מאמר שיטה

שימוש בבדיקת הזזה תרמית לבדיקת קשירת מצע לסלנופרוטאין O

DOI:

10.3791/67139

⸱

9 באוגוסט 2024

 , 
1Department of Physiology, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Charles and Jane Pak Center for Mineral Metabolism and Clinical Research, University of Texas Southwestern Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים את מבחן השינוי התרמי, טכניקה מבוססת פלואורסצנטיות בעלת תפוקה גבוהה המשמשת לחקר הקישור של מולקולות קטנות לחלבונים בעלי עניין.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגדרת חשיבותם הביולוגית של חלבונים בעלי תפקידים לא ידועים מציבה מכשול משמעותי בהבנת תהליכים תאיים. אף על פי שתחזיות ביואינפורמטיות ומבניות תרמו לחקר חלבונים לא ידועים, אימותים ניסיוניים במבחנה נפגעים לעתים קרובות על ידי התנאים האופטימליים וקו-פקטורים הדרושים לפעילות ביוכימית. קשירת קו-פקטור חיונית לא רק לפעילות של אנזימים מסוימים, אלא גם עשויה לשפר את היציבות התרמית של החלבון. אחד היישומים המעשיים של תופעה זו טמון בניצול השינוי ביציבות התרמית, כפי שנמדד על ידי שינויים בטמפרטורת ההתכה של החלבון, כדי לבחון את קשירת הליגנד.

בדיקת שינוי תרמי (TSA) יכולה לשמש לניתוח הקישור של ליגנדות שונות לחלבון המעניין או למצוא מצב מייצב לביצוע ניסויים כגון קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. כאן נתאר פרוטוקול עבור TSA המשתמש בפסאודוקינאז, Selenoprotein O (SelO), לשיטה פשוטה ובעלת תפוקה גבוהה לבדיקת קשירת מתכת ונוקלאוטידים. בניגוד לקינאזות קנוניות, SelO קושר ATP בכיוון הפוך כדי לזרז את העברת AMP לשרשראות הצד ההידרוקסיל של חלבונים בשינוי פוסט-תרגומי המכונה AMPylation חלבון. על ידי מינוף השינוי בטמפרטורות ההתכה, אנו מספקים תובנות חיוניות לגבי האינטראקציות המולקולריות העומדות בבסיס פונקציית SelO.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלק גדול מהפרוטאום האנושי נותר מאופיין בצורה גרועה. "אפקט תאורת הרחוב" המתואר על ידי דנהם וקוסטצ'ר ואחרים מתייחס לתופעה שבה חלבונים שנחקרו בהרחבה מקבלים תשומת לב רבה יותר, ומשאירים חלבונים שלא נחקרו מספיק מתעלמיםמ-1,2. גורמים התורמים להשפעה זו כוללים את החשיבות הביולוגית ואת הרלוונטיות של מחלות של חלבונים מסוימים. יתר על כן, מחקר קודם המציע ידע בסיסי, כמו גם את הזמינות של כלים לניתוח פונקציונלי, עוד יותר מגרה מחקר על חלבונים נחקרים מאוד 1,2. פרויקטים כגון Understudied Proteins Initiative, Structural Genomics Consortium ו-Enzyme Function Initiative שואפים לאפיין חלבונים שלא נחקרו מספיק באמצעות פרוטאומיקה מבנית ותפקודית 2,3,4. גישה משלימה לזיהוי הפונקציות המולקולריות של חלבונים שלא נחקרו מספיק היא לבחון את האינטראקציות של חלבונים אלה עם מולקולות קטנות כדי לקבל תובנות חשובות לגבי הוויסות וספציפיות המצע.

קשירה של מולקולות קטנות יכולה להגביר את היציבות התרמית של חלבון5. תופעה זו, הידועה בשם ייצוב קונפורמציה המושרה על ידי ליגנד, גורמת לעיתים קרובות לעלייה בטמפרטורת ההתכה של חלבון, ומספקת אינדיקציה מדידה לקשירת ליגנד6. ניתן למדוד את היציבות התרמית של חלבון באמצעות פלואורימטריה של סריקה דיפרנציאלית (DSF), הידועה גם בשם Thermofluor, או Thermal Shift Assay (TSA)7,8,9,10. ב- TSA, דגימת חלבון נתונה לטמפרטורות עולות בנוכחות צבע רגיש לסביבה6. כאשר החלבון מתפתח ומתפרק, הצבע נקשר לאזורים ההידרופוביים החשופים של החלבון ופולט פלואורסצנטיות. צבעים פלואורסצנטיים חיצוניים, או צבעים רגישים לסביבה, חסרים פלואורסצנטיות פנימית ובמקום זאת פלואורסצנטיים באינטראקציה עם מולקולת המטרה שלהם 9,11,12. הצבע הנפוץ ביותר, SYPRO Orange, מציע מספר יתרונות כגון יציבות משופרת ופלואורסצנטיות רקע מינימלית 8,9,12. יש לציין כי SYPRO Orange תואם למערכות תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR) בהתחשב באורכי גל העירור והפליטה שלו סביב 470 ננומטר ו-570 ננומטר, בהתאמה. תכונה ייחודית זו מאפשרת מדידות בעלות תפוקה גבוהה, מדויקות ורגישות התואמות למערכות גילוי פלואורסצנטיות הנפוצות במערכות RT-PCR8.

TSA הוא כלי רב-תכליתי לחקר אינטראקציות חלבונים עם גורמים משלימים או תרופות פוטנציאליים ולזיהוי תנאים מייצבים לקריסטלוגרפיה. חלק מיתרונותיו על פני שיטות סינון אחרות הם פשטות ההתקנה היחסית שלו והתפוקה הגבוהה שלו עם לוחות 96 או 384 בארות 13,14,15. הפיתוח של טכניקה זו היה טרנספורמטיבי עבור מחקרים גילוי תרופות, מציע נוחות ומאפשר מחקר של תוספים מגוונים כגון יונים, ליגנדות, ותרופות 6,16. יתר על כן, יכולת ההסתגלות של TSA עודדה מדענים להרחיב את התועלת שלה, מה שמקל על מדידת זיקות מחייבות לצד מבחני הסינון 17,18. TSA הוא כלי יעיל במחקרי ביולוגיה מבנית לזיהוי תנאים המקדמים את ייצוב החלבון המעניין להתגבשות19. לפיכך, גמישותו וקלילותו היחסית מיצבו את TSA כטכניקת אבן פינה באפיון חלבונים. כאן, נשתמש ב- TSA כדי לנתח את הקישור של מתכות ונוקלאוטיד לפסאודוקינאז שלא נחקר, Selenoprotein O (SelO), כדוגמה.

קינאזות הן אחת ממשפחות החלבונים הממוקדות ביותר בגילוי תרופות20. כ -10% מהקינאזות האנושיות צפויות להיות לא פעילות ונקראות פסאודוקינזות מכיוון שהן חסרות שאריות קטליטיות, הדרושות לקטליזה 21,22. Selenoprotein O (SelO) הוא פסאודוקינאז משומר אבולוציונית שחסר את האספרטט השמור במוטיב HRD הקטליטי23. באיקריוטים, SelO מתמקם במיטוכונדריה ומגן על התאים מפני עקה חמצונית 24,25. ניתוחים מבניים וביוכימיים מראים כי SelO מעביר אדנוזין מונופוספט (AMP) מ-ATP למצעים חלבוניים בשינוי פוסט-תרגומי המכונה AMPylation25. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שאנזימים המזרזים AMPylation עשויים לקשור נוקלאוטידים חלופיים כגון UTP in vitro 26,27. יש לציין כי מחקרים הוכיחו כי הומולוג SelO מסלמונלה טיפימוריום מזרז את החלבון UMPylation, או העברת UMP, באופן תלוי מנגן28. לאור התצפיות המסקרנות הללו, אנו בודקים את הקישור של SelO ל-ATP ול-UTP בנוכחות מגנזיום ומנגן, ומשמשים דוגמה מייצגת ליישומים של TSA. ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקול הבא כדי לייעל ולבחון את האינטראקציות של חלבונים ותוספים אחרים בעלי עניין.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מערך ניסיוני

  1. השתמש במחזור תרמי שיכול לזהות פלואורסצנטיות, כגון מכשיר RT-PCR, כדי לבצע את הפרוטוקול המתואר. אם אתה משתמש ב- SYPRO Orange, כמתואר בפרוטוקול זה, השתמש במצב סריקה המאפשר עירור סביב 470 ננומטר וזיהוי פליטה סביב 570 ננומטר. תכנת את thermocycler להחזיק את הדגימה ב 20 ° C במשך 2 דקות, ואחריו עלייה בטמפרטורה של 0.5 ° C / 1 דקה עד 95 ° C; למדוד עוצמת פלואורסצנטיות כל 1 °C.
    הערה: אנו ממליצים על שלב אופציונלי בסוף המחזור כדי להחזיר את בלוק הדגימה ל- 20°C (איור 1).
  2. כל תגובה מכילה ארבעה מרכיבים: חיץ, חלבון מעניין, תוסף וצבע פלואורסצנטי חיצוני. תכנן את הניסוי כך שיכלול בקרות כגון ללא חלבון, ללא צבע, חלבון ללא תוספים, ותוספים בלבד כדי לקבוע כל פלואורסצנטיות רקע שעשויה להשפיע על פרשנות התוצאות. אם זמין, לכלול בקרה חיובית כגון תוסף הידוע לקשור ולייצב את החלבון המעניין.
  3. השתמש חלבון מטוהר עבור הבדיקה. כדי לעקוב אחר דוגמה זו, השתמש E. coli SelO, מבוטא ומטוהר כפי שתואר קודם לכן25,29. בקצרה, לבטא את הסומו שלו המתויג SelO (E. coli SelO ppSumo) בתאי Rosetta DE3 ולטהר אותו באמצעות זיקה Ni2+-NTA. חותכים את תג הסומו שלו באמצעות פרוטאז Ulp ומטהרים את SelO עוד יותר על ידי כרומטוגרפיית סינון ג'ל.
  4. הפלואורסצנטיות של SYPRO Orange תהיה תלויה באינטראקציה שלה עם החלבון המעניין. מכיוון שאינטראקציות אלה ישתנו מחלבון לחלבון, מטבו את ריכוז החלבון והצבע לקבלת האות המרבי לרעש של אות פלואורסצנטי.
    הערה: SYPRO Orange אינו תואם לחלבונים ותוספים מסוימים כגון דטרגנטים11,30. ניתן לבדוק צבעים חיצוניים נוספים המפורטים ב-12 לפי הצורך.

2. קביעת ריכוז הצבע האופטימלי (איור 2A)

  1. הכינו דילולים של 20 μL של 50x, 40x, 30x, 20x ו-10x SYPRO Orange מתמיסת המלאי, המסופקת ב-5,000x ב-DMSO.
  2. יש לחלק 8 μL של חלבון 6.25 מיקרומטר המדולל במאגר TSA לשש בארות נפרדות של צלחת PCR של 384 בארות.
    הערה: בדוגמה שלנו, השתמשנו במאגר TSA הבא כדי לבצע את הדילולים: 10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl ו- 1 mM DTT. ניתן להריץ דגימות בשלוש כדי לשפר את אמינות התוצאות.
  3. הוסף 1 μL של חיץ TSA לכל באר.
    הערה: נפח חיץ זה יוחלף בתוספת של מולקולות קטנות לאחר אופטימיזציה של צבע וריכוז חלבון.
  4. הוסף 1 μL מכל דילול סדרתי של תמיסת צבע SYPRO Orange לכל באר. הוסף 1 μL של חיץ ללא צבע לבאר הסופית עבור שליטה ללא צבע.
  5. מכסים את הצלחת בסרט דבק אופטי שקוף.
  6. סובבו לזמן קצר את הצלחת במהירות של 1,000 × גרם למשך דקה אחת בצנטריפוגה המצוידת במתאם לוחית PCR.
  7. הניחו את הצלחת במכשיר RT-PCR והתחילו את פרוטוקול התרמו-מחזור המתואר בשלב 1.1.

3. קביעת ריכוז החלבון האופטימלי (איור 2B)

  1. הכינו 20 μL של דילולים טוריים של 25 μM, 12.5 μM, 6.25 μM, 3.125 μM ו-1.56 μM של חלבון באמצעות מאגר TSA (10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl ו-1 mM DTT).
  2. יש לחלק 8 מיקרוליטר של דילול סדרתי של החלבון לחמש בארות נפרדות של צלחת בת 384 בארות.
  3. יש לחלק חיץ רקב-6 וגם בקרה ללא חלבון.
  4. הוסף 1 μL של חיץ TSA לכל באר.
    הערה: נפח חיץ זה יוחלף בתוספת של מולקולות קטנות לאחר אופטימיזציה של צבע וריכוז חלבון.
  5. הוסף 1 μL מכל תמיסת צבע תפוז 50x SYPRO לכל באר.
  6. מכסים את הצלחת בסרט דבק אופטי שקוף.
  7. סובב לזמן קצר את הצלחת במהירות של 1,000 × גרם למשך דקה אחת בצנטריפוגה המצוידת במתאם לוחית PCR.
  8. הניחו את הצלחת במכשיר RT-PCR והתחילו את פרוטוקול התרמו-מחזור המתואר בשלב 1.1.

4. הגדרת ניסוי TSA (איור 3A)

הערה: לאחר אופטימיזציה של ריכוזי החלבון והצבע הכתום SYPRO, ניתן לבצע את הבדיקה בתוספת המולקולות הקטנות הרצויות לניתוח הקשירה.

  1. הגדר את מספר התנאים על ידי התחשבות בעותקים המשוכפלים ובבקרות המתאימות.
    הערה: לדוגמה, נבדוק את הכריכה של SelO לשמונה תנאים במשולש. כולל קבוצת הביקורת (ללא תוסף, ללא חלבון וללא צבע), יש לנו 11 תגובות x 3 (משולש) = 33 תגובות בסך הכל.
  2. בהתבסס על הריכוז האופטימלי של חלבון וצבע שנצפה עבור SelO, ודא שכל תגובה מכילה 8 μL של חלבון 6.25 μM, 1 μL של תוספת, ו 1 μL של 50x צבע כתום SYPRO עבור נפח תגובה כולל של 10 μL. לפיכך, הריכוז הסופי המשמש הוא חלבון 5 מיקרומטר וצבע כתום 5x SYPRO.
  3. הכן 288 μL של תמיסת חלבון 6.25 מיקרומטר באמצעות מאגר TSA. נפח זה של תמיסת עבודה חלבונית מהווה 36 תגובות (33 תגובות עם תוספת של 10% עבור וריאציות בפיפט).
  4. יש לפזר 8 μL של חלבון 6.25 מיקרומטר לבארות נפרדות של צלחת 384 בארות. יש לחלק את החיץ רק עבור בקרה ללא חלבון.
  5. הוסף 1 μL של מולקולות קטנות בריכוז 10x כדי להשיג 1x סופי. כדי לעקוב אחר דוגמה זו, הוסף 1 μL של 20 mM MgCl2 כדי להשיג ריכוז סופי של 2 mM. יש לחלק מאגר רק עבור הבקרה ללא תוספים.
  6. הוסף 1 μL מכל תמיסת צבע תפוז 50x SYPRO לכל באר.
  7. מכסים את הצלחת בסרט דבק אופטי שקוף.
  8. סובב לזמן קצר את הצלחת במהירות של 1,000 × גרם למשך דקה אחת בצנטריפוגה המצוידת במתאם לוחית PCR.
  9. הניחו את הצלחת במכשיר RT-PCR והתחילו את פרוטוקול התרמו-מחזור המתואר בשלב 1.1.

5. ניתוח נתונים

  1. ייצוא נתונים ממכשיר RT-PCR עבור יחידות פלואורסצנטיות יחסיות (RFU) ביחס לטמפרטורה (°C).
  2. השתמש בתוכנה הנבחרת כדי לחלץ ולהתוות נקודות נתונים עד לעוצמה הגבוהה ביותר שנמדדה עבור כל עקומת התכה. חשוב לציין כי בקרות ללא חלבון וללא צבע מציגות פלואורסצנטיות רקע נמוכה ללא עלייה תלוית טמפרטורה בפלואורסצנטיות (איור 3A,B וטבלה משלימה S1). בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנות נגישות באופן חופשי כגון MoltenProt31 או DSFWorld32.
  3. קבע את טמפרטורת ההתכה באמצעות Boltzmann Sigmoidal Fit עבור הנתונים. טמפרטורת ההתכה (Tm) מוגדרת כטמפרטורה שבה נצפית דנטורציה של 50% או חצי עוצמה מקסימלית (איור 3C).
  4. שינוי תרמי בעקומת ההיתוך עשוי להצביע על ייצוב או ערעור של תוספים. כדי לחשב את השינוי בטמפרטורת ההתכה (Tm), השתמש בנוסחה: Tm = Tm additive- Tm buffer. ערך חיובי מתאר מצב מייצב או תוסף אינטראקציה; ערך שלילי מתאר מצב מערער יציבות (איור 3D).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SelO אאוקריוטי מורכב מרצף מיקוד מיטוכונדריאלי N-טרמינלי, תחום דמוי קינאז, וסלנוציסטאין שמור מאוד במסוף C של החלבון23. אנזים תושב מיטוכונדריה זה מקודד תחום פסאודוקינאז הנשמר מחיידקים לבני אדם23. ניתוח מבני של הומולוג SelO ממזרקי Pseudomonas גילה שינויים בחומצות אמינו באתר הפעיל המאפשרים קשירה של ATP בכיוון הפוך בהשוואה לקינאזות קנוניות25. בהתאם לכך, SelO מזרז AMPylation, במקום זרחון, של חלבונים מרובים המעורבים באיתות נוגד חמצון כדי להגן על התאים מפני נזק חמצוני ומוות תאים25. בנוסף לאמפילציה, הודגם כי אמפילאזות פרוקריוטיות ואיקריוטיות מסוימות מזרזות UMPylation27,28.

השתמשנו רקומביננטי מטוהר E. coli SelO ב TSA כדי לבחון את הקישור של נוקלאוטידים ATP ו UTP ל SelO בנוכחות קטיונים divalent. בדומה לקינאזות קנוניות, SelO מכיל את מוטיב DFG שבו האספרטט קושר את יון המתכת כדי לתאם נוקלאוטיד באתר הפעיל. ראשית, ביצענו אופטימיזציה של ריכוז החלבון והצבע למדידות פלואורסצנטיות חזקות ב-TSA, וקבענו כי 5 מיקרומטר עד 10 מיקרומטר E. coli SelO היה אופטימלי עם 5x SYPRO Orange (איור 2). יתר על כן, הראינו כי ללא חלבון, כמו גם בקרות ללא צבע, היה אות פלואורסצנטי נמוך שלא היה מגיב לעליית הטמפרטורה. זיהינו עליות של +4°C ו-+12°C ביציבות התרמית של E. coli SelO בנוכחות ATP-Mg2+ ו-ATP-Mn2+, בהתאמה (איור 3). עם זאת, לא ראינו שינוי ביציבות התרמית בעת הדגירה עם UTP, מה שמצביע על כך שאי קולי SelO עשוי שלא להציג קשירה ניתנת לזיהוי ל- UTP.

figure-results-1
איור 1: הגדרת thermocycler. דוגמה לתוכנית thermocycler המשמשת להגדלת טמפרטורת הדגימה ב +0.5 ° C / min בעת מדידת פלואורסצנטיות SYPRO Orange באמצעות ערוץ FERET. ההמלצה כוללת גם דגירה של טמפרטורת הסביבה בתחילת הפרוטוקול ובסופו. קיצור: FRET = העברת אנרגיית תהודה Förster. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אופטימיזציה של ריכוזי חלבונים וצבעים. (A) תוצאות מייצגות של מיטוב ריכוז הצבע התפוז SYPRO באמצעות 5 מיקרומטר Escherichia coli SelO. (B) תוצאות מייצגות של מיטוב ריכוז E. coli SelO באמצעות צבע כתום 5x SYPRO. עקומת דנטורציה תרמית מתארת יחידות פלואורסצנטיות יחסיות (ציר Y) ביחס לטמפרטורה (ציר x). התוצאות מייצגות ממוצע ± SD מבארות משולשות (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: עקומות דנטורציה תרמית ואנליזות ΔTm של SelO בנוכחות נוקלאוטיד וקטיונים דו-ערכיים. (A) נתונים גולמיים של עקומות דנטורציה תרמית של דגימות (5 מיקרומטר Escherichia coli SelO בנוכחות 200 מיקרומטר ATP או UTP וקטיונים דו-ערכיים של 2 מיקרומטר, 5x SYPRO Orange) שיוצאו ממכונת RT-PCR ושורטטו. SelO ATP-Mg מייצג דגימות עם SelO, ATP ו- MgCl2, SelO ATP-Mn מייצג דגימות עם SelO, ATP ו- MnCl2, SelO UTP-Mg מייצג דגימות עם SelO, UTP ו- MgCl2, SelO UTP-Mn מייצג דגימות עם SelO, UTP ו- MnCl2. שימו לב שהבקרות ללא צבע וללא חלבון מציגות פלואורסצנטיות נמוכה. התוצאות מייצגות ממוצע ± SD מבארות משולשות (n = 3). (B) עקומות דנטורציה תרמית המשורטטות לעוצמה הגבוהה ביותר ומתאימות למשוואה הסיגמואידית של בולצמן. למרות שדנטורציה תרמית של SelO לא הושפעה מ-UTP, ראינו שינוי ניכר בדנטורציה תרמית בנוכחות ATP (עקומות סגולות). התוצאות מייצגות ממוצע ± SD מבארות משולשות (n = 3). (C) היסטוגרמה המתארת ערכי Tm כפי שנגזרו מההתאמה הסיגמואידלית של בולצמן לנתונים המיוצגים באיור 3B. התוצאות מייצגות ממוצע ± SD מבארות משולשות (n = 3). SelO 39.2 °C ± 0.085, SelO ATP-Mg 43.3 °C ± 0.133, SelO ATP-Mn 50.9 °C ± 0.085, SelO UTP-MG 39.1 °C ± 0.056, SelO UTP-MN 39.9 °C ± 0.087. (D) היסטוגרמה המתארת את השינוי בטמפרטורת ההתכה ΔTm (תוסף Tm - Tm buffer). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה S1: נתונים לדוגמה עבור TSA של SelO בנוכחות מתכות ונוקלאוטידים. גיליון אלקטרוני של נתונים גולמיים המיוצאים ממחשב RT-PCR, ונתונים המעובדים כדי למחוק ערכים לאחר עוצמת RFU מרבית כמתואר בשלבי פרוטוקול 5.1 ו- 5.2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת השינוי התרמי (TSA) משמשת כשיטה יעילה לסינון אינטראקציות חלבון-ליגנד, כולל אלה עם גורמים משלימים ומעכבים. בפרוטוקול זה, השתמשנו ב-TSA כדי למדוד את הקישור של הפסאודוקינאז SelO לנוקלאוטידים ולקטיונים דו-ערכיים. הממצאים שלנו מראים כי SelO מציג יציבות תרמית מוגברת בנוכחות ATP ו- Mg2+/Mn2+. תצפית זו מתיישבת עם דיווחים קודמים שהצביעו על כך שהומולוגים SelO מ- E. coli, S. cerevisiae ו- H. sapiens מזרזים את העברת AMP מ- ATP לשרשרת הצד ההידרוקסיל של מצעי חלבון25,29. למרות ש-TSA מספק תובנות חשובות לגבי קשירת נוקלאוטידים, ייתכן שהוא לא יזהה את המצע in vivo. מולקולות אחרות, לא רק המצע, יכולות גם הן להשפיע על היציבות התרמית של חלבון. כדי לזהות במדויק מצע, יש לקחת בחשבון גורמים כגון ריכוז תאי וזיקה קשירה. עם זאת, TSA הוא כלי מצוין לסינון מגוון רחב של תנאים, כגון קשירה של מולקולות קטנות, באמצעות ייצוב תרמי כקריאה.

התועלת של TSA משתרעת מעבר ליישומה בניתוח קשירת מולקולות קטנות לאתרים פעילים או רגולטוריים של חלבונים. TSA תרם באופן משמעותי לאפיון ביופיזי של חלבונים על ידי מתן תנאים מייצבים שהופכים את החלבון לתורם יותר לניסויי קריסטלוגרפיה. יש לציין כי TSA מציעה מספר יתרונות, כולל ההתקנה הפשוטה שלה ויכולות התפוקה הגבוהה שלה באמצעות חומרי מעבדה זמינים בדרך כלל כגון לוחות PCR ומכונות RT-PCR. יתרונות אלה מאפשרים בדיקה של תנאים רבים שעשויים להיות לא ישימים או פשוטים עם טכניקות אחרות. מחקרים רבים השתמשו ב- TSA כדי למדוד את היציבות התרמית של חלבונים רקומביננטיים עם ספרייה של תרכובות כדי לקבוע את התנאים האופטימליים להתגבשות חלבונים19,33.

הכללת בקרות מתאימות נחוצה כדי למנוע פרשנות שגויה של עקומות התכה, כאשר אוטופלואורסצנטיות מהלוחות או התוספים היא דאגה נפוצה. TSA עשוי שלא להתאים לתרכובות המציגות אוטופלואורסצנטיות או להרוות את הפלואורסצנטיות של תפוז SYPRO. פתרון אפשרי הוא לסנן צבעים חלופיים המתוארים ב-12. פרוטוקול TSA המתואר כאן יכול להיות מותאם בקלות עבור חלבונים אחרים ותוספים מעניינים. התוספים אינם מוגבלים אך ורק לתרכובות מסיסות במים, כפי שמודגם בפרוטוקול שלנו עם נוקלאוטידים וקטיונים דו-ערכיים. במקום זאת, תוספים יכולים להקיף מגוון רחב של מצבים כגון pH משתנה, ליגנדות, או תרופות המסיסות ב- DMSO8. יתר על כן, דגירה מוקדמת של הליגנד עם החלבון עשויה לספק תוצאות ניתנות לשחזור יותר על ידי הפחתת הפרעות וממצאים מהצבע. תוספים כגון שומנים ודטרגנטים עלולים להוביל לפלואורסצנטיות גבוהה בשל האינטראקציות שלהם עם SYPRO Orange. דוגמה לעקומת דנטורציה מוצגת באיור 3A , אשר מתאר פלואורסצנטיות רקע נמוכה בשילוב עם עלייה משמעותית בפלואורסצנטיות בעת דנטורציה תרמית של החלבון. הריכוז האופטימלי של צבע וחלבון יניב את יחס האות לרעש המרבי תוך שמירה על אות פלואורסצנטי עקבי בכל העותקים המשוכפלים.

TSA מציעה את היתרון של פשטות עם המרכיבים המינימליים שלה, ובכך להפחית את מספר המשתנים לאופטימיזציה. צעדים קריטיים כוללים קביעת הריכוזים האופטימליים הן של הצבע והן של החלבון. חשוב לציין כי TSA דורש חלבון מטוהר, "מתנהג היטב". החלבון והתוסף חייבים להיות יציבים במאגר בריכוזים המשמשים ב- TSA. חלבונים או תנאים המועדים לצבירה או אוליגומריזציה עלולים לגרום לקריאות פלואורסצנטיות שגויות. חלבונים מצטברים או לא מקופלים עשויים להציג פלואורסצנטיות גבוהה בתחילה עם עלייה קטנה בלבד בעת דנטורציה. אוליגומריזציה של חלבונים יכולה גם לגרום למצבי מעבר מרובים, מה שמסבך את ניתוח10. ניתן לכוונן את ריכוז החלבון כדי למנוע צבירה.

TSA תואם למגוון רחב של מאגרים ומלחים, ומאפשר אופטימיזציה של תנאי הייצוב של החלבון והתוסף11. ניתן להתאים את נפחי החלבונים ותמיסות התוספים כדי להתגבר על מגבלות ריכוזי החלבונים והתוספים. לדוגמה, ניתן להשתמש בריכוזים נמוכים יותר של תוסף כגון 5x במקום בתמיסה 10x המשמשת בתוצאות המייצגות. יש לציין כי הכמות היחסית של חלבון ותוסף הנדרשים לביצוע הבדיקה נמוכה מכיוון שלוחות PCR של 384 בארות יכולים להכיל נפחים נמוכים של 10 מיקרוליטר מכלל הדגימה.

בהתחשב בחוזקות של TSA, הוא אידיאלי לחקר חלבונים שלא נחקרו כראוי כגון pseudokinases. פסאודואנזימים הם חלבונים לא פעילים קטליטית שהם הומולוגיים מבחינה מבנית לאנזימים פעילים34. מחקרים מבניים וביוכימיים שנערכו לאחרונה הראו כי כמה פסאודו-אנזימים הם אנזימים פעילים, בעוד שלרובם יש פונקציות לא קטליטיות35,36. למרות שאינם פעילים מבחינה קטליטית, פסאודו-אנזימים מעורבים במחלות שונות וממלאים תפקידים חשובים, כולל פיגומים ומודולציה אלוסטרית37. עם זאת, מנגנון הפעולה והמשמעות התפקודית של פסאודו-אנזימים רבים אינם ידועים. פעילותם של כמה פסאודו-אנזימים מווסתת על ידי קשירת ליגנד, מה שמביא ליציבות תרמית מוגברת הקשורה לשינויים קונפורמטיביים של החלבון14. אנו מציעים כי TSA הוא כלי רב ערך לבחינת הקישור של ליגנדים לפסאודואנזימים כדי לקבוע את הליגנד האופטימלי לפעילות פונקציונלית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.S. הוא W.W. Caruth, Jr. Scholar במחקר ביו-רפואי, מניעת סרטן ומכון המחקר של טקסס (CPRIT) מלגאי, ומרכז צ'ארלס וג'יין פאק למטבוליזם מינרלי ומחקר קליני מלגאי. עבודה זו נתמכה על ידי NIH Grant K01DK123194 (A.S.), CPRIT Grant RR190106 (A.S.), Welch (I-2046-20200401) ו-Welch (I-2046-20230405).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אדנוזין 5&פריים;-טריפוספט דיסודיום מלח הידרטסיגמא אולדריץ'A2383-10Gמשמש לתוצאות מייצגות אך אינו נדרש לביצוע TSA
Avanti J-15R עם מכלול מנשא מיקרופלייטבקמן קולטרC19416
CFX Opus 384 מערכת PCR בזמן אמתBio-Rad12011452
מעטפת קשיחה 384 בארות PCR צלחות PCR, דופן דקה, חצאית, שקופה/לבנהBio-RadHSP3805
מגנזיום כלורידסיגמא אולדריץ'M8266-100Gמשמש לתוצאות מייצגות אך אינו נדרש לביצוע TSA
מנגן (II) כלוריד טטרהידרטסיגמא אולדריץ'M3634-500Gהמשמש לתוצאות מייצגות אך אינו נדרש לביצוע
סרט איטום צלחת TSA Microseal 'B' PCR, דבק,ביו-ראדאופטי MSB1001
כתם ג'ל חלבון כתום SYPROסיגמא אולדריץ'S5692-500UL
אורידין 5&פריים;-טריפוספט מלח טריסודיום הידרטסיגמא אולדריץ'U6625-100MGמשמש לתוצאות מייצגות אך אינו נדרש לביצוע TSA

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dunham, I. Human genes: Time to follow the roads less traveled. PLoS Biol. 16 (9), e3000034(2018).
  2. Kustatscher, G., et al. An open invitation to the understudied proteins initiative. Nat Biotechnol. 40 (6), 815-817 (2022).
  3. Jones, M. M., et al. The structural genomics consortium: A knowledge platform for drug discovery: A summary. Rand Health Q. 4 (3), 19(2014).
  4. Oberg, N., Zallot, R., Gerlt, J. A. Efi-est, efi-gnt, and efi-cgfp: Enzyme function initiative (efi) web resource for genomic enzymology tools. J Mol Biol. 435 (14), 168018(2023).
  5. Pace, C. N., Mcgrath, T. Substrate stabilization of lysozyme to thermal and guanidine hydrochloride denaturation. J Biol Chem. 255 (9), 3862-3865 (1980).
  6. Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).
  7. Huynh, K., Partch, C. L. Analysis of protein stability and ligand interactions by thermal shift assay. Curr Protoc Protein Sci. 79, 21-28 (2015).
  8. Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).
  9. Wu, T., et al. Conformationally responsive dyes enable protein-adaptive differential scanning fluorimetry. bioRxiv. , 10.1101/2023.01.23.525251 (2023).
  10. Wu, T., et al. Protocol for performing and optimizing differential scanning fluorimetry experiments. STAR Protoc. 4 (4), 102688(2023).
  11. Gao, K., Oerlemans, R., Groves, M. R. Theory and applications of differential scanning fluorimetry in early-stage drug discovery. Biophys Rev. 12 (1), 85-104 (2020).
  12. Hawe, A., Sutter, M., Jiskoot, W. Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization. Pharm Res. 25 (7), 1487-1499 (2008).
  13. Lucet, I. S., Murphy, J. M. Characterization of ligand binding to pseudokinases using a thermal shift assay. Methods Mol Biol. 1636, 91-104 (2017).
  14. Murphy, J. M., et al. A robust methodology to subclassify pseudokinases based on their nucleotide-binding properties. Biochem J. 457 (2), 323-334 (2014).
  15. Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. Thermal denaturation assays in chemical biology. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 128-136 (2012).
  16. Lo, M. C., et al. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery. Anal Biochem. 332 (1), 153-159 (2004).
  17. Bai, N., Roder, H., Dickson, A., Karanicolas, J. Isothermal analysis of thermofluor data can readily provide quantitative binding affinities. Sci Rep. 9 (1), 2650(2019).
  18. Vivoli, M., Novak, H. R., Littlechild, J. A., Harmer, N. J. Determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry. J Vis Exp. (91), e51809(2014).
  19. Vedadi, M., et al. Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (43), 15835-15840 (2006).
  20. Taujale, R., et al. Informatic challenges and advances in illuminating the druggable proteome. Drug Discov Today. 29 (3), 103894(2024).
  21. Bailey, F. P., Byrne, D. P., Mcskimming, D., Kannan, N., Eyers, P. A. Going for broke: Targeting the human cancer pseudokinome. Biochem J. 465 (2), 195-211 (2015).
  22. Kung, J. E., Jura, N. Prospects for pharmacological targeting of pseudokinases. Nat Rev Drug Discov. 18 (7), 501-526 (2019).
  23. Dudkiewicz, M., Szczepinska, T., Grynberg, M., Pawlowski, K. A novel protein kinase-like domain in a selenoprotein, widespread in the tree of life. PLoS One. 7 (2), e32138(2012).
  24. Han, S. J., Lee, B. C., Yim, S. H., Gladyshev, V. N., Lee, S. R. Characterization of mammalian selenoprotein o: A redox-active mitochondrial protein. PLoS One. 9 (4), e95518(2014).
  25. Sreelatha, A., et al. Protein ampylation by an evolutionarily conserved pseudokinase. Cell. 175 (3), 809-821 (2018).
  26. Frese, M., et al. The alarmone diadenosine tetraphosphate as a cosubstrate for protein ampylation. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (8), e202213279(2023).
  27. Mostert, D., et al. Pronucleotide probes reveal a diverging specificity for ampylation vs umpylation of human and bacterial nucleotide transferases. Biochemistry. 63 (5), 651-659 (2024).
  28. Yang, Y., et al. The ydiu domain modulates bacterial stress signaling through Mn2+-dependent umpylation. Cell Rep. 32 (12), 108161(2020).
  29. Mukherjee, M., Sreelatha, A. Identification of selenoprotein o substrates using a biotinylated atp analog. Methods Enzymol. 662, 275-296 (2022).
  30. Kroeger, T., et al. Edta aggregates induce sypro orange-based fluorescence in thermal shift assay. PLoS One. 12 (5), e0177024(2017).
  31. Kotov, V., et al. In-depth interrogation of protein thermal unfolding data with moltenprot. Protein Sci. 30 (1), 201-217 (2021).
  32. Wu, T., Gale-Day, Z. J., Gestwicki, J. E. Dsfworld: A flexible and precise tool to analyze differential scanning fluorimetry data. Protein Sci. 33 (6), e5022(2024).
  33. Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. Optimization of protein buffer cocktails using thermofluor. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69, Pt 2 209-214 (2013).
  34. Ribeiro, A. J. M., et al. Emerging concepts in pseudoenzyme classification, evolution, and signaling. Sci Signal. 12 (594), eaat9797 (2019).
  35. Goldberg, T., Sreelatha, A. Emerging functions of pseudoenzymes. Biochem J. 480 (10), 715-728 (2023).
  36. Pon, A., Osinski, A., Sreelatha, A. Redefining pseudokinases: A look at the untapped enzymatic potential of pseudokinases. IUBMB Life. 75 (4), 370-376 (2023).
  37. Murphy, J. M., Mace, P. D., Eyers, P. A. Live and let die: Insights into pseudoenzyme mechanisms from structure. Curr Opin Struct Biol. 47, 95-104 (2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Thermal Shift AssaySelenoprotein OProtein AMPylationLigand BindingMelting TemperatureNucleotide BindingMetal BindingPseudokinase ActivityHigh Throughput ScreeningProtein Stability

מאמרים קשורים