות בעת יצירת הערכים המציינים פזילה. במילים אחרות, מודל DLC הופך כל נקודה סביב העין להכרחית אך לא מספיקה להכללה של נקודת זמן. זה מאפשר לנו לסנן נתונים תת-אופטימליים באמצעות אותו מספר נקודות כמו ASM מבלי להסתמך על השונות הגדולה יותר שנובעת מהסתמכות על כל כך הרבה נקודות מרכיבות. בנוסף, צמצמנו טעויות אנוש פוטנציאליות על ידי תכנון מודלים שאינם מסתמכים לחלוטין על דיוקם של אנשים מיומנים.

בעת עיבוד נתונים, מצאנו כי השיטה שלנו סיננה במדויק נקודות תת-אופטימליות ונקודות חריגות שהיו גדולות יותר ממה שהיה אפשרי, בהתחשב בגודל המרבי של עין העכבר (פרוטוקול סעיף 10). השתמשנו בפקודות מאקרו שבדקנו אם לכל אחת מ-10 הנקודות המקיפות את העין בנפרד היה ערך סבירות גבוה מ-0.92, וסיננו כל אחת מתחת לערך זה. בעתיד, זה יכול להיות מותאם כדי להפוך את הנתונים המעובדים פחות או יותר סלקטיבי. פקודות המאקרו גם סיננו כל ערכי מרחק אוקלידיים הגדולים מ-200 פיקסלים, מכיוון שמצאנו שהמרחק הגדול ביותר האפשרי בין החלק העליון לחלק התחתון של העין היה 150 פיקסלים. ייתכן שיהיה צורך לשנות זאת בהתאם למערך הניסוי. אם המצלמה אינה באותו מרחק מהעין, אז הערך המקסימלי יכול להיות פחות או יותר באופן משמעותי. כוחם של נתוני מאקרו אלה הוא בכך שהם אפשרו לנו לחלץ מדידות בין החלק העליון והתחתון של העין באופן שהיה תלוי בכך שהמודל דיווח על סבירות גבוהה יותר עבור כל הנקודות המרכיבות את העין.

DLC ו- ASM מוגבלים שניהם בכך שהם מסתמכים על העכבר להיות במצב קבוע במרחק קבוע מראש מהמצלמה כדי לאפשר קנה מידה עקבי של הגדלה בין תנאי הבסיס לתנאי הטיפול. לפיכך, תנועה מהחיה עצמה, מיקום שגוי בתוך המנגנון, או שינוי בהליך הניסוי יפגעו ביכולת של המודל לזהות את השטח הכולל של העין. המודל שלנו משפר במידת מה את המגבלות הללו על ידי ניצול המרחק האוקלידי, כלומר המרחק למעלה ולמטה של אורך העין, המאפשר מעקב משופר למרות הבדלים בזוויות המצלמה, תנועה מהחיה ושונות ניסיונית בין הפעלות שונות ללא צורך בכיול מחדש נוסף. עם זאת, אנו מכירים בכך ששיפורים בנורמליזציה כדי להסביר את תנועת הראש עשויים להביא למעקב טוב עוד יותר אחר פזילה בבעלי חיים נעים.

מגבלה נוספת של השיטה שלנו היא שהיא סיננה נקודות שבהן המרחק האוקלידי התקרב לאפס, מה שמציין את סגירת העין. למרות סינון התורמים המשמעותיים הללו לפזילה, עדיין הצלחנו לזהות תגובת פזילה הנגרמת על ידי CGRP בצורה חזקה יותר מאשר שיטות קודמות (p = 0.007). הסרת מרכיב זה של פזילה הופכת למגבילה במיוחד כאשר מנסים להשוות לנקודות עניין נוספות, כגון פעילות מוחית. אנו חושבים שמציאת משמעות בעת הסרת נקודות אלה מראה את חוסנה של שיטה זו, אך אנו מכירים בכך שהסרת מרכיבים אלה של פזילה אינה אידיאלית. מחקרים עתידיים המשתמשים בשיטה זו צריכים לכלול מספר רב יותר של מסגרות חריגות כדי לאמן טוב יותר את המודלים בזיהוי פזילה כשהיא מתקרבת לאפס. בסך הכל, פיתוח שיטה למעקב אמין אחר פזילה אוטומטית עשוי לאפשר מחקרים שמטרתם לקשר מאפיינים חשובים של התנהגות טבעית למצב המוחי שלה, ולאפשר חקירה חזקה של פרופילי פעילות מוחית כגון בהקשר של מיגרנה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CUDA toolkit 11.8
cuDNN SDK 8.6.0
מחשבי אינטל עם Windows 11, דור 13
מודול תוסף LabFaceX 2D Eyelid Tracker לעכבר נודד בחינם:	FaceX LLC	NA	כל מצלמה שיכולה להקליט עין של בעל חיים מספיקה, אבל זו חומרת מעקב העיניים שלנו.
מנהל התקן של NVIDIA GPU בגרסה 450.80.02 ואילך
NVIDIA RTX A5500, 24 GB DDR6	NVIDIA	[490-BHXV]	כל GPU שעומד בדרישות המינימום שצוינו עבור גרסת ה-DLC שברשותך, כרגע 8GB, מספיק. השתמשנו ב-NVIDIA GeForce RTX 3080 Ti GPU
Python 3.9-3.11
TensorFlow גרסה 2.10