מאמר שיטה

הכנת ספריית cDNA רגישה במיוחד לריצוף הדור הבא של מיקרו-רנ"א משלפוחיות חוץ-תאיות קטנות

DOI:

10.3791/67154

⸱

13 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health (HMH), 2Oncology department, Georgetown University, 3Department of Medicine B, Hadassah - Hebrew University Medical Center, 4EValuate Diagnostics LLC, 5Jersey Shore University Medical Center (JSUMC), 6Illumina Inc.

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מכילות מיקרו-RNA ספציפיים לתא המווסתים את התאים המקבלים, שזיהוים עשוי לשפוך אור על תפקודם ותפקידם כסמנים ביולוגיים. פרוטוקול הכנת ספריית ה-cDNA האופטימלי שלנו מציג ברקודים ייחודיים המאפשרים ריבוב דגימות ועיבוד משופר של רכבי EV עם קלט נמוך תוך שימוש בברקודים בעלי אינדקס כפול מזווג לתאימות עם רצפי Illumina.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים אחרונים מראים כי שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs), הנמצאות בכל הנוזלים הביולוגיים, ממלאות תפקידים קריטיים בתקשורת בין-תאית על ידי תיעול חלבונים, DNA ו-RNA. מיקרו-רנ"א (miRNAs) הארוזים ב-sEVs התגלו כרגולטורים קריטיים הניתנים למסירה בתאי מקבל. מכיוון ש-sEVs המופרשים על ידי תאים נורמליים וחולים נושאים מטעני miRNA שונים, מחקרי פרופיל sEV-miRNA אחרונים מצביעים על כך שהם עשויים לסייע בזיהוי סמנים ביולוגיים חדשים במחזור הדם. עם זאת, sEVs ספציפיים לתא/מחלה המסתובבים בנוזלים ביולוגיים מגוונים, לאחר בידודם, מספקים כמויות miRNA נמוכות, שבדרך כלל קשה לכמת באמצעות מתודולוגיות ספקטרומטריות קונבנציונליות. ריצוף RNA קטן שאינו מקודד מהדור הבא (NGS), המאפשר הגברה של רצפי miRNA משובטים, מציע הזדמנות יקרת ערך להעריך את מטעני ה-miRNA של sEVs. למרבה הצער, הליכי הכנת ספריית cDNA מסחריים דורשים לעתים קרובות כניסות RNA הרבה מעל הכמויות הבלתי ניתנות לכימות הזמינות מ-sEVs מבודדים.

לפיכך, בהתחשב בחוסן וביכולות הריבוב של הליך הכנת ספריית ה-cDNA הקיים שלנו (כלומר, מותאם בתחילה לניתוח של RNA משובץ פרפין קבוע בפורמלין (FFPE) בעל קלט נמוך, מושפל מאוד, קבוע פורמלין (FFPE), ביקשנו להעריך את תחולתו לניתוח של sEV miRNAs. חשוב לציין, בהתחשב בשיפורי האשכולות הטכניים האחרונים של שבבי ריצוף, ביקשנו להתאים את גישת ברקוד התמלול שלנו בתוך זרימת עבודה של הכנת ספריית cDNA תואמת אינדקס כפול כדי לשפר את יכולות הריצוף והריבוב שלנו. באמצעות RNA שהופק מ-8.4 ×-109 sEVs ב-16 שכפולים, ומירידה בכמויות של sEVs מ-1010 sEVs ל-2.5 ×-107 sEVs, הערכנו את יכולת השחזור והרגישות של מתודולוגיה זו. הנתונים מדגימים כי ברקודי ה-DNA של 16 3 אינץ' מאפשרים זיהוי רגיש וניתן לשחזור של פרופילי sEV-miRNA על פני חזרות תוך שימוש ב-3.15 pg של סך כל ה-RNA הקטן שאינו מקודד או 1.35 pg של miRNAs.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) הן חלקיקים בגודל ננומטר (בקוטר ~30-200 ננומטר) שמקורם בתאים עטופים בקרום דו-שכבתי פוספוליפידי, העובר בירושה מתא המקור שלהם ומגן בחוזקה על המטענים המולקולריים שלהם 1,2. מקובל היטב שכמעט כל התאים מייצרים ומשחררים sEVs לתא הבין-תאי, אשר בתורו ניתן לזהות ברוב הנוזלים הביולוגיים (כלומר, דם, שתן, רוק וכו')2,3,4. מחקרים אחרונים הראו כי המטענים המולקולריים העטופים ביציבות (כלומר, DNA, RNA, חלבונים, שומנים וכו')5,6,7 של sEVs, ברגע שהם במגע או נמסרים לתאים הנמענים, מתווכים תקשורת בין-תאית8. מאמצי המחקר הנוכחיים התמקדו בשיפור הבידוד של sEVs ספציפיים לתא מנוזלים ביולוגיים מגוונים, כדי לזהות ולנטר במדויק את המטענים המולקולריים הללו 9,10. בהתחשב בכך ש-sEVs מכילים RNA קטנים שאינם מקודדים ובמיוחד מיקרו-RNAs (miRNAs), השומרים על תפקודם הרגולטורי עם אספקה תאית, מחקרים רבים התמקדו בהערכת התועלת של miRNAs כסמנים ביולוגיים שיכולים לחשוף את מצב תא המקור שלהם 11,12,13.

מיקרו-רנ"א (miRNAs) מייצגים קבוצה גדולה (~2,000 ידועים בבני אדם) של רנ"א קטנים שאינם מקודדים בגדלים הנעים בין 19 ל-25 נוקלאוטידים (nt), הנקשרים לאתרים משלימים לא מושלמים באזורים הלא מתורגמים של מטרות ה-mRNA שלהם ומכוונים את הפירוק שלהם ו/או את הדיכוי שלאחר השעתוק14,15. מבחינה תפקודית, miRNAs תוארו כשולטים בתהליכים ביולוגיים רבים, ודה-ויסות של ביטוים נקשר לשינויים בתהליכים מולקולריים, ביוכימיים ופיזיולוגיים התורמים להתחלה והתפתחות של מחלות, כולל סרטן 16,17,18. חשוב לציין, מחקרים הראו שתאים חולים ובמיוחד תאים סרטניים, לא רק מבטאים באופן דיפרנציאלי miRNAs בהשוואה לתאים רגילים18, אלא שגם האריזה שלהם ל-sEVs שונהב-19,20.

בעוד שמספר מחקרים מתמקדים בביסוס התהליכים והמסלולים המולקולריים המכוונים את האריזה של sEVs בתאים נורמליים וחולים 19,21,22, מחקרי סמנים ביולוגיים מתמקדים כיום בזיהוי חתימות RNA ו/או miRNA קטנות שאינן מקודדות הניתנות להבחנה הארוזות ומופרשות על ידי תאים חולים/סרטניים ספציפיים באמצעות sEVs. בידוד ממוקד של sEVs ספציפיים לתאים חולים מנוזלים ביולוגיים אנושיים מגוונים והערכת המטענים המולקולריים הרב-אומיים שלהם עשויים לאפשר פיתוח בדיקות אבחון ופרוגנוסטיות לזיהוי לא פולשני של מחלות וסרטן אנושיים מגוונים 23,24,25,26. למרות ש-sEV-miRNAs הם התעתיקים הלא מקודדים הנחקרים ביותר, מיני RNA קטנים אחרים שאינם מקודדים (כלומר, איזופורמים של miRNA (isomiRs), piwiRNAs, מקטע RNA העברה (tRFs), rRNAs, RNA יתום שאינו מקודד (oncRNAs)...) מוערכים גם הם על התועלת הפוטנציאלית שלהם כסמנים ביולוגיים sEV במחזור, עם דגש ספציפי על זיהוי סוגי סרטן שונים 27,28,29,30,31,32.

יתרון, ניתוח ריצוף מהדור הבא (NGS) של תעתיקי RNA קטנים שאינם מקודדים (כולל miRNAs), לאחר הכנת ספריית הברקוד וה-cDNA שלהם, הוא אידיאלי לחקר מיני RNA קטנים שאינם מקודדים ידועים ו/או לא ידועים הכלולים ב-sEVs במחזור, שעשויים להיות קשורים למחלות27. ואכן, sEV small-RNA NGS מספק גישה בעלת תפוקה גבוהה לגילוי תעתיקי RNA קטנים שאינם מקודדים ספציפיים לתא שאחרת היו נשארים לא ידועים, אם היו מוערכים באופן גלובלי עם טכנולוגיות ספציפיות למטרה (כלומר, Multiplex PCR, מיקרו-מערכים, פאנלים מותאמים אישית וכו') 32,33,34. בהתחשב בכך שבעבר ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול הכנת ספריית cDNA רגיש במיוחד וניתן לשחזור מאוד, שפיתחנו לניתוח RNA משובץ פרפין קבוע פורמלין (FFPE)35,36, ביקשנו להתאים אותו לניתוח של RNA ו-miRNAs קטנים שאינם מקודדים עטופים בתוך sEVs 37,38,39,40.

עם הפסקת הייצור של מכשיר Illumina HiSeq2500, שסיפק לנו שנים של ניתוח miRNA חד-אינדקסי חד-צדדי באיכות גבוהה של מטעני sEV37,40, ביקשנו לחקור את יכולת השחזור והרגישות של הפרוטוקול שלנו כאשר הוא מותאם למכשירי ריצוף מעודכנים תוך שימוש בכימיה של אינדקס כפול מזווג כעת. מתוך כוונה לשמור על יכולות הריבוב של הפרוטוקול המקורי, שמרנו על 16 הברקודים הקיימים להכנת תעתיקי cDNA של RNA קטן לפני שילובם בכימיה כפולה מזווגת. באמצעות זוג ברקודים i5 ו-i7 בלבד, אנו מאפשרים הכנה של ספריית cDNA מבוססת מעבדה חזקה שבה עיבוד וניתוח בו-זמנית של עד 16 דגימות בודדות משפרים את יכולת השחזור האנליטי של sEV RNA בעל קלט נמוך. לפיכך, אנו מציגים את התהליכים הביוכימיים, הברקודים המעודכנים, פריימרים של PCR וסמני גודל, ושלבי הבידוד הדרושים ליצירת ספריות cDNA הניתנות לשחזור באמצעות כמויות נמוכות במיוחד של miRNAs המבודדים מ-sEVs פלזמה אנושית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. כל הריאגנטים והאוליגונוקלאוטידים מוכנים באופן הבא:

הערה: כל הנוקלאוטידים המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים באיור 1 ובקובץ משלים 1 בריכוזים המשמשים ליישום פרוטוקול זה. ראה קובץ משלים 2 לרצפי פריימר.

  1. הכינו תמיסת מלאי של קוקטייל כיול, שישמש בכל קשירה בודדת כבקרה לתגובות האנזימטיות השונות:
    1. השהה מחדש את האוליגונוקלאוטיד הנשא (0.5 מיקרומטר) (קובץ משלים 1) עם מים נטולי RNase.
    2. שלב את 10 הכיולים (10 μL כל אחד, קובץ משלים 1) לתוך שפופרת יחידה של 1.5 מ"ל כדי להגיע למלאי של 100 מיקרומטר, דלל אותו באמצעות האוליגונוקלאוטיד הנשא כדי להגיע לתמיסה של 0.0052 ננומטר, ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס.
  2. השעו מחדש כל אחד מ-17 מתאמי ה-3' הייחודיים (16 מתאמי ברקוד ניסיוניים ומתאם ברקוד בדיקה אחד) (איור 1A) עם מים נטולי נוקלאז בריכוז של 50 מיקרומטר.
    הערה: כל מתאם מועבר לצינורות בודדים המכילים 2.5 מיקרוליטר לאחסון ב-80 מעלות צלזיוס למשך עד שנתיים, כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה של המלאי הגדול יותר.
  3. השעו מחדש את האוליגונוקלאוטידים הניסיוניים השונים של RNA, כולל נושא מיצוי ה-RNA (קובץ משלים 1), נושא קשירת RNA 3' (קובץ משלים 1), בדיקת קשירת RNA (קובץ משלים 1), וקשירה 3' (קובץ משלים 1; מתאם 19 nt-3' ומתאם 24 nt-3') וקשירה 5' (קובץ משלים 1; מתאם 5'adapter-19 nt-3'מתאם ומתאם 5'adapter-24 nt-3'), ל-250 ננוגרם/מיקרוליטר.
  4. לדלל את מתאם 5' מטוהר HPLC ל-100 μM במים נטולי נוקלאז (איור 1A).
  5. השעו מחדש את ה-RT ואת הפריימרים הראשונים של PCR 5' ו-3' RT/PCR ל-100 μM עם מים נטולי נוקלאז (איור 1B).
  6. השעו מחדש את האוליגונוקלאוטידים השניים של PCR 5' ו-3' PCR i7 ו-i5 ל-100 מיקרומטר עם מים נטולי נוקלאז (איור 1B).
    הערה: בחר כל פריימר DNA עד 10 ניסויים ואחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  7. הכן צבע טעינת ג'ל פוליאקרילאמיד (PAA), ערבב והוציא 1 מ"ל לצינורות ואחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    1. הכן תמיסה של 0.5 M Na2H2 EDTA על ידי הוספת 18.6 גרם של Na2H2 EDTA ל-50 מ"ל מים נטולי נוקלאז. הוסף כדורי NaOH לאט לתמיסת Na2H2 EDTA המוכנה כדי להגיע ל-pH של 8.0. השלימו את הנפח עד 100 מ"ל באמצעות ddH2O כדי לקבל תמיסת מלאי של 0.5 M Na2H2 EDTA (pH 8.0)
    2. שקלו 15 מ"ג של ברומופנול כחול לתוך שפופרת של 15 מ"ל, השעו מחדש את האבקה ב-600 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז, הוסיפו 14.25 מ"ל של פורממיד נטול יונים. לבסוף, הוסף 150 מיקרוליטר של תמיסת 0.5 M Na2H2 EDTA, pH 8.0. יש לחלק את תמיסת ה-PAA הסופית לצינורות של 1 מ"ל ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    3. הכן את צבע טעינת הג'ל 5x אגרוז.
      1. שקלו והמיסו 1.86 גרם של Na2H 2-EDTA ב-50 מ"ל מים נטולי RNase והתאימו את ה-pH ל-8.0 על ידי הוספת כדורי NaOH. הוסף מים ללא RNase ל-100 מ"ל כדי לקבל פתרון 50 mM Na2H2 EDTA.
      2. ל -5 מ"ל של 50 מ"מ Na2H2 EDTA, הוסף 20 מ"ג של ברומופנול כחול, 20 מ"ג של קסילן ציאנול FF ו-2 גרם של Ficoll type-400. מערבולת את הצינור המכיל את שלושת הצבעים כדי לערבב ולהוסיף 5 מ"ל נוספים של 50 מ"מ Na2H2 EDTA. Aliquot צינורות בודדים של 1 מ"ל של צבע טעינת ג'ל אגרוז 5x ואחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

2. הכנת דגימות ה-EV RNA

  1. לאחר הבידוד של sEVs, העריכו את המורפולוגיה שלהם באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM; איור 2), ריכוז באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA; איור 3), והתפלגות חלבון פני השטח באמצעות ננו-הדמיה ברזולוציה גבוהה (איור 4), או טכנולוגיית כימות sEV מקבילה.
  2. יש להקצות מספר שווה ערך של sEVs בצינורות שונים, להוסיף RNase-A (12.5 מיקרוגרם/מ"ל) ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
  3. התחל מיצוי של RNA קטנים שאינם מקודדים, כולל miRNAs, מ-sEVs באמצעות ערכת מיצוי RNA קטן והתחל בידוד פאזה של RNA.
  4. הפרד את השלב המימי התחתון של מאגר הליזה של RNA, הוסף אותו לצינור חדש ולאחר מכן הוסף 4 ננוגרם של אוליגונוקלאוטיד נושא RNA (קובץ משלים 1) לכל דגימת RNA, לפני ביצוע בידוד עמודות בהתאם להוראות היצרן.
  5. ואקום מהיר של כל דגימת RNA בודדת ל-9.5 מיקרוליטר כדי להתחיל את פרוטוקול הכנת ספריית ה-cDNA.

3. הגדר קשירה של מתאם הברקוד 3' עם 16 דגימות RNA ודגימת בדיקה אחת

  1. זהה 16 דגימות sEV-RNA בודדות, צרף אותן ב-9.5 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגות סיליקון של 1.5 מ"ל, והנח אותן על קרח לפחות 10 דקות לפני תחילת הניסויים.
  2. הכן את מאגר ה-10x RNA Ligase (ללא ATP) טרי לפני הניסוי.
    1. בשפופרת סיליקון של 1.5 מ"ל, שלב 343 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפולים נטולי נוקלאז (ddH2O), 500 מיקרוליטר של 1 M Tris pH 7.5, 100 מיקרוליטר של 1 M MgCl2, 50 מיקרוליטר של 20 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר, ו-7 מיקרוליטר של 14 M 2-מרקפטואתנול.
    2. מערבבים את התמיסה על ידי החלקת הצינור, צנטריפוגה למשך 2 שניות ב-2,000 × גרם בטמפרטורת החדר (RT) על צנטריפוגה שולחנית, ולאחר מכן מניחים על קרח.
      הערה: כל השלבים המתארים "צנטריפוגה למשך 2 שניות" נעשים כולם עם מיקרוצנטריפוגה ב-RT במהירות שאינה גבוהה מ-2,000 × גרם.
  3. הפשירו את קוקטייל הכיול של 0.0052 ננומטר על ידי הנחת הצינור על קרח למשך 10 דקות.
  4. הכן את תערובת המאסטר של קשירה ל-18 תגובות בשפופרת סיליקון של 1.5 מ"ל על ידי שילוב של 40 מיקרוליטר של מאגר RNA Ligase 10x, 10 מיקרוליטר של קוקטייל כיול של 0.0052 ננומטר ו-40 מיקרוליטר של ddH2O ללא נוקלאז.
  5. החלק וסובב את צינור ה-1.5 מ"ל והנח אותו על קרח.
  6. הוסף 4.5 מיקרוליטר של תערובת מאסטר קשירה לכל אחת מ-16 דגימות ה-sEV RNA המצוטטות בנפרד, ותגובת קשירת הבדיקה המכילה 100 ננוגרם של אוליגונוקלאוטיד בדיקת קשירת RNA (קובץ משלים 1) שצוין בעבר ובנפח של 9.5 מיקרוליטר. יש לערבב ולסובב את הצינורות לפני שמניחים אותם בחזרה על הקרח.
  7. העבירו את 16 הדגימות ותגובת הבדיקה לגוש חום למשך דקה אחת ב-90 מעלות צלזיוס והעבירו בחזרה לקרח.
  8. העבירו בנפרד 4 מיקרוליטר של 50% PEG לכל צינור, החליקו כדי לערבב וסובבו את הצינורות לפני הנחתם בחזרה על הקרח.
  9. הפשירו 2.5 מיקרוליטר מכל אחד מ-17 המתאמים הברקודים בגודל 3 אינץ' (16 ניסיוניים (#1 עד #16) ומתאם הבדיקה (#17)) והניחו על הקרח להפשרה.
  10. העבירו 1 מיקרוליטר מכל אחד מ-17 המתאמים ל-16 הדגימות המתאימות המכילות sEV-RNA ודגימת בדיקה אחת, עם Ligation Master Mix (כלומר, 4.5 מיקרוליטר), ו-50% PEG (כלומר, 4 מיקרוליטר).
    הערה: כל התמיסות והתגובות מעורבבות על ידי סיבוב הצינורות וסיבובם, במקום לזרוק את התמיסות למעלה ולמטה, כדי למנוע אובדן חומר.
  11. הכן את אנזים הקשירה המדולל T4 RNA Ligase 2 קטום K227Q על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של האנזים עם 10 מיקרוליטר של ddH2O נטול נוקלאז לתוך צינור סיליקון חדש של 1.5 מ"ל.
  12. העברת 1 מיקרוליטר של אנזים קשירת K227Q מדולל T4 RNA Ligase 2 לכל אחד מ-17 הצינורות (16 דגימות RNA ניסיוניות ו-1 מבחן). אין לזרוק פיפטות למעלה ולמטה, להחליף קצוות בין כל צינור, לשמור את הצינורות על קרח, לערבב, לצנטריפוגה ולהניח את הצינורות על קרח.
  13. הנח את הקשרים על קרח טרי במחזיק צינור בדלי קרח בחדר הקירור, למשך הלילה עד 18 שעות.

4. בידוד PAGE של מתאם 3 'RNA קטן קשור

  1. הנח את 17 הצינורות על גוש חום בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת כדי להשבית את ה-T4 RNA Ligase 2, והניח על קרח למשך 2 דקות להתקררות.
  2. שלב 1 מיקרוליטר של GlycoBlue ו-26 מיקרוליטר של 5 M NaCl נטול נוקלאז לתוך צינור טרי והעביר 1.2 מיקרוליטר מתמיסת משקעים זו לכל אחד מ-17 הצינורות.
  3. הוסף 63 מיקרוליטר של 100% אתנול לכל אחד מ-17 הצינורות, סגור, החליק וסובב כלפי מטה למשך 2 שניות לפני שמניחים בחזרה על הקרח.
  4. שלב את התוכן של 16 צינורות ה-sEV RNA לצינור סיליקון יחיד של 1.5 מ"ל, תוך שמירה על צינור קשירת ה-RNA לבדיקה נפרד.
  5. הפוך את הצינור המכיל את הדגימות המשולבות פי 3 לערבוב, צנטריפוגה קצרה למשך 2 שניות, והניח על קרח למשך 60 דקות כדי לשקע.
  6. הכינו ג'ל גדול (16 על 20ס"מ) 15% פוליאקרילאמיד (PAGE) כדלקמן:
    1. סיליקון (כלומר, באמצעות תמיסה מבוססת סיליקון) ויציקת לוחות הזכוכית הקצרים והארוכים יחד עם מרווחים של 0.1 ס"מ.
    2. הכן את תערובת הג'ל של 15% PAGE על ידי שילוב של 9 מ"ל של מדלל מערכת, 18 מ"ל תרכיז מערכת, 3 מ"ל של מאגר מערכת, 240 מיקרוליטר של APS (9%) ו-12 מיקרוליטר של TEMED בצינור חרוטי של 50 מ"ל.
    3. העבירו במהירות את התמיסה בין לוחות הזכוכית באמצעות פיפטה של 30 מ"ל. לפני שהג'ל מתפלמר, הוסף מסרק בעל 14 בארות (בעובי 0.1 ס"מ), והניח את הג'ל עומד זקוף למשך 30 דקות ב- RT.
  7. שחזר את הצינור עם דגימות ה-RNA המשולבות מקרח וצנטריפוגה ב-16,000 × גרם למשך 60 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  8. בינתיים, סיים את הגדרת ה-15% PAGE על ידי הסרה עדינה של המסרק, ניקוי הבארות עם H2O נטול נוקלאז עם בקבוק שפריץ מעל כיור, לפני ייבוש והגדרת ה-15% PAGE על מנגנון הג'ל, שבו המאגרים העליונים והתחתונים מלאים בתמיסת 0.5x Tris-Borate EDTA (TBE), לפני הפעלה מוקדמת של 30 דקות ב-450 וולט.
  9. הסר את הצינור מהצנטריפוגה (שלב 4.6) וייבש בזהירות את כדור ה-RNA באמצעות פיפטה של פסטר עם קצה 10 מיקרוליטר ללא פילטר בקצהו המחובר למערכת ואקום, מבלי להפריע לגלולה.
  10. השעו מחדש את גלולת ה-RNA המכילה את 16 קשירות ה-RNA המשקעות ב-20 מיקרוליטר של ddH2O נטול נוקלאז והוסיפו 20 מיקרוליטר של תמיסת טעינת ג'ל PAA. העבירו את הצינור לערבב, צנטריפוגה למשך 2 שניות והניחו על קרח.
  11. החלף 0.5x TBE של מכשיר ג'ל ב-0.5x TBE טרי.
  12. הגדר צינור עם סולם בגודל RNA של 20 bp, שני צינורות עם כל אחד משני סמני גודל ה-DNA הקצרים של 3 '(קובץ משלים 1), וצינור אחד המכיל את בדיקת קשירת ה-RNA אוליגונוקלאוטיד (כלומר, קשור עם מתאם ברקוד #17).
  13. לכל אחד מהצינורות (כלומר, סולם, אוליגוס DNA קצר של קשירה 3 אינץ' ובדיקת קשירת RNA), הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת העמסת ג'ל PAA.
  14. הגדר את צינור דגימת ה-RNA 16 הקשור ו-1 מבחנה לקשירת RNA ב-90 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת והחזר לקרח.
  15. החלף מאגר TBE של 0.5x מהמאגרים התחתונים והעליונים כאחד (כלומר, הוסף חיץ מתחת למפלס הבאר כך שלא יהיה זיהום צולב בין בארות במהלך הטעינה) והעמיס את הסולם על קצות הג'ל, קשירת בדיקת ה-RNA, שני סמני גודל ה-DNA הקצרים משני צידי הבאר המכילים את 16 קשירות ה-RNA המשולבות עם ברקוד 3' (ראה איור 5).
  16. הפעל את ג'ל ה-15% PAGE עם כל הדגימות למשך 90 דקות ב-450 וולט (~35 mA) בתנאים מקוררים (כלומר, עם מאווררים שנושפים אוויר על לוחות הזכוכית).
  17. הסר 15% PAGE מהזכוכית ורסס אותו קלות בתמיסת SYBR Gold (10 μL SYBR Gold ב-25 מ"ל של 0.5x TBE) ותן לו לשבת מוטה במשך 5 דקות בחושך.
  18. הנח את הג'ל על טרנס-מאיר אור כחול (איור 5) ויישר גם את מתאם 19 nt-3' וגם את שני סמן גודל מתאם 24 nt-3' אוליגונוקלאוטידים קצרים של DNA עם סרגל וכרו את אזור הג'ל המכיל את מבני ה-miRNA הקשורים (איור 6 מציג את הקשירה של 3' ואת המבנה המתקבל). בנפרד, כרתו את הרצועה העליונה של קשירת בדיקת ה-RNA, שתשמש גם לקשירת בדיקה 5' למחרת.
  19. הנח את שתי חתיכות הג'ל הנפרדות (כלומר, עבור 16 דגימות RNA ולקשירת בדיקה) לתוך צינורות מפסק ג'ל שונים של 0.5 מ"ל המוגדרים בצינורות סיליקון של 1.5 מ"ל, צנטריפוגה ב-16,000 × גרם למשך 3 דקות ב-RT ולאחר מכן השעו מחדש את שתי חתיכות הג'ל המפוצלות עם 300 מיקרוליטר של תמיסת NaCl של 400 מ"מ, סגור את הצינורות, ולאטום אותם עם פרפילם.
  20. הנח את הצינורות על שייקר עם תסיסה ב-1,100 סל"ד ב-4 מעלות צלזיוס, למשך הלילה (16-17 שעות).

5. קשירה של מתאם 5'

  1. העבירו שני ג'לים מקוטעים נפרדים ותמיסותיהם (דגימות מקודדות בגודל 16 x 3 אינץ' (ברקודים #1 עד #16) ו-RNA בדיקה מקודד בגודל 3 אינץ' (ברקוד #17)) על שני צינורות סינון נפרדים של 5 מיקרומטר, כל אחד מהם מוגדר בצינורות סיליקון של 1.5 מ"ל, אטום אותם עם פרפילם, וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-2,300 × גרם ב-RT.
  2. הוסף 950 מיקרוליטר של 100% אתנול לכל תמיסה מסוננת, סגור את הצינורות, הפוך לערבוב, סובב למשך 2 שניות, אטום את הצינורות עם פרפילם והניח אותם על קרח למשך שעה.
  3. הכינו טרי מלאי DMSO מימי של 50% על ידי שילוב של 1 מ"ל מים נטולי נוקלאז עם 1 מ"ל DMSO, עטפו את הצינור בנייר אלומיניום ואחסנו ב-RT בחושך.
  4. הכן ג'ל 15% PAGE והפעל אותו מראש, לפי השלבים המתוארים בסעיף 4.6.
  5. צנטריפוגה הצינורות המכילים את דגימות ה-RNA הקשורים 3' ואת קשירת ה-RNA לבדיקה ב-16,000 × גרם למשך 60 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לזרז את ה-RNA הקשורים.
  6. הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי לגעת בכדורי ה-RNA, וייבש בוואקום.
  7. השעו מחדש את הגלולה הקשורה 3' של 16 דגימות RNA ובדקו RNA כל אחת ב-8 מיקרוליטר של ddH2O נטול נוקלאז מבלי לזרום למעלה ולמטה. העבירו קלות את הצינורות לערבוב, צנטריפוגה למשך 2 שניות (2,000 × גרם) ב-RT, והניחו את הצינורות על קרח.
  8. הכן את מאגר ה-10x RNA Ligase (עם ATP) על ידי ערבוב של 500 מיקרוליטר של 1 M Tris (pH 7.5), 100 מיקרוליטר של 1 M MgCl2, 50 מיקרוליטר של 20 מ"ג/מ"ל BSA אצטיל, 200 מיקרוליטר של 10 מ"מ ATP, 7 מיקרוליטר של 2-מרקפטואתנול 14 M, ו-143 מיקרוליטר של מים נטולי RNase לתוך צינור של 1.5 מ"ל.
  9. הוסף 2 מיקרוליטר של מאגר ליגאז RNA 10x (כלומר, עם ATP), 1 מיקרוליטר של מתאם 100 מיקרומטר 5' ו-4 מיקרוליטר של DMSO מימי 50% לכל צינור. החליק כדי לערבב, סובב במשך 2 שניות ב-RT, ואז הגדר את הצינור ב-90 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת כדי לנטרל את ה-RNA, והנח אותו בחזרה על הקרח.
  10. הוסף 3 מיקרוליטר של 50% DMSO, החליק לערבב, סובב לגלולה, הוסף 3 מיקרוליטר של T4 RNA Ligase לכל צינור, החלק את הצינורות, צנטריפוגה למשך 2 שניות ב-RT, והניח את הצינורות על השייקר על 37 מעלות צלזיוס למשך 75 דקות.
    הערה: אין לזרוק פיפטה למעלה ולמטה.
  11. הכן את סולם ה-DNA של 20 nt ושני צינורות נפרדים המכילים את סמן ה-5'-גודל קשירה אוליגונוקלאוטידים ארוכים של DNA (קובץ משלים 1; מתאם 5'מתאם-19 nt-3', ומתאם 5'מתאם-24 nt-3'), והוסף 20 מיקרוליטר של PAA לכל אחד מהצינורות.
  12. לאחר השלמת קשירת המתאם בגודל 5 אינץ', הוסף 20 מיקרוליטר של PAA לכל אחת משתי הקשירות (כלומר, 16 דגימות RNA ובדיקת RNA), ערבב על ידי החלקה, סיבוב כלפי מטה וקבע על 90 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ולאחר מכן הנח את הצינורות בחזרה על הקרח.
  13. רוקנו את המאגרים העליונים והתחתונים של מכשירי ג'ל והוסיפו תמיסת TBE טרייה פי 0.5 מתחת למפלס הבארות של המאגר העליון.
  14. טען את הסולם בקצה הג'ל, דגימת ה-RNA הבדיקה הקשורה בגודל 5', שני האוליגונוקלאוטידים הארוכים של ה-DNA (כלומר, מתאם 5'-19 nt-3', ומתאם 5'-24 nt-3') בבארות המקיפות את הבאר שבה ייטענו 16 דגימות ה-RNA הקשורות 5' (איור 6 מציג את הקשירה של 5' והמבנה המתקבל). הפעל את הג'ל למשך 90 דקות ב -450 וולט.
  15. לאחר השלמת הריצה, הסר את הג'ל מהמכשיר והזכוכית ורסס אותו בתמיסת SYBR Gold (כלומר, 10 מיקרוליטר של SYBR Gold ב-25 מ"ל של 0.5x TBE), ותן לו לשבת בחושך למשך 5 דקות.
  16. באמצעות מתאם 5' מתאם-19 nt-3' ושני סמני גודל מתאם 5'-24 nt-3' אוליגונוקלאוטידים ארוכים של DNA כמדריכי גודל, כרתו ישירות את החלק של הג'ל המכיל את דגימות 16 ה-RNA הקשורות 5' (איור 7).
    הערה: קשירת ה-RNA של הבדיקה מוערכת על הג'ל כדי להוכיח כי קשירת מתאם 5' מאפשרת תזוזה שווה ערך בגודל לסמני הגודל. קשירת ה-RNA של הבדיקה אינה נכרתת מהג'ל; רק 16 דגימות ה-RNA המשולבות הקשורות.
  17. העבירו את חתיכת הג'ל הכריתה המכילה את 16 דגימות ה-RNA הקשורות לתוך שפופרת מפסק ג'ל של 0.5 מ"ל המוגדרת לתוך שפופרת של 1.5 מ"ל, סובבו ב-16,000 × גרם למשך 3 דקות ב-RT, ולאחר מכן הוסיפו 300 מיקרוליטר של 300 מ"מ NaCl ו-1 מיקרוליטר של פריימר 100 מיקרומטר 3' RT/PCR (איור 1B) לחתיכות הג'ל המרוסקות בצינור.
  18. אטמו את השפופרת עם פרפילם והניחו על שייקר המעורר ב-1,100 סל"ד ב-4 מעלות צלזיוס, למשך הלילה (17-18 שעות) בחדר קר.

6. שעתוק הפוך של ה-RNA וה-miRNA הקטנים הלא מקודדים הקשורים 5' ו-3'

  1. יש לזרוק את התמיסה מהצינור המכיל את הג'ל הכתוש על צינור מסנן של 5 מיקרומטר המוחדר לתוך צינור נטול RNase עם סיליקון בנפח 1.5 מ"ל ולהסתובב לזמן קצר כדי לאפשר לתמיסה לעבור דרך המסנן.
  2. הוסף 950 מיקרוליטר של 100% אתנול לתמיסה מסוננת זו, הפוך את הצינור לערבוב, סובב במשך 2 שניות והניח על קרח למשך 60 דקות.
  3. זרז את כדור ה-RNA על ידי צנטריפוגה של הצינור ב-16,000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעה.
  4. החזר את הצינור, הסר את הסופרנטנט בזהירות מבלי לגעת בגלולה, וייבש את הגלולה בוואקום לפני השעייתה מחדש ב-5.6 מיקרוליטר של H2O נטול נוקלאז.
  5. הגדר את תגובת ה-RT על ידי הוספת 3 מיקרוליטר של מאגר גדיל ראשון פי 5, 4.2 מיקרוליטר של 10x dNTPs (כל אחד ב-2 מ"מ) ו-1.5 מיקרוליטר של דיתיותרייטול (DTT) לצינור. החליקו כדי לערבב, וסובבו במשך 2 שניות.
  6. הגדר את התגובה ב-90 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות בדיוק ולאחר מכן העבר את הצינור לבלוק ב-50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
  7. התחל את תגובת ה-RT על ידי הוספת 0.75 מיקרוליטר של אנזים טרנסקריפטאז הפוך לתמיסה, החליק לערבב והגדר על 50 מעלות צלזיוס למשך 35 דקות.
  8. העבירו את הצינור בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת כדי לנטרל את האנזים ואת גדילי ה-cDNA/RNA, ואז הוסיפו 95 מיקרוליטר של H2O נטול RNase, העבירו את הצינור לערבוב והניחו אותו על קרח למשך 2 דקות. שפופרת זו מכילה cDNA שנוצר מ-16 דגימות RNA, כל אחת בנפרד מקודדת ב-3'.

7. בצע את בדיקת PCR והגברה בקנה מידה גדול

  1. הכן מאגר PCR טרי פי 10 על ידי שילוב של 304 מיקרוליטר של H2O ללא נוקלאז, 125 מיקרוליטר של 2 M KCl, 50 מיקרוליטר של 1 M Tris pH 8.0, 10 מיקרוליטר של 1 M MgCl2, 5 מיקרוליטר של 1% טריטון X-100 ו-6 מיקרוליטר של 1 M 2-מרקפטואתנול לתוך צינור שניתן לאחסן על קרח.
  2. הרכיבו תגובת פיילוט/בדיקה PCR עבור ה-cDNA המיוצר בשלב 6.8 (למעלה) על ידי שילוב של 67 מיקרוליטר של H2O נטול נוקלאז עם 10 מיקרוליטר של מאגר PCR 10x, 10 מיקרוליטר של 10x dNTPs, 0.5 מיקרוליטר של פריימר PCR 100 מיקרומטר 5 אינץ', 0.5 מיקרוליטר של פריימר PCR 100 מיקרומטר 3 אינץ', 10 מיקרוליטר של ספריית מלאי cDNA, ו-2 מיקרוליטר של 50x Taq פולימראז לתוך צינור PCR טרי.
    הערה: לפני ביצוע ה-PCR amplification, הגדר את המכשיר על ידי הקמת שני קבצים שונים כדלקמן: עבור File#1: 94°C למשך 45 שניות, 50°C למשך 85 שניות, ו-72°C למשך 60 שניות למשך 12 מחזורים, ו-4°C; ועבור File#2: 94 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, 50 מעלות צלזיוס למשך 85 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות למשך 2 מחזורים, ו-4 מעלות צלזיוס.
  3. עבור תגובת ה-PCR של הפיילוט/בדיקה, הנח את צינור ה-PCR המכיל את 100 מיקרוליטר של תגובת ה-PCR ב-Thermocycler והפעל את File#1.
  4. לאחר השלמת קובץ #1, פתח את צינור ה-PCR והעביר 12 מיקרוליטר מהתגובה למיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכילה 3 מיקרוליטר של צבע טעינת ג'ל פי 5. סגור את הצינור וכתוב "12 מחזורים" על המכסה.
  5. קח את צינור ה-PCR, הכנס אותו לתוך התרמו-סייקלר והתחל את File#2.
  6. לאחר השלמת File#2, העבירו 12 מיקרוליטר של תגובת ה-PCR לתוך שפופרת של 1.5 מ"ל המכילה 3 מיקרוליטר של צבע טעינת ג'ל פי 5, וכתבו "14 מחזורים" על הכובע שלו.
  7. חזור על הגברות ה-PCR ארבע פעמים נוספות ברציפות (כלומר, שני מחזורי PCR כל אחד), תוך העברת 12 מיקרוליטר של מוצר PCR בסוף כל הגברה, ובתורו קבל ארבעה צינורות שונים, המסומנים 16, 18, 20 ו-22 מחזורים.
  8. טען את הסולם בגודל 20 nt, וכל אחד ממוצרי ה-PCR המוגבר על אגרוז של 2.5% והפעל את הג'ל ב-0.5x TBE למשך 30 דקות ב-120 וולט.
  9. זהה את מחזור הגברת ה-PCR האופטימלי (איור 8A), בהתבסס על היחס והנוכחות של דימרים פריימר (פס תחתון) וה-cDNA המוגבר (פס עליון).
    הערה בהתחשב בכך שקלט ה-RNA הכולל עם 16 דגימות עשוי להיות נמוך מ-1 ננוגרם, צפוי שדימרים פריימר ייצרו תוצר מהר יותר ובכמויות גדולות יותר מה-cDNA המטוהר. לפיכך, מחזור ה-PCR המתאים נבחר בדרך כלל בין 18 ל-22 מחזורים. באיור 8A, מחזור ה-PCR המתאים לספרייה זו הוא 20. באיור 8B, גודל מבנה ה-PCR מפורט.
  10. לאחר זיהוי מחזור הגברת ה-PCR המתאים, הגדר PCR שלילי (ללא cDNA) וארבע תגובות PCR חיוביות של 100 מיקרוליטר (כלומר, כל אחת מכילה 12 מיקרוליטר של cDNA).
    1. כדי לפשט את הכנת תגובות ה-PCR, הגדר PCR Master Mix (כלומר, עבור 4.5 תגובות) בשפופרת של 1.5 מ"ל על ידי שילוב של 292.5 מיקרוליטר של H2O נטול נוקלאז, 45 מיקרוליטר של מאגר PCR 10x, 45 מיקרוליטר של 10x dNTPs, 3.25 מיקרוליטר של פריימר RT/PCR 3' (איור 1B) ו-2.25 מיקרוליטר של פריימר PCR 5' (איור 1B). הפוך את הצינור הזה כדי לערבב ולהסתובב כדי לאסוף בתחתית הצינור.
    2. העבירו 86 מיקרוליטר של PCR Master Mix לכל אחד מארבעה צינורות PCR של 0.5 מ"ל.
    3. הוסיפו 12 מיקרוליטר של ספריית cDNA (מאוחסנת על קרח), ואז 2 מיקרוליטר של 50x טיטניום Taq פולימראז לכל אחד מ-4 צינורות ה-PCR, וערבבו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
    4. הכן את צינור תגובת ה-PCR ללא תבנית על ידי הוספת 77 מיקרוליטר של H2O נטול נוקלאז, 10 מיקרוליטר של מאגר PCR 10x, 10 מיקרוליטר של 10x dNTPs, 0.5 מיקרוליטר של פריימר PCR 5', 0.5 מיקרוליטר של פריימר PCR 3' ו-2 מיקרוליטר של 50x Taq פולימראז לצינור PCR נפרד ופיפטינג למעלה ולמטה כדי לערבב.
    5. הגדר את צינורות ה-PCR בתרמו-סייקלר באמצעות מחזור ה-PCR שזוהה בשלב 7.9 והגדר תוכנית חדשה על התרמו-סייקלר כדי להגביר לפי הצורך.
  11. הכן ג'ל אגרוז 2.5% עם 0.5x TBE ואתידיום ברומיד, והעביר 12 מיקרוליטר מכל צינור PCR לצינורות בודדים המכילים 3 מיקרוליטר של צבע טעינת ג'ל פי 5.
  12. הכן את סולם 20 nt על ידי שילוב של 3 מיקרוליטר סולם עם 9 מיקרוליטר של H2O נטול נוקלאז ו-3 מיקרוליטר של צבע טעינת ג'ל.
  13. טען את הג'ל, הפעל אותו במשך 30 דקות ב-120 וולט, וודא שהגברת ה-PCR דומה בין ארבע התגובות השונות ושהפקד ללא תבנית ריק (איור 8C).
  14. שלב את ארבע תגובות ה-PCR בין שני צינורות מיקרו-צנטריפוגה סיליקון של 1.5 מ"ל (כלומר, שני צינורות שכל אחד מהם מכיל 90 מיקרוליטר של מוצר), והוסף 18 מיקרוליטר של 5 M NaCl, ו-800 מיקרוליטר של 100% אתנול בכל אחד משני הצינורות.
    1. הפוך את הצינורות לערבוב ואחסן אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס כדי לשקע למשך הלילה.

8. טיהור הספרייה המוגברת PCR

  1. צנטריפוגה שני הצינורות המכילים את תגובות ה-PCR החיוביות המעורבות ב-16,000 × גרם למשך 60 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  2. לאחר 60 דקות, הסר את הסופרנטנט, יבש את כדורי ה-DNA בוואקום, והשהה אותם מחדש ב-19.5 מיקרוליטר של מאגר 1x, ולאחר מכן הוסף 0.5 מיקרוליטר של אנזים PmeI.
  3. הגדר את מעכלי ה-PmeI ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי להסיר כל אחד מסמני גודל ה-DNA שפעלו בבארות הסמוכות (כלומר, מתאם 19 nt-3', מתאם 24 nt-3') או נשאי RNA (כלומר, נושא מיצוי RNA, נושא קשירה RNA לאחר 3') מזהמים פוטנציאליים (כלומר, ראה אתרי PmeI הכלולים ב-RNA ו-DNA פריימרים בקובץ משלים 1)
  4. הפעל את שני העיכול בשלוש בארות שונות של ג'ל אגרוז 2.5% באמצעות 0.5x TBE כדי למנוע הצטברות עודף של דימרים פריימר בבאר אחת ויצירת מריחה.
    1. הוסף 3 מיקרוליטר של צבע טעינת ג'ל פי 5 לכל אחד מהעיכולים, שלב את שני העיכולים, ולאחר מכן טען 16.5 מיקרוליטר לשלוש בארות סמוכות נפרדות.
    2. טען את הסולם בגודל 20 nt DNA בבארות הקצה של הג'ל והפעיל את הג'ל למשך 90 דקות ב-150 V (איור 8D).
  5. כדי לטהר את ספריות ה-DNA, הוציאו את רצועות ה-PCR העליונות משלושת הנתיבים הסמוכים של הג'ל, והעבירו אותן לצינור טרי של 1.5 מ"ל.
  6. טהר את הספרייה המוגברת של PCR באמצעות ערכת מיצוי ג'ל, בהתאם להוראות היצרן, וכימת את מוצר ה-DNA המטוהר באמצעות פלואורומטר, בהתאם להוראות היצרן.

9. הגברת PCR סופית להוספת ברקודים התואמים לרצף

  1. הכינו תערובת חיץ PCR טרייה פי 10 כמו זו המתוארת בשלב 7.1.
  2. הגדר תגובות PCR על ידי הכללת בקרה שלילית אחת (ללא מגברים) ושלוש תגובות PCR באמצעות 0.75 ננוגרם של תוצר ה-PCR המטוהר מהגברת ה-PCR הראשונה בכל אחד משלושת הצינורות כדלקמן:
    1. הגדר שלוש תגובות PCR בודדות על ידי ערבוב של 75 מיקרוליטר של ddH2O, 10 מיקרוליטר של מאגר PCR 10x, 10 מיקרוליטר של 10x dNTPs, 1 מיקרוליטר של פריימרPCR 5' 2 nd (כלומר, פריימר i503 (איור 1B)), 1 מיקרוליטר של 3' PCR2 פריימר (כלומר, פריימר i702 (איור 1B)), 1 מיקרוליטר של תוצר PCR (כלומר, 0.75 ננוגרם ממוצר 1ST PCR מטוהר בג'ל), ו-2 מיקרוליטר של טיטניום טאק פולימראז.
    2. הגדר את בקרת ה-PCR השלילי (כלומר, ללא תבנית DNA) על ידי ערבוב של 76 מיקרוליטר של ddH2O, 10 מיקרוליטר של מאגר PCR 10x, 10 מיקרוליטר של 10x dNTPs, 1 מיקרוליטר של פריימרPCR 5' 2 nd (כלומר, פריימר i503 (איור 1B)), 1 מיקרוליטר של 3' PCR2 פריימר ( כלומר, פריימר i702 (איור 1B)), ו-2 מיקרוליטר של Taq Polymerase.
    3. הגדר את ארבע תגובות ה-PCR (כלומר, בקרה שלילית אחת, שלוש חיוביות) על תרמו-סייקלר המתוכנת באופן הבא: 72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו-95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות למשך 9 מחזורים, ולאחר מכן 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, והחזקה סופית ב-10 מעלות צלזיוס.
  3. לאחר השלמת מחזורי ה-PCR, קח 10 מיקרוליטר מתערובת התגובה והוסף 3 מיקרוליטר של צבע טעינה, והעריך את המוצרים על ג'ל אגרוז של 2.5% כפי שמוצג באיור 9A, יחד עם סולם 20 nt.
  4. עם אימות גודל מוצר ה-PCR (כלומר, פס PCR עליון הפועל ב-164 bp כפי שמוצג באיור 9B ואיור 6 לגודל ופרטים על המבנה הסופי) והתפלגות הפס, שלב את מוצרי ה-PCR בשני צינורות על ידי הוספה לכל 135 מיקרוליטר של תוצר PCR (כלומר, 90 μL + 45 μL), 13.5 μL של 5 M NaCl, ו-650 מיקרוליטר של 100% אתנול, ומשקעים ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  5. למחרת, סובב את שני צינורות ה-PCR ב-16,000 × גרם למשך 60 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  6. יבש כל גלולה, השהה מחדש עם 19.5 מיקרוליטר של מאגר PmeI 1x, והוסף 0.5 מיקרוליטר של PmeI למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר כדי לחסל עוד יותר את כל סמני הגודל שפעלו בבארות הסמוכות (כלומר, מתאם 19 nt-3', מתאם 24 nt-3') או נשאי RNA (כלומר, נושא מיצוי RNA, נושא קשירה RNA לאחר 3') מזהמים.
  7. הגדר את המוצרים המעוכלים בשלוש בארות של ג'ל אגרוז 2.5% והפרד ב -150 וולט למשך 90 דקות.
  8. כרתו את הרצועה העליונה, שפועלת ב-164 bp (איור 9C), וטהרו את תוצר ה-DNA באמצעות ערכת בידוד DNA וכימתו עם פלואורומטר.
  9. הפעל את מוצר ה-PCR הסופי על שבב DNA כדי לאמת את הגודל, הריכוז והטוהר של הספרייה לפני דילולים וניתוח באמצעות רצף.
  10. העבר את קובץ הנתונים של FASTQ לצינור RNAworld לצורך חיתוך מתאם, דה-מולטיפלקס, יישור לגנום האנושי, לפני ניתוחי miRNA, כפי שתואר קודם לכן41. לחלופין, באמצעות הסקריפט המוצג בקובץ משלים 3, בצע דה-מולטיפלקס של הקריאות מקובץ FASTQ ועבד עוד באמצעות צינור אנליטי של RNA קטן לבחירה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שמפורט בפרוטוקול לעיל, אנו מתארים עיבוד בו-זמני של עד 16 דגימות RNA חוץ-תאיות קטנות (sEV) (כלומר, לניתוח של RNA ו-miRNAs קטנים שאינם מקודדים), המנותחים יחד בספרייה אחת, לאחר שעברו קידוד 3'. ה-sEVs שנבחרו לניתוחים שלנו בודדו על ידי אולטרה-צנטריפוגה, כפי שתואר קודם לכן37,40, מ-45 מ"ל פלזמה שנאספה מנשים שאובחנו עם סרטן שד טריפל נגטיב במרכז הרפואי של אוניברסיטת ג'רזי שור (IRB#Pro2018-0425). עם הבידוד, ה-sEVs האולטרה-צנטריפוגים אומתו בהתאם להנחיות

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו פרוטוקול הכנת ספריית cDNA לריצוף הדור הבא (NGS) הניתן לשחזור ורגיש של RNA לא מקודד, כולל microRNAs (miRNAs) המבודדים ביעילות משלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs). בהתחשב בכך שניתן לשחזר כמות מוגבלת של RNAs ו-miRNAs קטנים שאינם מקודדים מ-sEVs מבודדים באופן גלובלי או סלקטיבי, ביקשנו לייעל את הליך הכנת ספריית ה-cDNA שלנו המאפשר ניתוח ניתן לשחזור ורגיש של מטעני miRNA של sEVs.

כצעד ראשון לפני בידוד יעיל וסלקטיבי של sEV-RNA, יש צורך בשלב טיפול ב-RNAse-A כדי לחסל ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O.L. הוא מייסד לא מובטל של EValuate Diagnostics, Inc עם אחוז קטן מהון המניות בחברה. למחברים האחרים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו רוצים להודות למעבדה של ד"ר תומאס טושל על תמיכתם ועל מתן גישה לטכנולוגיה המקורית שפותחה במעבדתם, כמו גם על הענקת גישה לצינור RNAworld.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1% טריטון X-100 InvitrogenHFH10
10 מ"מ ATP אמביוןAM8110G
10x dNTPs אמביוןAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14 מ' מרקפטואתנולסיגמאO3445I-100 
סולם 20 נ"ט Jena BioscienceM-232S
20 מ"ג/מ"ל סרום בקר אלבומיןסיגמאB8894-5ML 
50x טיטניום טאק מעבדות קלונטק 
אמוניום פרסולפטפישר סיינטיפיק 7727-54-0
טרנסמאייטור אור כחול- מצלמת בטוחה 2.0 ThermofisherG6600
BRL מערכת אלקטרופורזה ג'ל אנכית עם לוחות זכוכית ומסרקיםGIBCOV16
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)SigmaD9170-5VL
מיקרוצנטריפוגה אפנדורף 5424Rארה"ב מדעי4054-4537Q
Eppendorf Thermomixerארה"ב מדעי4053-8223Q
צינור סינון עם מסנן 5 מ"מIST Engineering Inc.5388-50
פישרברנד צינורות מיקרוצנטריפוגה בעלי שימור נמוך סיליקון 1.5 מ"לפישר סיינטיפיק02-681-320
צינור מפסק ג'ל 0.5 מ"לIST הנדסה בע"מ3388-100
מכשיר אלקטרופורזה ג'ל 7 ס"מ x 10 ס"מ- Mini-sub Cell GT עם מגשי ג'ל ומסרקיםBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Illumina NextSeq 1000/2000 sequencer אילומינה20047256
ג'רזי-קוט (פתרון מבוסס סיליקון)LabScientific, Inc 1188
KCl 2 MאמביוןAM9640G
MgCl2 1 MאמביוןAM9530G
מיניפוגה צנטריפוגה אישית עם רוטור כפולארה"ב מדעית2641-0016
דגם V16 מכשיר אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד, משקפיים, מסרקים ומרווחיםCiore מדעי החיים21070010
אוליגונוקלאוטידיםIDTמוגדר במהלך ההזמנה
מערכת מיני אלקטרופורזה Owl EasyCast B2 - עם מגשי ג'ל ומסרקיםThermofisher ScientificB2
Qiaquick Qiagen28704
קיוביט פלואורומטרThermofisher ScientificQ33238
אנזים הגבלה PmeI ו-10x Cut Smart BufferNEBR0560S
טרנסקריפטאז הפוך- Superscript IIIThermoFisher12574026
מים ללא RNase אמביוןAM9932
שייקר- אפנדורף תרמומיקסראפנדורף5385000024
SeaKem LE agarose של Lonza50002
Superscript III Invitrogen18080-044
SYBR GoldLife Technologies S11494
טיטניום טאק פולימראזטאקרה639208
T4 RNA ליגאז 1 NEBM0204S
T4 RNA Ligase 2 קטום K227Q NEB0351L
TEMEDפישר סיינטיפיק O3446I-100
Themocycler עם מכסה מחומםApplied Biosystem4359659
Tris 1 M pH 7.5 Invitrogen15567027
Tris 1 M pH 8.0אמביוןAM9855G
מערכת UltraPure Sequagel תרכיז, מדלל וחוצץNational DiagnosticsEC-833
639208 ערכת מיצוי ג'ל ערכת תמלול הפוך

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2 (8), 569-579 (2002).
  2. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  3. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  4. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nat Protoc. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  5. Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions. J Clin Invest. 126 (4), 1139-1143 (2016).
  6. Raposo, G., Stahl, P. D. Extracellular vesicles: a new communication paradigm. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (9), 509-510 (2019).
  7. Liu, Y. J., Wang, C. A review of the regulatory mechanisms of extracellular vesicles-mediated intercellular communication. Cell Commun Signal. 21 (1), 77(2023).
  8. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell Commun Signal. 19 (1), 104(2021).
  9. Shami-Shah, A., Travis, B. G., Walt, D. R. Advances in extracellular vesicle isolation methods: a path towards cell-type specific EV isolation. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids. 4, 447-460 (2023).
  10. Jiang, C., Fu, Y., Liu, G., Shu, B., Davis, J., Tofaris, G. K. Multiplexed profiling of extracellular vesicles for biomarker development. Nanomicro Lett. 14 (1), 3(2021).
  11. O'Brien, K., Breyne, K., Ughetto, S., Laurent, L. C., Breakefield, X. O. RNA delivery by extracellular vesicles in mammalian cells and its applications. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 585-606 (2020).
  12. Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandão, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: from biomarkers to mediators of physiology and disease. Cell Metab. 30 (4), 656-673 (2019).
  13. Xu, D., et al. MicroRNAs in extracellular vesicles: sorting mechanisms, diagnostic value, isolation, and detection technology. Front Bioeng Biotechnol. 10, 948959(2022).
  14. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of microRNA biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
  15. O'Brien, J., Hayder, H., Zayed, Y., Peng, C. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 9, 402(2018).
  16. Ardekani, A. M., Naeini, M. M. The role of microRNAs in human diseases. Avicenna J Med Biotechnol. 2 (4), 161-179 (2010).
  17. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am J Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  18. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  19. Dellar, E. R., Hill, C., Melling, G. E., Carter, D. R. F., Baena-Lopez, L. A. Unpacking extracellular vesicles: RNA cargo loading and function. J Extracell Biol. 1 (5), e40(2022).
  20. Lee, Y. J., Shin, K. J., Chae, Y. C. Regulation of cargo selection in exosome biogenesis and its biomedical applications in cancer. Exp Mol Med. 56 (4), 877-889 (2024).
  21. Barman, B., et al. VAP-A and its binding partner CERT drive biogenesis of RNA-containing extracellular vesicles at ER membrane contact sites. Dev Cell. 57 (8), 974-994.e8 (2022).
  22. Oka, Y., Tanaka, K., Kawasaki, Y. A novel sorting signal for RNA packaging into small extracellular vesicles. Sci Rep. 13 (1), 17436(2023).
  23. Wang, X., Tian, L., Lu, J., Ng, I. O. Exosomes and cancer - diagnostic and prognostic biomarkers and therapeutic vehicle. Oncogenesis. 11 (1), 54(2022).
  24. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835(2023).
  25. Chatterjee, M., et al. Circulating extracellular vesicles: an effective biomarker for cancer progression. Front Biosci (Landmark Ed). 29 (11), 375(2024).
  26. Asleh, K., et al. Extracellular vesicle-based liquid biopsy biomarkers and their application in precision immuno-oncology. Biomark Res. 11 (1), 99(2023).
  27. Wang, J., et al. Systematic assessment of small RNA profiling in human extracellular vesicles. Cancers (Basel). 15 (13), 3446(2023).
  28. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int J Biochem Cell Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  29. Avendaño-Vázquez, S. E., Flores-Jasso, C. F. Stumbling on elusive cargo: how isomiRs challenge microRNA detection and quantification, the case of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1784617(2020).
  30. Goh, T. X., Tan, S. L., Roebuck, M. M., Teo, S. H., Kamarul, T. A systematic review of extracellular vesicle-derived Piwi-interacting RNA in human body fluid and its role in disease progression. Tissue Eng Part C Methods. 28 (10), 511-528 (2022).
  31. Liu, D. S. K., Yang, Q. Z. C., Asim, M., Krell, J., Frampton, A. E. The clinical significance of transfer RNAs present in extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 23 (7), 3692(2022).
  32. Teng, M., Liu, L. Y., Hua, J. T., Chen, S., He, H. H. Orphan noncoding RNAs: novel regulators and cancer biomarkers. Ann Transl Med. 7 (Suppl 1), S21(2021).
  33. von Felden, J., et al. Unannotated small RNA clusters associated with circulating extracellular vesicles detect early stage liver cancer. Gut. , (2021).
  34. Dogra, N., et al. Extracellular vesicles carry transcriptional 'dark matter' revealing tissue-specific information. J Extracell Vesicles. 13 (8), 12481(2024).
  35. Loudig, O., et al. Evaluation and adaptation of a laboratory-based cDNA library preparation protocol for retrospective sequencing of archived microRNAs from up to 35-year-old clinical FFPE specimens. Int J Mol Sci. 18 (3), 627(2017).
  36. Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective microRNA sequencing: complementary DNA library preparation protocol using formalin-fixed paraffin-embedded RNA specimens. J Vis Exp. (135), e57471(2018).
  37. Mitchell, M. I., et al. Extracellular vesicle capture by antibody of choice and enzymatic release (EV-CATCHER): a customizable purification assay designed for small-RNA biomarker identification and evaluation of circulating small-EVs. J Extracell Vesicles. 10 (8), e12110(2021).
  38. Mitchell, M. I., et al. Customizing EV-CATCHER to purify placental extracellular vesicles from maternal plasma to detect placental pathologies. Int J Mol Sci. 25 (10), 5102(2024).
  39. Mitchell, M. I., et al. Non-invasive detection of orthotopic human lung tumors by microRNA expression profiling of mouse exhaled breath condensates and exhaled extracellular vesicles. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids. 5 (1), 138-164 (2024).
  40. Mitchell, M. I., et al. Exhaled breath condensate contains extracellular vesicles (EVs) that carry miRNA cargos of lung tissue origin that can be selectively purified and analyzed. J Extracell Vesicles. 13 (4), e12440(2024).
  41. Farazi, T. A., et al. Bioinformatic analysis of barcoded cDNA libraries for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 171-187 (2012).
  42. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): from basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  43. Kim, J. A., et al. Small RNA sequencing of circulating small extracellular vesicles microRNAs in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 13 (1), 5528(2023).
  44. Llorens-Revull, M., et al. Comparison of extracellular vesicle isolation methods for miRNA sequencing. Int J Mol Sci. 24 (15), 12183(2023).
  45. Crossland, R. E., et al. MicroRNA profiling of low concentration extracellular vesicle RNA utilizing NanoString nCounter technology. J Extracell Biol. 2 (1), e72(2023).
  46. Miceli, R. T., et al. Extracellular vesicles, RNA sequencing, and bioinformatic analyses: challenges, solutions, and recommendations. J Extracell Vesicles. 13 (12), e70005(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MicroRNAmiRNA sEVRNARNA
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים