מאמר שיטה

בידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם ברקמת הטחול של העכבר

DOI:

10.3791/67234

⸱

20 בספטמבר 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 2Scientific Research Center, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 3Medical Interdisciplinary Science Research Center of Western Guangdong, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד אקסוזומים שמקורם בטחול עכברים באמצעות שילוב של עיכול עם קולגן מסוג I ואולטרה-צנטריפוגה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אקסוזומים (Exo) הם מבנים דו-שכבתיים ליפידים המופרשים על ידי תאים שונים, כולל אלה של בעלי חיים, צמחים ופרוקריוטים. מחקרים קודמים גילו כי אקסו שמקורו בהומור או בסופרנאטנט תאי הם מטרות מבטיחות לסמנים ביולוגיים אבחוניים או פרוגנוסטיים חדשים, מה שמדגיש את תפקידם המשמעותי בפתוגנזה של מחלות. Exo שמקורו ברקמה (Ti-Exo) משך תשומת לב גוברת בשל יכולתו לשקף במדויק את ספציפיות הרקמה ואת המיקרו-סביבה. Ti-Exo, הנוכח בחלל הבין-תאי, ממלא תפקידים מכריעים בתקשורת בין-תאית ובאיתות חוצה איברים. למרות הערך המוכר שלהם בהבהרת מנגנוני המחלה, בידוד Ti-Exo נותר מאתגר בשל מורכבות מטריצות הרקמה והשונות בשיטות החילוץ. במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול מעשי לבידוד אקסוזומים מרקמת הטחול של עכברים, המספק טכניקה הניתנת לשחזור לניתוח זיהוי עוקב ולמחקרים פונקציונליים. השתמשנו בעיכול קולגנאז מסוג I בשילוב עם אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד אקסו שמקורו בטחול. המאפיינים של אקסו המבודד נקבעו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, ציטומטר זרימת ננו וכתם מערבי. אקסו המבודד שמקורו בטחול הציג את המורפולוגיה האופיינית של שלפוחיות דו-שכבתיות ליפידיות, עם גדלי חלקיקים הנעים בין 30 ננומטר ל-150 ננומטר. בנוסף, פרופיל הביטוי של סמנים אקסוזום אישר את נוכחותם וטוהרתם של אקסוזומים. יחד, ביססנו בהצלחה פרוטוקול מעשי לבידוד אקסו שמקורו בטחול בעכברים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אקסוזומים (Exo) הם תת-קבוצה של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs), שגודלן נע בין 30 ל-150 ננומטר, והיא מכילה מגוון רחב של ביומולקולות, כולל חלבונים, חומצות גרעין ושומנים1. ביומולקולות אלה נגזרות מתאי ההורים ומשוחררות לחלל החוץ תאי. אקסו מאפשרת חילופי מידע ביומולקולריים בין תאים והמיקרו-סביבה הסובבת אותם, וממלאת תפקידים הן במערכות פרוקריוטיות והן במערכות אאוקריוטיות2. המאפיינים של אקסוזומים, כגון תוכן, גודל, מרכיבי קרום ומקור תאי, משתנים מאוד ומושפעים מסוג התא המקורי, מצב התא ותנאי הסביבה.

אקסוזומים מסווגים בדרך כלל לשלוש קטגוריות בהתבסס על המקור שלהם: תרבית תאים, נוזל גוף, נגזר רקמה (Ti-Exo). בעוד אקסוזומים שמקורם בתרביות תאים נחקרו בהרחבה בשל נגישותם ותפוקתם העקבית, השימוש בהם מוגבל על ידי שינויים פוטנציאליים במאפייני התא לאחר תרבית ממושכת, אשר עשויים להציג באופן שגוי את תפקודיהם הביולוגיים 3,4,5. יתר על כן, רוב תרביות התאים נשמרות בסביבות דו-ממדיות שאינן מחקות את האינטראקציות הבין-תאיות המורכבות in vivo, מה שעלול להשפיע על פירוש הנתונים6. לעומת זאת, אקסוזומים שבודדו מנוזלים ביולוגיים מציעים אפשרות זעיר פולשנית לעקוב אחר התקדמות המחלה בזמן אמת7. עם זאת, דגימות אלה מכילות לעתים קרובות תערובת של אקסוזומים ממקורות שונים, מה שמסבך את הזיהוי המדויק של המקור העיקרי שלהם8. בהתחשב באתגרים אלה, יש עניין גובר ב- Ti-Exo, השוכנים באינטרסטיציום החוץ תאי והם מתווכים מרכזיים של איתות בין-תאי.

הטחול ממלא תפקיד מכריע בתפקוד מערכת החיסון ובשמירה על הומאוסטזיס פנימי. למרות הפרוטוקולים הקיימים לבידוד Ti-Exo מאיברים כגון המוח, הכבד והגידולים, שיטות מעשיות לאקסוזומים שמקורם בטחול מדווחות באופן מוגבל 9,10. מחקר זה נועד לבסס פרוטוקול מעשי לבידוד אקסוזומים מרקמת הטחול בעכברים שונה מדו"ח קודם11. אנו מפרטים שיטה המערבת עיכול collagenase ואחריו אולטרה צנטריפוגה, אשר ממזער את ההפרעה של קרום התא ומבטיח טוהר גבוה ותשואה של Exo נגזר הטחול. המאפיינים של אקסו מבודד באמצעות פרוטוקול מבוסס זה אומתו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM), ציטומטר זרימת ננו (Nano-FCM) וכתם מערבי, ואישרו את יעילות הפרוטוקול למחקר ניסיוני נוסף.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדגימות נלקחו מעכברים, עם אישור אתי שניתן על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית גואנגדונג. תיאורים מפורטים של חומרים, ציוד ותוכנות המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים. פרטי ההכנה לפני השאיבה מתוארים באיור 1, בעוד שתהליך המיצוי וההעשרה של הטחול-אקסו מתואר באיור 2.

1. הכנה

  1. קירור מראש של צנטריפוגות במהירות גבוהה ובמהירות גבוהה במיוחד ל -4 ° C והגדר את הטמפרטורה של שייקר שולחני ל -37 ° C.
  2. הכינו צלחות תרבית תאים (figure-protocol-1100 מ"מ), צינורות צנטריפוגות סטריליות בנפח 50 מ"ל, קרח ומסננת תאים סטרילית (figure-protocol-270 מיקרומטר) כפי שמוצג באיור 1A, B.
  3. יש לעקר מספריים ומלקחיים באמצעות תרסיס 75% אלכוהול, ולאחר מכן לבצע עיקור בטמפרטורה גבוהה. הכלים האלה מוצגים באיור 1C.
  4. הניחו את רקמת הטחול בצלחת פטרי סטרילית figure-protocol-3בקוטר 100 מ"מ על קרח, ושטפו את הדם שעל פני השטח עם מי מלח סטריליים חוצצים פוספט (PBS). יבש את רקמות הטחול עם גזה סטרילית ולשקול אותם לאחר ייבוש.
    הערה: אם הרקמה קפואה, הפשירו אותה בצלחת במשך 15 דקות על קרח לפני שתמשיכו.
  5. לחות מסננת התא (figure-protocol-470 מיקרומטר) על ידי הטלת 1 מ"ל של PBS סטרילי לתוך המסננת באמצעות פיפט העברה סטרילי.
  6. מכינים את מאגר העיכול (0.1% סוג I collagenase) באמצעות 1x PBS עם מערבל מערבולת.
    הערה: יש להשתמש ב-10 מ"ל של חיץ עיכול עבור כל 100 מ"ג של רקמת טחול. ריכוז הקולגנאז נבחר במחקר זה על סמך הוראות המוצר. עבור סוגי רקמות אחרים, ייתכן שהחוקרים יצטרכו להתאים פרמטרים אלה בהתבסס על צפיפות הרקמה והרכבה. ניסויים מקדימים עם ריכוזים משתנים וזמני עיכול מומלצים כדי לקבוע את התנאים האופטימליים עבור כל סוג רקמה.

2. עיכול רקמות

  1. קוצצים את הרקמה לחתיכות קטנות ואחידות בעזרת מספריים בצלחת תרבית על קרח (איור 3A) ומעבירים לצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל בעזרת צינור העברה סטרילי.
  2. הוסיפו חיץ עיכול לצינור בהתאם למשקל רקמת הטחול כפי שצוין לעיל (איור 3B), ואז נערו את הצינור בזווית של 45° על שייקר אופקי ב-37°C. עקוב אחר התקדמות העיכול ועצור את העיכול כאשר גושי רקמות התפזרו, ורובם איבדו את צורתם. זמן העיכול צריך להשתנות בין רקמות. בתנאי הניסוי במחקר זה, זמן העיכול הוא כ -30 דקות.
  3. העבירו את התערובת המעוכלת למסננת תאים (Ф70 מיקרומטר) בטמפרטורת החדר (RT) כדי להסיר פסולת רקמות סיבית וגדולה יותר.
    הערה: יש להשלים את הסינון מיד לאחר העיכול.
  4. אספו את התסנין בצינור צנטריפוגה חדש של 50 מ"ל.

3. בידוד אקסוזום על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית

  1. צנטריפוגה מסננת ב 500 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. גלולה שמכילה תאים שיורית, פסולת תאים וגרעינים נראית אחרי צנטריפוגה, כפי שמוצג באיור 3C.
  2. העבר את supernatant לצינור חדש צנטריפוגה ב 3000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C. גלולה שמכילה גופים אפופטוטיים ומיקרוזומים נראית אחרי צנטריפוגה, כפי שמוצג באיור 3D.
  3. העבר את הסופרנאטנט לצינור וצנטריפוגה חדשים ב 10,000 x גרם למשך 30 דקות ב 4 ° C. ניתן לראות גלולות המכילות מיקרו-שלפוחיות וקרום פלזמה לאחר צנטריפוגה, כפי שניתן לראות באיור 3E.
  4. אולטרה-צנטריפוגה את הסופרנאטנט שנוצר ב 120,000 x גרם במשך 2 שעות ב 4 ° C. ניתן לראות גלולה בתחתית הצינור לאחר צנטריפוגה, כפי שניתן לראות באיור 3F.
  5. השליכו את הסופרנטנט, שטפו את הגלולה עם PBS, ואולטרה-צנטריפוגה שוב ב-120,000 x גרם במשך שעתיים ב-4°C כדי לקבל אקסוזומים. ניתן לראות גלולה בתחתית הצינור לאחר צנטריפוגה, כפי שניתן לראות באיור 3G.
  6. ממיסים את האקסוזומים המבודדים עם PBS סטרילי (200 מיקרוליטר לטחול) ומאחסנים את האקסוזומים המבודדים בצינור צנטריפוגה חדש של 2 מ"ל בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

4. אפיון אקסוזום במיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)

הערה: TEM שימש כדי לקבוע אם Exo שחולץ הציג מאפייני שלפוחית. דגימות אקסו המזוהות במיקרוסקופ אלקטרונים חייבות להיות דגימות טריות או מאוחסנות לזמן קצר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לזמן קצר.

  1. תקן אקסוזומים (2-6 מיקרוגרם/μL) עם פרפורמלדהיד ברמת מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) של 2% ב-RT למשך שעתיים.
  2. מניחים 10 מיקרוליטר של תמיסה אקסוזום על רשת נחושת, דוגרים ב-RT למשך 10 דקות, שוטפים במים מזוקקים סטריליים ומכסים את עודפי הנוזל בנייר סופג.
  3. מכתימים את רשת הנחושת עם 2% אורניל אצטט למשך דקה אחת, מכסים את עודפי הנוזל בנייר פילטר ומייבשים תחת מנורת ליבון למשך 2 דקות.
  4. צפו בדגימה המוכנה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת ב 80 קילו וולט.

5. התפלגות גודל ומדידת ריכוז חלקיקים של אקסוזומים

  1. טען את חלקיקי הפוליסטירן הסטנדרטיים (250 ננומטר) לציטומטר זרימת ננו.
  2. מדוד את ריכוז החלבון של דגימות Exo באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA. יש לדלל את דגימת Exo עם PBS בהתאם לתוצאות בדיקת חלבון BCA (לדלל את האקסוזומים ל-1-10 ננוגרם/μL), ולאחר מכן לטעון את דגימות Exo לננו-זרימה כדי למדוד את עוצמת פיזור הצד (SSI).
  3. חישוב ריכוז Exo לפי היחס בין SSI לריכוז החלקיקים בננו-חלקיקי פוליסטירן סטנדרטיים.
    הערה: עבור מדידת גודל, עקומה סטנדרטית נוצרת על ידי טעינת ננו-חלקיקי סיליקה סטנדרטיים עם גדלי שיפוע (68 ננומטר, 91 ננומטר, 113 ננומטר, 155 ננומטר) לציטומטר זרימת ננו. הטעינה של מדגם Exo עוקבת אחר כך. התפלגות הגודל של אקסו חושבה על פי התרופה הסטנדרטית.

6. ליזה ואישור אימונובלוט של חלבונים אקסוזום

  1. הוסף 100 μL של חיץ ליזה של בדיקת משקעים חיסוניים ברדיו (RIPA) לכדורית האקזוזום לצורך ניתוח חלבונים.
  2. מערבולת במרץ, מכסה עם פאראפילם, רוק במשך 20 דקות ב- RT, ואז מערבולת שוב.
  3. צנטריפוגה קצרה ב 1000 x גרם עבור 30-60 שניות לאסוף את הדגימה, להעביר צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל, ולאחסן ב -20 ° C עד -80 ° C עד הניתוח.
  4. עבור אימונובלוט, יש לערבב דגימות עם מאגר העמסה 5x כדי להשיג ריכוז של 1x ולהתכונן לאלקטרופורזה בג'ל.
  5. אם רוצים בקרות הומוגניות של כל הרקמה, השתמשו בחיץ ליזה חזק עם מעכב פרוטאז כדי ליזה את הרקמה, כמפורט לעיל. לאחר מכן, צנטריפוגו את הדגימות במהירות של 10,000 x גרם למשך 10 דקות והשליכו את המטריצה החוץ-תאית הנותרת, תאים שלמים או פסולת תאית שלמה.
  6. מרתיחים את מאגר הדגימה המכיל אקסוזומים או הומוגנט רקמות ב 95 ° C למשך 5-10 דקות. טען חלבון שווה לכל נתיב לתוך ג'ל SDS-PAGE 10%. עומס חלבון שווה של הומוגנט רקמה כבקרה.
  7. המשך עם אלקטרופורזה ג'ל תחת מתח של 80 V במשך כשעתיים באמצעות מאגר אלקטרופורזה קונבנציונאלי. בצע ניתוח כתמים מערביים כדי לאשר ביטוי חלבון אקסו בליזטים המטוהרים ולהשוות שפע אקסו יחסי בשברים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד וטיהור של אקסוזומים שמקורם בטחול
כדי לבודד אקסוזומים מרקמת הטחול של עכבר השתמשנו בשילוב של עיכול קולגן ואולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית (איור 2). השלבים הראשונים כללו טיפול מקדים ברקמת הטחול כדי להסיר דם פני השטח, ולאחר מכן עיכול עם collagenase מסוג I. טיפול אנזימטי זה הקל על פירוק רכיבי המטריקס החוץ תאיים, ובכך שחרר את האקסוזומים תוך שמירה על שלמותם. לאחר העיכול, נעשה שימוש בסדרה של צעדי צנטריפוגה כדי להסיר ברצף פסולת תאית, גופים אפופטוטיים ובועיות גדולות יותר, שהגיעו לשיאם באולטרה-צנטריפוגה של הסופרנאטנט ב -120,000 x גרם כדי להניע את האקזוזומים. הליכי בידוד מאוחרים יותר הניבו כדוריות מסיסות PBS מועשרות באקסו שמקורו בטחול, כפי שניתן לראות באיור 3G.

תוצאות TEM
המורפולוגיה של האקסוזומים המבודדים נבדקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, שיטה סטנדרטית לחקר אפיון האקסוזומים. TEM משמש בדרך כלל כדי לאמת את נוכחותם של אקסוזומים, להעריך את איכות האקסוזומים ולצפות במורפולוגיה של אקסוזומים. תמונות TEM (איור 4A) חשפו נוכחות של שלפוחיות בצורת גביע, אשר אופייניות לאקזוזומים. שלפוחיות אלה הציגו מבנה דו-שכבתי שומני ברור, המאשר את הבידוד המוצלח של אקסוזומים מרקמת הטחול.

התפלגות גודל של טחול-אקסו
התפלגות הגודל והריכוז של האקסוזומים נקבעו באמצעות ציטומטר ננו-זרימה. התוצאות (איור 4B) הצביעו על כך שקוטר האקסוזומים המבודדים נע בין 30 ל-150 ננומטר, עם ריכוז שיא של כ-60 ננומטר. קוטר החלקיקים המבודדים היה דומיננטי בין 50-80 ננומטר, עם ריכוז חלקיקים ממוצע של 4.6 x 109 חלקיקים למ"ל. טווח גדלים זה עולה בקנה אחד עם מאפיינים שדווחו בעבר של אקסוזומים, מה שמאמת עוד יותר את פרוטוקול הבידוד.

ניתוח כתמים מערביים
כדי לאשר את נוכחותם של סמנים אקסוזומליים, ביצענו ניתוח כתם מערבי. הסמנים האקזוזומליים TSG101 ו-CD9 זוהו בדגימות הטחול-אקסו, ואילו GM130, חלבון מטריצת גולג'י המשמש כביקורת שלילית, לא זוהה (איור 4C). לשם השוואה, החלבון של סמנים אלה בא לידי ביטוי ברקמות הטחול של העכבר (Spleen-T). זה מצביע על הטוהר הגבוה של האקסוזומים המבודדים, שכן הם היו נטולי מזהמים תאיים.

figure-results-1
איור 1: הכנת אספקה. (A) צינורות צנטריפוגות בנפח 50 מ"ל, צלחות תרבית, קרח וכלי ניתוח הונחו בארון בטיחות ביולוגית. (B) מסננת תאים סטרילית (figure-results-270 מיקרומטר). (ג) כלי ניתוח מעוקרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 2: הליך בידוד טחול-אקסו. הכן רקמת טחול לחתוך אותו לחתיכות קטנות PBS קר, ואחריו עיכול עם סוג I collagenase וצנטריפוגה כפי שצוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 3: תמונות מייצגות של בידוד טחול-אקסו. (A) גושי טחול קטנים המוכנים לעיכול הבא. (B) גושי רקמת הטחול עם חיץ העיכול. (C) כדורים לאחר 500 x גרם צנטריפוגה. (D) כדורים לאחר צנטריפוגה של 3,000 x גרם . (E) כדוריות לאחר צנטריפוגה של 10,000 x גרם . (F) כדורים לאחר צנטריפוגה של 120,000 x גרם . (G) כדורי אקסוזום לאחר צנטריפוגה של 120,000 x גרם . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 4: זיהוי של טחול-אקסו. (A) תוצאות TEM המציגות חלקיקים מבודדים כשלפוחיות קרומיות עגולות או סגלגלות עם מורפולוגיה בצורת גביע. סרגל קנה מידה = 200 ננומטר ו- 50 ננומטר, בהתאמה. (B) ניתוח התפלגות גודל על ידי Flow Nano Analyzer הראה כי הקוטר של Spleen-Exo נע באופן דומיננטי בין 50 ננומטר ל 80 ננומטר, עם ריכוז חלקיקים ממוצע של 4.6 × 109 חלקיקים / מ"ל. (C) ניתוח כתמים מערביים המראה ביטוי של חלבוני סמן ספציפיים לאקזוזום (TSG101 ו-CD9) בטחול-אקסו, עם ביטוי שלילי של GM130. סמנים אלה זוהו בדגימות חלבון שהופקו מטחול עכבר (קבוצת Spleen-T). הוצגו תמונות הכתם המערבי המייצג (n = 6 רקמות). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים אחרונים דיווחו כי אקסוזומים שמקורם בטחול (Spleen-Exo) ממלאים תפקיד קריטי בטיפול בסרטן קיבה12. כדי להבהיר עוד יותר את הפונקציות של טחול-Exo, יש צורך להקים שיטה לשחזור אופטימלי עבור מיצוי שלהם מרקמת הטחול. בעוד שקיימים פרוטוקולים לבידוד אקסוזומים מסרטן המוח והכבד13,14, שיטות לרקמות אחרות אינן מפותחות ודורשות אימות נוסף. במחקר זה התווינו שיטה מעשית לבידוד אקסו מרקמת הטחול.

במהלך השנים האחרונות, שיטות שונות שימשו כדי לחלץ Exo במחקר מדעי ויישומים, כולל אולטרה צנטריפוגה, צנטריפוגה שיפוע צפיפות, immunoadsorption חרוזים מגנטיים, אולטרה סינון, משקעים פולימרי15. אולטרה-צנטריפוגה נותרה שיטת תקן הזהב לחילוץ אקסו ממקורות שונים. מחקרים קודמים התמקדו בשיבוש מבני רקמות כדי להשיג ריכוזים גבוהים יותר של Exo, המורכב ממקורות תוך-תאיים וחוץ-תאיים של Exo16. Collagenase ממזער את ההשפעה על שלמות קרום התא, ומבטיח את טוהר Ti-Exo3. Collagenase שימש למיצוי שלפוחיות חוץ-תאיות ממלנומה גרורתית אנושית, שומן, סרטן המעי הגס ורקמות סרטן הכבד 5,10,13,17. עם זאת, הריכוז וזמן העיכול של collagenase להשתנות בין רקמות שונות.

קבענו פרוטוקול ספציפי לבידוד טחול-אקסו באמצעות קולגנאז מסוג I לעיכול, ואחריו סינון באמצעות אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, כדי להניב טחול-אקסו באיכות גבוהה. אולטרה-צנטריפוגה יכולה להסיר ביעילות תאים שיורית, שלפוחיות גדולות, פסולת תאים וגופים אפופטוטיים מהדגימות16. Crescitelli et al. השתמשו collagenase D ו ultracentrifugation הדרגתי כדי לבודד שלפוחיות חוץ תאיות קטנות עם גודל ממוצע של 75 ננומטר בקוטר5. בהשוואה לפרוטוקול שלהם, הפרוטוקול שלנו השתמש בקולגנאז מסוג I ובצעד אולטרה-צנטריפוגה נוסף ב-120,000 x גרם כדי להשיג טוהר אופטימלי של אקסוזומים. בניגוד לדיווחים קודמים שהשתמשו בהומוגניזציה של רקמות כדי להשיג תרחיף רקמות14,18, הגישה שלנו שומרת על שלמות הממברנה של תאים ברקמות. בנוסף, Vella et al. הפעילו צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות (שיפוע סוכרוז משולש) כדי ליצור שלוש קבוצות של חלקיקים, מה שדרש זמן נוסף לפעולה10. גישה זו ייצרה שלפוחיות גדולות בגודל מעל 200 ננומטר, אוכלוסייה הטרוגנית של שלפוחיות בגדלים הנעים בין 50 ננומטר ל -200 ננומטר, ובועיות קטנות בגודל של כ -20 ננומטר. הפרוטוקול המתואר בפרוטוקול מחקר זה כולל סדרה של צעדי אולטרה-צנטריפוגה כדי לחסל באופן שיטתי תאים שיורית, פסולת תאים, גופים אפופטוטיים ובועיות גדולות יותר, ובכך לשפר את טוהר האקסו המתקבל. אנו שמים דגש על טיפול זהיר במהלך איסוף הסופרנאטנט כדי למנוע הפרעה לכדורי המשקעים.

אנו מעריכים את המורפולוגיה והטוהר של הטחול-אקסו המבודד באמצעות TEM וניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. שתי הבדיקות גילו כי החלקיקים שמקורם בטחול שבודדו על ידי פרוטוקול זה הציגו בועיות דו-שכבתיות ליפידיות ובועיות בצורת גביע בגדלים הנעים בין 30 ננומטר ל-150 ננומטר, שהם המאפיינים האופייניים של אקסוזומים19. CD9 ו-TSG101 הם סמנים אקסוזום19, ו-GM130, חלבון גולג'י, משמש כסמן שלילי לזיהוי אקסוזום20. התוצאות הראו כי Spleen-Exo היו חיוביים עבור CD9 ו- TSG101, בעוד GM130 לא זוהה, מה שמאשר את הבידוד המוצלח של Exo באיכות גבוהה, נגזר רקמות מטחול.

בהשגת Ti-Exo באיכות גבוהה, בחירת סוג האנזים המתאים, הריכוז ומשך העיכול, כמו גם אחסון רקמות מתאים, היא חיונית. לא ראינו הבדל משמעותי בריכוזי החלבונים בין Exo שמקורו ברקמות טחול טריות לעומת קפואות (הנתונים לא הוצגו), מה שמצביע על היתכנות עיבוד כמויות גדולות של רקמות קפואות כדי להפחית את זרימת העבודה. בידוד Ti-Exo דורש זמן פעולה ארוך עבור אולטרה-צנטריפוגה, מה שהופך אותו לבלתי מעשי להשלים את כל הפרוטוקול בתוך פרק זמן מתאים בעת שימוש ברקמות טריות ביישומים קליניים. לכן, שימוש ברקמות קפואות לבידוד אקסוזום תהיה אפשרות טובה יותר. הפשרה ב 37 ° C אינו מתאים לרקמות קפואות עקב חדירה חלקית של חומרים cryoprotective ברקמות. דווח כי בעת ביצוע בידוד אקסוזום באמצעות רקמות קפואות המפשרות על קרח, תנובת האקסוזומים לא הראתה משמעות בתוכן בהשוואה לרקמות טריות21. לכן, הפשרנו את רקמות הטחול הקפואות על קרח כדי לבצע בידוד אקסוזום בעת שימוש בדגימות האחסון ב -80 מעלות צלזיוס.

עם זאת, לפרוטוקול המתואר במחקר זה יש מספר מגבלות. השלבים הנרחבים הכרוכים בחילוץ ובזיהוי גוזלים זמן. בהתחשב במטרה הסופית של יישום מחקר Exo לטיפול במחלות קליניות, שיטות מהירות וחסכוניות יותר הופכות קריטיות יותר ויותר. בנוסף, בעוד התוצאות מבוססות על דגימות רקמת עכבר, התחולה על רקמות אנושיות עדיין לא נקבעה.

לסיכום, הפרוטוקול מספק שיטה לחילוץ אקסו טהור ביותר מרקמת הטחול, המתאימה לניתוח מפורט במורד הזרם. אקסו שמקורו ברקמה משקף את המיקרו-סביבה של מקורם בצורה מדויקת יותר וטומן בחובו פוטנציאל משמעותי להבהרת תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים באורגניזמים חיים. מחקרים עתידיים יוכלו להתאים פרוטוקול זה לרקמות אנושיות, ולאפשר מיצוי של אקסוזומים רלוונטיים מבחינה קלינית למטרות אבחון וטיפול. שיטה זו עשויה להיות שימושית במיוחד בחקר התפקיד של אקסוזומים בתגובות חיסוניות, בהתחשב בתפקיד הקריטי של הטחול במערכת החיסון. יתר על כן, ניתן לשנות את הפרוטוקול כדי לבודד אקסוזומים מרקמות אחרות, מה שעשוי לסייע בפיתוח סמנים ביולוגיים ספציפיים לרקמות וטיפולים ממוקדים. על ידי שיפור ההבנה שלנו של ביולוגיה אקסוזומית, פרוטוקול זה יכול לתרום להתקדמות ברפואה מדויקת ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82370281, 81870222), הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (2022A1515012103), והמדע, פרויקט ההקצאה התחרותית של הקרן המיוחדת לפיתוח טכנולוגיה של העיר ג'נג'יאנג (2021A05086), וקרן הסטארט-אפ מבית החולים המסונף השני של האוניברסיטה הרפואית גואנגדונג (23H03).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
70 ומיקרו; m מסננת תאיםBiologix Group Co., Ltd.ארה"ב15-1070
נוגדן CD9Cell Signaling Technology, Inc (CST), ארה"ב983275
נוגדן Anti GM130Proteintech Group, Inc.סין 66662-1-LG
אנטי TSG101 נוגדןAbcam Plc, בריטניה125011
צלחת תרבית תאיםWuxi NEST ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין704001
צינור צנטריפוגהWuxi NEST ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין788211
קולגנאז סוג ISigma-Aldrich Corp., ארה"בC2674
שייקרתרמוסטטי שולחנישנחאי bluepard מכשירים ושות', בע"מ, סיןTHZ-100
מאגר אלקטרופורזהווהאן Servicebio Technology Co., Ltd., סין G2081-1L
ערכת בדיקת חלבון BCA משופרתשנחאי Beyotime ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין P0010S
Flow NanoAnalyzerNanoFCM Inc., סיןN30E
מערכת הדמיה פלואורסצנטית/כימילומינסנציה גואנגג'ואו ביולייט ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סיןGelView 6000Plus
HRP עז נגד עכבר IgGProteintech Group, Inc.סין 15014
HRP עז נגד ארנב IgGProteintech Group, Inc.סין 15015
קורא מיקרו-פלטותמכשירים מולקולריים, ארה"בCMax Plus
Microscissorsשנחאי  רפואי  מכשירים (קבוצה) Co., Ltd.,סיןWA1010
פינצטה מיקרוסקופיתשנחאי  רפואי  מכשירים (קבוצה) Co., Ltd., סיןWA3010
Multifuge X1R Pro צנטריפוגהתרמו פישר מדעי, ארה"ב75009750
מספריים עינייםשנחאי  רפואי  מכשירים (קבוצה) Co., Ltd., סיןY00030
פינצטה עינייםשנחאי  רפואי  מכשירים (קבוצה) Co., Ltd., סין JD1060
Optima XPN-100 צנטריפוגה אולטרה-סינוןבקמן קולטר, ארה"בA94469
פוספט חוצץ מלח (PBS)בייג'ינג Solarbio מדע & טכנולוגיה ושות', בע"מ, סיןP1003
RIPA מאגר ליזה (חזק, ללא מעכבים)שנחאי Beyotime ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין P0013K
מעדניית סרגל  ייצור  חברה, סין
SDS-PAGE מאגר טעינה לדוגמא, 5xשנחאי Beyotime ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין P0015
העברת PipetBiologix Group Co., Ltd.USA30-0238A1
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורהיטאצ'י, יפןH-7650
צינור אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר, ארה"ב355618
מאגר העברה מערבית ווהאן Servicebio טכנולוגיה ושות', בע"מ, סין G2028-1L

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).
  2. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  3. Crescitelli, R., Lasser, C., Lotvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).
  4. de Jong, B., Barros, E. R., Hoenderop, J. G. J., Rigalli, J. P. Recent advances in extracellular vesicles as drug delivery systems and their potential in precision medicine. Pharmaceutics. 12 (11), 1006(2020).
  5. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  6. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  7. Leung, L. L., Riaz, M. K., Qu, X., Chan, J., Meehan, K. Profiling of extracellular vesicles in oral cancer, from transcriptomics to proteomics. Semin Cancer Biol. 74, 3-23 (2021).
  8. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. N Engl J Med. 379 (10), 958-966 (2018).
  9. Wang, X., et al. An enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue. J Vis Exp. (192), e64499(2023).
  10. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).
  11. Hoshino, A., et al. Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers. Cell. 182 (4), 1044-1061.e18 (2020).
  12. Chen, Y., et al. Yiwei decoction promotes apoptosis of gastric cancer cells through spleen-derived exosomes. Front Pharmacol. 14, 1144955(2023).
  13. Useckaite, Z., et al. Proteomic profiling of paired human liver homogenate and tissue-derived extracellular vesicles. Proteomics. 24 (11), e2300025(2023).
  14. Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 307, 210-220 (2018).
  15. Lai, J. J., et al. Exosome processing and characterization approaches for research and technology development. Adv Sci (Weinh). 9 (15), e2103222(2022).
  16. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  17. Roh, Y. J., et al. Adipose tissue-derived exosomes alleviate particulate matter-induced inflammatory response and skin barrier damage in atopic dermatitis-like triple-cell model. PLoS One. 19 (1), e0292050(2024).
  18. Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).
  19. Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., Mazumder, N. Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: A review. Mol Biotechnol. 63 (4), 249-266 (2021).
  20. Menu, E., Vanderkerken, K. Exosomes in multiple myeloma: from bench to bedside. Blood. 140 (23), 2429-2442 (2022).
  21. Shen, S., et al. Effects of lysate/tissue storage at -80 degrees C on subsequently extracted EVs of epithelial ovarian cancer tissue origins. iScience. 26 (4), 106521(2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Spleen ExosomesExosome IsolationTissue Derived ExosomesDifferential UltracentrifugationType I CollagenaseTransmission Electron MicroscopyNano Flow CytometryExosome MarkersImmune ResponseMouse Spleen Tissue

מאמרים קשורים