מאמר שיטה

כימות דרוזופילה מלנוגסטר פנוטיפים בעין: גישה חישובית המשלבת אילסטיק ופלינוטיפר

DOI:

10.3791/67219

⸱

4 באוקטובר 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy Practice and Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Minnesota

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת העיניים דרוזופילה היא כלי שימושי לחקר תהליכים ביולוגיים שונים, במיוחד מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות. עם זאת, כימות ידני של פנוטיפים של עיניים גסות יכול להיות מוטה ולא אמין. כאן אנו מתארים שיטה שבה ilastik ו Flynotyper משמשים לכימות פנוטיפ העין בצורה משוחדת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עין התרכובת Drosophila melanogaster היא מערך בנוי היטב ומקיף של כ-800 אומטידיה, המציג תבנית סימטרית ומשושה. סדירות זו וקלות התצפית הופכות את מערכת העיניים דרוזופילה לכלי רב עוצמה למדל מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות שונות. עם זאת, לדרכים לכימות פנוטיפים חריגים, כגון דירוג ידני של ציוני חומרת העין, יש מגבלות, במיוחד כאשר מדרגים שינויים חלשים במורפולוגיה של העין. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו גישות חישוביות כגון Flynotyper. השימוש באור טבעתי מאפשר תמונות איכותיות יותר הניגשות לשלמות של אומטידיה. עם זאת, תמונות אלה לא ניתן לנתח על ידי Flynotyper ישירות בשל צללים על ommatidia הציג אור הטבעת. כאן, אנו מתארים דרך בלתי משוחדת לכמת פנוטיפים של עיניים גסות שנצפו במודלים של מחלת דרוזופילה על ידי שילוב של שתי תוכנות, ilastik ו- Flynotyper. על ידי עיבוד מראש של התמונות עם אילסטיק, ניתן לכמת בהצלחה את פנוטיפ העין המחוספסת באמצעות Flynotyper.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגנום Drosophila melanogaster מכיל ~75% מהאורתולוגים הגנטיים הקשורים למחלות אנושיות. בנוסף, במהלך התפתחות העיניים של דרוזופילה, כשני שלישים מהגנים בגנום באים לידי ביטוי, מה שהופך את עין הדרוזופילה למערכת גנטית יוצאת דופן לחקר תפקודים מולקולריים ותאיים שונים, התפתחות ומודלים של מחלות 1,2. לפיכך, מערכת העיניים Drosophila היא כלי ניסיוני שימושי לחקר תהליכים ביולוגיים שונים.

העין המורכבת של דרוזופילה היא מערך בנוי היטב ומקיף של ~800 אומטידיה המציגים תבנית סימטרית ומשושה3. ניתן להשתמש בסדירות של תבנית משושה זו כדי להעריך את ההשפעה של החדרת מוטציות ושינויים בביטוי גנים במורפולוגיית העין4. מחקרים קודמים הדורשים הערכה של מורפולוגיה של העין הסתמכו במידה רבה על דירוג ידני של חומרת פנוטיפים בעין בלתי. כדי לדרג את הפנוטיפים של העין, תמונות מורפולוגיות חיצוניות של העין נלקחות על ידי סטריאומיקרוסקופ 5,6. פנוטיפ העין של כל קבוצה מוערך על ידי פיצול העין החיצונית לארבעה אזורים וחישוב שיעור הניוון בכל אזור 5,6. לאחר מכן, הערכים משמשים לחישוב ממוצעים המושווים לערכים המתקבלים מזבובי בקרה7. הניקוד מבוסס על מידת האיחוי, אובדן האומטידיה, וארגון הזיפים 7,8. תמונות עין זבוב שצולמו באמצעות סטריאומיקרוסקופ נרכשות על ידי חוקר אחד, וניתוח הפנוטיפ של העין מבוצע על ידי חוקר אחר עם ערכות אימות משולשות 7,8.

כשמדובר בדירוג שינויים חלשים במורפולוגיה של העין בעין בלתי, יש מגבלות4. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו גישות חישוביות כגון FLEYE ו- Flynotyper 1,9. Flynotyper היא שיטה חישובית חדשנית להערכה כמותית של שינויים מורפולוגיים במערכת העיניים דרוזופילה1. הוא מזהה באופן אוטומטי את עין הדרוזופילה ואת האומטידיום הבודד, ומחשב ציונים פנוטיפיים (P-Scores) בהתבסס על אי הסדירות שלהעין1. ציון P גבוה יותר מצביע על כך שעין הזבוב מנוונת יותר. תוכנה זו שימשה בהצלחה לכימות החריגה של עיני דרוזופילה 10. למרות Flynotyper מבטיח תהליך אוטומטי, זה עדיין לא יכול להיות מיושם בהצלחה על כמה תמונות עיניים שצולמו על ידי שיטות שונות מיקרוסקופיית אור.

מבחינה איכותית, אנו מעדיפים מקור אור טבעתי על פני מקור אור חד-נקודתי, מכיוון שהוא מציע ייצוג מדויק יותר של כל אומטידיום. עם זאת, כאשר נעשה שימוש באור הטבעת, הוא יוצר צל בצורת טבעת בחלק העליון של כל אומטידיום בשל הצורה המיספרית של האומטידיום. צל בצורת טבעת זה מעכב זיהוי אומטיאלי מדויק על ידי Flynotyper, מה שמוביל לחישוב שגוי של P-Scores.

כדי להתגבר על בעיות אלה, יישמנו את ilastik, כלי מבוסס למידת מכונה לניתוחים שונים, כדי לסווג אומטידיה בתמונות עין זבוב11. לאחר מכן הזננו את התמונות שנוצרו על ידי אילסטיק לתוך Flynotyper כדי לחשב P-Scores. זה מאפשר לנו לכמת את הפגמים המורפולוגיים של עין דרוזופילה ללא משוא פנים1.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. היערכות לכימות

  1. הורד והתקן את ilastik11, ImageJ ואת תוסף ImageJ Flynotyper1. ראה טבלת חומרים לקבלת קישורים לאתר אינטרנט להתקנה. הורד את החבילות המתאימות בהתאם למערכת ההפעלה של המחשב (Mac, Windows, Linux וכו '). בצע את הוראות ההתקנה בדיוק כפי שצוין.
    הערה: ביצוע ההוראות בדיוק כפי שצוין בקישורים שסופקו הוא הכרחי. המחשב המשמש זקוק למערכת הפעלה של 64 סיביות; אחרת, אין מפרטים נדרשים אחרים. עיין בטבלת החומרים לקבלת מפרט המחשב של המערכת המשמשת לפרוטוקול זה.
  2. השתמש בתמונה סטנדרטית כדי לאמן את מודל למידת המכונה. צלם תמונה של עין זבוב בריאה באמצעות מיקרוסקופ אור עם טבעת אור (כגון w1118 x GMR-GAL4), תוך שימוש במרכז העין כנקודת המוקד. לנתח זכרים ונקבות בנפרד; לכן, לרכוש תמונה סטנדרטית עבור זכרים ועבור נקבות.
    הערה: ההגדרות משתנות במידה רבה בהתאם למיקרוסקופ ולמצלמה. ראו את הפסקה השנייה בדיון למידע כללי יותר על הכנת זבובים ורכישת תמונות.
  3. צלם תמונות של עיני הזבוב הניסיוניות באמצעות אותן הגדרות המשמשות לרכישת תמונה סטנדרטית.
    הערה: התמצאות טובה היא בעלת חשיבות עליונה לכימות מדויק. ראו איור 4 כדוגמה להתמצאות נכונה.

2. שימוש באילסטיק לזיהוי אומטידיה מתמונות עין זבוב

  1. לפני תחילת הניתוח, ודא שכל קבוצות הניסוי, ללא קשר למצב הניסוי, נמצאות באותה תיקיית קבצים כדי להקל על התהליכים הבאים. ודא ששמות הקבצים מתאימים כדי לזהות קבוצות ניסוי ולהבחין בין זכרים לנקבות.
    הערה: אנו ממליצים להדפיס את הפרוטוקול ולהשתמש במחשב כדי להגדיל איורים, מכיוון שקל ביותר לעקוב אחר פרוטוקול זה באופן חזותי.
  2. פתח את התוכנה.
    הערה: מומלץ לא לפתוח יישומים אחרים בעת הפעלת התוכנה; אחרת, המחשב עלול לפעול לאט מאוד, במיוחד במערכות ישנות או פחות חזקות.
  3. לחץ על צור פרויקט חדש | זרימות עבודה אחרות, בחר ספירת צפיפות תאים ובחר מיקום לשמירת קובץ הפרוייקט (איור 1A).
  4. לחץ על 1. נתוני קלט | הוסף חדש | הוסף תמונות נפרדות. בחרו את התמונה הסטנדרטית (איור 1B).
  5. לחץ על 2. בחירת תכונות ובחר תכונות לשימוש. בחר את התכונות המוצגות באיור 1C; בחר ערכי סיגמא נוספים כדי להגביר את הרגישות (כלומר, 10, 15, 20 וכו ').
    הערה: אם תיבות רבות מדי מסומנות, התוכנית עשויה לפעול במשך זמן רב.
  6. לחץ על 3. ספירה והגדרת ערך הסיגמא של הקידמה ל- 5.00. סמן 50 אומטידיום בודד או יותר באמצעות הכלי חזית בתמונה הסטנדרטית.
    הערה: חמישים סימונים מתאימים בדרך כלל לניתוח; אולם ככל שאומטידיה מסומנת יותר, כך התוצאות יהיו מדויקות יותר (איור 1D).
  7. לחץ על 3. ספירה ושימוש בכלי רקע כדי לסמן את החלק החיצוני של האומטידיה (איור 1E). ציירו קווים ירוקים בצורת סריג סביב האומטידיה.
    הערה: בדומה לסימונים רבים יותר על האומטידיה, ככל ששורטטו יותר קווים ירוקים, כך התוצאות יהיו מדויקות יותר.
  8. לחץ על 4. ייצוא צפיפות | בחרו 'ייצוא קביעות תמונה ' לקביעת קביעות תמונה (איור 1F). לחץ על פרטי קובץ פלט | בחר פורמט ו tif לניתוח נוסף ב Flynotyper.
  9. לחץ על 5. עיבוד אצווה | בחרו Raw Data Files ובחרו את כל תצלומי הזבובים הניסיוניים לניתוח (איור 1G). רשימת התמונות המיובאות שיש לנתח מוצגת תחת Select Raw Data Files (איור 1H). לחץ על עבד את כל הקבצים בתחתית 5 . מקטע עיבוד אצווה .
    הערה: להזכירכם, ניתוחים של גברים ונשים צריכים להיעשות בנפרד. בהתאם למחשב שבו נעשה שימוש, שלב זה עשוי להימשך 10 דקות או יותר, במיוחד אם קיימות תמונות מיובאות רבות.
  10. לאחר סיום התוכנה, בדוק את אותה תיקיית קבצים המכילה את תמונות עין הזבוב הניסיוניות; יהיו תמונות שחורות בשם "YourSampleName_Probabilities" (איור 1I).

3. שימוש ב-ImageJ להכנת תמונות עבור Flynotyper

  1. פתח את קובץ .tif שנוצר על-ידי אילסטיק (התיבות השחורות) ב-ImageJ.
    הערה: יש לטפל בכל קובץ .tif שנוצר על ידי ilastik בנפרד.
  2. השתמשו בכלי בחירת מלבן ליצירת מלבן סביב העין בלבד. לאחר ציור המלבן, חתוך את האזור על-ידי בחירה באפשרות Ctrl + X או Ctrl + C (איור 2A). המתן להופעת תיבה שחורה בצורת קו המתאר של המלבן.
    הערה: מערכת ההפעלה של המחשב תקבע אם להשתמש ב- 'Ctrl + X' או 'Ctrl + C'. בדרך כלל, 'Ctrl + X' הוא עבור Windows ו- 'Ctrl + C' משמש עבור Mac.
  3. פתח את עין הזבוב החתוכה כעת באמצעות ImageJ; לחץ על קובץ | חדש | לוח פנימי (איור 2B).
  4. שמור את עין הזבוב החתוכה כ- JPEG על ידי לחיצה על קובץ | שמירה בשם | יג. התמונות החתוכות נמצאות כעת באותה תיקיית קבצים כמו התמונות הניסיוניות המקוריות.
    הערה: כדי להקל על השלב הבא, מומלץ ליצור תיקיית קבצים חדשה בשם 'cut' ולהכניס את כל התמונות החתוכות לתיקייה זו.

4. שימוש ב-Flynotyper לחישוב ציונים פנוטיפיים

  1. פתח את Flynotyper כתוסף ImageJ על ידי לחיצה על תוספים | פלינוטיפר.
  2. בחר Add Genotypes ופתח את התיקייה הכוללת את תמונות עין הזבוב החתוכות (תיקיית הקובץ החתוך). שם התיקיה יופיע תחת גנוטיפים (איור 2C).
  3. בדוק את התיבות מיקרוסקופ אור ואנכית אך התאם בהתאם במידת הצורך. בדוק את התיבות יציבות ומרחק למרכז תחת דירוג Ommatidia לפי: (איור 2C).
  4. עבור מספר ommatidia מדורגת נחשב, קלט 200.
    הערה: באופן כללי, 200 הוא מספר טוב אך התאם בהתאם להעדפות.
  5. לחץ על הפעל והמתן להופעת תוצאות הניתוח (איור 2D).
    הערה: שלב זה עשוי להימשך 5 דקות או יותר (או קצר יותר), בהתאם לעוצמת העיבוד של המחשב שבו נעשה שימוש.
  6. העתק והדבק את הקובץ לדוגמה ואת P-Score לתוך תוכנה סטטיסטית לניתוח נוסף.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר קודם השתמשנו בפרוטוקול הזה כדי לקבוע משנים גנטיים של חלבון VCP מוטנטי הקשור לטרשת אמיוטרופית צידית עם דמנציה פרונטוטמפורלית (ALS-FTD)12. בנוסף, שיטה זו שימשה גם במאמר אחר כדי להעריך את הרעילות של ALS-FTD בתיווךS59L CHCHD10, אפילו בעת שימוש במיקרוסקופ סטריאוסקופיישן יותר 13. כדי לאמת עוד יותר את התוצאות הללו, השתמשנו באילסטיק ובפלינוטיפר באותה מוטציה של מחלת ALS-FTD כמו Baek et al.13; עם זאת, צוות מעבדה לא מיומן ביצע את הניסוי והשיג תוצאות דומות. לפיכך, שילוב של ilastik ו- Flynotyper היא שיטה חזקה לניוון ניקוד ללא משוא פנים של Drosophila ommatidia.

אנו מעדיפים את השימוש באור טבעתי מאחר שהוא מאפשר הערכות איכותיות יותר (איור 3). עם זאת, שימוש באור טבעתי גורם לצל ש-Flynotyper אינו יכול לנתח ישירות. כדי להתגבר על כך, עיבדנו מראש את התמונות באילסטיקה לפני שכימות P-Scores עם Flynotyper. בסך הכל, ציוני P של עין זבוב לא מנוונת (GMR-GAL4) היו נמוכים משמעותית בהשוואה לעין מנוונת בינונית (2x_S81L) ולעין מנוונת חמורה (3x_S81L) (איור 4A,B וטבלה 1). זוהי התוצאה הצפויה, שכן ציוני P גבוהים יותר שנוצרו מ- Flynotyper מצביעים על עין מנוונת יותר1. כאשר לא נעשה שימוש באילסטיק, היו הבדלים זניחים בציוני P בין עין לא מנוונת לעין מנוונת במידה בינונית (איור 4C וטבלה 1). עובדה זו מצביעה על כך ש-Flynotyper מתקשה לזהות במדויק דפוסי אומטידיה בתנאי תאורה טבעתית ללא שימוש באילסטיק. הסיבה לכך היא ש- Flynotyper נועד להשתמש בתמונות שצולמו עם אור דו-נקודתי המומר לגווני אפור עם התאמות נוספות כדי לזהות את המרכז האומטידיאלי1. אילסטיק משכפל תהליך זה על ידי שילוב נקודה במרכז כל אומטידיום, מה שמאפשר כימות בתוך Flynotyper.

figure-results-1
איור 1: תהליך עבודה ilastik לדוגמה. (א) יצירת פרויקט חדש באילסטיק. (ב) בחירת התמונה הסטנדרטית. (C) בחירת ערכי סיגמא תחת בחירת תכונה. (ד) סימון חזית האומטידיה לרגישות. (ה) סימון הרקע של אומטידיה לרגישות. (ו) בחירת האופן שבו התוכנה תייצא קבצים מעובדים. (G) בחירת תמונות העין הזבוב הניסיוניות שיש לנתח. (H) להראות אילו תמונות ניסיוניות של עין זבוב ינותחו. (I) מוצר מוגמר לאחר הפעלת התוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תהליך עבודה לדוגמה של Flynotyper. (A) בחירת עין הזבוב בלבד לניתוח נוסף. (B) פתיחת תמונת העין החתוכה בחלון חדש. (C) בחירת התמונות החתוכות שיש לנתח והפרמטרים שיש לבדוק לצורך ניתוח. (ד) תוצאות לדוגמה. ציונים פנוטיפיים מוצגים בימין הקיצוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תמונות עיניים איכותיות של דרוזופילה . אותה עין זבוב שצולמה באור טבעתי (משמאל) ונלקחה באור דו-נקודתי (מימין) בתנאים לא מנוונים (למעלה) ומנוונים (למטה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: שימוש באילסטיק לפני Flynotyper לכימות מדויק של פנוטיפ העין המחוספסת בדרוזופילה. (A) תמונות עיניים דרוזופילה מייצגות של עין לא מנוונת (GMR-GAL4), עין מנוונת בינונית (2x_S81L) ועין מנוונת חמורה (3x_S81L). (B) תוצאות הכימות של Flynotyper לאחר השימוש ב-ilastik. ערכי P של מבחן t דו-צדדי של תמורות חושבו כדי להקל על פירוש התוצאות (GMR-GAL4 לעומת 2x_S81L: p = 0, GMR-GAL4 לעומת 3x_S81L: p = 0) (C) תוצאות כימות מ- Flynotyper ללא שימוש ב- ilastik. ערכי P של מבחן t דו-צדדי של תמורות חושבו כדי להקל על פירוש התוצאות (GMR-GAL4 לעומת 2x_S81L: p = 0.597, GMR-GAL4 לעומת 3x_S81L: p = 0.687). N = 3 לכל קבוצה. נקודות הנתונים מרועדות או מוערמות על ציר ה- x לקבלת בהירות חזותית. קו אופקי מלא מייצג את הממוצע. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

GMR-GAL42x_S81L3x_S81L
עם ilastikבלי אילסטיקעם ilastikבלי אילסטיקעם ilastikבלי אילסטיק
26.755.752.551.259.955.6
17.453.55054.960.752
22.855.556.855.260.155.1

טבלה 1: ציוני P בעת שימוש ב- Flynotyper עם ilastik ובעת שימוש ב- Flynotyper בלבד.

איור משלים S1: תושבת ראש זבוב שהוגדרה לרכישת תמונה. זוהי דוגמה לאופן ההגדרה לרכישת תמונות באמצעות גיליונות נייר מרובים. עם זאת, ניתן להשתמש בכל שיטה המבטיחה כיוון נכון של הראש ועין הזבוב. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: תוצאות כמותיות של ilastik ו- Flynotyper בעת שימוש בערך סיגמא של 2.5 תחת בחירת תכונות. שימוש בערך סיגמא שאינו 5.0 תחת בחירת תכונות באילסטיקה עלול לגרום לכימות לא מדויק. באופן ספציפי, ערך סיגמא של 2.5 גורם לאובדן רגישות. ערכי P של מבחן t דו-צדדי של תמורות חושבו כדי להקל על פירוש התוצאות (GMR-GAL4 לעומת 2x_S81L: p = 0.192, GMR-GAL4 לעומת 3x_S81L: p = 0). N = 3 לכל קבוצה. נקודות הנתונים מרועדות או מוערמות על ציר ה- x לקבלת בהירות חזותית. קו אופקי מלא מייצג את הממוצע. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S3: אובדן רגישות וציוני P לא מדויקים עקב טלאים נמקיים. חיצים לבנים מצביעים על מקטעים של טלאים נמקיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S1: P-Scores בעת שימוש בערך סיגמא של 2.5 תחת בחירת תכונות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האומטידיה של דרוזופילה מהווה מערכת שימושית לחקר תפקודים ביולוגיים שונים ומחלות גנטיות. הסדירות של אומטידיה היא מדידה טובה לבחינת ההשפעה של מוטציות גנטיות4. למרות שקיימות מספר שיטות לחישוב סדירות אומטידיאלית, כגון דירוג ידני, שיטות אלה יכולות להיות מוטות מאוד. כדי להתגבר על גישה מוטה זו, פותחו כלים חצי אוטומטיים 1,11.

לכימות מדויק של העיניים, יש לייעל את הכנת הזבוב והגדרתו. בעוד אנו מבינים שלכל מעבדה תהיה התקנה משלה, אנו מספקים את ההתקנה הבאה במעבדה שלנו כדי לתת לקוראים מושג כיצד להכין זבובים לרכישת תמונות. זבובים מוקפאים ומאוחסנים ב -80 ° C. השתמשנו בגודל מדגם של 3 מכיוון שמניסיוננו, כאשר GMR-GAL4 משולב עם מוטציית S81L, יש מעט מאוד שונות בין האוכלוסייה. עם זאת, יש לזכור, יש להתאים את גודל המדגם לביצוע בדיקת מובהקות השערת אפס. כדי להרכיב את הזבובים לצורך רכישת תמונה, ראש הזבוב מונח על דף נייר קטן מאוד שמתפקד ככרית כך שמרכז העין הוא בערך מישור המוקד (איור משלים S1). המעבדה שלנו משתמשת במיקרוסקופ ובמצלמה מסוג Z-stack (ראו טבלת חומרים) מכיוון שהדבר מפיק תמונות ברורות יותר, מה שמאפשר את ההדמיה הטובה ביותר של העין כולה מכיוון שעין הזבוב היא בצורת כיפה. עם זאת, הפונקציה Z-stack אינה דרישה עבור פרוטוקול זה מכיוון שהשתמשנו בהצלחה בשיטה זו עם סטריאומיקרוסקופ ישן יותר ללא פונקציית Z-stack13. חוגת הטבעת לבהירות מסובבת לא יותר מרבע מהדרך למעלה כדי למנוע חשיפת יתר. העובי הכולל של הדגימות שלנו נע בין 300 ל-450 מיקרון.

במחקר זה, הראינו כי ניתוח של עיני זבוב עם ilastik ו Flynotyper מניב תוצאות כימות ommatidia משוחד ואמין. ניתחנו דפוסי Drosophila ommatidia באמצעות ilastik, כלי ניתוח ביו-תמונה מבוסס למידת מכונה, כדי לסמן ommatidia, ולאחר מכן Flynotyper, שיטה חישובית המשמשת למדידת סדירות ommatidia 1,11. אנו מעדיפים להשתמש בטבעת אור כדי לקבל תמונות להערכה איכותית טובה יותר. עם זאת, גישה זו אינה מאפשרת ל-Flynotyper להפיק תוצאות כמותיות באמצעות תמונות אלה. לכן, ilastik מיושם כדי preprocess תמונות אלה, ותמונות מעובדות אלה שימשו בהצלחה עם Flynotyper כדי לייצר תוצאות כמותיות. כאשר התמונות לא עובדו מראש עם אילסטיק לפני Flynotyper, ציוני P הכוללים היו דומים בין עיניים לא ניווניות וניווניות. זה מדגיש את החשיבות של שימוש ilastik הראשון בעת יישום טבעת אור עבור תוצאות כמותיות.

יש כמה מגבלות בשיטות שלנו. ההגדרות ב- ilastik יכולות להשתנות מאוד ויכולות לגרום לנתונים לא משמעותיים. לדוגמה, ביצענו סדרה נוספת של ניתוחים באמצעות אותן תמונות, אך התאמנו את ערך הסיגמא הקדמי באילסטיקה ל- 2.5 במקום 5. כתוצאה מכך אבדה הרגישות בפנוטיפים ניווניים בינוניים (איור משלים S2 וטבלה משלימה S1). מגבלה נוספת היא אובדן רגישות בעיניים עם יותר מדי התנוונות. בהשוואה לעין 3x_S81L, עין עם כתמים נמקיים היא איכותית הרבה יותר מנוונת. עם זאת, ציון P הממוצע עבור עיניים 3x_S81L היה 60.2, בעוד שציון P הממוצע עבור עיניים עם כתמים נמקיים היה 60.9. לכן, עיניים עם יותר מדי התנוונות, כגון כתמים נמקיים, יכולות גם לגרום לאובדן רגישות (איור משלים S3).

שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא בחירת תמונה סטנדרטית מתאימה, המשמשת לאימון אילסטיק. תמונה סטנדרטית לא מנוונת עם ניגודיות ברורה בין האומטידיה לבין תאי הפיגמנט שמסביב, כגון עיניים אדומות או כתומות, תביא לכימות מדויק יותר ב- Flynotyper. שלב קריטי נוסף הוא בחירת תכונות באילסטיקה שבה רגישות, המיוצגת כערכי סיגמא, נבחרת כדי לכוונן את תוכנת למידת המכונה (איור 1D). הבחירה של מעט מדי תכונות יכולה להפחית את הרגישות של ilastik, מה שמוביל סימון לא מדויק של ommatidia. הבחירה של תכונות רבות מדי תגדיל את משך הזמן וכוח העיבוד הנדרשים כדי לייצר תוצאות, ותפחית את יעילות ההליך. לחלופין, אם יש ניוון איכותי ניכר של העין, אך תוצאות הניתוח אינן מובהקות סטטיסטית, הגדלת ערך הסיגמא של התכונות שנבחרו תהיה תיקון פוטנציאלי. עם זאת, בחירות התכונות המסופקות בפרוטוקול זה מפיקות באופן קבוע תוצאות מדויקות. ביצוע השלבים הקריטיים כפי שנכתבו יסייע לצמצם את הבעיות הנפוצות ביותר ולפתור בעיות בעתיד.

לסיכום, שיטה זו מספקת תמונות איכותיות יותר תוך שהיא מניבה גם כימות אמין ובלתי משוחד של מערכת העיניים דרוזופילה . כתוצאה מכך, שיטה זו יכולה לשפר את התועלת של ניוון העין ככלי רב עוצמה למידול מחלות ניווניות בעתיד.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לפדרו פרננדז-פונז על השימוש במיקרוסקופ ובמצלמה המשמשים בפרוטוקול זה. ברצוננו להודות גם לאווה שפמן על מתן משוב על בהירות הפרוטוקול. תמיכה כספית ניתנה על ידי קרן Wallin Neuroscience Discovery Fund לנאם צ'ול קים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מפרטRyzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
FlynotyperIyer, J. et al. (2016)הורד תוכנה כאן: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.htmlתוכנת קוד פתוח. אין להשתמש ב-Flynotyper 2.0. בזמן הפרסום, 2.0 היה חדש למדי ופרוטוקול זה מותאם לגרסה המקורית של Flynotyper.
ilastikBerg, S. et al. (2019)הורד תוכנה כאן: https://www.ilastik.org/download.htmlתוכנת קוד פתוח. הורד את גרסה 1.4.0.post1 תחת Regular Builds המתאים למערכת ההפעלה של המחשב שלך.
ImageJהורד תוכנה כאן: https://imagej.net/ij/download.htmlתוכנת קוד פתוח. נעשה שימוש בגרסאות 1.53 ו-1.54. 1.54 היא הגרסה המעודכנת והיא הורדת ברירת המחדל.
Leica Application Suite (LAS X)Leica MicrosystemsLASX Office 1.4.6 28433מערכת ותוכנה המשמשת לרכישת z-stack.
מיקרוסקופ Leica Z16 APO עם מצלמת DMC2900Leica Microsystems10 447 173, 12 730 466המכונה מיקרוסקופ Z-stack ומצלמה בטקסט. מוצר זה מאוחסן כעת בארכיון.
מחשב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Iyer, J., et al. Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster. G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).
  2. Thomas, B. J., Wassarman, D. A. A fly's eye view of biology. Trends Genet. 15 (5), 184-190 (1999).
  3. Roignant, J. -Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 795-804 (2009).
  4. Diez-Hermano, S., Ganfornina, M. D., Vegas, E., Sanchez, D. Machine learning representation of loss of eye regularity in a Drosophila neurodegenerative model. Front Neurosci. 14 (1), 1-14 (2020).
  5. Appocher, C., Klima, R., Feiguin, F. Functional screening in Drosophila reveals the conserved role of REEP1 in promoting stress resistance and preventing the formation of Tau aggregates. Hum Mol Genet. 23 (25), 6762-6772 (2014).
  6. Pandey, U. B., et al. HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS. Nature. 447 (7146), 860-864 (2007).
  7. Outa, A. A., et al. Validation of a Drosophila model of wild-type and T315I mutated BCR-ABL1 in chronic myeloid leukemia: an effective platform for treatment screening. Haematologica. 105 (2), 387-397 (2019).
  8. Shirinian, M., et al. A transgenic Drosophila melanogaster model to study human T-lymphotropic virus oncoprotein Tax-1-driven transformation in vivo. J Virol. 89 (15), 8092-8095 (2015).
  9. Diez-Hermano, S., Valero, J., Rueda, C., Ganfornina, M. D., Sanchez, D. An automated image analysis method to measure regularity in biological patterns: a case study in a Drosophila neurodegenerative model. Mol Neurodegener. 10 (1), 1-10 (2015).
  10. Yusuff, T., et al. Drosophila models of pathogenic copy-number variant genes show global and non-neuronal defects during development. PLoS Genet. 16 (6), e1008792-e1008792 (2020).
  11. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16, 1226-1232 (2019).
  12. Chalmers, M. R., Kim, J., Kim, N. C. Eip74EF is a dominant modifier for ALS-FTD-linked VCPR152H phenotypes in the Drosophila eye model. BMC Res Notes. 16 (1), 1-5 (2023).
  13. Baek, M., et al. TDP-43 and PINK1 mediate CHCHD10S59L mutation-induced defects in Drosophila and in vitro. Nat Commun. 12 (1), 1-20 (2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Drosophila Eye PhenotypesRough Eye QuantificationFlynotyper AnalysisIlastik Image ProcessingOmmatidial PatternDisease Model QuantificationEye Morphology ScoringCell Density CountingRing Light ImagingImage J Analysis

מאמרים קשורים