מאמר שיטה

כימות נשימה מיטוכונדריאלית בתאי שמרים שלמים

1.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67186

⸱

8 בנובמבר 2024

 ,  ,  , 
1School of Chemistry, Universidad Autónoma de Querétaro, 2Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Morelia, 3Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

במאמר זה

סיכום

נשימה מיטוכונדריאלית בתאים שלמים של שמרים היא אינדיקטור רב ערך לביו-אנרגטיקה של התאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות פנוטיפ זה הרלוונטי למיני שמרים שונים.

תקציר

חילוף החומרים מתואם בעיקר על ידי זמינות האנרגיה התאית ותנאי הסביבה. מבחנים לדעת כיצד תאים מתאימים את חילוף החומרים האנרגטי לתנאים תזונתיים וסביבתיים שונים נותנים מידע רב ערך להבהרת מנגנונים מולקולריים. זרחון חמצוני הוא המקור העיקרי ל-ATP ברוב התאים, ופעילות הנשימה המיטוכונדריאלית היא מרכיב מרכזי בזרחון חמצוני, תוך שמירה על פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית לסינתזת ATP. נשימה מיטוכונדריאלית נחקרת לעתים קרובות במיטוכונדריה מבודדת שחסרה את ההקשר התאי. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות נשימה מיטוכונדריאלית בתאים שלמים של שמרים. שיטה זו חלה על כל מיני השמרים, אם כי היא שימשה בדרך כלל לתאי Saccharomyces cerevisiae. ראשית, נבדק גידול השמרים בתנאים ספציפיים. לאחר מכן, התאים נשטפים ומושעיים מחדש במים נטולי יונים ביחס של 1:1 (w/v). לאחר מכן מכניסים תאים לתא אוקסימטר תוך ערבוב מתמיד, ואלקטרודה של קלארק משמשת לכימות צריכת החמצן. חלק מהמולקולות ממוקמות ברצף בתא ונבחרות על פי השפעה זו על שרשרת הובלת האלקטרונים או סינתזת ATP. מעכב ATPase אוליגומיצין מתווסף תחילה למדידת נשימה יחד עם סינתזת ATP. לאחר מכן, נעשה שימוש במצמד למדידת יכולת הנשימה המקסימלית. לבסוף, תערובת של מעכבי שרשרת הובלת אלקטרונים מתווספת כדי להשליך את צריכת החמצן שאינה קשורה לנשימה המיטוכונדריאלית. הנתונים מנותחים באמצעות רגרסיה ליניארית כדי לקבל את השיפוע, המייצג את קצב צריכת החמצן. היתרון בשיטה זו הוא בכך שהיא ספציפית לנשימה מיטוכונדריאלית של שמרים, תוך שמירה על ההקשר התאי. חשוב להדגיש כי מעכבים המשמשים לכימות נשימה מיטוכונדריאלית עשויים להשתנות בין מיני שמרים.

מבוא

המיטוכונדריה ממלאת תפקיד מהותי בביו-אנרגטיקה תאית מכיוון שהיא המקור העיקרי ל-ATP עבור רוב התאים, ומספר מסלולים מתכנסים ותלויים בפעילות המסלולים המיטוכונדריאלים1. יש צורך בזרחון חמצוני לסינתזה של ATP המשלבת הובלת אלקטרונים דרך שרשרת הובלת האלקטרונים כדי להפחית את פעילות החמצן ו- F1F0- ATPase, תוך סינתזה של ATP באמצעות פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית המיוצר עקב שטף אלקטרונים2. לפיכך, נשימה מיטוכונדריאלית היא חלק מהזרחון החמצוני3.

שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית מורכבת מארבעה קומפלקסים או, במקרים מסוימים, קומפלקס שמרים חסר I (למשל, Saccharomyces cerevisiae), שלושה קומפלקסים ושלושה חלבוני דהידרוגנאז4. מתחמי נשימה ממוקמים בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי; שמרים מסוימים מציגים את שרשרת הובלת האלקטרונים הקנונית עם קומפלקס I (NADH dehydrogenase) או שלושה NADH dehydrogenase, ubiquinone (Co Q), קומפלקס II (succinate ubiquinone oxidoreductase), קומפלקס III (ubiquinone cytochrome oxidoreductase), ציטוכרום c (Cyt c) וקומפלקס IV (ציטוכרום c אוקסידאז)5,6. הובלת אלקטרונים דרך הקומפלקסים מאפשרת שאיבת פרוטונים ממטריצת המיטוכונדריה לחלל הבין-ממברני, ויוצרים פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית7. פרוטונים הממוקמים בחלל הבין-ממברני נשאבים הפוך, לכיוון מטריצת המיטוכונדריה על ידי F1F0 -ATPase כדי לסנתז מולקולת ATP אחת לכל ארבעה פרוטונים שנשאבים8.

מדידות נשימה מיטוכונדריאלית מספקות תובנות חשובות לגבי שלמות המיטוכונדריה, יכולת הנשימה הביו-אנרגטית של התאויכולת הנשימה המיטוכונדריאלית 9. ניתן לנתח את תפקוד הנשימה המיטוכונדריאלית במבחנה או באתרה באמצעות טכניקות מגוונות. עם זאת, ניתוח נשימה מיטוכונדריאלית בתאים שלמים יכול להציג סדרה של יתרונות מכיוון שהוא כולל את כל חילוף החומרים של התא, שכן האינטראקציות של התאים עם סביבתם וחילוף החומרים התוך-תאי נלקחות בחשבון בעת שימוש בתאים שלמים10. יתר על כן, שימוש בתאים שלמים מאפשר הערכה קלה של תנאי ניסוי שונים ומזהה שינויים מינימליים שלא ניתן היה לראות במיטוכונדריהמבודדת 10,11. יתרון נוסף של כימות נשימה מיטוכונדריאלית בתאים שלמים הוא שההשפעות של התפשטות ולוקליזציה של המיטוכונדריה נשמרות12.

נשימת מיטוכונדריה של יונקים בתאים שלמים תוארה בפירוט רב12, תוך השארת המחקר של אורגניזמים איקריוטיים אחרים, כגון שמרים. כאן, אנו מציעים טכניקה לכימות נשימה מיטוכונדריאלית המותאמת לשמרים מפרוטוקולים של יונקים. לפיכך, מושגים מכימות יונקים של נשימה מיטוכונדריאלית שימשו בטכניקה זו. לדוגמה, טכניקה זו מחולקת לשלבים שונים כפרוטוקול היונקים: 1) נשימה בסיסית (תלויה בסובסטרט), 2) נשימה מקושרת ל-ATP (באמצעות עיכוב סינתאז ATP), 3) יכולת נשימה מקסימלית (שימוש במצמד המאפשר חדירות של פרוטונים דרך הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית), 4) עיכוב נשימה מיטוכונדריאלית (שימוש בתערובת של מעכבי שרשרת נשימה כדי להשליך את צריכת החמצן למקורות אחרים שונים מ נשימה מיטוכונדריאלית)11,13. לכן, מאמר זה נועד להציג פרוטוקול לכימות נשימה מיטוכונדריאלית בשמרים.

פרוטוקול

1. אמצעי תרבות והכנת חיסון

  1. הכינו 100 מ"ל של תמצית שמרים-מדיום פפטון-דקסטרוז (YPD) על ידי הוספת 1 גרם תמצית שמרים, 2 גרם פפטון קזאין ו-2 גרם גלוקוז ב-95 מ"ל מים מזוקקים. מחלקים 3 מ"ל למבחנות זכוכית של 10 מ"ל, מעקרים ב-121 מעלות צלזיוס ו-1.5 psi למשך 15 דקות.
    הערה: ניתן לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4 - 8 מעלות צלזיוס עד חודש.
  2. יש לחסן מבחנה מזכוכית בנפח 10 מ"ל המכילה 3 מ"ל מדיום YPD עם 250 מיקרוליטר של תאי שמרים משומרים בגליצרול בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. דגירה למשך הלילה עם תסיסה מתמדת ב-200 סל"ד ו-30 מעלות צלזיוס.
    הערה: הדגירה הטמפרטורה עשויה להשתנות בחלק ממיני השמרים (למשל, ל-Kluyveromyces marxianus יש טמפרטורת גידול אופטימלית של 37 מעלות צלזיוס).
  3. ממלאים צלחת פטרי (60 x 15 מ"מ2) באגר סטרילי 2% YPD (מוסיפים 10 גרם תמצית שמרים, 20 גרם פפטון קזאין, 20 גרם גלוקוז ו-20 גרם אגר בקטריולוגי ל-950 מ"ל מים מזוקקים) ומפסים את צלחת הפטרי עם תאי השמרים הגדלים במבחנה מזכוכית של 10 מ"ל באמצעות לולאה סטרילית. דגרו את צלחת הפטרי בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עד להופעת מושבות מבודדות.
  4. הכן חיסון מקדים על ידי חיסון מבחנה סטרילית מזכוכית של 10 מ"ל המכילה 3 מ"ל של מדיום YPD ב-2% גלוקוז עם שתיים או שלוש מושבות מבודדות שמרים מצלחת הפטרי. דגירה למשך הלילה עם תסיסה מתמדת ב-30 מעלות צלזיוס.

2. תנאי גידול ותכנון ניסויים

  1. לחסן בקבוק ארלנמאייר בנפח 500 מ"ל המכיל 100 מ"ל של מדיום שלם סינתטי סטרילי (מדיום SC; 0.18 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו, 0.5 גרם אמוניום גופרתי, 0.2 גרם דיפוטסיום פוספט, 1 גרם תוספי נשירה סינתטיים של שמרים וגלוקוז על פי התכנון הניסיוני, ב-98.02 מ"ל מים מזוקקים) עם תרבית שמרים ב-ODראשוני 600 ~ 0.1, כלומר כ-3 מ"ל של חיסון הלילה (OD600 ~ 3). הגדירו את המצב הסביבתי או את התוסף עם האתגר הכימי שייבדק בנשימה מיטוכונדריאלית (למשל, הוספת 100 מיקרומטר רסברטרול). הכן בקרה לרכב בבקבוק נפרד לאתגר הכימי. בדוק לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים.
    הערה: מומלץ להשתמש במדיה מינימלית כדי להשליך רעש תזונתי בבדיקה, והמדיה המינימלית המוצעת בשלב זה משמשת עבור S. cerevisiae ועשויה להיות שונה עבור מיני שמרים אחרים. לבסוף, ריכוז הגלוקוז בתוספת במצע התרבית הוא קריטי כדי למנוע דיכוי גלוקוז או אפקט קראבטרי המעכב את הנשימה המיטוכונדריאלית; ריכוזים מתחת ל-0.5% (w/v) נתנו תגובות טובות בנשימה המיטוכונדריאלית המלווה בשיעורי גדילה גבוהים ב-S. cerevisiae. בשמרים שליליים לסרטנים, ריכוזי גלוקוז גבוהים לא השפיעו על הנשימה המיטוכונדריאלית (למשל, K. marxianus).
  2. שקלו צינור חרוטי ריק של 50 מ"ל והשתמשו בו כדי לקצור תאים בשלב האמצע (OD600 ~ 0.5) על ידי צנטריפוגה ב-4000 x גרם למשך 5 דקות.
    הערה: שלב אמצע היומן מומלץ לבדיקת נשימה מיטוכונדריאלית מכיוון שזהו שלב הצמיחה בו חילוף החומרים האנרגטי פעיל יותר.
  3. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה פי 3 עם 25 מ"ל מים נטולי יונים. שקלו את הצינור החרוטי עם תאי הגלולה (משקל רטוב) והפחיתו את משקל הצינור החרוטי כדי לקבל את המשקל הרטוב של התא.
  4. השעו מחדש את הגלולה ב -2 מ"ל מים נטולי יונים.
  5. רשום את ריכוז התאים על ידי חלוקת המשקל הרטוב ב-2 כדי לקבל מ"ג תאים/מ"ל. ערך זה חיוני כדי לקבוע כמה נפח צריך להוסיף כדי לקבל 50 מ"ג תאים לבדיקה.

3. בדיקת צריכת חמצן (פולרוגרפיה)

  1. השתמש באלקטרודת חמצן מסוג קלארק המחוברת לצג YSI5300A ולמחשב לרכישת נתונים.
    1. הניחו 5 מ"ל של חומצה סולפונית מורפו-אתנול המותאמת ל-pH 6 עם טריאתנולמין (מאגר MES-TEA; 10 מ"מ) ו-50 מ"ג תאים (משקל רטוב) בתא הפולרוגרף. הניחו בעדינות את האלקטרודה, דאגו שלא יהיו בועות.
    2. הפעל את צג YSI5300A, את המחשב לרכישת נתונים ואת החדר לערבוב. הגדר את צג YSI5300A על ידי בחירת חוגת ההגדרה של ערוץ 1 ב-AIR. כוונן את ערוץ 1 ל-100% עם חוגת הכיול של ערוץ 1 וייצב את האות למשך 5 דקות ב-100%.
    3. התחל להקליט נתונים במחשב ולמדוד זמן באמצעות כרונומטר.
      הערה: לצג YSI5300A אין מחשב או תוכנית לאיסוף נתונים; זה יכול להיות מיושם חיצונית על ידי המשתמש.
    4. השתמש בתיעול רוחבי של האלקטרודה בתא האוקסימטר כדי להוסיף את המצע הניתן לחמצון, אוליגומיצין, המנתק ותערובת מעכבי שרשרת הנשימה ברצף.
  2. הוסף את המצע הניתן לחמצון (גלוקוז, גליצרול, L-לקטט או מקור פחמן אחר על פי תכנון הניסוי) לריכוז סופי של 10 מ"מ עם מזרק כרומטוגרפיה. שמור על החדר סגור כל הזמן ועם תסיסה מתמדת. רשום את צריכת אחוזי האוויר למשך 2-3 דקות כדי לקבוע את הנשימה הבסיסית.
    הערה: גלוקוז, גליצרול ו-L-לקטט משמשים לניתוח שרשרת הובלת האלקטרונים באתרים שונים בשרשרת הנשימה: חילוף החומרים של גלוקוז מפחית את NAD+ ליצירת NADH ומשמש לניתוח כל שרשרת הנשימה; גליצרול מעביר אלקטרונים ליוביקינון ומשמש להערכת שרשרת הנשימה מיוביקינון; לבסוף L-לקטט מוותר על האלקטרונים שלו לציטוכרום c ומשמש לקביעת ההשפעה מציטוכרום c14. מצעים אלה יכולים להשתנות בהתאם ליכולת האנזימטית של מיני השמרים.
  3. הוסף אוליגומיצין כדי לקבל ריכוז סופי של 0.01 מ"מ בתא האוקסימטר באמצעות מזרק כרומטוגרפיה כדי להעריך נשימה מקושרת ל-ATP ולתעד צריכת אחוזי אוויר למשך 2-3 דקות.
  4. השלם את המפרק, 3-chlorophenylhydrazone carbonyl cyanide (CCCP) כדי להשיג ריכוז סופי של 0.015 מ"מ בתא האוקסימטר עם מזרק כרומטוגרפיה כדי לקבוע את יכולת הנשימה המקסימלית ולתעד את צריכת אחוזי האוויר למשך 2-3 דקות.
  5. השתמש במזרק כרומטוגרפיה כדי להוסיף את מעכבי שרשרת הובלת האלקטרונים: ראשית, 2- thenoyltrifluoroacetone (TTFA) ולאחר מכן, אנטימיצין A (AA) בריכוזים סופיים של 1 מ"מ ו-1 מ"ג/מ"ל, בהתאמה. מדוד כל מעכב במשך 2-3 דקות.
    הערה: מעכבי שרשרת הובלת האלקטרונים יכולים להיות שונים בין מיני שמרים; יש לקחת זאת בחשבון בשלב זה.
  6. יש לסנן כל מקור פחמן בנפרד (כלומר, גלוקוז, גליצרול או L-לקטט). חזור על שלבים 3.3 עד 3.5 עבור כל מקור פחמן. שטפו את התא 3x עם 70% אתנול ו-3x במים נטולי יונים לאחר כל שימוש.

4. עיבוד נתונים

  1. השתמש בעקומות צריכת חמצן (התוויית אחוז אוויר לעומת זמן) כדי לחשב את שיפועי המצע הניתן לחמצון (נשימה בסיסית), אוליגומיצין (נשימה מקושרת ל-ATP), CCCP (נשימה מקסימלית), AA ו-TTFA (לא נשימה מיטוכונדריאלית; איור 1). חשב שיפועים בודדים עבור כל תרכובת משלימה באמצעות רגרסיה ליניארית כמתואר להלן.
    1. יצירת קובץ פרויקט חדש בתוכנה הסטטיסטית. בחר XY במקטע Create. בחר באפשרות הזן או ייבא נתונים לטבלה חדשה במקטע טבלת נתונים.
    2. בחר מספרים במקטע המשנה X במקטע אפשרויות. לחץ על הזן 3 ערכים משוכפלים בעמודות משנה זו לצד זו בסעיף המשנה Y בסעיף אפשרויות.
      הערה: תבנית הטבלה כוללת עמודת X אחת ומספר עמודות Y, כל אחת עם 3 עמודות משנה בשם A: Y1 ו- A: Y2.
    3. הזן נתוני זמן בעמודות X (למשל, 0, 2, 4, 6, 8 שניות או 0, 1, 2, 3 דקות). כתוב את אחוז האוויר בעמודות Y.
    4. בצע התאמה ליניארית של רגרסיה. לחצו על ניתוח בשורת התפריטים. באפשרות ניתוח, בחר רגרסיה ליניארית פשוטה בניתוחי XY ולחץ על אישור.
    5. השג את ערך השיפוע מהטבלאות תוצאות בנתונים בחלק הימני של המסך.
  2. כתוב ערכי שיפוע בגיליון נתונים והחסר את ערך השיפוע המתקבל מתערובת מעכבי הנשימה (AA ו-TTFA) ממדרונות המתקבלים מהמצע הניתן לחמצון, אוליגומיצין ו-CCCP להשלכת צריכת חמצן ממקורות שונים מנשימה מיטוכונדריאלית.
  3. הכפל את הערכים המתקבלים ב-237 מיקרומטר של O2. ערך זה נחשב למסיסות של O2 במדיום מיטוכונדריאלי מאוזן עם אוויר (20.9% O2) ב-25 מעלות צלזיוס; ערך זה משתנה בהתאם לטמפרטורה, לגובה ולמאגר המופעל.
  4. המרה לדקה; הערכים המתקבלים הם מיקרומטר של O2 בכל פעם, תלוי באופן התוויית הזמן, כדי להשיג מיקרומטר של O2 / דקה.
  5. לחלק ב -50, כלומר מ"ג התאים המשמשים; תא MG יכול להשתנות בהתאם לתכנון הניסוי. לבסוף, צריכת החמצן מתבטאת כמיקרומטר של O2/מ"ג של תאים x דקה

תוצאות

ניתן להשתמש בטכניקת נשימה מיטוכונדריאלית זו עבור מיני שמרים אחרים מלבד S. cerevisiae, כגון Scheffersomyces stipitis15 ו-K. marxianus16. עם זאת, למטרות ייצוגיות, אנו מציגים רק תוצאות מ-S. cerevisiae. ידוע היטב כי S. cerevisiae מציג חילוף חומרים נשימתי דומיננטי בריכוזי גלוקוז נמוכים (מתחת ל-0.8 מ"מ)17,18. לפיכך, כדי לאשש את הפנוטיפ הנשימתי של S. cerevisiae, הוא גדל בשני ריכוזי גלוקוז לגירוי (0.5% גלוקוז) והגבלת (5% גלוקוז) נשימה מיטוכונדריאלית18,19. כצפוי, התוצאות המתקבלות בנשימה בסיסית (סובסטרט ניתן לחמצון), נשימה מקושרת ל-ATP (אוליגומיצין) ויכולת נשימה מקסימלית (CCCP) מאמתות את חילוף החומרים האנרגטי האופייני של S. cerevisiae (איור 2). ראינו ערכים גבוהים יותר של צריכת חמצן (נשימה בסיסית, נשימה מקושרת ל-ATP וקיבולת נשימה מקסימלית) בתאים שגדלו עם 0.5% גלוקוז בהשוואה לערכים שהתקבלו בתאים שגדלו עם 5% גלוקוז (איור 2).

בנוסף, הבדיקות השתמשו בשלושה סובסטרטים: גלוקוז, גליצרול ו-L-לקטט. מטרת השימוש בסובסטרטים מגוונים היא להעריך חלקים שונים בשרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית. במצבים אלה, הנשימה המיטוכונדריאלית לא הראתה שינויים משמעותיים תלויי סובסטרט מכיוון שלא נוסף טיפול להפרעה לשרשרת הנשימה (איור 2).

השתמשנו בקוורצטין כדי להעריך את יכולת הטכניקה, תרכובת המשפיעה לרעה על הנשימה המיטוכונדריאלית20. הנתונים שהתקבלו הראו כי קוורצטין הפחית באופן משמעותי את הנשימה המיטוכונדריאלית בתאים שגודלו במצע שקיבל תוספת של 0.5% גלוקוז (איור 3). מצד שני, תאים שגודלו במצע שקיבל תוספת של 5% גלוקוז לא הראו השפעה שלילית משמעותית מקוורצטין (איור 4).

figure-results-1
איור 1: עקומת צריכת חמצן מייצגת. עקומת צריכת חמצן המתקבלת בתאי S. cerevisiae הגדלים במצע SC (0.5% גלוקוז). צבעים מייצגים שיפועים שונים המתקבלים במצע, מפרקים ותוספי מעכבים. ירוק: המצע השתמש בגלוקוז ובנשימה בסיסית המתאימה לשיפוע. כחול: אוליגומיצין, מעכב ATP סינתאז, שיפוע המשמש לקביעת נשימה מקושרת ל-ATP. צהוב: CCCP, ניתוק, שיפוע המשמש להערכת נשימה מקסימלית. אפור ואדום: קומפלקס מעכבים II ו-III, בהתאמה; שיפוע המשמש לקביעת צריכת חמצן שאינה תלויה במיטוכונדריה. קיצורים: CCCP = 3-chlorophenylhydrazone carbonyl cyanide; TTFA = 2- thenoyltrifluoroacetone; AA = אנטימיצין A. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: מבחני צריכת חמצן בתאי S. cerevisiae הגדלים ב-0.5% ו-5% גלוקוז. הנשימה המיטוכונדריאלית מוערכת באמצעות צריכת חמצן הנמדדת בנשימה בסיסית, קיבולת נשימה מקסימלית ונשימה מקושרת ל-ATP בתאי S. cerevisiae הגדלים ב-SC בתוספת של 0.5% ו-5% גלוקוז. שלושה סובסטרטים שימשו להערכת השפעתם הספציפית על שרשרת הובלת האלקטרונים: גלוקוז (NADH dehydrogenases), גליצרול (מאגר יוביקינון) ו-L-לקטט (ציטוכרום c). (A) נשימה בזאלית ב-5% ו-0.5% גלוקוז עם גלוקוז, גליצרול ו-L-לקטט כסובסטרטים; (ב) נשימה מקסימלית ב-5% ו-0.5% גלוקוז עם גלוקוז, גליצרול ו-L-לקטט כסובסטרטים; (C) נשימה מקושרת ל-ATP ב-5% ו-0.5% גלוקוז עם גלוקוז, גליצרול ו-L-לקטט כמצע. התוצאות מוצגות כממוצע ± S.D. משלושה ניסויים עצמאיים, כאשר לכל ניסוי יש שתי חזרות טכניות. ANOVA חד כיווני ואחריו מבחן Tukey (עמ' ≤ 0.05; אותיות שונות: הבדל מובהק, אותן אותיות: אין הבדל משמעותי) לניתוח סטטיסטי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: קוורצטין הגביל את הנשימה המיטוכונדריאלית בריכוז נמוך של גלוקוז בתאי S. cerevisiae שגדלו. מדידת צריכת החמצן בוצעה בנשימה בסיסית, קיבולת נשימה מקסימלית ונשימה מקושרת ל-ATP בתאי S. cerevisiae שגדלו במדיה SC (0.5% גלוקוז) בתוספת קוורצטין (100 מיקרומטר). אתנול שימש להמסת תמיסת הקוורצטין. התוצאות מוצגות כממוצע ± S.D. משלושה ניסויים עצמאיים, כאשר לכל ניסוי יש שתי חזרות טכניות. ניתוחים סטטיסטיים נעשו באמצעות זוג מבחן t של סטודנטים (*, ** p ≤ 0.05). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: קוורצטין אינו משפיע על הנשימה המיטוכונדריאלית בריכוז גבוה של גלוקוז בשמרי אפייה S. cerevisiae. צריכת החמצן נמדדה בנשימה בסיסית, קיבולת נשימה מקסימלית ונשימה מקושרת ל-ATP בתאי S. cerevisiae שגדלו בתקשורת SC (5% גלוקוז) בתוספת קוורצטין (100 מיקרומטר). אתנול משמש להמסת תמיסת הקוורצטין. התוצאות מראות ממוצע ± S.D. משלושה ניסויים עצמאיים, כל אחד עם שתי חזרות טכניות. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות מבחן t זוגי של תלמידים (p ≤ 0.05; ns: לא מובהק). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

זרחון נשימה מיטוכונדריאלית ממלא תפקיד מהותי במספר מסלולים התלויים בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ושומרים על רמות ATP באמצעות זרחון חמצוני. הבנת האופן שבו תנאים סביבתיים ותזונתיים משפיעים על הנשימה המיטוכונדריאלית של שמרים משמשת ככלי להבהרת מנגנונים מולקולריים.

חיוני לשקול את השלבים הקריטיים הבאים כדי להשיג תוצאות אמינות משיטה זו. תסיסה >200 סל"ד היא קריטית להשגת מספיק ביומסה בתנאי גדילה נשימתיים לבדיקת נשימה מיטוכונדריאלית; תנאי תסיסה נמוכים מ-200 סל"ד גורמים לצמיחה לקויה ולהיווצרות ביומסה, שלוקח זמנים גבוהים יותר להגיע לשלב הצמיחה באמצע העץ ועלולים להשפיע על שיעורי צריכת החמצן מכיוון שהתאים שורדים בסביבה פחות מחומצנת. ריכוז הגלוקוז במדיה נקבע על פי פנוטיפ השמרים (Crabtree-חיובי או שלילי); זה קריטי במקרה של שמרים חיוביים לסרטן מכיוון שריכוזי גלוקוז גבוהים מעכבים את הנשימה המיטוכונדריאלית ועלולים להפעיל הטיה בפירוש הנתונים. לדוגמה, ב-S. cerevisiae, גלוקוז גורם לדיכוי קטבולי, ומעכב את הנשימה המיטוכונדריאלית בריכוזי גלוקוז גבוהים21,22. על סמך ראיות אלה מתקבלים ערכים נמוכים יותר בנשימה הבסיסית, בנשימה הקשורה ל-ATP ובנשימה מקסימלית של תאים הגדלים בריכוז גלוקוז גבוה (5%) בהשוואה לתאי שמרים הגדלים בריכוז גלוקוז נמוך (0.5%). יש לבחור בקפידה מעכבי שרשרת נשימה בהתאם לרגישות השמרים; זה קריטי כדי להיפטר ממקורות צריכת חמצן תאיים מלבד נשימה מיטוכונדריאלית.

סובסטרטים, מפרקים מיטוכונדריאלים ומעכבים משמשים לקביעת פרמטרים שונים של נשימה מיטוכונדריאלית בתאים שלמים. עם זאת, לשימוש בהם יש כמה מגבלות. לדוגמה, יש לקחת בחשבון את המטרות הלא ספציפיות מחוץ למיטוכונדריה של מעכבי מיטוכונדריה ומפרקים בתאים שלמים כדי למנוע הטיה בפירוש צריכת החמצן. יתר על כן, יש לבדוק ביתר פירוט את השימוש במקורות פחמן חלופיים לסינון אתר הפעולה בשרשרת הנשימה מכיוון שתוצרי לוואי של חילוף חומרים של גליצרול או L-לקטט יכולים להתחמצן כדי להפחית את NAD+ או FAD+, אשר מוותרים על אלקטרונים ומפעילים את שרשרת הנשימה מאז NADH דהידרוגנאזות וקומפלקס II, בהתאמה. לבסוף, S. cerevisiae ושמרים אחרים מכילים מובילי PDR כגון Yor1p (חלבון עמידות לאוליגומיצין שמרים), מה שמרמז על פליטת אוליגומיצין מהתאים23. יתר על כן, יש צורך בבדיקות המשתמשות בתאים חסרי PDR, למשל, זן AD1-8, שיש לו טרנספורטרים עיקריים של PDR וגורמי שעתוק PDR1/PDR3 שנמחקו, כדי לאמת את השימוש באוליגומיצין ב-S. cerevisiae לכימות נשימה מיטוכונדריאלית.

השימוש בתאים שלמים לכימות נשימה מיטוכונדריאלית שומר על ההקשר התאי, ומעניק טכניקה חזקה יותר להכרת ההשפעות התזונתיות או הסביבתיות על ביו-אנרגטיקה של שמרים. יתר על כן, שימוש בתאים שלמים משמרים לכימות נשימה מיטוכונדריאלית הוא חסכוני יותר, וברמה הטכנית, קל יותר ממיטוכונדריה מבודדת. בנוסף, כמו במבחני מיטוכונדריה מבודדים, מקורות פחמן מגוונים מצביעים על אתר הפעולה בשרשרת הנשימה של מולקולות מסוימות. כהוכחה לכך, הטכניקה הזו מאשרת כי תוספי רסברטרול משפיעים על שרשרת הנשימה ברמת NADH דהידרוגנאז, שכן עיכוב רסברטרול בנשימה הבסיסית נצפה רק עם גלוקוז ולא עם גליצרול או L-לקטט24. מחקרי מבחנה עם קומפלקס מסיס I הדגימו כי רסברטרול מתחרה עם NAD+, מה שמשפיע על פעילות קומפלקס I25. זה מאשש את הפנוטיפ שנצפה בתאים שלמים בטכניקה המוצגת כאן. חוץ מזה, טכניקה זו אמינה גם לחקר ההשפעות השליליות של כימיקלים על נשימת המיטוכונדריה של שמרים. לדוגמה, קוורצטין הוא פוליפנול שנחקר רבות בעשורים האחרונים. בין הראיות העיקריות שנמצאו, הוכח שהוא מגביל את הנשימה המיטוכונדריאלית בתאים שלמים, אשר אומתו על ידי פעילות שרשרת נשימה מורכבת26,27. חשוב לציין, מחקרים מגוונים דיווחו על השפעות מעכבות קוורצטין על נשימה מיטוכונדריאלית במחקרי מודלים שונים28.

חשוב שיהיה תיאור מפורט של חילוף החומרים של שמרים, כולל ביו-אנרגטיקה, מכיוון שמיקרואורגניזמים אלה יכולים להיות פתוגנים של בעלי חיים, כולל בני אדם, ומשמשים גם כמפעלי תאים או ביישומים ביוטכנולוגיים.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי ה-Tecnológico Nacional de México (מענק 20026.24-PD) שהוענק ל-LAMP.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2- thenoyltrifluoroacetone (TTFA)MerckT27006קומפלקס מעכב II
3-כלורופנילהידרזון קרבוניל ציאניד (CCCP)MerckC2759מנתקת נשימה מיטוכונדריאלית   
אבסולוט אתנולMerck107017להמסת קוורצטין 
AgarMerckA1296YPD הכנת אגר
אמוניום גופרתי גרגירי (NH4)2SO4J.T. Baker0792-05SC הכנת מרק
אנטימיצין A (AA)MerckA8674קומפלקס מעכב III
aYSI5300A--------מוניטור 
צנטריפוגההרמלZ 206 Aלתאים צנטריפוגה
חמצן מסוג קלארק--------אלקטרודה 
מחשב--------לרכישת נתונים 
דיפוטסיום פוספט K2HPO4J.T. Baker3252-05SC הכנת מרק
גלוקוזMerckG7021YPD הכנת מרק
גליצרולMerckG5516תוסף מצע בינוני 
לקטטMerckL1250תוסף מצע בינוני 
אוליגומיצין מ-Streptomyces diastatochromogenesMerckO4876עיכוב של סינתאז ATP מיטוכונדריאלי
שייקר אורביטליתרמו פישרSHKE6000דגירה של צינורות זכוכית ובקבוקון 
פפטון מקזאין, עיכול אנזימטיMerck82303YPD הכנת מרק
קוורצטין Merck337951להפחתת נשימה מיטוכונדריאלית
Uracil הכנת מרק MerckU0750SC
תמצית שמריםMerckY1625הכנת מרק YPD
בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו ואמוניום גופרתיMerckY1251SC הכנת מרק
שמרים תוספי תזונה בינוניים נשירה סינתטית ללא אורצילMerckY1501SC הכנת מרק

מקורות

  1. Jang, D. H., Seeger, S. C., Grady, M. E., Shofer, F. S., Eckmann, D. M. Mitochondrial dynamics and respiration within cells with increased open pore cytoskeletal meshes. Biol Open. 6 (12), 1831-1839 (2017).
  2. Duvezin-Caubet, S., Caron, M., Giraud, M. F., Velours, J., di Rago, J. P. The two rotor components of yeast mitochondrial ATP synthase are mechanically coupled by subunit delta. Proc Natl Acad Sci. 100 (23), 13235-13240 (2003).
  3. Vakifahmetoglu-Norberg, H., Ouchida, A. T., Norberg, E. The role of mitochondria in metabolism and cell death. Biochem Biophys Res Comm. 482 (3), 426-431 (2017).
  4. Matus-Ortega, M. G., et al. New complexes containing the internal alternative NADH dehydrogenase (Ndi1) in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 32 (10), 629-641 (2015).
  5. Avéret, N., Jobin, M. L., Devin, A., Rigoulet, M. Proton pumping complex I increases growth yield in Candida utilis. Biochim Biophys. 1847 (10), 1320-1326 (2015).
  6. Schägger, H. Respiratory chain supercomplexes. IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).
  7. Lasserre, J. P., et al. Yeast as a system for modeling mitochondrial disease mechanisms and discovering therapies. Dis Model Mech. 8 (6), 509-526 (2015).
  8. Turina, P., Samoray, D., Gräber, P. H+/ATP ratio of proton transport-coupled ATP synthesis and hydrolysis catalysed by CF0F1-liposomes. EMBO J. 22 (3), 418-426 (2003).
  9. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Prot. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  10. Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal muscles. Int J Mol Sci. 23 (4), 2252(2022).
  11. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
  12. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
  13. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. J Biol Chem. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  14. Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen by Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
  15. Granados-Arvizu, J. A., Canizal-García, M., Madrigal-Pérez, L. A., González-Hernández, J. C., Regalado-González, C. Inhibition of alternative respiration system of Scheffersomyces stipitis and effect on glucose or xylose fermentation. FEMS Yeast Res. 21 (2), foab005(2021).
  16. Carrillo-Garmendia, A., et al. Snf1p/Hxk2p/Mig1p pathway regulates hexose transporters transcript levels, affecting the exponential growth and mitochondrial respiration of Saccharomyces cerevisiae. Fungal Genet Biol. 161, 103701(2022).
  17. Maslanka, R., Zadrag-Tecza, R. Reproductive potential of yeast cells depends on overall action of interconnected changes in central carbon metabolism, cellular biosynthetic capacity, and proteostasis. Int J Mol Sci. 21 (19), 7313(2020).
  18. Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol. 102 (10), 4535-4548 (2018).
  19. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Rep. 21 (11), e50845(2020).
  20. Carrillo-Garmendia, A., et al. Cytotoxicity of quercetin is related to mitochondrial respiration impairment in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 39 (11-12), 617-628 (2022).
  21. Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. FEBS J. 281 (21), 4805-4814 (2014).
  22. Gancedo, J. M. Yeast carbon catabolite repression. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (2), 334-361 (1998).
  23. Katzmann, D. J., et al. Expression of an ATP-binding cassette transporter-encoding gene (YOR1) is required for oligomycin resistance in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 15 (12), 6875-6883 (1995).
  24. Madrigal-Perez, L. A., Nava, G. M., Gonzalez-Hernandez, J. C., Ramos-Gomez, M. Resveratrol increases glycolytic flux in Saccharomyces cerevisiae via a SNF1-dependet mechanism. J Bioenerr Biomemb. 47 (4), 331-336 (2015).
  25. Gueguen, N., et al. Resveratrol directly binds to mitochondrial complex I and increases oxidative stress in brain mitochondria of aged mice. PloS One. 10 (12), e0144290(2015).
  26. Lagoa, R., Graziani, I., Lopez-Sanchez, C., Garcia-Martinez, V., Gutierrez-Merino, C. Complex I and cytochrome c are molecular targets of flavonoids that inhibit hydrogen peroxide production by mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1807 (12), 1562-1572 (2011).
  27. de Oliveira, M. R., et al. Quercetin and the mitochondria: A mechanistic view. Biotechnol Adv. 34 (5), 532-549 (2016).
  28. Carrillo-Garmendia, A., Madrigal-Perez, L. A., Regalado-Gonzalez, C. The multifaceted role of quercetin derived from its mitochondrial mechanism. Mol Cell Biochem. , (2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ATPSaccharomyces Cerevisiae

מאמרים קשורים