מאמר שיטה

סטנדרטיזציה של תוכנה חצי-אוטומטית חדשנית למדידת צמיחת עצבים

DOI:

10.3791/67163

⸱

9 באוגוסט 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, University of Turin, 2Department of Neuroscience Rita Levi-Montalcini, University of Turin, 3University School for Advanced Studies IUSS Pavia

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחני צמיחת עצבים מספקים ערך כמותי על תהליכים עצביים רגנרטיביים. היתרון של תוכנה חצי אוטומטית זו הוא שהיא מחלקת גופי תאים ונוירוטים בנפרד על ידי יצירת מסכה ומודדת פרמטרים שונים כגון אורך נוירוט, מספר נקודות הסתעפות, שטח אשכול תא-גוף ומספר אשכולות תאים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקות הדמיה חיה יעילות הן חיוניות להערכת המורפולוגיה העצבית על מנת למדוד את צמיחת הנוירוטים בזמן אמת. מדידה נכונה של צמיחת נוירוטים הייתה אתגר ארוך שנים לאורך השנים בתחום המחקר במדעי המוח. פרמטר זה משמש אבן פינה במערכים רבים של ניסויים במבחנה , החל מתרביות מנותקות ותרביות אורגנוטיפיות ועד קווי תאים. על ידי כימות אורך הנוריט, ניתן לקבוע אם טיפול מסוים עבד או אם התחדשות אקסונלית משופרת בקבוצות ניסוי שונות. במחקר זה, המטרה היא להדגים את החוסן והדיוק של תוכנת Incucyte Neurotrack neurite outgrowth analysis. תוכנה חצי-אוטומטית זו זמינה במערכת מיקרוסקופיה בהילוך מהיר המציעה מספר יתרונות על פני מתודולוגיות נפוצות בכימות אורך העצב בתמונות ניגודיות פאזה. האלגוריתם מסווה ומכמת מספר פרמטרים בכל תמונה ומחזיר מדדים של תאים עצביים, כולל אורך נוירוט, נקודות הסתעפות, אשכולות תא-גוף ואזורי אשכול תא-גוף. ראשית, אימתנו את החוסן והדיוק של התוכנה על ידי התאמה בין הערכים שלה לאלה של NeuronJ הידני, תוסף פיג'י. שנית, השתמשנו באלגוריתם שמסוגל לעבוד גם על תמונות ניגודיות פאזה וגם על תמונות אימונוציטוכימיות. באמצעות סמנים עצביים ספציפיים, תיקפנו את ההיתכנות של ניתוח צמיחת עצבים מבוסס פלואורסצנטיות על נוירונים חושיים בתרביות מבחנה . בנוסף, תוכנה זו יכולה למדוד אורך עצבי על פני תנאי זריעה שונים, החל מתאים בודדים ועד רשתות עצביות מורכבות. לסיכום, התוכנה מספקת פלטפורמה חדשנית וחסכונית בזמן למבחני צמיחת נוירונים, וסוללת את הדרך לכימות מהיר ואמין יותר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעצבים סיאטיים, ניתן למדוד התחדשות אקסונלית1. בנוסף, מחקרי מבחנה הראו את ההיתכנות של ניטור צמיחה אקסונלית 2,3 כדי להבין את השלבים השונים שלה, מהנבטה אקסונלית לניוון אקסונלי, הן בנוירונים בריאים והן בתאי עצב פגועים. על ידי מעקב אחר תהליכים אלה, ניתן למדוד פרמטרים כגון קוטביות אקסונלית, חניכה, יציבות והסתעפות. הפרמטר האחרון הוא קריטי להבנת תפיסת כאב נוירופתית 4,5,6. באופן דומה, ניוון אקסונלי יכול להיות מנוטר in vivo7 או in vitro 8,9. במהלך צמיחת נוירוטים, רשתות שלד אקטין ומיקרוטובול מתייצבות או משתנות בהתאם לצרכי התא10. שלד האקטין מתארגן מחדש כדי לאפשר את היווצרות חרוט הצמיחה האקסונלי, והמיקרוטובולים מתיישרים מחדש לצרורות כדי לייצב את הנוירוט הגדל11. על מנת לחקור צמיחה של נוירונים מרכזיים והיקפיים במבחנה, מכמתים שלושה פרמטרים נפוצים: אורך אקסונלי כולל, מרחק מקסימלי ונקודות הסתעפות. פרמטרים אלה משמשים לחקר תגובת הצמיחה העצבית לטיפול (כלומר, נוירוטרופינים, תרכובות, מעכבים, חומצה רטינואית, siRNA, shRNA) או בבעלי חיים מהונדסים גנטית 12,13,14. כדי להעריך אם לתאי עצב יש יותר תאי עצב מוארכים ו/או יותר הסתעפות, שלושת הפרמטרים האלה מאפשרים לנו להעריך את המורפולוגיה של תא עצב. מדידת אורך נוריט היא הפרמטר בעל העניין העליון במספר מערכי ניסוי במבחנה. מגרעיני שורש גביים מבוצעים בעיקר שני סוגים של תרבויות: תרבית חוץ גופית מנותקת או תרבות אורגנוטיפית של צמחי DRG שלמים. בכל מקרה, אורך הנוירוט הוא פרמטר זהב להערכת תוצאות הניסוי. בקו תאים דמוי נוירון מוטורי (NSC-34), צמיחה אקסונלית והסתעפות נמדדות לאחר התמיינות המושרה על ידי חומצה רטינואית15,16. למעשה, על ידי מדידת צמיחת הנוירוטים, ניתן לקבוע אם טיפול מסוים עבד17, קצב הצמיחה18, או יכולת ההתחדשות לאחר הליך פציעה19.

כיצד להעריך נכונה את צמיחת הנוירוטים הציבה מספר לא מבוטל של אתגרים לאורך השנים בתחום המחקר. עם זאת, אין סטנדרטיזציה של מדידות אורך עצבים. חלק מהשיטות הנפוצות ביותר עבור תרביות תאים במבחנה הן, למשל, התוסף הידני NeuronJ בפיג'י18,20 או MetaMorph21,23 והנוירולוסידההחצי-אוטומטי 23,24. מלבד מתודולוגיות ידניות, ישנן גם שיטות אוטומטיות, כגון תוסף NeuriteTracer בפיג'י25, תוכנת HCA Vision26,27 או WIS-NeuroMath 2,28. מתודולוגיות אחרות פחות מדויקות מסתמכות על מדידת הממד הכולל של הנוירונים. שיטות אלה כוללות מדידת המרחק הווקטורי מגוף התא לקצה האקסוןהארוך ביותר 29 או ניתוח שול30. עם זאת, שיטות מדידה אלה מתאימות לתרביות בצפיפות נמוכה מאוד או לתאי עצב בודדים. יתר על כן, כל המתודולוגיות הללו משמשות בעיקר על נוירונים מוכתמים או נוירונים המבטאים פלואורופורים מקודדים גנטית (כלומר, GFP, נוגה, mCherry). סוג תא העצב וצפיפות תרבית התא משפיעים עמוקות על בחירת מתודולוגיית המדידה. לדוגמה, פילוח ידני של תאי עצב עם מורפולוגיות מורכבות ומסובכות מאוד, כגון נוירוני DRG, יכול בקלות להפוך למשימה בלתי אפשרית. אם נוירונים מפותלים הם כבר אתגר לסגמנט, רשתות עצביות הן לגמרי מחוץ להישג ידן של גישות ידניות בשל הארגון המורכב מאוד שלהן.

מצד אחד, פילוח ידני מדויק מאוד משום שהוא מבוצע על ידי עיניים אנושיות ואינטליגנציה; מצד שני, זה באמת גוזל זמן. הוצאת הזמן הגבוהה הנדרשת בשיטות ידניות היא החיסרון העיקרי. מסיבה זו, רק נוירונים מעטים נרכשים לניתוח, מה שהופך אותו לפחות מדויק ויקר במונחים של זמן. גישות אוטומטיות או חצי אוטומטיות, לעומת זאת, מצמצמות חלקית את בזבוז הזמן. עם זאת, יש להם גם כמה חסרונות. צריך לאמן שיטות אוטומטיות כדי לעבוד כמו שצריך, ואם התוכנה לא מספיק אינטראקטיבית עם המשתמש, הפילוח יכול להיות שגוי.

מלבד מדידת צמיחת נוירוטים, מספר נקודות ההסתעפות הוא גם מידע בעל ערך. באמצעות פילוח ידני ניתן לחשב את מספר נקודות ההסתעפות, בעוד שהדבר אינו אפשרי עם מרחק וקטורי. בשיטות אוטומטיות, מספר נקודות ההסתעפות מסופק בדרך כלל, ואילו בניתוח שול, יש לחשב אותו באמצעות נוסחה מתמטית.

במאמר שיטות זה, אנו שואפים לתאר את הפונקציונליות והיעילות של תוכנה חצי-אוטומטית זו במדידת האורך האקסונלי הכולל ופרמטרים אחרים. המכונה מאפשרת רכישה אוטומטית של תמונות בנקודות זמן מוגדרות או לביצוע מחקרים ארוכי טווח (ימים, שבועות, חודשים), תוך שמירה על סביבה פיזיולוגית לתאים חיים. למדידת צמיחת תאי עצב באמצעות הדמיית קיטוע זמן של ניגודיות פאזה יש את היתרון בכך שהיא מאפשרת ניטור רציף של קינטיקה וגדילה של נוירוטים. בנוסף, ניתן גם לעקוב אחר מוות תאי באמצעות תוספת במדיה של צבעים ספציפיים המכוונים לתאים מתים 31,32,33. למרות שהתוכנה שוחררה בשנת 2012, אנו הראשונים לתקנן מתודולוגיה זו באופן ניתן לשחזור וללא משוא פנים לכימות מדויק של צמיחת נוירוטים. עם זאת, חשוב לציין כי התוכנה אינה כלולה ברכישת המכונה. למרות הוצאה נוספת זו, השימוש בו מציע יתרונות משמעותיים במדידת אורך אקסונלי כולל ופרמטרים אחרים, ובכך תורם למחקר בתחום מדעי המוח.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סריקת הכלי במכונה

הערה: הזיהוי מתבצע על ידי מצלמת Basler Ace 1920-155 מיקרומטר מובנית.

  1. פתח את התוכנית על-ידי לחיצה על התחבר להתקן ובחירה באפשרות תזמון - כדי לרכוש. לאחר מכן לחץ על הסימן + .
  2. ציין אם הספינה תיסרק שוב ושוב או רק פעם אחת על ידי בחירה באפשרות סרוק בלוח הזמנים או סרוק פעם אחת, בהתאמה.
  3. בחר חדש כדי ליצור כלי שיט חדש לגמרי לסריקה. אם לא נוסף כלי שיט חדש, צור סריקה חדשה באמצעות אחת מהאפשרויות המתוארות להלן.
    1. בחר העתק נוכחי כדי ליצור כלי שיט חדש על-ידי העתקת כלי שיט מלוח הזמנים הנוכחי. בחר העתק הקודם כדי ליצור כלי שיט חדש על-ידי העתקת כלי שיט שנסרק בעבר.
    2. בחר הוסף סריקה כדי לשחזר כלי שיט שנסרק בעבר לסריקות נוספות.
  4. בחר את סוג הסריקה בהתבסס על הבדיקה והיישום. עבור הניתוח, בחר רגיל.
  5. ציין הגדרות סריקה. בחרו אחת מהאפשרויות 'תא אחר תא', 'ללא', 'דבק תא אחר תא' או 'תא אחר תא שאינו דבק', וציינו את ערוצי התמונה בהתאם למולקולות הפלואורסצנטיות שנעשה בהן שימוש. בחר באפשרות ללא עבור תרביות נוירונים חושיים בוגרים ועובריים. עבור שורות תא, בחר אפשרויות ללא או דבק תא אחר תא .
  6. בחר את מטרת המיקרוסקופ (4x, 10x, 20x). לרכוש עם הגדלה גבוהה יותר (20x) בתרביות ראשוניות, בעוד בשורות תאים, 10x מספיק.
  7. בחר את סוג כלי השיט לסריקה מתוך האפשרויות המוצגות. ציין את מיקום הכלי במגירה על ידי בחירת מיקומו על המפה הווירטואלית של המגירה.
  8. ציין את תבנית הסריקה לרכישת התמונה באמצעות בחירת הבארות לסריקה. בחר את מספר התמונות הרצוי לכל באר. תופיע הערכה של משך הסריקה.
  9. ספק מידע על כלי השיט על ידי הקלדת השם וציין את מפת הצלחת על ידי לחיצה על הסימן + .
  10. לחץ על הבא. בחר את סוג הניתוח ולחץ על הבא. יופיע מסך סיכום של האפשרויות שנבחרו. אם זה נכון, לחץ על סרוק עכשיו והסריקה תתחיל.

2. הגדרה לניתוח תמונת ניגודיות פאזה

הערה: ניתוח נוירוטראק יכול להתבצע רק על תמונות שנרכשו בעבר על ידי המכונה.

  1. בחר את הכלי הסרוק כדי לנתח. בחר ניתוח הפעלה. בחר צור הגדרת ניתוח חדשה.
  2. בחר Neurotrack. בחרו 'ערוצי תמונה'. בחרו ערכה מייצגת של תמונות לביצוע הניתוח. בחר את כל התמונות עבור כל באר כדי לאמן את האלגוריתם.
  3. מקד את הגדרות הגדרת הניתוח על-ידי התאמת הפרמטרים הבאים.
    הערה: כברירת מחדל, תאי עצב מחולקים במגנטה, בעוד שגופי תאים בצהוב. ניתן לשנות את הצבעים לפי הצורך.
    1. עבור פילוח אשכול תאים-גוף, התאם את הפעולות הבאות כמתואר להלן.
      1. מצב סגמנטציה: פילוח התמונות נעשה כדי להבחין בין גופי תאים לבין רקע ועצבים. בחר בין בהירות למרקם. עבור תרביות ראשוניות וקווי תאים, בחר מצב בהירות.
      2. התאמת סגמנטציה: השתמשו במחוון כדי להתאים את רגישות הפילוח לכיוון יותר תאי רקע או יותר תאים. הוא נע בין 0 (רקע) ל -2 (תאים). זה מגדיל או מקטין את גודל המסכה הצהובה. הזיזו את המחוון לכיוון 0 (רקע) כדי שגודל המסיכה הצהובה יצטמצם בהדרגה וישאיר מקום למסיכת המג'נטה. ההפך מתרחש אם המחוון מוזז לכיוון 2 (תאים).
    2. לצורך ניקוי, התאם את הפעולות הבאות כמתואר להלן.
      1. מילוי חור (מיקרומטר2): התאם זאת כדי להסיר חור במסיכת גוף התא הקטן מהאזור שצוין על-ידי המשתמש.
      2. התאמת גודל (פיקסלים): הגדל (אם חיובי) או כווץ (אם שלילי) את המסיכה הצהובה במספר הפיקסלים שצוין. זה נע בין -10 ל +10. התאימו זאת כדי להוסיף או להסיר סגמנטציה צהובה על עצמים בעלי ניגודיות גבוהה, כגון תאים מתים ופסולת תאית.
      3. רוחב תא מינימלי (מיקרומטר): בחר ערך כדי להגדיר את הגודל שבו גופי התא ייחשבו לנוריטים.
    3. עבור מסנני אשכול גוף התא, התאם את הפרטים הבאים כמתואר להלן.
      1. שטח (מיקרומטר2): הגדר ערך מינימלי ומקסימלי של שטח גוף התא. ערכים מעל ומתחת לערכים שנקבעו לא ייחשבו כגופי תאים.
    4. עבור פרמטרים עצביים, התאם את הדברים הבאים כמתואר להלן.
      1. סינון: הוא מפחית את המיסוך של פגמים בכלי דם קטנים ופסולת. בחר בין האפשרויות ללא, טוב יותר והטוב ביותר. בחר ללא רק עבור תרבויות וכלי נקיים מאוד. בחר טוב יותר לעיבוד מהיר יותר על חשבון אובדן זיהוי של נוירוטים עדינים מאוד. זה עשוי להיות מספיק עבור תאים עם neurites עבה או ניגודיות גבוהה; כמו כן, זה יכול להיות שימושי עבור כלי עם פגמים רבים או פסולת. בחר Best לקבלת זמן עיבוד ארוך יותר, אך זוהי הגדרת המסנן הרגישה ביותר כדי להבטיח זיהוי של נוירונים עדינים מאוד.
      2. רגישות לנוירונים: השתמש כדי להתאים את רגישות הזיהוי. הגדל את הרגישות כדי לזהות נוירונים עדינים יותר. זה נע בין 0.25 (פחות) ל 0.75 (יותר).
        הערה: היא מגבירה או מפחיתה את רגישות התוכנה לזיהוי עצבים. אם המחוון מועבר לכיוון 0.25 (פחות), התוכנה תהיה מחמירה יותר בזיהוי שלה של neurites. במקום זאת, אם המחוון יוזז לכיוון 0.75 (יותר), התוכנה תהיה פחות קפדנית בזיהוי זה, ולכן, יותר פגמים (כלומר, פסולת תאים, לכלוך) ייחשבו neurites.
      3. רוחב נוירוט (מיקרומטר): השתמש בו כדי לכוונן את הזיהוי לגודל הנוירונים. זה יכול להיות 1, 2 או 4. על ידי הגדלתו, העצבים הדקים יותר לא ייחשבו. הגדר אותו ל-1 עבור תרביות נוירונים חושיים ראשוניים למבוגרים ו-2 עבור קווי תאים ותרביות נוירונים חושיים עובריים.
  4. לחצו על 'תצוגה מקדימה נוכחית' כדי להציג באופן חזותי את התמונה המקוטעת. המדידות הבאות יסופקו עבור כל תמונה: אורך נוריט (מ"מ/מ"מ2), נקודות הסתעפות נוריט (למ"מ2), אשכולות תא-גוף (למ"מ2) ואזור אשכול תא-גוף (מ"מ2/מ"מ 2).
  5. חזור על שלבים 2.3 ו- 2.4 עבור כל התמונות שנבחרו. לחץ על הבא.
  6. בחר את זמן הסריקה ואת היטב כדי לנתח. הקצה שם הגדרה, ובמידת הצורך, הערות ניתוח. לחץ על הבא > סיום.

3. הגדרה לניתוח תמונה של אימונוציטוכימיה (ICC)

  1. בצע את אותם השלבים המתוארים בין 2.1 ל- 2.4. בחרו בערוצי התמונה של תאי עצב וגרעינים. בחר את ערכת התמונות; בחר כל התמונות עבור כל באר כדי לאמן את האלגוריתם.
  2. מקד את הגדרות הגדרת הניתוח על-ידי התאמת הפרמטרים הבאים כמתואר להלן.
    הערה: כברירת מחדל, תאי עצב מחולקים בכחול, בעוד שגופי תאים הם סגולים. עם זאת, ניתן לשנות את הצבעים לפי הצורך.
    1. פילוח אשכול תאים-גוף: השתמש באפשרות זו כדי לפלח את התמונה לאובייקטים מעניינים. העריכו את בהירות הרקע בכל פיקסל בתמונה. לאחר איתור הרקע, בצע אחת מהאפשרויות הבאות.
      1. ללא חיסור רקע: השתמש באפשרות זו כדי לפלח מבלי לשנות את התמונה המקורית. בחר בין סף אדפטיבי או קבוע. אדפטיבי: הרקע משמש לחיפוש אובייקטים אך לא מופחת במפורש; עם אפשרות זו, ניתן להגדיר את התאמת הסף (GCU). סף קבוע: עצמים בהירים יותר מסף זה מזוהים בתמונה המקורית; עם אפשרות זו, ניתן להגדיר את הסף (GCU).
      2. חיסור רקע: השתמש/י באפשרות זו כדי להחסיר את הרקע מהתמונה באמצעות המרת צורה של כובע עליון, ואז החילו עליו סף. עם אפשרות זו, הגדר רדיוס וסף. רדיוס: נעשה שימוש בדיסק ברדיוס זה; הדיסק צריך להיות גדול מספיק כך שהוא לא יתאים לחלוטין לכל אובייקט בתמונה. סף: עצמים בהירים יותר מסף זה מזוהים בתמונה שהוחסרה ברקע.
    2. ניקוי: השתמש באפשרות הבאה כדי לבצע זאת.
      1. מילוי חורים (מיקרומטר2): השתמש באפשרות זו כדי להסיר חורים במסיכת גוף התא הקטנים יותר מהאזור שצוין.
      2. התאמת גודל (פיקסלים): השתמשו באפשרות זו כדי להגדיל (אם חיובי) או לכווץ (אם שלילי) את המסיכה הסגולה במספר הפיקסלים שצוין. הטווח הוא -10 עד +10. הוא מוסיף או מסיר סגול על עצמים בעלי ניגודיות גבוהה כגון תאים מתים ופסולת תאית.
      3. רוחב תא מינימלי (מיקרומטר): השתמש בזה כדי להגדיר את הגודל שבו גופי התא ייחשבו לנוריטים.
    3. מסנני אשכול תא-גוף: השתמש באפשרות הבאה כדי להחיל את המסננים.
      1. שטח (מיקרומטר2): הגדר ערך מינימלי ומקסימלי של שטח גוף התא. ערכים מעל ומתחת לערכים שנקבעו לא ייחשבו כגופי תאים.
    4. פרמטרים של Neurite: השתמש באפשרות הבאה כדי להגדיר אותם.
      1. רגישות גסה של נוריט: השתמש באפשרות זו כדי להתאים את בהירות הנוירונים. יש להגביר את הרגישות אם עוצמת הפלואורסצנטיות של העצבים נמוכה. זה נע בין 0 (פחות) ל 10 (יותר). זה מגביר או מקטין את הרגישות של התוכנה לזהות נוירוטים בהירים פחות. ערכים אופטימליים נעים בין 7 ל -10; שימו לב שאם הוא מוגדר ל-10, סביר מאוד להניח שגם רקע יילקח בחשבון במדידת הנוריט.
      2. רגישות עדינה של עצבים: השתמש באפשרות זו כדי להתאים את רגישות הזיהוי. יש להגביר את הרגישות כדי לזהות נוירוטים עדינים יותר. זה נע בין 0.25 (פחות) ל 0.75 (יותר). זה מגביר או מקטין את הרגישות של התוכנה לזהות נוירוטים עדינים ופחות בהירים. אם המחוון זז לכיוון 0.25 (פחות), התוכנה לא תתייחס לנוירונים חלשים. במקום זאת, אם המחוון מוזז לכיוון 0.75 (עוד) התוכנה תזהה גם נוירוניטים חלשים מאוד (כמעט רקע).
      3. רוחב נוירוט (מיקרומטר): השתמש בו כדי לכוונן את הזיהוי לגודל הנוירונים. זה יכול להיות 1, 2 או 4. על ידי הגדלתו, העצבים הדקים יותר לא ייחשבו. הגדר אותו על 1 עבור תרביות נוירונים חושיים בוגרים ראשוניים, על 2 עבור קווי תאים ותרביות נוירונים חושיים עובריים.

4. ייצוא נתונים

  1. פתח את הניתוח. לחצו על Graph Metrics.
  2. בחר את המדד, נקודות הזמן והבארות המעניינות.
  3. בחר באפשרות הקיבוץ בין 'הכל', 'ללא', 'עמודות', 'שורות' ו'מפת לוחות' המשוכפלת.
  4. לחץ על ייצוא נתונים ובחר את תיקיית היעד, ואם יש צורך, אפשרויות אחרות. ייווצר קובץ .txt.
    הערה: המכונה תספק ערך ממוצע יחיד של המדד שנבחר עבור כל באר. ביאור ידני נדרש במהלך הניתוח כדי לאחזר ערכי תמונה בודדים.

5. ייצוא תמונות

  1. פתח את כלי השיט. לחץ על ייצוא תמונות וסרטים.
  2. בחרו בסוג הייצוא של התמונות.
    1. בחרו באפשרות 'כפי שמוצג' כדי לייצא תמונות כפי שמוצגות. לחץ על הבא ובחר את התמונות המעניינות לייצוא. לחץ על הבא.
      1. בחר את סוג הרצף בין סרט בודד או סדרת תמונות לבין נקודות הזמן. לחץ על הבא.
      2. התאם את אפשרויות הייצוא לפי הצורך ולחץ על הבא. הגדר את תיקיית הפלט, פורמט הקובץ ושם הקובץ ולאחר מכן לחץ על יצא.
    2. בחר As Stored כדי לייצא תמונות בתבנית Raw. בחר את סוג התמונה.
      1. בחר את נקודות הזמן ואת הבארות המעניינות. לחץ על הבא. הגדר את תיקיית הפלט, פורמט הקובץ ושם הקובץ ולאחר מכן לחץ על ייצא.
  3. ייצוא תמונות עם מסיכות הפילוח
    1. פתח את הניתוח. לחץ על הסמל של שכבות תמונה. בחר את מסכות הערוצים הרצויות (פאזה, נוירוט ופאזה, אשכול תא-גוף). בצע את שלב 5.2.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלגוריתם מדידת צמיחת יתר של נוירוטים מסוגל לזהות נוירונים הן ברשתות עצביות והן בתאי עצב בודדים. הוא יוצר מסיכה צהובה שמפלחת עצמים בעלי ניגודיות גבוהה, כגון גופי תאים, פסולת תאית, תאים מתים, צמחי רקמות וצללים. בנוסף, מסכת מג'נטה מופיעה על נוירוטים בעוביים שונים. ערכי אורך העצב מסופקים במ"מ/מ"מ2, המציינים שהאורך האקסונלי חולק בשטח התמונה, שהוא 0.282739 מ"מ2 וקבוע לכל תנאי סריקה. לכן, על מנת לקבל ערכים טהורים של אורך נוירוט במ"מ, המספרים שסופקו על ידי התוכנה צריכים להיות מוכפלים על ידי שטח התמונה.

שיטה חצי אוטומטית לעומת ידנית
התוכנה המשמשת היא מתודולוגיה חצי אוטומטית למדידת אורך האקסונלי הכולל. כדי להעריך את דיוק התוכנה, ערכנו מדידות על אותם תאי עצב בשיטה הידנית גם עם תוסף NeuronJ. כפי שמתואר באיור 1, מסכת הסגמנטציה על תאי העצב דומה מאוד בין שתי השיטות (איור 1A).

בנוסף, ערכנו ניתוח סטטיסטי של הערכים שהתקבלו כדי לבחון את המתאם ביניהם. ניתוח מתאם ספירמן הניב מקדם r גבוה של 0.8526, ולכן סיפק ראיות חזקות לדיוק ולדיוק של האלגוריתם (איור 1B). מדידה אוטומטית דורשת סטנדרטים גבוהים של איכות תרבות המבוססת על ניקיונה, צפיפותה וטוהרה. התוצאות המתקבלות עם פילוח חצי אוטומטי ניתנות לשחזור ואינן מושפעות משיפוט אישי. יכולת שחזור בלתי משוחדת היא בעיה עבור מתודולוגיות ידניות.

לפעמים, שגיאות סגמנטציה חצי אוטומטיות יכולות להתרחש בגלל סיבות שונות. בתמונות ניגודיות פאזה, ניתן היה לזהות לכלוך בתרבית כנוירוטים על ידי סגמנטציה חצי-אוטומטית. יתר על כן, נוכחותם של סוגי תאים שונים יכולה להפריע לתהליך הסגמנטציה. בעיות כאלה אינן מתעוררות עם פילוח ידני כי זה מבוצע על ידי עיניים אנושיות. עם זאת, אם מתעוררות בעיות כאלה, ניתן להתגבר עליהן על ידי שימוש בתמונות אימונוציטוכימיות כבקרה.

פילוח של נוירוטים
עבור תרביות ראשוניות של נוירוני DRG בוגרים, נקודת המוצא האופטימלית לניתוח פאזה אמין היא שיהיו תאי עצב מצופים באופן אחיד בתרבית הבאר והנקייה. אם מתרחשות טעויות במהלך הזריעה והתאים מתרכזים בנקודה אחת, כפי שמודגם באיור 2A-B, הערכים יהיו יותר הערכה מאשר השתקפות קרובה של המציאות. במצבים כאלה, המסכה הצהובה תכסה את רוב תאי העצב שבין התאים (איור 2A-B), וכך יאבדו את אורך תאי העצב. יתר על כן, התוכנה תהיה מוטה באופן משמעותי בזיהוי של נוירוריטים, וסביר מאוד להניח שמסכת מגנטה תופיע על עצמים שאינם נוירוטים (איור 2D). בתמונה אופטימלית, צריכים להיות עד 15 נוירונים בהגדלה של פי 20.

כאשר תאי העצב מצופים כראוי והתרבית נקייה, כפי שמודגם באיור 3A-B, מומלץ להתאים את מחוון הסגמנטציה לכיוון הרקע (0.5 - 0.7; איור 3C). הדבר מסייע להפחית את הרכיב הצהוב שיופיע על עצמים בעלי ניגודיות גבוהה בתמונה, כגון נקודות הסתעפות שאמורות להיות במגנטה. יתר על כן, אם תאי עצב הם מודגשים, רגישות לנוירוטים בין 0.4 ל-0.5 אמורה להספיק כדי לכסות את רובם (איור 3C-D).

מצב נפוץ נוסף שיכול להיווצר הוא תרבית מלוכלכת עם פסולת תאים רבים ותאים מתים, כפי שמוצג באיור 4A-B. בתנאים כאלה, ישנם אובייקטים רבים בעלי ניגודיות גבוהה. לכן, מומלץ להגדיל את גודל המסכה הצהובה על ידי התאמת מחוון הפילוח לכיוון התא או על ידי הגדלת פרמטר גודל ההתאמה (+1, +2 וכן הלאה; איור 4C). עם זאת, יהיה זה שימושי גם להפחית מעט את הרגישות לנוריט כדי למנוע מהתוכנה לזהות באופן שגוי כאובייקטים עצביים שאינם נוירוטים ככאלה. (איור 4C-D).

לפעמים, תאי עצב יכולים להיראות דקים וחיוורים מאוד, כפי שמוצג באיור 5A-B, מה שמציב אתגרים לתוכנה לפלח אותם במדויק (איור 5D). במקרה זה, מומלץ להגדיל את הרגישות לנוירוטים לפחות ל-0.6 (איור 5C). אולם זכרו שככל שהרגישות גבוהה יותר, כך גדלה ההסתברות שהתוכנה תסמן באופן שגוי עצמים שאינם נוירונים ככאלה (איור 5D). ניתן לנקוט אמצעי זהירות מסוימים כדי למנוע מהטיה של הרגישות לגדול יותר מדי, לדוגמה, על ידי התאמת מחוון הפילוח לכיוון תאים. עם זאת, אם תאי עצב דקים מכדי שניתן יהיה לזהות אותם על ידי התוכנה, ערכי אורך הנוריט יהיו מוטים ללא קשר.

במקרה של תמונות אימונוציטוכימיה, הבעיה העיקרית טמונה ברקע. מלבד תנאי הזריעה שלגביהם חלים הכללים הנ"ל, המקור העיקרי להטיה הוא הפלואורסצנטיות עצמה. התוכנה מזהה ביעילות תאי עצב בהירים מאוד, בעוד שתאי עצב דקים יותר ופחות אינטנסיביים נותרים מאחור (איור 6A-B). כדי למנוע אובדן של אורך הנוריט, ניתן להגדיל את הרגישות העדינה של העצב עד 0.75 (איור 6C). עם זאת, מומלץ מאוד להפחית את הרגישות הגסה של הנוריט ל-8-9 לפחות כדי למנוע הטיית גילוי מוגזמת על-ידי התחשבות בתאי עצב ברקע (איור 6C-D). אם האחרון אינו מצטמצם, כל הרקע יהיה מפולח, כפי שמתואר באיור 7.

בעיה נפוצה ברכישת פלואורסצנטיות היא פיזור האור. לעתים קרובות, תמונות אימונוציטוכימיות מציגות פנסים בתמונה, אשר משפיעים באופן משמעותי על איכות ודיוק הניתוח (איור 8A-B). במצב כזה, לא ניתן לעשות הרבה כדי לשפר את הניתוח, והערכים יהיו יותר אומדן. פיזור אור מפריע לזיהוי תאי עצב כך שרק תאי עצב בהירים מאוד יזוהו (איור 8C-D). בעיה נוספת בתמונות אימונוציטוכימיה היא איכות הצביעה כשלעצמה. לעתים קרובות, עקב טעויות אנוש, אקסונים יכולים להישבר (איור 9A), וגופי תאים יכולים להיקרע במהלך שטיפות (איור 9B). טעויות אלה מהוות בעיה קריטית מכיוון שערכי אורך העצב מאבדים דיוק ודיוק. כתוצאה מכך, הפרשנות של נתונים ביולוגיים משתנה, מה שמוביל למסקנות שגויות.

עבור תרבויות עובריות, המצב שונה. בסוג זה של תרבית, נוכחותם של תאי גלייה היא הדומיננטית. כתוצאה מכך, השגיאות גדלות באופן משמעותי ככל שהתוכנה מזהה גם את הרירית של תאי גלייה (איור 10A-B). כדי למזער בעיה זו, יש להזיז את מחוון הפילוח לכיוון תאים, בדרך כלל סביב ערכים של 1.7-2 (איור 10C-D). גישה זו מבטיחה שרוב תאי הגליה מכוסים על ידי המסכה הצהובה ולכן אינם נלקחים בחשבון במדידת אורך העצב. עצה שימושית נוספת היא לשמור על רוחב הנוירוט על 2, מאחר שתאי עצב עובריים בתרבית בדרך כלל מציגים צורות דו-קוטביות או חד-קוטביות עם נוירוטים עבים (איור 10C-D). אמצעי זהירות זה מסנן את רוב הרירית של תאי גלייה שהם בדרך כלל דקים מאוד. לבסוף, היזהר לא להגדיל את הרגישות neurite יותר מדי; אחרת, מה שסונן על ידי פרמטר רוחב הנוריט ייכלל שוב במדידת אורך הנוריט.

במקרה של תרביות עובריות, שבהן מרכיב תאי הגליה הוא השולט, אימונוציטוכימיה עשויה להיות האפשרות הטובה יותר. על-ידי צביעה ספציפית של תאי עצב, בעיית הסגמנטציה של תאי גליה נפתרת מאחר שגליה לא תהיה מוכתמת, מה שהופך את הניתוח להרבה יותר קל ומדויק (איור 11).

לבסוף, התוכנה יכולה להיות מנוצלת גם כדי להעריך את תוכנית ההתמיינות של קווי תאים ו / או iPSCs כדי להעריך את מצב הצמיחה שלהם. לפיכך, היישום של פרמטרים דומים ואמצעי זהירות ניתן להשתמש למטרות שונות.

בנוגע לתהליך ההתמיינות, חוסנה של התוכנה הוכח בקו התאים NSC-34 (קו תאים היברידי המורכב מתאי נוירובלסטומה של עכברים ומוטונוירונים הנגזרים מחוט השדרה של עוברי עכברים) במהלך ההבשלה לתאים דמויי מוטונוירונים. באשר לתרביות ראשוניות של DRG, נקודת המוצא האופטימלית לניתוח טוב היא זריעת תאים אחידה. ניתן לעקוב אחר התאים הבלתי ממוינים והממוינים, לאחר טיפול בחומצה רטינואית, באמצעות רכישות במהלך כל תקופת התרבית או כפי שמוצג באיור 12, בנקודת הזמן האחרונה.

ואכן, בנוסף לאורך הנוריט, האלגוריתם מספק גם את פרמטר נקודת ההסתעפות. עם זאת, חשוב לציין כי פרמטר נקודת ההסתעפות אינו מייצג את המספר המדויק של נקודות הסתעפות; במקום זאת, הוא מציין את צפיפות ההסתעפות בתמונה כפי שהיא מבוטאת במ"מ/מ"מ2. מדידה זו מושפעת באופן משמעותי מפסולת בתרבית ומריכוז הזריעה. לכן, צפיפות הנוירונים בתמונה וניקיון התרבות הם גורמים מכריעים להשגת ערכים אמינים. אם התרבית מציגה פסולת תאים רבים, שאינה מסוננת על ידי המסכה הצהובה, הם ייכללו באורך הנוריט וכן במדידת נקודת ההסתעפות.

כתוצאה מכך, מומלץ לנרמל ערכים אלה עבור ספירת התא, שכן מספר תאי העצב בתמונה משפיע על אורך הנוירוט ועל מדידות נקודות ההסתעפות.

פילוח גופי תאים
בין כל הפרמטרים שמספקת המערכת, ישנם אשכול תא-גוף ואזור אשכול תא-גוף. עם זאת, שני פרמטרים אלה אינם אמינים לשימוש כערכים לספירת תאים. כפי שמודגם באיור 4, התוכנה מפלחת עצמים בעלי ניגודיות גבוהה במסכה הצהובה, כולל צללים הנגרמים כתוצאה מתנועה בינונית בבאר. נוסף על כך, הוא גם מפלח תאים מתים ופסולת תאית (איור 4). כדי לקבל ספירת תאים אמינה של תאי העצב הגדלים, ניתן להשתמש בשיטה ידנית, כמו הכלי Cell Counter בפיג'י (איור 13).

סיכום של פרמטרי הניתוח המוצעים ממוינים לפי סוג התרבית מוצג בטבלה 1 עבור תמונות פאזה ובטבלה 2 עבור תמונות אימונוציטוכימיות. יתר על כן, סיכום של פרמטרי הניתוח המוצעים לפתרון בעיות ספציפיות מובא בטבלה 3.

figure-results-1
איור 1: ניתוח מתאם בין סגמנטציה ידנית וחצי אוטומטית של תאי עצב. (A) משמאל, תמונת פאזה מייצגת של תא עצב המקוטע עם תוסף NeuronJ בפיג'י. מימין, תמונת פאזה מייצגת של נוירון מקוטעת עם התוכנה החצי-אוטומטית. (B) רגרסיה ליניארית פשוטה שרצה על 20 תאי עצב נותחה בשיטות ידניות וחצי אוטומטיות. מקדם מתאם ספירמן r = 0.8526, p**** < 0.0001. התמונות נרכשו 48 שעות לאחר הזריעה. הגדלה פי 20. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. הדמות נוצרה עם BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: שגיאת זריעה בתרבית נוירונים חושיים בוגרים. (A) תמונת פאזה מייצגת של שגיאת הזריעה. (B) נציג תמונה מפולח אוטומטית. המסכה הצהובה מקלחצת את גופי התא, מסכת המג'נטה מקלחת את העצבים. (C) פרמטרים להמחשה של ניתוח צמיחת עצבים. (D) לוח עליון: זום על השגיאה של פילוח גוף התא (מסיכה צהובה) עקב קיבוץ של גופי תאים. פאנל תחתון: זום על השגיאה של סגמנטציה עצבית (מסכת מגנטה) עקב פסולת תאית. התמונות נרכשו 48 שעות לאחר הזריעה. הגדלה פי 20. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. הדמות נוצרה עם BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תרבית אידיאלית של נוירונים חושיים בוגרים לניתוח צמיחת עצבים. (A) תמונת פאזה מייצגת של מצב זריעה אידיאלי לניתוח צמיחת עצבים. (B) נציג תמונה מפולח אוטומטית. המסכה הצהובה מקלחצת את גופי התא, מסכת המג'נטה מקלחת את העצבים. (C) פרמטרים להמחשה של ניתוח צמיחת עצבים. (D) זום על סגמנטציה של גוף התא (מסכה צהובה) ועל סגמנטציה של נוירוטים (מסכת מגנטה). התמונות נרכשו 48 שעות לאחר הזריעה. הגדלה פי 20. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. הדמות נוצרה עם BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: אלמנטים מטרידים בניתוח צמיחת תאי עצב בתאי עצב חושיים בוגרים. (A) תמונת פאזה מייצגת של פסולת תאית וצללים כתוצאה מתנועות בינוניות. (B) נציג תמונה מפולח אוטומטית. המסכה הצהובה מקלחצת את גופי התא, מסכת המג'נטה מקלחת את העצבים. (C) פרמטרים להמחשה של ניתוח צמיחת עצבים. (D) זום על השגיאה של סגמנטציה של גוף התא (מסכה צהובה) וסגמנטציה של נוירוטים (מסכת מגנטה) עקב פסולת תאים וצללים של התווך הנע. התמונות נרכשו 48 שעות לאחר הזריעה. הגדלה פי 20. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. הדמות נוצרה עם BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: תאי עצב דקים בניתוח צמיחת תאי עצב בתאי עצב חושיים בוגרים. (A) תמונת פאזה מייצגת של תאי עצב המאופיינים בתאי עצב דקים מאוד. (B) נציג תמונה מפולח אוטומטית. המסכה הצהובה מקלחצת את גופי התא, מסכת המג'נטה מקלחת את העצבים. (C) פרמטרים להמחשה של ניתוח צמיחת עצבים. (D) פאנל עליון: זום על אובדן אורך הנוריט עקב מגבלות זיהוי של סגמנטציה של עצבים (מסכת מג'נטה). פאנל תחתון: זום על השגיאה של סגמנטציה עצבית (מסיכת מגנטה) על עצמים זרים. התמונות נרכשו 48 שעות לאחר הזריעה. הגדלה פי 20. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. הדמות נוצרה עם BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: בהירות תאי עצב בניתוח צמיחת תאי עצב בתרבית תאי עצב חושיים בוגרים. (A) תמונה אימונוציטוכימית מייצגת (סמן עצבי Tuj1) של תאי עצב המאופיינים בנוריטים בהירים ועבים מאוד. (B) נציג תמונה מפולח אוטומטית. המסכה הסגולה מפלחת את גופי התא, המסכה הכחולה מפלחת את העצבים. (C) פרמטרים להמחשה של ניתוח צמיחת עצבים. (D) פאנל עליון: זום על שגיאת פילוח גוף התא (מסיכה סגולה) בשל עובי העצבים. פאנל תחתון: זום על אובדן אורך הנוירוט עקב בהירות פלואורסצנטית אינטנסיבית של נוירוריטים עבים. התמונות נרכשו 48 שעות לאחר הזריעה. הגדלה פי 20. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. הדמות נוצרה עם BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: פלואורסצנטיות רקע בניתוח צמיחת עצבים בתרבית תאי עצב חושיים בוגרים. (A) תמונה אימונוציטוכימית מייצגת (סמן עצבי Tuj1) של רעש פלואורסצנטי גבוה ברקע. (B) נציג תמונה מפולח אוטומטית. המסכה הסגולה מפלחת את גופי התא, המסכה הכחולה מפלחת את העצבים. (C) פרמטרים להמחשה של ניתוח צמיחת עצבים. (D) זום על שגיאת הסגמנטציה של העצב (מסכה כחולה) עקב הפרעה של פלואורסצנטיות הרקע. התמונות נרכשו 48 שעות לאחר הזריעה. הגדלה פי 20. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. הדמות נוצרה עם BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 8: פיזור אור בניתוח צמיחת תאי עצב של תאי עצב חושיים בוגרים. (A) תמונה אימונוציטוכימית מייצגת (סמן עצבי Tuj1) של פיזור האור. (B) נציג תמונה מפולח אוטומטית. המסכה הסגולה מפלחת את גופי התא, המסכה הכחולה מפלחת את העצבים. (C) פרמטרים להמחשה של ניתוח צמיחת עצבים. (D) פאנל עליון: זום על אובדן אורך הנוירוט עקב הפרעה של פיזור האור. לוח תחתון: זום על שגיאת פילוח גוף התא (מסיכה סגולה). התמונות נרכשו 48 שעות לאחר הזריעה. הגדלה פי 20. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. הדמות נוצרה עם BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9
איור 9: טעויות המשפיעות על איכות הליך הצביעה המפריעות לניתוח צמיחת עצבים של תרבית נוירונים חושיים בוגרים. (A) משמאל, תמונת פאזה מייצגת של נוירונים חושיים בוגרים. מימין, תמונה אימונוציטוכימית מייצגת (סמן עצבי Tuj1) של נוירוטים שבורים עקב שטיפה בהליך הצביעה. (B) משמאל, תמונת פאזה מייצגת של נוירונים חושיים בוגרים. מימין, תמונה אימונוציטוכימית מייצגת (סמן עצבי Tuj1) של הסרת גוף התא עקב שטיפות של הליך הצביעה. התמונות נרכשו 48 שעות לאחר הזריעה. הגדלה פי 20. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. הדמות נוצרה עם BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-10
איור 10: תרבית נוירונים חושית עוברית אידיאלית (E13.5) לניתוח צמיחת עצבים. (A) תמונת פאזה מייצגת של תנאי זריעה אידיאלי לניתוח צמיחת עצבים בתרבית נוירונים חושיים עובריים. (B) נציג תמונה מפולח אוטומטית. המסכה הצהובה מקלחצת את גופי התא, מסכת המג'נטה מקלחת את העצבים. (C) פרמטרים להמחשה של ניתוח צמיחת עצבים. (D) זום על סגמנטציה של גוף התא (מסכה צהובה) ועל סגמנטציה של נוירוטים (מסכת מגנטה). התמונות נרכשו 24 שעות לאחר הזריעה. הגדלה פי 20. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. הדמות נוצרה עם BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-11
איור 11: תרבית נוירונים חושית עוברית אידיאלית (E13.5) לניתוח צמיחת נוירונים עצביים. (A) תמונה אימונוציטוכימית מייצגת (סמן עצבי Tuj1) של תרבית נוירונים חושיים עובריים אידיאלית לניתוח צמיחת עצבים. (B) נציג תמונה מפולח אוטומטית. המסכה הסגולה מפלחת את גופי התא, המסכה הכחולה מפלחת את העצבים. (C) פרמטרים להמחשה של ניתוח צמיחת עצבים. (D) זום על פילוח גוף התא (מסכה סגולה) ועל סגמנטציה של תאי עצב (מסכה כחולה). התמונות נרכשו 24 שעות לאחר הזריעה. הגדלה פי 20. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. הדמות נוצרה עם BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-12
איור 12: תאי NSC-34 ממוינים הגדילו את תאי העצב ואת ההסתעפות בהשוואה לבקרות לא ממוינות. תמונות מייצגות של תאי NSC-34. לוח עליון: תאי NSC-34 לא ממוינים (בקרה). פנל תחתון: תאי NSC-34 ממוינים לאחר 96 שעות של טיפול בחומצה רטינואית. בצד שמאל של שני החלוניות, תמונות עם ניגודיות פאזה, ואילו בצד ימין של שני החלוניות, תמונות מפולחות אוטומטית (סומא בצהוב, נוירוטים במגנטה). התמונות נרכשו 96 שעות לאחר הזריעה. הגדלה פי 10. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. הדמות נוצרה עם BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-13
איור 13: הכלי מונה תאים בפיג'י. ספירת תאים ידנית בוצעה על תמונת פאזה של מצב זריעה אידיאלי לניתוח צמיחת עצבים. הגדלה פי 20. הדמות נוצרה עם BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סוג התרבותתרבות DRG למבוגרים (שלב)תרבית DRG עוברית (שלב)NSC-34 (שלב)
הגדלהפי 20פי 20פי 10
מצב סגמנטציהבהירותבהירותבהירות
התאמת סגמנטציה0.5 - 0.71.7 - 21
התאמת גודל (פיקסלים)0, +1, +20, +10
סינוןהטוב ביותרהטוב ביותרהטוב ביותר
רגישות לנוירוטים0.4 - 0.50.25 - 0.40.3 - 0.5
רוחב נוריט122

טבלה 1: סיכום פרמטרים מוצעים להגדרת ניתוח עבור תרביות נוירונים חושיים בוגרים, תרביות נוירונים חושיים עובריים (E13.5) ותרביות NSC-34 בתמונות ניגודיות פאזה.

סוג התרבותתרבות DRG למבוגרים (ICC)תרבית DRG עוברית (ICC)
הגדלהפי 20פי 20
מצב סגמנטציהבהירותבהירות
התאמת סגמנטציה0.5 - 0.71.7 - 2
התאמת גודל (פיקסלים)0, +1, +20, +1
סינוןהטוב ביותרהטוב ביותר
נוירוט רגישות גסה8 - 98 - 9
רגישות עדינה לנוירוטעד 0.750.5 - 0.75
רוחב נוריט12

טבלה 2: סיכום הפרמטרים המוצעים להגדרת ניתוח עבור תרביות נוירונים חושיים בוגרים, תרביות נוירונים חושיים עובריים (E13.5) ותרביות NSC-34 בתמונות אימונוציטוכימיות.

בעיההצעות
תרבות מלוכלכתהתאמת מחוון הפילוח לכיוון תאים
הגדלת פרמטר גודל ההתאמה (+1,+2...)
ירידה קלה ברגישות לנוירונים
נוירוטים חיוורים/דקיםהגדל את הרגישות העצבית (לפחות 0.6)
התאם את מחוון הפילוח לכיוון תאים.
נוירוטים דקים ב-ICCהגברת רגישות עדינה לנוירוטים (עד 0.75)
הפחתת רגישות גסה של נוירוט (לפחות ל 8-9)
תאי גליההתאמת מחוון הפילוח לכיוון תאים (1.7-2)
רוחב נוירוט ב- 2

טבלה 3: סיכום הפרמטרים המוצעים להגדרת ניתוח לפתרון בעיות ספציפיות בסוגים שונים של תרבויות.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדידה מדויקת של האופן שבו תאי עצב גדלים בתנאים בריאים, פצועים וחולים היא פרמטר קריטי במערכי ניסויים רבים בתחום מדעי המוח. בין אם עובדים עם תרביות אורגנוטיפיות של צמחי DRG שלמים או תרבויות מנותקות, מדידה נכונה של צמיחה אקסונלית הייתה אתגר משמעותי במהלך 20 השנים האחרונות. ללא כימות אמין ומדויק של צמיחת נוירוטים, לא ניתן להעריך אם טיפול ספציפי, כגון חומצה רטינואית (במשך 4 ימים) עבור תאי NSC-3434 או נוירוטרופינים (במשך 1-2 ימים) עבור נוירוני DRG עובריים 14,35, היה יעיל. נוירונים בדרך כלל מפגינים צמיחה מתמשכת כאשר הם בריאים; עם זאת, לאחר פציעה קצב הצמיחה האקסונלי עולה12,13. תזמון הוא קריטי בעת מדידת צמיחה אקסונלית; לכן, לפני תחילת הניסוי, חיוני לבצע מבחן ניסוי כדי לקבוע את הזמן האופטימלי לתיקון התאים בהתבסס על עקומת קצב הצמיחה שלהם.

הבחירה בשיטה, ידנית או אוטומטית, מסמנת קו פרשת מים מבחינת השקעת זמן ודיוק. חלק מהשיטות הידניות הנפוצות ביותר כוללות NeuronJ18,20 ו- Metamorph (Visitron)2,22,28. שיטות ידניות דורשות מהמשתמשים לעקוב באופן ידני אחר נוירוטים, דבר הגוזל זמן רב ודורש תמונות של תא בודד. עם פילוח ידני של נוירונים, רשתות עצביות הן לגמרי מחוץ להישג יד. בדרך כלל, מתודולוגיות אלה מודדות רק את האקסון הארוך ביותר או משתמשות במדידת המרחק הווקטורי, ובכך מאבדות מידע חשוב כגון מספר נקודות ההסתעפות והאורך האקסונלי הכולל. שיפור מסוים מסופק על ידי ניתוח שול30, אשר בכל מקרה מוגבל לתנאים של תא בודד. אנליזה של תא בודד מציבה מספר אתגרים, החל מזריעת תאים. תאי עצב חייבים להיות מצופים בריכוז נמוך מאוד, אשר לא יכול להיות תנאי הגידול המתאים ביותר עבור כל סוג התא. בעיה נוספת עולה מרכישת תמונות. בדרך כלל, המיקרוסקופ הקונפוקלי מנוצל להדמיה, הדורשת משתמשים מיומנים ונוירונים פלואורסצנטיים ואינה חסכונית בזמן או בעלות. בעזרת המיקרוסקופ הקונפוקלי מתקבלות תמונות ברזולוציה גבוהה, אך מעט מאוד תאי עצב מצולמים מכל ניסוי. זה מייצג מגבלה מכיוון שיש צורך בשכפולים ביולוגיים נוספים כדי להגיע למספר מספיק של נוירונים.

כמה מתודולוגיות אוטומטיות כגון NeuroMath 2,28 פותרות את הבעיה של סגמנטציה עצבית גוזלת זמן אשר מבוצעת באופן אוטומטי.

עם זאת, בשל אילוצי זמן, מודול מדידת צמיחת עצבים זה מספק תוצאות מהירות יותר בעת רכישת תמונות במכונת המיקרוסקופ בהילוך מהיר. האחרון, יחד עם תוכנה זו, משפר באופן משמעותי את הזמן ואת יעילות העלות עבור התלמידים והחוקרים הראשיים.

מכונת הרכישה מאפשרת יצירת מפה שלמה למדי של הבאר, רכישת מספר משתנה של תמונות המבוססות על קוטר הבאר. זה מייצג יתרון משמעותי כאשר נוירונים מרובים מקבלים הדמיה בו זמנית. עם זאת, הגעה להגדלה של פי 20 בלבד מספיקה ומתאימה לניתוח התמונות באמצעות התוכנה. כוחו נשען על יכולתו להתאמן על סט תמונות ולבצע מדידה חצי אוטומטית של אורך האקסונלי הכולל. בנוסף, התוכנה יכולה לעבוד הן על נוירונים בודדים והן על רשתות נוירונים. התוכנה מסוגלת לפלח נוירוטים וגופי תאים עם שתי מסכות שונות. מסיכה צהובה מפלחת את כל העצמים בעלי הניגודיות הגבוהה בתמונה, כגון גופי תאים, פסולת תאים וצללים. מסכת מג'נטה, במקום זאת, מקלחת נוירוטים. הדיוק והדיוק של התוכנה הוכחו על ידי פילוח של אותם נוירונים הן עם התוכנה והן עם NeuronJ. מנקודת מבט של ניתוח סטטיסטי, הערכים של אורכי עצבים מתואמים יפה עם מקדם מתאם ספירמן גבוה.

לאחר הערכת אמינות השיטה, עברנו לניתוח תנאי הבדיקה השונים. לניתוח אופטימלי, נדרשים אמצעי זהירות מסוימים. ראשית, נוירונים צריכים להיות זרע באופן אחיד בבאר, הימנעות כתמים עם ריכוז תאים גבוה. התקבצות תאי העצב גורמת לתוכנה לאבד דיוק בזיהוי הנוירוטים. משתנה נוסף המשפיע על הדיוק והדיוק של הניתוח הוא ניקיון התרבות. עדיף תרבית נקייה עם מעט פסולת תאית ותאים מתים. עם זאת, התוכנה מסוגלת לפצות על בעיות כאלה על ידי אפנון של רגישות neurite ואת מסכת פילוח גוף התא. כאמור, המסכה הצהובה מקלחת עצמים בעלי ניגודיות גבוהה, ביניהם יש גם צללים הנגרמים מתנועת המדיום בבאר. הצללים עשויים לכסות את הנוירוטים, ובכך לגרום לאובדן אורך הנוריט. עם זאת, בעיה כזו נפתרת בקלות על ידי מתן אפשרות למדיום להתיישב לפני רכישת תמונה.

האלגוריתם מסוגל לבצע כימות אורך עצבי הן בתמונות ניגודיות פאזה והן בתמונות אימונוציטוכימיה. כאשר פלואורסצנטיות מעורבת, יש לנקוט אמצעי זהירות אחרים על מנת לקבל ניתוח אמין. ראשית, איכות הכתם משפיעה עמוקות על תוצאות הניתוח. אם נוירוטים שבורים או מקוטעים וגופי תאים נקרעים במהלך שטיפות, הניתוח מאבד כוח ואמינות. בנוסף, הפלואורסצנטיות עצמה מייצגת אלמנט שעלול להטריד את הניתוח. מכיוון שהמיקוד מבוצע באופן אוטומטי על ידי המכונה, המטרה ממקדת עצמים בהירים מאוד כגון חפצים, גופי תאים או נוירונים עבים. כתוצאה מכך, נוירוטים דקים יותר ובהירים פחות נותרים מאחור, מה שמקשה על המשתמש למדוד כראוי את אורך הנוריט.

כתוצאה מכך, ניתוח תמונות פאזה עשוי להיות מבוסס יותר בהשוואה לניתוח של תמונות אימונוציטוכימיות. התוכנה מסוגלת לעבוד על מורפולוגיות עצביות רבות ושונות מהמורכבות והמשוכללות ביותר לפשוטות ביותר, או כתאים בודדים או ברשתות עצביות. לכן, ניתן להשתמש בו בתחומי מחקר רבים ושונים, החל מתרביות ראשוניות של נוירונים המגיעים ממערכת העצבים המרכזית או ההיקפית בשלבי התפתחות שונים ועד נוירונים וקווי תאים שמקורם ב- iPSC כגון NSC-34.

למרות הפוטנציאל המשמעותי של התוכנה, ניתן לציין כמה מגבלות. ראשית, הדיוק של פילוח גוף התא הוא תת-אופטימלי. כתוצאה מכך, פרמטרים כגון אשכול גוף התא ואזור אשכול גוף התא אינם יכולים לשמש באופן אמין לספירת תאים. שנית, בנוסף לאמצעי הזהירות הדרושים לסגמנטציה אופטימלית של הנוירוטים, אקסונים לא עבים מספיק עשויים להיות מחוץ למדידת אורך הנוריט, ובכך לגרום לאובדן נתונים.

פרמטר נקודת ההסתעפות נתקל בבעיות הקשורות לשני סוגי הסגמנטציה. צללים, תאים מתים או פסולת בתרבית הממוקמים על נקודות הסתעפות מסתירים אותם כשהם מכוסים על ידי פילוח גוף התא. יתר על כן, במקרה של נוירוטים דקים, האמינות של פרמטר נקודת ההסתעפות שוב נפגעת קשות.

יתר על כן, המיקוד האוטומטי במהלך רכישת התמונה יכול לפעמים להיות לא אופטימלי. ההגדלה המקסימלית של המכונה מוגבלת פי 20, מה שעשוי להיות לא מספיק לצפייה בפרטים עדינים יותר או פלואורסצנטיות במבנים דקים כגון נוירוטים. בנוסף, המכונה מתפקדת בצורה הטובה ביותר עם מצעי פלסטיק הומוגניים. אם הוכנס כיסוי זכוכית לבאר, המיקוד על הזכוכית עלול להיכשל, וכתוצאה מכך תמונות מטושטשות חלקית. עם זאת, תוכנה זו חלה לא רק על נוירונים אלא גם על תחומי מחקר שונים לחלוטין, כגון צמיחה פטרייתית36.

בהתחשב בכל הדברים, אנו מאמינים שמודול מדידת צמיחת עצבים זה הוא כלי אמין למדידת נוירונים במהירות, ללא משוא פנים וביעילות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי המחקר נערך ללא כל קשרים מסחריים או פיננסיים שעלולים ליצור ניגוד אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו רוצים להודות לאלסנדרו ורצ'לי על ההערות הביקורתיות ועל התמיכה הטכנית של סרטוריוס לעזרה. המחקר שלנו בנושאים אלה נתמך בנדיבות על ידי מענק ריטה-לוי מונטלצ'יני 2021 (MIUR, איטליה). מחקר זה מומן על ידי Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027 למחלקה למדעי המוח ריטה לוי מונטלצ'יני. המחקר של ד.מ.ר נערך במהלך ובתמיכת קורס הדוקטורט הבין-אוניברסיטאי הלאומי האיטלקי בפיתוח בר קיימא ושינויי אקלים (קישור: www.phd-sdc.it).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קולגנאז AMerck / Roche10103586001
Dispase II (פרוטאז ניטרלי, דרגה II)Merck / Roche4942078001
Dulbecco's Modified Eaggle's MediumMerck / SigmaD5796
סרום בווין עוברי Merck / SigmaF7524
Ham's F-12 Nuttrient Mix (1X)ThermoFisher Scientific21765029
Ham's F12 עם L-גלוטמיןEurocloneECM0135L
תמיסת מלח מאוזנת של הנקסEurocloneECM0507L
HBSS (10X), ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדוםThermoFisher Scientific14185045
HyClone מאפיין סרום בקר עוברי (ארה"ב)CytivaSH30071.03
Incucyte, תוכנת ניתוח Neurotrack Sartorius9600-0010
L-15 בינוני (לייבוביץ)Millipore/SigmaL5520
חלבון עכבר למינין, טבעיThermoFisher Scientific23017015
L-ציסטאיןMerck / SigmaC7352
L-15 בינוני של לייבוביץ עם L-גלוטמיןEurocloneECB0020L
עכבר NGF 2.5S (>95%)Alomone LabsN-100
Neurobasal Medium [-] גלוטמיןThermoFisher Scientific21103049
NSC-34CELLutions Biosystems Inc (אונטריו, קנדה)CLU140
פפאין מלטקס פפאיהSigmaP4762
פניצילין-סטרפטומיצין (5,000 יחידות / מ"ל)ThermoFisher Scientific15070063
Percoll ( צפיפות 1.130 גרם/מ"ל)של Cytiva
(1 מ"ג/מ"ל)EMD Millipore/MerckA-003-E
תמיסת פולי-ליזין (0-01%)SigmaP4832
רקומביננטי אנושי NT-3PeproTech450-03
חומצה רטינואיתMerck / SigmaR2625
תמיסת טריפסין-EDTAסיגמאT3924
β-Tubulin III (Tuj1) נוגדןMerck / SigmaT8660
תמיסת פולי-די-ליזין 17089101

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359, 1416-1421 (2018).
  2. Marvaldi, L., et al. Enhanced axon outgrowth and improved long-distance axon regeneration in sprouty2 deficient mice. Dev Neurobiol. 75, 217-231 (2015).
  3. Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. J Cell Biol. 218, 1871-1890 (2019).
  4. Marvaldi, L., et al. Importin α3 regulates chronic pain pathways in peripheral sensory neurons. Science. 369, 842-846 (2020).
  5. Gangadharan, V., et al. Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting. Nature. 606, 137-145 (2022).
  6. Testa, L., Dotta, S., Vercelli, A., Marvaldi, L. Communicating pain: emerging axonal signaling in peripheral neuropathic pain. Front Neuroanat. 18, (2024).
  7. Thongrong, S., et al. Sprouty2 and -4 hypomorphism promotes neuronal survival and astrocytosis in a mouse model of kainic acid induced neuronal damage. Hippocampus. 26, 658-667 (2016).
  8. Yaron, A., Schuldiner, O. Common and divergent mechanisms in developmental neuronal remodeling and dying back neurodegeneration. Curr Biol. 26, R628-R639 (2016).
  9. Maor-Nof, M., et al. Axonal degeneration is regulated by a transcriptional program that coordinates expression of pro- and anti-degenerative factors. Neuron. 92, 991-1006 (2016).
  10. Bromberg, K. D. Regulation of neurite outgrowth by Gi/o signaling pathways. Front Biosci. 13, 4544-4557 (2008).
  11. Girouard, M. P., et al. Collapsin response mediator protein 4 (CRMP4) facilitates wallerian degeneration and axon regeneration following Sciatic nerve injury. eNeuro. 7, (2020).
  12. van Erp, S., et al. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594(2021).
  13. Wang, X., et al. Driving axon regeneration by orchestrating neuronal and non-neuronal innate immune responses via the IFNγ-cGAS-STING axis. Neuron. 111, 236-255 (2023).
  14. Kaselis, A., Treinys, R., Vosyliūtė, R., Šatkauskas, S. DRG axon elongation and growth cone collapse rate induced by Sema3A are differently dependent on NGF concentration. Cell Mol Neurobiol. 34, 289-296 (2014).
  15. Maier, O., et al. Differentiated NSC-34 motoneuron-like cells as experimental model for cholinergic neurodegeneration. Neurochem Int. 62, 1029-1038 (2013).
  16. Nango, H., et al. Highly efficient conversion of motor neuron-like NSC-34 cells into functional motor neurons by Prostaglandin E2. Cells. 9, 1741(2020).
  17. Kim, H., Caspar, W. T., Shah, S. B., Hsieh, A. H. Effects of proinflammatory cytokines on axonal outgrowth from adult rat lumbar dorsal root ganglia using a novel three-dimensional culture system. Spine J. 15, 1823-1831 (2015).
  18. Frey, E., et al. An in vitro assay to study induction of the regenerative state in sensory neurons. Exp Neurol. 263, 350-363 (2015).
  19. Zhang, Z., et al. Cerebellar injury and impaired function in a rabbit model of maternal inflammation induced neonatal brain injury. Neurobiol Learn Mem. 165, 106901(2019).
  20. Pemberton, K., Mersman, B., Xu, F. Using ImageJ to assess neurite outgrowth in mammalian cell cultures: Research data quantification exercises in undergraduate neuroscience lab. J Undergrad Neurosci Educ. 16, A186-A194 (2018).
  21. Marvaldi, L., Hausott, B., Auer, M., Leban, J., Klimaschewski, L. A Novel DRAK inhibitor, SC82510, promotes axon branching of adult sensory neurons in vitro. Neurochem Res. 39, 403-407 (2014).
  22. Quarta, S., et al. Peripheral nerve regeneration and NGF-dependent neurite outgrowth of adult sensory neurons converge on STAT3 phosphorylation downstream of neuropoietic cytokine receptor gp130. J Neurosci. 34, 13222-13233 (2014).
  23. Woitke, F., et al. Adult hippocampal neurogenesis poststroke: More new granule cells but aberrant morphology and impaired spatial memory. PLoS One. 12, e0183463(2017).
  24. Xiao, X., et al. Automated dendritic spine detection using convolutional neural networks on maximum intensity projected microscopic volumes. J Neurosci Meth. 309, 25-34 (2018).
  25. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Meth. 168, 134-139 (2008).
  26. Wang, D., et al. HCA-Vision: Automated neurite outgrowth analysis. SLAS Disc. 15, 1165-1170 (2010).
  27. Whitlon, D. S., et al. Novel high content screen detects compounds that promote neurite regeneration from cochlear spiral ganglion neurons. Sci Rep. 5, 15960(2015).
  28. Rishal, I., et al. WIS-neuromath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Dev Neurobiol. 73, 247-256 (2013).
  29. Smith, D. S., Pate Skene, J. H. A Transcription-dependent switch controls competence of adult neurons for distinct modes of axon growth. J Neurosci. 17, 646-658 (1997).
  30. Gardiner, N. J., et al. Preconditioning injury-induced neurite outgrowth of adult rat sensory neurons on fibronectin is mediated by mobilisation of axonal α5 integrin. Mol Cell Neurosci. 35, 249-260 (2007).
  31. Hauck, J. S., et al. Heat shock factor 1 directly regulates transsulfuration pathway to promote prostate cancer proliferation and survival. Commun Biol. 7, 9(2024).
  32. Zhu, Y., et al. Loss of WIPI4 in neurodegeneration causes autophagy-independent ferroptosis. Nat Cell Biol. 26, 542-551 (2024).
  33. Reggiani, F., et al. BET inhibitors drive Natural Killer activation in non-small cell lung cancer via BRD4 and SMAD3. Nat Commun. 15, 2567(2024).
  34. Ackerman, H. D., Gerhard, G. S. Bile acids induce neurite outgrowth in NSC-34 cells via TGR5 and a distinct transcriptional profile. Pharmaceuticals. 16, 174(2023).
  35. Tuttle, R., Matthew, W. D. Neurotrophins affect the pattern of DRG neurite growth in a bioassay that presents a choice of CNS and PNS substrates. Development. 121, 1301-1309 (1995).
  36. Wurster, S., et al. Live monitoring and analysis of fungal growth, viability, and mycelial morphology using the IncuCyte NeuroTrack processing module. mBio. 10 (3), e00673-e00719 (2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Time Lapse

מאמרים קשורים