Method Article

הקרנת שבר קוולנטי באמצעות בדיקת קשירה כמותית בלתי הפיכה

DOI:

10.3791/67178

⸱

February 28th, 2025

 ,  , 
1Department of Chemistry, Imperial College London, Molecular Sciences Research Hub, 2Department of Life Sciences, Imperial College London, South Kensington Campus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת קשירה כמותית בלתי הפיכה (qIT) היא שיטה מבוססת פלואורסצנטיות לזיהוי מקטעים קוולנטיים העוסקים באופן סלקטיבי בחלבון מטרה. כאן, פרוטוקול מפורט מתואר כדי לתאר את בדיקת qIT, עם תוצאות לדוגמה כלולות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרכובות היוצרות קשרים קוולנטיים עם חלבוני מטרה ספציפיים מציעות מגוון יתרונות כבדיקות כימיות וחומרים טיפוליים. בדרך כלל, מולקולות קטנות אלקטרופיליות תגובתיות קלות משמשות ליצירת קשרים קוולנטיים עם שרשראות צד ציסטאין נבחרות בחלבונים ספציפיים. גישות אלקטרופיליות ראשונות של גילוי ליגנדים, לפיהן ספרייה של מולקולות קטנות אלקטרופיליות מוקרנות כנגד מטרה חלבונית, הפכו פופולריות מכיוון שהן נמנעות מהצורך בהתקנה במורד הזרם של ראש קרב אלקטרופילי במורד הזרם. עם זאת, בדיקות סקר כאלה מסובכות, שכן ליגנדות אלקטרופיליות יכולות להציג מגוון רחב של שיעורים שונים של תגובה ספונטנית עם ציסטאין. קשירה כמותית-בלתי הפיכה (qIT) מציעה שיטה מבוססת פלואורסצנטיות לזיהוי ופיתוח פגיעות המנרמלת נתונים עבור הבדלים אלה בתגובתיות של תרכובות פנימיות. שיעורי התגובה של תרכובות בודדות עם חלבון מטרה נקבעים ומושווים לתגובתיות של תרכובות עם טריפפטיד גלוטתיון בלתי מובנה (זהו פרוקסי לתגובת תרכובת ספונטנית), מה שמאפשר זיהוי של תרכובות המגיבות באופן מועדף עם החלבון המעניין. מתודולוגיה זו יושמה בהצלחה לזיהוי מקטעים קוולנטיים סלקטיביים כנגד מספר מטרות תרופות, כולל פרוטאז ראשי SARS-CoV-2, קינאז תלוי ציקלין 2 ו- RAP27A. כאן, אנו מדגימים את היישום של qIT על חלבון מטרה כדי ליצור מערך נתונים כמותי וחזק, המאפשר תעדוף של ליגנדות פגיעה לפיתוח עתידי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ליגנדות קוולנטיות-תגובתיות ממוקדות ציסטאין (מולקולות המפעילות השפעה ביולוגית על ידי תגובה עם שאריות ציסטאין נבחרות על חלבון מסוים) הפכו פופולריות יותר ויותר ככלים כימיים וטיפולים במהלך העשורים האחרונים1. אלה מורכבים בדרך כלל מאלקטרופיל תגובתי קל (כגון אקרילאמיד, כלורואצטמיד או ויניל סולפון) המצורף לליגנד מואטי עם זיקה גבוהה למטרה חלבונית2. באופן אידיאלי, אינטראקציה ליגנד-חלבון מתקדמת באמצעות מנגנון דו-שלבי הכולל קשירת ליגנד לא קוולנטית ראשונית, ואחריה היווצרות קשר קוולנטי בלתי הפיך בין ציסטאין המטרה ואלקטרופיל3.

מספר ליגנדות קוולנטיות, כולל מעכב טירוזין קינאז איברוטיניב של ברוטון, פותחו על ידי אספקת ליגנד הפיך שזוהה בעבר עם ידית אלקטרופילית4. עם זאת, גישה זו לא תמיד מצליחה, וניסיונות אחרים מצאו כי התקנת אלקטרופילים דורשת אופטימיזציה משמעותית5. במקום זאת, גישות אלקטרופיליות תחילה, במיוחד באמצעות מקטעים אלקטרופיליים, הפכו פופולריות יותר בשנים האחרונות. אלה בדרך כלל כוללים דגירה של ספרייה של אלקטרופילים עם חלבון ולאחר מכן בחירת תרכובות עם קצב מוגבר של תגובה כלפי ציסטאין, אשר מניחים כי נגרמת על ידי אינטראקציות לא קוולנטיות, פרודוקטיבי בין ליגנד וכיס קשירה6. יש לציין כי שיטות אלה יושמו בהצלחה במהלך הפיתוח של מעכב KRAS (G12C) Sotorasib1.

סינון אלקטרופיל ראשון מציב מספר אתגרים ייחודיים בהשוואה לסינון ליגנד לא קוולנטי מסורתי, בעיקר בשל השונות הגבוהה בתגובתיות בתוך ובין מחלקות ראשי קרב7. רוב האלקטרופילים המגיבים לציסטאין יגיבו, לאורך זמן, עם כל שאריות הציסטאין החשופות לממס, ללא קשר לאינטראקציה סלקטיבית כלשהי עבור חלבון המטרה. לפיכך, תפוסת הליגנדים תגדל עם הזמן עבור כמעט כל האלקטרופילים, וללא בקרה על תגובתיות, בחירת הפגיעות תהיה לעתים קרובות מוטה לכיוון מקטעים תגובתיים יותר הפוגעים במטרה במהירות רבה יותר8.

יתר על כן, שיטות סינון אלקטרופיל ראשונות משתמשות לעתים קרובות בספקטרומטריית מסות כדי לזהות היווצרות של ליגנד חלבון, אשר מוגבלת בתפוקה9. דגימת תגובה סדירה נדרשת לאורך פרק זמן ממושך (שעות עד ימים) כדי לאפיין כראוי קינטיקה של תגובה עבור ספרייה של תרכובות עם אלקטרופיליות מגוונת10. מסך של 300 מקטעים שנדגמו ב-10 נקודות זמן ידרוש לפיכך ביצוע של 3000 ספקטרום מסה, מעבר לתפוקה של רוב מערכות ספקטרומטריית מסות החלבון. לכן, רצוי להשתמש בשיטות בעלות תפוקה גבוהה יותר לניטור היווצרות ליגנד חלבון.

הגישה המתוארת כאן, בדיקת קשירה בלתי הפיכה כמותית (qIT), היא שיטת סינון אלקטרופילית ראשונה השולטת בתגובתיות פנימית ומשתמשת בקריאה פלואורסצנטית פשוטה7. חלבון, או גלוטתיון (טריפפטיד לא מובנה המכיל תיול המשמש כבקרה לתגובתיות פנימית) מודגרים עם ספרייה של מקטעים אלקטרופיליים, ודגימות רגילות שנלקחות למרווה לתמיסה של CPM (7-Diethylamino-3-(4'-Maleimidylphenyl)-4-Methylcoumarin, סוכן פלואורוגני לכימות תיול). היווצרות האדוקציה בין הציסטאין למקטע האלקטרופילי מפחיתה את כמות התיול הזמין לתגובה עם CPM, ומפחיתה את הפלואורסצנטיות המתקבלת במרווים. פלואורסצנטיות CPM פועלת אפוא כפרוקסי לתיול שלא מגיב, ומאפשרת לקבוע את הקינטיקה של תגובת תיול עם כל מקטע אלקטרופילי. מקטעים אלקטרופיליים עם תגובתיות חלבון משופרת משמעותית על פני גלוטתיון נבחרים כפגיעות ומקבלים עדיפות להמשך הפיתוח (איור 1).

figure-introduction-1
איור 1: סכמה של qIT. סקירה סכמטית של בדיקת qIT. (נוצר באמצעות BioRender). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

בחירת פגיעות באמצעות ערכי REF שולטת בתגובתיות פנימית ומבטיחה שמקטעים ייבחרו כפגיעות רק אם הם יוצרים אינטראקציות לא קוולנטיות, פרודוקטיביות, עם יעד חלבוני. קריאת הפלואורסצנטיות הפשוטה פירושה גם שבדיקת qIT ניתנת להרחבה מאוד ואינה דורשת שיטות מבוססות ספקטרומטריית מסות לניטור תגובה.

כאן, מתואר הליך מקיף עבור בדיקת qIT, עם תוצאות לדוגמה הכלולות כדי להמחיש את ביצועי הבדיקה ואת בחירת הפגיעה.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בניית ספריית פרגמנטים

  1. עצבו ספרייה של שברים אלקטרופיליים וסנתז או רכשו אותם. ספריות מקטעים אלקטרופיליים מורכבות בדרך כלל מאלקטרופילים בעלי תגובתיות קלה (כגון אקרילאמידים, כלורואצטמידים וויניל סולפונאמיד) המצורפים למגוון רחב של פיגומים כימיים. ספריות שברים אלקטרופיליים זמינות באופן נרחב מספקים מסחריים, ופרטים נוספים על התכנון והבנייה שלהם נסקרים במקום אחר 5,11.
  2. ממיסים כל תרכובת ב-DMSO לריכוז של 50 מילימול, ואז מפיצים תרכובת שונה לכל באר של עמודות 3 עד 22 של צלחת מאגר של 384 בארות, המכונה צלחת ספריית הפרגמנטים.
    1. חלק DMSO לכל באר של עמודות 1, 2, 23 ו- 24 עבור הפקדים החיוביים והשליליים. פריסת הלוחות יכולה להשתנות בהתאם למספר התרכובות שנבדקות (איור 2). הנפח שיתווסף ללוח הספרייה יהיה תלוי במספר המסכים שיש לבצע, בהתחשב בכך שנדרש כ-1.8 מיקרוליטר מכל באר לכל מסך qIT. הכינו מראש את צלחת ספריית הפרגמנטים ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4°C.

figure-protocol-1
איור 2: פריסת לוחות. סקירה כללית של פריסת צלחת qIT assay 384-well. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. הגדרת Assay (איור 3)

  1. הכן את הפתרונות הבאים: תמיסת חלבון רקומביננטי (חלבון מטרה בכל חיץ), מאגר בדיקת qIT (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 8)), מאגר מרווה לבדיקת qIT (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 7.5)), ותמיסות מלאי מורכבות (מקטע אלקטרופילי (50 mM) ב- DMSO).
    הערה: pH של 8 משמש במאגר התגובה כדי להאיץ את התגובה בין שאריות ציסטאין המטרה לבין שברים, המאפשר למדוד את קצב התגובה אפילו עבור מקטעים תגובתיים קלים מאוד. pH מעט נמוך יותר של 7.5 משמש במאגר המרווה מכיוון שקשר התיואטר שנוצר בין המאלימיד של CPM לבין תיול הציסטאין נוטה להידרליזה ב- pHs בסיסי יותר (לדוגמה, עבודה קודמת מצאה שמצומדים של ציסטאין-מלימיד יציבים הרבה יותר ב- pH 7.3 מאשר pH 812).
  2. הסר את תמיסות מלאי חלקי DMSO מהאחסון והשאר אותן בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפחות כדי לאפשר למלאי המורכב להפשיר.
  3. חיץ בדיקת qIT של דגה על ידי בעבוע עם גז ארגון במשך כ -30 דקות.
  4. החליפו ביסודיות את תמיסת חלבון המטרה במאגר בדיקת qIT נטול גזים. באופן מכריע, חומרים מחזרים כגון DTT ו-TCEP חייבים להיות מוסרים ביסודיות לריכוזים < 100 ננומטר, שכן הם יפריעו לכימות תיול. שלב זה יכול להתבצע באמצעות סדרה חוזרת ונשנית של חילופי חיץ, כמתואר להלן.
    1. יש לדלל את תמיסת החלבון מעבר למאגר בדיקת qIT נטול גז ביחידת מסנן ספין, להתרכז באמצעות צנטריפוגה (4000 x גרם, 4°C, 15 דקות) ולחזור על הפעולה. בדרך כלל, נדרשים 4 סבבים של 1 מתוך 15 דילולים כדי להסיר מספיק DTT (1 מ"ל) מ-1 מ"ל של תמיסת מלאי חלבונים רקומביננטיים, אם כי ניתן להתאים שלב זה בהתאם לריכוז חומר ההפחתה בתמיסת החלבון הרקומביננטי המקורית.
      הערה: לחלופין, חידוד תמיסת חלבון המטרה כנגד עודף גדול של מאגר בדיקת qIT נטול גז יכול להשיג את אותה תוצאה.
  5. דללו את תמיסת חלבון המטרה (המיוצרת בשלב 2.1) לריכוז חלבון של 15 מיקרומטר במאגר בדיקת qIT נטול גזים. כ-9 מ"ל של תמיסת חלבון מטרה נדרשים כדי למלא צלחת של 384 בארות עם נפח מת מספיק.
  6. הכן השעיה של 1.5% (v/v) של TCEP-agarose במאגר בדיקת qIT degassed. כ -9 מ"ל של תרחיף TCEP-agarose נדרש לכל צלחת הקרנה.
  7. יש לפזר 20 מיקרוליטר של תמיסת TCEP-agarose לכל באר של שתי צלחות 384 בארות.
  8. הכינו מלאי גלוטתיון של 15 מיקרומטר במאגר בדיקת qIT נטול גזים. יש להכין אותו מיד לפני הציפוי, שכן גלוטתיון מתחמצן במהירות בתמיסה ללא חומר מחזרים.
  9. יש לחלק 20 μL של מאגר בדיקת qIT לעמודות 1 ו-2 של שני לוחות 384 הקידוחים.
  10. יש לפזר 20 μL של 15 מיקרומטר חלבון או תמיסת גלוטתיון (בהתאם לצלחת המיועדת) לעמודות 3-24 של צלחת 384 בארות. אלה מכונים צלחת התגובה החלבונית וצלחת התגובה של גלוטתיון. השאר להפחית ב- RT למשך שעה אחת.
  11. יש לוותר על 58.2 μL של חיץ בדיקת qIT נטול גז לכל באר של צלחת 384 בארות, ולאחר מכן להעביר 1.8 μL מכל באר מקבילה של צלחת ספריית הפרגמנטים כדי ליצור לוח דילול מורכב, שבו כל תרכובת מדוללת לריכוז של 1.5 mM במאגר בדיקת qIT בתוספת 3% DMSO.
    הערה: שלב זה נעשה קל יותר עם תחנת צנרת 384, המאפשרת העברת מלאי מורכב עבור כל באר בפעולה אחת.
  12. לאחר דגירה של שעה אחת של חלבון וגלוטתיון עם TCEP-agarose, העבירו 20 מיקרוליטר של תמיסת תרכובת מכל באר של צלחת דילול התרכובת הן לפלטת התגובה של החלבון והן ללוחית התגובה של גלוטתיון כדי להתחיל את הבדיקה. שלב זה נעשה קל יותר גם עם תחנת צנרת 384. שלבי הבדיקה מסוכמים באיור 3.
    הערה: ניתן לשנות את ריכוז המקטע לפי הצורך, וניתן לחזור על מבחני qIT עבור הפגיעות בריכוזים נמוכים יותר, אם רוצים, כדי לאשר שהזיקה החלבונית אינה תוצר של ריכוז המקטע הגבוה. ריכוז המקטעים הגבוה יחסית משמש להעלאת kpro ו- kGSH כדי להבטיח ששיעורים מדויקים ניתנים לקביעה עבור תרכובות תגובתיות קלות (שיכולות להציג t1/2 (GSH) > 24 שעות בתנאי הבדיקה). יתר על כן, למרות שריכוז מקטעים של 500 מיקרומטר הוא גבוה, ריכוזי מיקרומטר גבוהים עד mM נמוכים שימשו בסינון מקטעים, למשל13.
  13. הפעל טיימר - הבדיקה החלה, ויש לבצע מרווה בנקודות זמן קבועות בהתאם לסעיף להלן.

figure-protocol-2
איור 3: סיכום בדיקת qIT. סיכום הממחיש את השלבים העיקריים של תגובת בדיקת qIT מוגדרת היטב. (נוצר באמצעות BioRender). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. CPM מרווה

הערה: מרווה CPM מבוצעת כדי לכמת את כמות התיול הבלתי מגיב שנותרה בלוחות התגובה של החלבונים והגלוטתיון. אלה צריכים להתבצע בנקודות זמן נפרדות (לדוגמה, נקודות הזמן הבאות משמשות בדרך כלל: 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 ו- 1440 דקות) כדי לאפשר ניטור קינטיקה של תגובה.

  1. הכן פתרונות מלאי CPM (500 מיקרומטר) ב- DMSO, חלק אותם לתוך 111.2 μL aliquots בצינורות מיקרוצנטריפוגה, ואחסן אותם ב -20 ° C. מניות CPM אלה ניתן להכין מראש, ו 1 aliquot יידרש לכל נקודת זמן מרווה.
  2. הכן תמיסת מרווה CPM (1.4 מיקרומטר) על ידי הפשרת תמיסת מלאי CPM קפואה (500 מיקרומטר) והוספתה למאגר מרווה של 40 מ"ל qIT assay.
  3. יש לפזר 27 מיקרוליטר של תמיסת מרווה CPM לכל באר של שתי צלחות 384 בארות - שתיים נדרשות להרוות הן את צלחות התגובה של החלבון והן של הגלוטתיון. אלה נקראים CPM-Quench Plates, להכין אותם מקסימום של 30 דקות לפני השימוש.
  4. צנטריפוגה את צלחת התגובה החלבונית ב 200 x גרם במשך 3 דקות כדי להבטיח TCEP-agarose הוא כדור.
  5. בנקודות זמן שנקבעו מראש, העבירו דגימה של 3 מיקרוליטר מכל באר של צלחת תגובת החלבונים לצלחת קוונץ 'CPM ממולאת מראש. שלב זה הוא גם פשוט באמצעות תחנת צנרת 384.
  6. ערבבו את צלחת ה-CPM Quench Plate על ידי שאיפה וניפוק של 3 x 25 μL. חשוב להסיר את הדגימה מראש הבאר כדי למנוע שאיפה של TCEP-agarose בתחתית, אשר יפריע CPM מרווה.
  7. חזור על שלבים 3.4-3.6 עם צלחת התגובה של גלוטתיון.
  8. דגרו על צלחות ה-CPM Quench (שהוכנו ב-3.4-3.6) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
  9. מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של לוח המרווה CPM (עירור ב- 384 ננומטר ופליטה ב- 470 ננומטר).

4. ניתוח נתונים ובחירת להיטים

  1. עבור כל מרווה, חשב Z' כמדד לאיכות המבחן. יש להתעלם מכל CPM מרווה עם Z' < 0.5.
    Z' = 1 - ((3σ שליטה חיובית +3σ שליטה שלילית) / (μשליטה חיובית - שליטהשלילית μ))
    כאשר σ = עוצמת פלואורסצנטיות סטיית תקן ו- μ = ממוצע עוצמת הפלואורסצנטיות
  2. חישוב ערכי פלואורסצנטיות ממוצעים עבור בארות הבקרה השליליות והחיוביות (עמודות 1 ו- 2, ו- 23 ו- 24, בהתאמה).
  3. לנרמל כל תגובה היטב לערכי הפלואורסצנטיות הממוצעים של הבקרות החיוביות והשליליות:
    % שונה = 100 x (פלואורסצנטיות באר מורכבת - פלואורסצנטיות בקרה שלילית) / (פלואורסצנטיות בקרה חיובית - פלואורסצנטיות בקרה שלילית)
  4. בנפרד, יש לרשום % שינוי לעומת הזמן עבור כל תרכובת המגיבה עם גלוטתיון ועם חלבון המטרה.
  5. התאמת נתוני % שינוי לעומת זמן מנורמל למודל דעיכה מעריכית חד פאזית הן עבור התגובה עם חלבון והן עם גלוטתיון באמצעות המשוואה:
    % שונה = ae - kt + c
    כאשר a = טווח הערכים % שהשתנו, k = קצב התגובה, t = זמן, c = הערך % שהשתנה בזמן אינסופי. התאמת עקומה וקביעת פרמטרים יכולה להתבצע באמצעות תוכנה מסחרית (כגון Graphpad).
  6. השתמש בקצב שבו מקטעים מגיבים עם חלבון (kpro) וגלוטתיון (kGSH) כדי לחשב את הערך Rate Enhancement Factor (REF) עבור כל מקטע:
    REF = kpro / kGSH
  7. השתמש בערכי REF כדי לבחור קטעי פגיעה. ניתן לבצע זאת על ידי הגדרת סף REF (לדוגמה, REF > 3), שיעור פגיעה שרירותי (למשל, 2% העליון), או על ידי בחירת מקטעים עם סטיות תקן REF 3 הגדולות מהממוצע הגיאומטרי.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת qIT משמשת כאן לזיהוי פגיעות מקטע קוולנטי עבור חלבון ציסטאין יחיד ללא שם. MgCl2 (10 mM) נוסף למאגרי התגובה מכיוון שחלבון המטרה ידוע להיקשר ליוני Mg2+ . הבדיקה בוצעה בטריפליקט, ונקבע הקצב שבו כל מקטע הגיב הן עם חלבון המטרה (kpro) והן עם גלוטתיון (kGSH). ערכי Z היו גדולים מ-0.5 עבור כל צלחות המרווה והיו בממוצע 0.75 עבור מרווה חלבונית ו-0.79 עבור מרווה גלוטתיון, מה שמצביע על ביצועי בדיקה מצוינים. לאחר מכן חושבו ערכי REF עבור כל מקטע, והכניסות נבחרו כאשר REF >- 3.

התוצאות המייצגות (איור 4), מספקות דוגמה לבחירת פגיעות באמצעות בדיקת qIT. תרכובת 1 הגיבה בקצב גבוה פי 6.0 עם שאריות ציסטאין על חלבון המטרה מאשר עם גלוטתיון, ובאמצעות קריטריון של REF > 3, נבחרה להיט (איור 4B). תאוצת קצב זו מצביעה על נוכחות של אפקט טמפלציה, לפיו אינטראקציות לא קוולנטיות, מציבות 1 בכיוון הנכון עבור הציסטאין על חלבון המטרה להגיב עם ראש הקרב כלורואצטמיד. לעומת זאת, 2 הוא דוגמה למקטע שאינו נפגע מכיוון שהתגובה בין 2 לשאריות ציסטאין המטרה אינה מואצת ביחס לתגובה בין 2 לגלוטתיון. חוסר תאוצת הקצב מצביע על כך שאין אינטראקציות לא קוולנטיות, הממקמות את 2 בכיוון הנכון כדי להגיב עם שאריות ציסטאין המטרה.

figure-results-1
תרשים 4: תוצאות מייצגות. התוצאות מראות ניטור תגובת חלבון וגלוטתיון על ידי qIT עבור (A) תגובתיות פנימית גבוהה, מקטע פגיעה חיובי כוזב אפשרי, ו-(B) מקטע פגיעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת qIT מספקת פלטפורמה יעילה ונוחה לסינון מקטעים אלקטרופיליים תגובתיים לציסטאין כנגד חלבון מטרה. עם זאת, ישנם שיקולים קריטיים שעלולים לפגוע בביצועי הבדיקה אם אינם נלקחים בחשבון כראוי. בעיקר, חלבוני המטרה חייבים לכלול רק ציסטאין אחד שנחשף לפני השטח כדי להתאים לבדיקת qIT, מכיוון ששאריות ציסטאין אחרות יגיבו עם CPM ויפריעו למדידות פלואורסצנטיות. במקרים קודמים שבהם חלבוני מטרה מכילים מספר רב של ציסטאין שנחשף לפני השטח (כגון עבור הפרוטאז הראשי SARS-CoV-2, GTPase RAP27A הקטן וקינאז תלוי ציקלין 2), מבנים סינון עם שאריות מפריעות הוסרו שימשו בעבר בהצלחה. עם זאת, היעילות של אסטרטגיה זו תשתנה בהתאם לחלבון 10,14,15.

בנוסף, מכיוון שבדיקת qIT מודדת את הירידה בתיול הזמין להגיב עם CPM לאורך זמן, כל גורם שמפחית את שיעור התיול הזמין, כגון חמצון תיול או צבירת חלבונים, עלול לפגוע בביצועי הבדיקה. פירוק גזי חיץ ושימוש בחומר מחזר משותק (TCEP-agarose) מבטיחים חמצון תיול איטי, ויש למתן כל חמצון שנותר על ידי נרמול מדידות הפלואורסצנטיות לאלה של בארות הבקרה החיוביות. עם זאת, בעיות יכולות להתעורר כאשר פיזור לא אחיד של TCEP-agarose בין בארות גורם חמצון תיול לא אחיד. לפיכך, ציפוי TCEP-agarose עקבי חיוני לביצועי המבחן, אשר יכול להיות מאתגר כאשר חלקיקי TCEP-agarose שוקעים במאגרי צנרת.

גם צבירת חלבונים יכולה להוות בעיה, שכן תנאי הבדיקה (דגירה של 24 שעות בטמפרטורת החדר) קשים יחסית. אסטרטגיות פתרון בעיות כגון היתוך חלבוני מטרה לתגי מסיס, שינוי מאגרי תגובה או ביצוע הבדיקה בטמפרטורות נמוכות יותר יכולות להפחית את הצבירה ועשויות לפתור בעיות יציבות חלבון. מקטעים מסוימים עשויים גם לגרום לצבירת חלבונים, מה שמפחית שוב את שיעור התיול הזמין להגיב עם CPM ויוצר פגיעות חיוביות כוזבות. אימות פגיעות אורתוגונליות באמצעות ספקטרומטריית מסה של חלבונים שלמים היא שיטה יעילה לאיתור מקרים אלה, שכן פגיעות חיוביות כוזבות ייצרו אוכלוסייה קטנה או לא קיימת של מינים מסומנים כאשר הם מודגרים עם חלבון מטרה.

כאשר שיקולים אלה נשלטים, לבדיקת qIT יש כמה יתרונות ברורים על פני שיטות אחרות לסינון מקטעים קוולנטיים. בחירת להיטים באמצעות REF מבטיחה שהלהיטים ייבחרו רק אם הם יוצרים אינטראקציות לא קוולנטיות, פרודוקטיביות, עם חלבון היעד. אלקטרופיליות של פרגמנטים משתנה על פני טווחים גדולים, הן בין ראשי נפץ שונים והן בתוך סוגי ראשי קרב; לדוגמה, עבודות קודמות מצאו שינויים של פי כמה מאות בקצב תגובתיות הגלוטתיון בין אקרילאמידים10. טווח רחב זה של אלקטרופיליות יכול להקשות על ההבחנה בין מקטעים עם ערכי kpro גבוהים בשל אפקט טמפלציה מאלה שהם פשוט תגובתיים מאוד, מה שיכול להוביל לבחירה במקטעים תגובתיים מאוד כפגיעות חיוביות כוזבות. לדוגמה, 2 הגיב עם שאריות ציסטאין המטרה מהר יותר מאשר 1 , ומבלי לקחת בחשבון תגובתיות פנימית, עשוי להיבחר כמכה. עם זאת, 2 אינו מגיב עם שאריות ציסטאין המטרה בקצב גבוה יותר מאשר עם גלוטתיון, מה שמצביע על כך ש-kpro גדול יותר של 2 ביחס ל-1 נובע מתגובתיות פנימית גדולה יותר של פרגמנט, ולא מאפקט טמפלציה.

קריאת הפלואורסצנטיות הפשוטה המשמשת את בדיקת qIT לכימות התיול הנותר היא גם יתרון רב. שיטות אחרות לסינון מקטעים קוולנטיים משתמשות בספקטרומטריית מסות חלבון שלם כדי לקבוע את הקצב שבו מקטעים מגיבים עם חלבון מטרה וב-LC-MS כדי לקבוע את הקצב שבו גלוטתיון מגיב עם מקטעים - שניהם דורשים ציוד מיוחד וחסרים תפוקה 8,16. קריאת הפלואורסצנטיות הנוחה הופכת את בדיקת qIT למדרגית ביותר ודורשת רק ציוד מעבדה זמין בדרך כלל.

יחד, חידושים אלה יוצרים שיטה חזקה וניתנת להרחבה של סינון מקטעים קוולנטיים, השוללת את הצורך בציוד ספקטרומטריית מסות.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.A. ו- D.J.M. הם ממציאים משותפים על פטנט המכסה את מבחן QIT: PCT/GB2017/052456.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק ממועצת המחקר הבריטית להנדסה ומדעי הפיזיקה (פרס סטודנט: EP/S023518/1).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ארגון גזBOCI1149
קורנינג 384 בארות, אוגן נמוך, לוחות בדיקה תחתונים שטוחיםקורנינג3575
CPMInvitrogenD346
DMSOסיגמא-אולדריץ'D8418
משותק TCEP-agaroseפירס77712
קורא צלחות מיקרוCLARIOstar
אטמי צלחת PCRBioRadMSA5001
L-גלוטתיון מופחתסיגמא-אולדריץG4251
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'S9888
נתרן הפססיגמא-אולדריץ'RES6007H-A7
'

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boike, L., Henning, N. J., Nomura, D. K. Advances in covalent drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 21, 881-898 (2022).
  2. Gehringer, M., Laufer, S. A. Emerging and re-emerging warheads for targeted covalent inhibitors: Application in medicinal chemistry and chemical biology. J Med Chem. 62, 5673-5724 (2019).
  3. Strelow, J. M. A perspective on the kinetics of covalent and irreversible inhibition. SLAS Discov. 22 (1), 3-20 (2016).
  4. Burger, J. A., Buggy, J. J. Bruton tyrosine kinase inhibitor Ibrutinib (PCI-32765). Leukemia Lymphoma. 54 (11), 2385-2391 (2013).
  5. Hocking, B., Armstrong, A., Mann, D. J. Covalent fragment libraries in drug discovery - Design, synthesis and screening methods. Prog Med Chem. 62, 105-146 (2023).
  6. Lucas, S. C. C., et al. Covalent hits and where to find them. SLAS Discov. 29 (3), 100142(2024).
  7. Craven, G., et al. High-throughput kinetic analysis for target-directed covalent ligand discovery. Angewandte Chemie. 130, 5355-5359 (2018).
  8. Kathman, S. G., Xu, Z., Statsyuk, A. V. A Fragment-based method to discover irreversible covalent inhibitors of cysteine proteases. J Med Chem. 57 (11), 4969-4974 (2014).
  9. Hallenbeck, K. K., et al. A liquid chromatography/mass spectrometry method for screening disulfide tethering fragments. SLAS Discov. 23 (2), 183-192 (2019).
  10. Craven, G., et al. Multiparamter kinetic analysis for covalent fragment optimization by using quantitative irreversible tethering (qIT). Chem Bio Chem. 21, 3417-3422 (2020).
  11. Keeley, A., et al. Covalent fragment libraries in drug discovery. Drug Discov Today. 25 (6), 983-996 (2020).
  12. Gober, I. N., Sharan, R., Villain, M. Improving the stability of thiol-maleimide bioconjugates via the formation of a thiazine structure. J Pept Sci. 29 (10), e3495(2023).
  13. Olp, M. D., et al. Covalent-fragment screening of BRD4 identifies a ligandable site orthogonal to the acetyl-lysine binding sites. ACS Chem Biol. 15 (4), 1036-1049 (2020).
  14. Qin, B., et al. Acrylamide fragment inhibitors that induce unprecedented conformational distorions in Entereovirus 71 3C and SARS-CoV-2 main protease. Acta Pharmaceutica Sinica B. 12 (10), 3924-3999 (2022).
  15. Jamshidiha, M., et al. Identification of the first structurally validated covalent ligands of the small GTPase RAP27A. RSC Med Chem. 13 (2), 150-155 (2022).
  16. Flanagan, M., et al. Chemical and computational methods for the characterization of covalent reactive groups for the prospective design of irreversible inhibitors. J Med Chem. 57, 10072-10079 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Covalent Fragment ScreeningQuantitative Irreversible TetheringCovalent LigandsElectrophilic Small MoleculesProtein Target ScreeningGlutathione ReactivityFluorescence AssayHit IdentificationRate Enhancement FactorCysteine Labeling

Related Articles