מאמר שיטה

ייצור קולגן בדוגמת ננו-פיברילר להנדסת רקמות

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67165

⸱

20 בספטמבר 2024

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הבא מציג שיטת שחול מבוססת גזירה לייצור הידרוג'לים של קולגן עם סיבים בדוגמת ננומטר, הניתנת ליישום במגוון רחב של יישומי הנדסת רקמות.

תקציר

ביו-חומרים רגנרטיביים נועדו להקל על אינטראקציות תא-חומר כדי להנחות את התיקון של רקמות ואיברים פגומים. חומרים אלה נועדו לחקות את התכונות הביופיזיקליות של רקמות מקומיות, ולספק הדרכה פנוטיפית ומורפולוגית תאית התורמת לשיקום נישת הרקמה המתחדשת. קולגן, חלבון מטריצה חוץ-תאי נפוץ, הוא מרכיב נפוץ בביו-חומרים מתחדשים אלה בשל התאימות הביולוגית שלו ותכונותיו החיוביות האחרות. המחקר הנוכחי מתאר שיטה חדשה ופשוטה לייצור קולגן ננו-פיברילר מהונדס עם דפוס סיבים מכוון. באמצעות מניפולציה של מתח גזירה, טמפרטורה ו-pH, פיברילוגנזה ויישור קולגן נשלטים במדויק ללא צורך בציוד מיוחד. גישה זו מאפשרת יצירת חומרים ביולוגיים של קולגן ננו-פיברילריים המחקים את המבנה הטבעי של רקמות המציגות מאפיינים אנזוטרופיים או איזוטרופיים. הגמישות בדפוס ננו-סיבים של קולגן לא רק מקלה על חקר דפוסים ננומטריים על התנהגות התא, אלא גם מציעה אפשרויות מגוונות ליישומי הנדסת רקמות דפוסיים.

מבוא

מטרת הרפואה הרגנרטיבית היא לשפר את התחדשות וריפוי הרקמות באמצעות יישום טיפולים מהונדסים. גישה אחת כוללת ייצור של מבנים ביו-חומריים המחקים מקרוב את ההרכב והמבנה של רקמות מקומיות. בעת תכנון מבנים אלה, שיקול קריטי הוא המטריצה החוץ-תאית הבסיסית המקורית (ECM), המספקת רמזים הדרכה לשגשוג תאים, נדידה והתמיינות, ובסופו של דבר מניעה את התחדשות הרקמות 1,2. ה-ECM המקורי מורכב בעיקר מקולגן סיבי 3,4. ברקמות מאורגנות מאוד כגון שרירי השלד והגידים, ECMs אלה מציגים דפוס מיושר, שהוא המפתח לתמיכה בהעברת כוח על פני הרקמה כמו גם בתפקוד המוטורי 5,6.

התועלת של קולגן כחומר ביולוגי ליישומי הנדסת רקמות משתרעת מעבר לשכיחותו הנרחבת ברקמות מקומיות, מכיוון שהוא מציג גם תאימות ביולוגית טובה, פירוק ביולוגי וזיקה לתאים 7,8,9. ההתקדמות האחרונה בפיתוח ביו-חומרים מבוססי קולגן התמקדה בחידוד התכונות הביופיזיקליות כדי להנחות טוב יותר את הרמזים המכניים והביוכימיים החיוניים להתחדשות רקמות ספציפיות. יצירת ביו-חומרים של קולגן עם מבנה סיבי במבחנה היא פשוטה יחסית, שכן מולקולות קולגן מסיסות בחומצה מסוגלות להתאסף לננו-סיבים כאשר הן נחשפות לטמפרטורות חמות ול-pH ניטרלי 10,11. עם זאת, ללא מניפולציה מודרכת, סיבים אלה ייווצרו לרשתות אקראיות, מה שיהפוך אותם ללא מתאימים ליישומי הנדסת רקמות אנזוטרופיים. טכניקות המסוגלות לייצר סיבים מיושרים כוללות אלקטרוספינינג וספינינג רטוב, יחד עם טכניקות שחול תמיסה אחרות12,13, ייבוש בהקפאה14, ייצור אלקטרוכימי או מגנטי15,16, תצהיר זרימת גזירה17, התגבשות המושרה על ידי זרימה18, שחול ג'ל19, יישור המושרה על ידי מתח20 ויישור מונחה כוח באמצעות מניפולציה של נוזל זרימה21,22. עם זאת, רבות מהשיטות הללו אינן תואמות מאוד לקולגן, מייצרות יישור בקנה מידה מיקרו אך לא בקנה מידה ננומטרי, מחייבות שלבי עיבוד נוספים כדי לגרום ליישור ויציבות או דורשות ציוד וריאגנטים מיוחדים ביותר, מה שהופך את האימוץ הנרחב שלהן למאתגר.

המחקר הנוכחי מציג שיטה מבוססת גזירה קלה לייצור קולגן ננו-פיברילרי, עם דפוס סיבים מיושר או מכוון אקראי, ללא צורך בציוד מיוחד כגון משאבות מזרקים או אלקטרו-ספינרים. טכניקה זו מנצלת את התלות ב-pH של פיברילוגנזה של קולגן. הפעלת כוח גזירה על קולגן מונומרי חומצי בתוך מאגר מנטרל מקדם פיבריוגנזה מיושרת לאורך כיוון הגזירה. באופן דומה, ניתן לגרום לקולגן לעבור פיבריוגנזה בהיעדר גזירה, המייצרת סיבים עם דפוסים אקראיים. רצועות הקולגן התלת-ממדיות המתקבלות, המורכבות מקולגן ננו-פיברילרי מיושר או אקראי, יכולות לשמש ככלים לחקר ההשפעות של דפוסים ננומטריים על התנהגות התאים. בנוסף, הם מציעים אפשרויות מגוונות ליישומי הנדסת רקמות אנזוטרופיים ואיזוטרופיים 23,24,25,26,27. ניתן להתאים את הדפוס כך שיתאים למבנה הרקמה המקורית המעניינת. ניתן גם לשלב את רצועות הקולגן בצרורות בגדלים שונים כדי לשמש כטיפול מהונדס מושתל בגדלים וצורות שונות של פציעות.

פרוטוקול

1. הכנת קולגן בדיאליזה (איור 1)

  1. חותכים צינורות דיאליזה לאורך של כ-3 אינץ'. השתמש בצינורות עם המפרט הבא: רוחב שטוח של 32 מ"מ, קוטר מנופח של 20 מ"מ וגודל נקבוביות של 4.8 ננומטר.
  2. החזר את צינורות הדיאליזה במים טהורים במיוחד.
  3. מהדקים קצה אחד של הצינור בעזרת קליפ צינורות דיאליזה.
  4. העבירו 5-6 מ"ל של קולגן זנב חולדה מסוג I (ריכוז: 9-10 מ"ג/מ"ל בחומצה אצטית 0.02 N) לתוך הצינור באמצעות מזרק של 10 מ"ל המצויד במחט 18 גרם. מהדקים את הקצה השני של הצינור לסגירה.
  5. הניחו שכבה בעובי 0.5-1 ס"מ של פתיתי פוליאתילן גליקול (PEG) על תחתית צלחת זכוכית, ולאחר מכן הניחו את צינור הדיאליזה המלא בקולגן על גבי שכבת ה-PEG.
    הערה: צלחת זכוכית בגודל 13 אינץ' x 9 אינץ' x 2 אינץ' יכולה להכיל בדרך כלל שורה של 4-5 צינורות מלאים בקולגן. ניתן להתאים את גודל המנה על פי נפח הקולגן הדרוש.
  6. מוסיפים עוד פתיתי PEG כדי לכסות לחלוטין את הצינור ומכניסים את המגש למקרר של 4 מעלות צלזיוס.
  7. כל 10-15 דקות, הסר את פתיתי ה-PEG הרטובים מפני השטח של צינור הדיאליזה וכסה מחדש את הצינור בשכבה טרייה של PEG יבש. מחזירים את התבשיל למקרר של 4 מעלות צלזיוס.
  8. חזור על שלב 1.7 פעמיים נוספות, ולאחר 30-35 דקות, שטוף את פתיתי ה-PEG הרטובים באמצעות מי ברז.
  9. שטפו את הצינור פעם נוספת באמצעות מים טהורים במיוחד וייבשו את הצינור עם טישו.
  10. שחרר קצה אחד של הצינור והעביר את הקולגן הדיאליזה (ריכוז סופי: ~30 מ"ג/מ"ל) לצינורות מיקרו-צנטריפוגה. סובבו לזמן קצר את בועות האוויר בקולגן באמצעות מיני צנטריפוגה (2,000 x גרם, ≤30 שניות, טמפרטורת החדר [RT]) ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
  11. יום אחד לפני השימוש, טען את הקולגן במזרקים.
    1. בעזרת מחט בגודל 16, שאב ~1 מ"ל של קולגן דיאליזה למזרק של 1 מ"ל.
      הערה: קולגן הוא חומר צמיג. ייתכן שיהיה צורך להעמיס מראש את ראש המחט בקולגן לפני שאיבת קולגן נוסף. הסר את ראש המחט והוציא כיסי אוויר גדולים לפי הצורך
    2. הסר את המחט ועטוף את ראש המזרק בפרפילם.
    3. יש לאחסן את המזרק המלא בקולגן זקוף בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר לבועות אוויר קטנות להתפוצץ.

2. הכנת שבבי זכוכית (איור 1)

זהירות: השתמש בהגנה על העיניים עבור חלק זה של הפרוטוקול.

הערה: שקופיות זכוכית הידרופוביות מצופות במיוחד משמשות לניסויים בתרבית תאים. יש לטפל בשקופיות בקצוות כדי למנוע הסרת ציפוי פני השטח. בצע את הליך חיתוך הזכוכית על משטח חיתוך מתאים.

  1. מדוד וסמן את המידות הרצויות של שבב הזכוכית באמצעות טוש קבוע
    1. אם יוצרים פיגומים עם 8 רצועות, סמנו מרווחים של כ-1 ס"מ לאורך הקצה הארוך של השקופית. התאם מידות לפי הצורך על סמך גודל הפיגום הרצוי.
  2. בעזרת קצה ישר (כלומר, קצה צלחת 6 בארות), החלק את חותך הזכוכית לאורך המדידה הראשונה כדי להבקיע את הזכוכית.
  3. המגלשה תישבר לאורך קו הניקוד בכוחות עצמה או תהפוך את המגלשה על רקמה (הצד ההידרופובי כלפי מטה) ותפעיל לחץ ידני על האזור המנוקד.
  4. סמן את הצד המצופה של מגלשת הזכוכית ההידרופובית באמצעות עט טוש אתנול.
  5. שטפו את שבב הזכוכית במים טהורים במיוחד כדי להסיר שאריות אבק זכוכית.
  6. יבש את שבבי הזכוכית באמצעות זרבובית ספסל לאוויר בלחץ או על ידי ערימתם בזווית במכסה האדים.
  7. חזור על הפעולה לפי הצורך עבור מספר השבבים הנדרש. אחסן את האסימונים ב-RT. לקבלת התוצאות הטובות ביותר של תרבית תאים, השתמש בשבבים מוכנים תוך 7 ימים.

3. הכנת מי מלח חוצץ פוספט 10x (PBS)

  1. מלאו בקבוק זכוכית ב-500 מ"ל מים טהורים במיוחד.
  2. יש להוסיף 10 טבליות PBS לבקבוק.
    הערה: פרוטוקול זה מניח שיחס הטאבלט עבור 1x PBS הוא טבליה אחת לכל 500 מ"ל. התאימו את מספר הטבליות לפי הצורך אם אתם משתמשים בטאבלט בגודל או במותג אחר.
  3. הוסיפו סבון ערבוב לבקבוק והניחו על צלחת ערבוב עד שהטבליות יתמוססו.
  4. ביום ייצור ההידרוג'ל, העבירו את הנפח הדרוש של 10x PBS לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
  5. הנח את הצינורות המלאים ב-PBS באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות לפני ייצור הקולגן.

4. ייצור ננו-סיבים של קולגן מיושר (איור 2)

  1. מוציאים מזרק קולגן מהמקרר ומחברים מחט קהה של 22 גרם.
  2. הניחו שקופית זכוכית במכסה של צלחת 4 בארות.
  3. כסו את השקופית במספיק 37 מעלות צלזיוס מחוממות 10x PBS כדי להטביע אותה (30-50 מ"ל).
  4. החזק את המזרק בזווית של כ-30-45 מעלות, הוציא ידנית רצועות דקות של קולגן על שבב הזכוכית במהירות של ~340 מ"מ לשנייה וקצב זרימה של ~3.2 מ"ל/דקה.
    הערה: השלם את שחול הקולגן תוך 30-60 שניות מהוספת ה-PBS המחומם כדי להבטיח שה-PBS לא יתקרר יתר על המידה.
  5. המתינו 1-2 דקות כדי לאפשר לקולגן להשלים את הפיברילוגנזה או עד שהקולגן יהפוך לצבע לבן אטום.
  6. השתמש במלקחיים כדי לחתוך את רצועות הקולגן לאורך. ודא שהרצועות ארוכות מספיק כדי שניתן יהיה לקפל 3-5 מ"מ מתחת לשני קצוות השבב.
  7. בזה אחר זה, עטפו בעדינות את רצועות הקולגן לאורכן (במקביל לאזור המסומן) על שבב זכוכית מוכן. תחוב את הקצוות מתחת לשבב.
  8. המשיכו להניח רצועות קולגן עד להשגת המידות הרצויות.
  9. מקם את הקולגן הידרוג'ל החדש שנוצר על פני שתי בארות של צלחת של 12 בארות. זה מאפשר זרימת אוויר בתהליך הייבוש ומונע מקצוות הזנב של הקולגן להיצמד למשטחים לא רצויים.
  10. השאירו הידרוג'לים על הספסל לייבוש למשך 1-3 שעות או עד שגבישי מלח PBS מכסים 50%-90% משטח ההידרוג'ל.
    הערה: זמן הייבוש ישתנה בהתאם לגודל ההידרוג'ל ולנוכחות עודפי נוזלים.
  11. טבלו כל הידרוג'ל ב-1x PBS למשך כ-30-60 שניות או עד להמסת גבישי המלח.
  12. יש לטפוח בעדינות את עודפי ה-PBS בעזרת טישו.
  13. מניחים הידרוג'לים בחזרה על צלחת הבאר ומניחים לייבוש במכסה אדים למשך הלילה.
  14. אחסן את ההידרוג'לים המיובשים ב- RT למשך כשבוע.

5. ייצור ננו-סיבים אקראיים של קולגן (איור 3)

  1. מוציאים מזרק קולגן מהמקרר ומחברים מחט קהה של 22 גרם.
  2. יש להוציא קולגן בטמפרטורה של ~3.2 מ"ל/דקה על שבב זכוכית יבש. יש להוציא מספיק קולגן כדי להשיג ממדים דומים להידרוג'לים של קולגן מיושרים. מנע הצטברות בועות אוויר לפי הצורך.
  3. הוציא קולגן נוסף כדי לעטוף את שולי שבב הזכוכית. זה ממזער את הסיכון לניתוק בשוגג.
  4. השתמש במלקחיים כדי לטבול את הקולגן המוקצף בצינור של 50 מ"ל של PBS מחומם פי 10.
  5. המתינו 45-60 שניות עד שהקולגן ישלים את הפיברילוגנזה או עד שהקולגן יהפוך לצבע לבן אטום.
  6. יש לטפוח בעדינות את עודפי ה-PBS בעזרת טישו.
  7. בצע את שלבים 4.9-4.14 לשטיפה וייבוש של ההידרוג'לים

6. עיקור והתייבשות

הערה: בצע את כל השלבים הבאים בארון בטיחות ביולוגית

  1. עקרו את הידרוג'ל הקולגן וצלחת הבאר שמסביב באתנול 70% למשך 15 דקות.
    1. הרם בקצרה את ההידרוג'לים באמצע העיקור באמצעות מלקחיים כדי להבטיח שגם החלק התחתון של שבב הזכוכית וגם ההידרוג'ל נמצאים במגע עם אתנול.
  2. הסר אתנול ואפשר להידרוג'לים להתייבש באוויר למשך 10 דקות.
  3. שטפו הידרוג'לים 3 פעמים ב-PBS סטרילי 1x, למשך 10 דקות כל אחד, כדי להסיר שאריות אתנול ולהחזיר לחות להידרוג'לים. הידרוג'לים מוכנים כעת לשימוש (תרבית תאים וכו '). ניתן להשאיר הידרוג'לים לזמן קצר ב-PBS לאחר שלב הכביסה הסופי אם אינם מוכנים מיד לשימוש.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר טכניקת שחול פשוטה מבוססת גזירה לייצור הידרוג'לים של קולגן המורכבים מננו-סיבים מיושרים (איור 2) או אקראיים (איור 3). דפוס ננו-פיבריל מסתמך על שליטה מדויקת בכוחות הגזירה, המושגת באמצעות אפנון משולב של מהירות המזרק וקצב שחול הקולגן. הערכים האופטימליים להשראת יישור סיבים נקבעו בעבר כמהירות מזרק של 340 מ"מ לשנייה וקצב שחול קולגן של 3.2 מ"ל/דקה28,29. איזון זה הוא קריטי לא רק להיווצרות ננו-פיבריל מיושר אלא גם להבטחת הפונקציונליות של ההידרוג'לים בקנה מידה מאקרו. אם יחס זה אינו מיושר, קיים סיכון לייצור הידרוג'לים שאינם מעוצבים כמצופה, כמו גם הידרוג'לים המכילים רצועות קולגן דקות מדי (קוטר <0.5 מ"מ), עבות (קוטר >1.5 מ"מ) או גליות לשימוש. לדוגמה, תנועה מהירה מדי של מזרק, יחד עם קצב שחול איטי מדי, מביאה לרצועות דקות, בעוד שהיחס ההפוך מניב רצועות עבות או גליות (איור 4A-D), תלוי במידת חוסר האיזון ביחס. הבדלים אלה בתכונות המקרוסקופיות יכולים ליצור מספיק שונות מרצועה לרצועה כדי להשפיע על שקיעת התאים וההידבקות המקומית.

לאחר שחול והרכבה של קולגן, ייצור ההידרוג'ל ממשיך דרך שלב ייבוש ראשוני, לרוב 1 עד 3 שעות, לפני שהוא עובר שלב כביסה ב-1x PBS (איור 2 ואיור 3). השגת תוצאות טופוגרפיות אופטימליות מסתמכת על איזון עדין בין התזמון והעוצמה של שלב הכביסה. כביסה לא מספקת או מעוכבת גורמת לשיבוש טופוגרפיית הסיבים, המסומנת על ידי טביעות של גבישי מלח PBS על הסיבים. לעומת זאת, שטיפה מוגזמת או מוקדמת של קולגן לאחר הייצור גורמת לשכבה מומסת של קולגן שמכסה את המאפיינים הטופוגרפיים (איור 4E,F).

מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) מאשר נוכחות של כיוון ננו-פיבריל מיושר או אקראי בתוך הידרוג'ל הקולגן. הן בהידרוג'לים המיושרים והן בהידרוג'לים האקראיים, הננו-סיבים מציגים קוטר סיבים בין 30-50 ננומטר29. מבחינה איכותית, ניכר כי הידרוג'לים מיושרים מכילים ננו-סיבים מיושרים חד-צידית (איור 5). יישור זה כומת בעבר באמצעות ניתוח טרנספורמציה פורייה מהיר דו-ממדי, שבו עלילת היישור מציגה שתי פסגות נפרדות המרוחקות 180 מעלות זו מזו עבור הידרוג'לים מיושרים, בניגוד להידרוג'לים בעלי אוריינטציה אקראית המציגים רק שיאים בתדר נמוך28.

תמונות שדה בהיר של מיובלסטים ראשוניים של שרירי השלד של עכבר ממחישות כי הנחיה ננו-טופוגרפית אנזוטרופית של סיבי קולגן מקדמת יישור תאי (איור 6). הוכח כי הידרוג'לים של קולגן ננו-דפוסי אלה גורמים ליישור תאים לא רק במיובלסטים26 אלא גם בסוגי תאים אחרים, כגון תאי אנדותל 23,24.

figure-results-1
איור 1: איור סכמטי של קולגן בצפיפות גבוהה במיוחד והכנת שקופיות זכוכית חתוכה. (A-F) תהליך דיאליזה של קולגן: (A) הכנת צינורות דיאליזה לרצועות בגודל 3 אינץ' ואבטחת הקליפ הראשון, (B) העמסת קולגן מלאי בצפיפות גבוהה לתוך צינורות ואבטחת הקליפ השני, (C) עטיפת צינורות הדיאליזה הטעונים עם פתיתי פוליאתילן גליקול (PEG), (D) הסרת פתיתי PEG רוויים, (E) שטיפה של פתיתי PEG במים, ו-(F) אחסון של קולגן בצפיפות גבוהה במיוחד לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה. (ז-ל) תהליך חיתוך שקופיות זכוכית: (G) רכישת שקופיות זכוכית ללימוד, (H,I) ניקוד של שקופית זכוכית עם חותך זכוכית עם קצה יהלום, (J) שבירת מגלשת זכוכית מהצד הלא מנוקד, (K) שטיפת זכוכית חתוכה במים, ו-(L) ייבוש מגלשת זכוכית. מיוצר באמצעות BioRender. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תהליך ייצור קולגן הידרוג'ל מיושר. שלב 1: שחול קולגן תחת גזירה לתוך מאגר PBS מחומם פי 10 ואינדוקציה של פיברילוגנזה; שלב 2: הרכבה של קולגן מוחצן על שקופיות זכוכית חתוכות; שלב 3: הרכבה של קולגן מוחצן נוסף כדי להגדיל את גודל ההידרוג'ל; ושלב 4: ייבוש הידרוג'לים של קולגן. מיוצר באמצעות BioRender. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תהליך ייצור אקראי של קולגן הידרוג'ל. שלב 1: שחול קולגן על שקופיות זכוכית חתוכות (רצועה אחת); שלב 2: שחול מתמשך של קולגן מגדיל את הגודל (רצועות מרובות); שלב 3: טבילה של קולגן מוחצן במאגר PBS 10X כדי ליזום פיברילוגנזה; ושלב 4: ייבוש הידרוג'לים. מיוצר באמצעות BioRender. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: שלבי שגיאה אפשריים בתהליך ייצור הקולגן הידרוג'ל. (A-F) דוגמאות ל-(A) רצועות קולגן עבות בצורה אופטימלית, (B) רצועות קולגן עבות מדי, (C) רצועות קולגן לא עבות מספיק, (D) רצועות קולגן משורבטות ו-(E,F) משטחי קולגן שטופים יתר על המידה המוצגים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של הידרוג'לים קולגן מיושרים ואקראיים. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. תנאי האלומה הוגדרו ל-2 keV, עם טווח זרם של 25-100 pA, ומרחק עבודה של 4-5 מ"מ. התמונות נשמרו באופן עקבי ברזולוציה של 6144 x 4096 פיקסלים עם זמן השתהות של 1 מיקרון. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: מיובלסטים ראשוניים של עכברים שגודלו על הידרוג'לים של קולגן מיושרים ואקראיים. מיובלסטים תורבבו על ההידרוג'לים במשך 3 ימים לפני ההדמיה. תמונות שדה בהיר צולמו בהגדלה של פי 10 באמצעות מיקרוסקופ הפוך. החץ מציין כיוון ננו-פיבריל מיושר. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

ניתן לזקק את השלבים הקריטיים של הפרוטוקול לשלושה חלקים עיקריים: 1) פיברילוגנזה של קולגן, 2) הרכבת הידרוג'ל ו-3) כביסה. תהליך פיברילוגנזה של קולגן מתרחש באופן ספונטני בתנאי נטרול ומסתמך על הרכבה עצמית של מולקולות קולגן בודדות למבנים סיביים מיוצבים גדולים יותר10,11. זה מושג באמצעות יישום של מדיום מנטרל כמו PBS 10x המחומם ל-37 מעלות צלזיוס והוא קריטי להנחיית האינטראקציות האלקטרוסטטיות המבטיחות התפתחות מלאה של קולגן לסיבים. יישור סיבי בקנה מידה ננומטרי מושג על ידי הפעלת כוחות גזירה במקביל להופעת פיברילוגנזה. נוכחות או היעדר גזירה כמו גם קצב הגזירה, יקבעו את דפוס הסיבים. שנית, הרכבת הידרוג'ל היא שלב מפתח בחיזוק יציבות החומר על ידי מתן עוגנים פיזיים בתהליך הייבוש, במהלכו מתרחשת התכווצות והתייבשות של הקולגן. שלב זה קריטי במיוחד אם השימוש המיועד הוא לזריעת תאים במבחנה, מכיוון שהוא מאבטח את הקולגן למצע נוקשה המונע התכווצות בלתי מבוקרת. תהליך ההרכבה שונה במקצת בין ההידרוג'לים המעוצבים האקראיים והמיושרים. היצמדות נכונה להידרוג'לים אקראיים דורשת שקיעת קולגן נוספת לאורך קצוות משטח ההרכבה (בדרך כלל זכוכית) לפני הפיבריוגנזה כדי לאבטח אותו לפני השטח. ההידרוג'לים עם דפוס מיושר נכרכים סביב קצוות משטח ההרכבה כדי לשרת את אותה מטרת עיגון. שיקול חשוב נוסף עבור הידרוג'ל מיושר הוא שהמיקום הראשוני של רצועת הקולגן קובע את צורת ההידרוג'ל ואחידותו. מיקום הרצועה שלאחר מכן מונחה על ידי מתח הפנים של הקולגן המופקד, תוך הקפדה על הימנעות מנגיעה בהידרוג'ל לאחר המיקום. לבסוף, ייבוש וכביסה נכונים של הידרוג'ל לאחר ההרכבה חיוניים לשמירה על התכונות הטופוגרפיות של ההידרוג'ל. ייבוש לקוי ואחריו שטיפה עם PBS אחד או מים עלול להוביל לשכבת קולגן מומסת או דמוית עוגה. כדי למנוע זאת, ייבוש מלא של ההידרוג'לים הוא חיוני וניתן לאשר אותו ויזואלית על ידי היווצרות גבישי PBS ועלייה באטימות הקולגן.

ההידרוג'לים של הקולגן שימשו הן למחקרי מבחנה והן ליישומי הנדסה רגנרטיבית in vivo 23,24,25,26,27. חשוב לציין כי ההידרוג'לים מיוצרים בתנאים לא סטריליים ויש לעקר אותם לפני כל צורה של תרבית תאים או השתלה. צורת העיקור המומלצת היא 70% אתנול, שכן צורות אחרות של עיקור, כמו אור אולטרה סגול, ישבשו את דפוס הננו-סיבים באמצעות קישור צולב ופירוק של מולקולות הקולגן30. עם זאת, הסרת אתנול באמצעות שלבי אידוי ושטיפה חשובה למזעור שאריות אתנול, מה שעלול להזיק לתאימות התאים. שונות מאצווה לאצווה של קולגן המלאי עשויה להוביל לשונות בריכוז העבודה של הקולגן הדיאליזה בצפיפות גבוהה, מה שעשוי להשפיע על תהליך הפיברילוגנזה. בהתאם ליישום, ניתן להעדיף דפוס איזוטרופי אקראי על פני דפוס אנזוטרופי מיושר; לכן, בפרוטוקול הנוכחי, כללנו את שתי הגישות לווסת את ארגון הסיבים.

מגבלה של שיטת האקסטרוזיה מבוססת הגזירה המתוארת בפרוטוקול זה היא שהתהליך הוא ידני מאוד ותלוי במשתמש. יש צורך בהכשרה ותרגול משמעותיים כדי לכייל כל מפעיל כדי להניב תוצאות הניתנות לשחזור. המשמעות היא שהתפוקה יכולה להיות נמוכה וגוזלת זמן כדי להבטיח דיוק. ניתן לפתור חלק מהמגבלות הללו באמצעות שיטות ייצור אוטומטיות מאוד מבוססות מכונה כגון הדפסת תלת מימד, אלקטרו-ספינינג וליתוגרפיה רכה ומשטחית. עם זאת, בניגוד לשיטות אחרות אלה, הליך ייצור ננו-סיבים ידני לחלוטין זה אינו דורש ציוד מיוחד והוא נגיש ובמחיר סביר. ככל שההתקדמות במתודולוגיות הדפסת תלת מימד וחסכוניות ממשיכות להשתפר, יש פוטנציאל להתאים ולשלב פרוטוקול זה עם טכנולוגיית הדפסת תלת מימד. אינטגרציה כזו, למרות שעדיין אינה אפשרית, תשפר את העקביות והתפוקה של פרוטוקול זה.

הייצור של שתי טופוגרפיות הידרוג'ל נפרדות מציע הזדמנות ייחודית להתעמק בהנחיה הננו-טופוגרפית של סיבי קולגן על מורפולוגיה תאית, התנהגות והתחדשות רקמות. על ידי התבוננות בתגובה לטופוגרפיות סיביות שונות, אנו יכולים לקבל תובנות לגבי האופן שבו דפוס ננומטרי של מצע משפיע על פנוטיפ התא. לדוגמה, עבודות קודמות מצביעות על כך שכאשר תאי אנדותל מאמצים מורפולוגיה מוארכת על גבי ננו-סיבים מיושרים, הם מציגים פנוטיפ אנטי דלקתי ועמידות מוגברת לתנאי זרימה מופרעים24. ממצאים אלה לא רק מקדמים את ההבנה שלנו לגבי התפתחות נגעים טרשת עורקים, אלא גם מבטיחים לתכנון שתלי מעקפים עתידיים להגנה מפני עורקים. ניתן להשתמש בהידרוג'לים קולגן אלה ליישומי הנדסת רקמות ולהעשיר אותם בגורמי גדילה או תאים לפני ההשתלה כדי לשפר את היעילות הטיפולית 25,26,27. ניתוח השוואתי מגלה כי הידרוג'לים עם טופוגרפיות מיושרות מציגים התחדשות שרירים וכלי דם מעולים בהשוואה להידרוג'לים עם טופוגרפיות אקראיות26 וכי ניתן להשתמש בהידרוג'לים אלה בצורה א-תאית "מהמדף" אם הם עמוסים בגורמי גדילה מיוגניים כדי לשפר את התחדשות הרקמות במודל פציעת עכבר27. בעוד שהמוקד העיקרי עד כה היה שימוש בהידרוג'לים אלה כטיפולים פוטנציאליים לפציעות שרירים, ניתן ליישם אותם בספקטרום רחב של יישומי התחדשות והנדסת רקמות.

גילויים

אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מימון מהברית למחקר והכשרה לשיקום רגנרטיבי, MTF Biologics, קרן אוניברסיטת אורגון לבריאות ומדע והקרן הרפואית קולינס. K.M.H. נתמך על ידי מלגת המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע (DGE-1937961) ומלגת מחקר לומדים וחוויות של סטודנטים באורגון (OSLER) (5TL1TR2371-8). K.H.N. נתמך על ידי מענקים מה-NIH/NHLBI (R00HL136701) וה-NIH/NIAMS (R01AR080150).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קולגן I, ריכוז גבוה, קורנינג זנב עכברושCB354249
ליקוי חמה TE-2000-U מיקרוסקופNikonTE-2000-U מיקרוסקופ הפוך
שקופיות מיקרוסקופ עבות במיוחדפישר סיינטיפיק22-267-005עובד היטב עבור משטח שחול קולגן
FEI Helios G3 NanoLab DualBeamThermo Fisher ScientificN/Aמיקרוסקופ אלקטרונים סורק
כלי חותך זכוכית סט 2 מ"מ-20 מ"מ בסגנון עיפרון שמן הזנת שמן קצה קרבידאמזון / MOARMORB07Y1D243Hאפשרות לחותך זכוכית
Hamilton Kel-F Hub מחטי נקודה קהה (Luer Lock, 22 גרם)פישר סיינטיפיק14-815-574מחטים לשחול קולגן
Nexterion Slide H 3-DSchottNC0782819שקופיות הידרופוביות
טבליות PBSתרמו פישר 18912014
פוליאתילן גליקול 8000פישר ביו-ריאגנטיםBP233-1
צינורות דיאליזה תאית חלקה פישר סיינטיפיקS25645G
קליפס דיאליזה SnakeSkinThermo Fisher ScientificPI68011
Synthware חותך זכוכית Synthware31-501-927אפשרות לחותך זכוכית

מקורות

  1. Padhi, A., Nain, A. S. ECM in differentiation: A review of matrix structure, composition and mechanical properties. Ann Biomed Eng. 48 (3), 1071-1089 (2020).
  2. Schlie-Wolter, S., Ngezahayo, A., Chichkov, B. N. The selective role of ECM components on cell adhesion, morphology, proliferation and communication in vitro. Exp Cell Res. 319 (10), 1553-1561 (2013).
  3. Ricard-Blum, S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978(2011).
  4. Shoulders, M. D., Raines, R. T. Collagen structure and stability. Annu Rev Biochem. 78, 929-958 (2009).
  5. Gillies, A. R., Lieber, R. L. Structure and function of the skeletal muscle extracellular matrix. Muscle Nerve. 44 (3), 318-331 (2011).
  6. Silver, F. H., Freeman, J. W., Seehra, G. P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties. J Biomech. 36 (10), 1529-1553 (2003).
  7. Friess, W. Collagen-biomaterial for drug delivery. Eur J Pharm Biopharm. 45 (2), 113-136 (1998).
  8. Lee, C. H., Singla, A., Lee, Y. Biomedical applications of collagen. Int J Pharm. 221 (1-2), 1-22 (2001).
  9. Liu, X., Zheng, C., Luo, X., Wang, X., Jiang, H. Recent advances of collagen-based biomaterials: Multi-hierarchical structure, modification and biomedical applications. Mater Sci Eng C. 99, 1509-1522 (2019).
  10. Harris, J. R., Reiber, A. Influence of saline and pH on collagen type I fibrillogenesis in vitro: Fibril polymorphism and colloidal gold labelling. Micron. 38 (5), 513-521 (2007).
  11. Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. Collagen fibril formation. Optimal in vitro conditions and preliminary kinetic results. J Biol Chem. 253 (18), 6578-6585 (1978).
  12. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. J Biomed Mater Res A. 79A (3), 456-463 (2006).
  13. Malladi, S., et al. Continuous formation of ultrathin, strong collagen sheets with tunable anisotropy and compaction. ACS Biomater Sci Eng. 6 (7), 4236-4246 (2020).
  14. Lowe, C. J., Reucroft, I. M., Grota, M. C., Shreiber, D. I. Production of highly aligned collagen scaffolds by freeze-drying of self-assembled, fibrillar collagen gels. ACS Biomater Sci Eng. 2 (4), 643-651 (2016).
  15. Torbet, J., Ronzière, M. C. Magnetic alignment of collagen during self-assembly. Biochem J. 219 (3), 1057-1059 (1984).
  16. Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3d cell migration. Curr Protoc Cell Biol. Chpater 10 (Unit 10.17), (2010).
  17. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomater. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  18. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: A potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  19. Yunoki, S., Hatayama, H., Ebisawa, M., Kondo, E., Yasuda, K. A novel method for continuous formation of cord-like collagen gels to fabricate durable fibers in which collagen fibrils are longitudinally aligned. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 107 (4), 1011-1023 (2019).
  20. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS One. 4 (6), e5902(2009).
  21. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3d collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), (2022).
  22. Su, C. Y., et al. Engineering a 3D collective cancer invasion model with control over collagen fiber alignment. Biomaterials. 275, 120922(2021).
  23. Nakayama, K. H., et al. Bilayered vascular graft derived from human induced pluripotent stem cells with biomimetic structure and function. Regen Med. 10 (6), 745-755 (2015).
  24. Nakayama, K. H., et al. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano Lett. 16 (1), 410-419 (2016).
  25. Nakayama, K. H., et al. Rehabilitative exercise and spatially patterned nanofibrillar scaffolds enhance vascularization and innervation following volumetric muscle loss. NPJ Regen Med. 3, 16(2018).
  26. Nakayama, K. H., et al. Treatment of volumetric muscle loss in mice using nanofibrillar scaffolds enhances vascular organization and integration. Commun Biol. 2 (1), 170(2019).
  27. Alcazar, C. A., Hu, C., Rando, T. A., Huang, N. F., Nakayama, K. H. Transplantation of insulin-like growth factor-1 laden scaffolds combined with exercise promotes neuroregeneration and angiogenesis in a preclinical muscle injury model. Biomater Sci. 8 (19), 5376-5389 (2020).
  28. Lai, E. S., Huang, N. F., Cooke, J. P., Fuller, G. G. Aligned nanofibrillar collagen regulates endothelial organization and migration. Regen Med. 7 (5), 649-661 (2012).
  29. Huang, N. F., et al. Spatial patterning of endothelium modulates cell morphology, adhesiveness and transcriptional signature. Biomaterials. 34 (12), 2928-2937 (2013).
  30. Weadock, K. S., Miller, E. J., Bellincampi, L. D., Zawadsky, J. P., Dunn, M. G. Physical crosslinking of collagen fibers: Comparison of ultraviolet irradiation and dehydrothermal treatment. J Biomed Mater Res. 29 (11), 1373-1379 (1995).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ייצור קולגן בדוגמת ננו-פיברילר להנדסת רקמות
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.