הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל צעד אחר צעד וניתן לשחזור של חסימת שופכן חד צדדית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
חסימת שופכן חד צדדית (UUO) היא סיבה שכיחה למחלת כליות כרונית (CKD), המובילה להתקדמות של פיברוזיס אינטרסטיציאלי כלייתי ובסופו של דבר גורמת לנזק בלתי הפיך לכליות. ההקלה על UUO היא קריטית. מספר מודלים של בעלי חיים של חסימת שופכן חד צדדית הפיכה (RUUO) נקבעו בספרות, המאפשרים תצפית על שינויים מבניים ונזק תפקודי תוך הדמיית שינויים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים לאחר הקלה בחסימת השופכה. במחקר זה הוקם מודל חסימה הפיך בשופכן העכברים החד-צדדי באמצעות צינור סיליקון. נזק כלייתי משמעותי נצפה לפני הקלה בחסימה, עם התאוששות חלקית לאחר מכן. בניגוד ל-UUO, מודל זה מונע הידרונפרוזיס מתקדם, מה שמוביל לתוצאות פתולוגיות מובהקות. הליך כירורגי פשוט זה מדגים אחוזי הצלחה גבוהים וטומן בחובו הבטחה כמודל קלאסי לחקירת נפרופתיה חסימתית הפיכה וטיפולים פוטנציאליים לפיברוזיס אינטרסטיציאלי כלייתי. יתר על כן, הוא מספק פלטפורמה מעשית לחקר מנגנוני ההחלמה מנפרופתיה חסימתית, התחדשות תאי כליה ועיצוב מחדש של רקמות.
מבוא
חסימת שופכה תורמת באופן משמעותי לפיברוזיס אינטרסטיציאלי כלייתי ולמחלת כליות כרונית (CKD), מה שעלול להוביל לנזק מבני בלתי הפיך ולליקויים תפקודיים בכליה1. בעוד שחסימת שופכן חד צדדית (UUO) נמצאת בשימוש נרחב לחקר פגיעה בכליות ו-CKD, היא אינה משכפלת במדויק את מנגנוני ההתאוששות הספונטניים המתרחשים לאחר הסרת חסימה. מודל ה-UUO כולל קשירת השופכן השמאלי עם תפרים, וכתוצאה מכך חסימה קבועה, הרחבת שופכן, הידרונפרוזיס, דחיסה של פרנכימת הכליה ודילול קליפת המוח. בדיקה היסטולוגית מגלה בדרך כלל התרחבות צינורית, נמק תאי אפיתל צינורי ודלקת אינטרסטיציאלית מתקדמת ופיברוזיס2. מודל זה חוקר בעיקר פיברוזיס אינטרסטיציאלי כלייתי ואובדן תפקוד כליות בלתי הפיך עקב חסימה מתמשכת.
עם זאת, מחלות כליות רבות שנתקלים בהן בפרקטיקה הקלינית, כגון חסימה הנגרמת על ידי חישובי שופכה או גידולים, הן הפיכות. מודל חסימת השופכן החד-צדדית הפיכה (RUUO) מאפשר שיקום חלקי של מבנה הכליות ותפקוד דרכי השתן, ובסופו של דבר פותר הידרונפרוזיס. ניתן להעריך את ההתאוששות באמצעות טכניקות הדמיה, בדיקה היסטולוגית וניתוח סמנים ביולוגיים כדי לכמת את ההפחתה בפגיעה בכליות ופיברוזיס3. מודל זה מחקה מקרוב את שלב ההחלמה של נפרופתיה חסימתית במסגרות קליניות ומתאים יותר מ-UUO לחקר תהליכי מפתח כגון דלקת, תגובות חיסוניות, התחדשות תאים ושיפוץ רקמות 4,5,6,7,8.
מודל RUUO מאפשר לחוקרים לנתח תיקון והתחדשות כליות לאחר הקלה בפציעה, תוך התייחסות למגבלות של UUO במחקרים דינמיים. על ידי השוואת נקודות זמן שונות לפני ואחרי חסימה, חוקרים יכולים לחקור מסלולים מולקולריים המעורבים בפציעה ותיקון, כולל דלקת, אפופטוזיס, פיברוזיס והתחדשות. גישה זו משפרת את ההבנה של מנגנוני התאוששות כלייתית ומזהה מטרות טיפוליות פוטנציאליות 2,3,4,5,8,9,10. בעוד שפיברוזיס כלייתי נחשב לעתים קרובות לבלתי הפיך, תצפיות קליניות מצביעות על כך שהקלה מוקדמת של חסימה בשלבי פיברוזיס ראשוניים עשויה לעצור או אפילו להפוך את התקדמות המחלה. מודל RUUO מספק פלטפורמה ניסיונית רבת ערך לחקירת תופעה זו11.
יתר על כן, מודל RUUO מקל על חקר היפוך פיברוזיס לאחר הקלה בחסימה, ומציע תובנות לגבי מנגנוני החלמה וטיפולים אנטי-פיברוטיים פוטנציאליים 3,4. כתוצאה מכך, מודל זה מעשי ביותר למחקר תרגומי. המטרה העיקרית של מודל ניסיוני זה היא לגרום לנפרופתיה חסימתית באמצעות קנולציה של השופכה, ואחריה הקלה סטנדרטית בנקודת זמן מוגדרת מראש כדי להבטיח עקביות. הוא מותאם לפשטות, שחזור ובטיחות, מה שהופך אותו לכלי יעיל למחקר ניסיוני.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה בבעלי חיים עמד בהנחיות הצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר של בית החולים לילדים של האוניברסיטה הרפואית של צ'ונגצ'ינג. בסך הכל 27 חולדות זכרים של Sprague Dawley (SD) הושגו באופן מסחרי ושוכנו במרכז חיות המעבדה של בית החולים לילדים של האוניברסיטה הרפואית של צ'ונגצ'ינג (SPF, מספר רישיון: SYXK (Chongqing) 2007-0016). החולדות הוחזקו בתנאי טמפרטורה מבוקרים עם מחזור אור/חושך של 12 שעות והייתה להם גישה אד-ליביטום למזון ומים.
הפרוטוקול נערך על חולדות SD זכרות בגילאי 6-8 שבועות והוא ישים לחולדות בכל הגילאים עם שופכנים דו-צדדיים. במחקר זה, 15 חולדות SD זכרות בנות 6 שבועות חולקו באופן אקראי לשלוש קבוצות: הקבוצה הילידית (n = 5), קבוצת UUO (n = 5) וקבוצת RUUO (n = 5). בנוסף, חמש חולדות SD בנות 8 שבועות (n = 5) נכללו כקבוצת ביקורת נוספת. כדי לבסס את מודל ה-RUUO, נעשה שימוש ב-12 חולדות, עם 7 חולדות נוספות שנרכשו כדי לקחת בחשבון סיכונים פוטנציאליים כגון תמותה תוך ניתוחית ואחריה, כשלים בניתוח, חסימה לא שלמה והיפוך לא מוצלח. זה הבטיח מינימום של 5 חולדות לקבוצה לניתוחים הבאים.
כל ההליכים הכירורגיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות והלאומיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. הצוות הכירורגי דבק בפרוטוקולים של ציוד מגן אישי, כולל מסכות כירורגיות, כפפות וחלוקים. מכשירים כירורגיים סטריליים שימשו לכל הליך ועברו חיטוי לפני ואחרי השימוש כדי לשמור על סטריליות. חומרי פסולת, כולל דגימות חדות וביולוגיות, הושלכו בהתאם לפרוטוקולים לניהול פסולת מסוכנת כדי להפחית את סיכוני הזיהום ולהבטיח בטיחות.
1. הכנת בעלי חיים ומכשירים
- בצע את כל ההליכים באמצעות מכשירים סטריליים (חיטוי) וחומרים מתכלים. חותכים את צינור הסיליקון המעוקר (קוטר פנימי: 1.5 מ"מ, קוטר חיצוני: 2.5 מ"מ) למקטעים של כ -1 ס"מ. בצע חתך אורכי לאורך צד אחד של דופן הצינור לשימוש לאחר מכן.
- להרדים את החולדות באמצעות הזרקה תוך-צפקית של פנטוברביטל (40 מ"ג/ק"ג) (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). אשר הרדמה מספקת על ידי בדיקת היעדר תגובות רפלקס, כגון רפלקס נסיגת הדוושה, בעת צביטת הבוהן. מרחו משחה עיניים וטרינרית על העיניים כדי למנוע התייבשות בקרנית בזמן ההרדמה.
- להסיר את בטן החולדה מתהליך ה- xiphoid לסימפיזה של הערווה ולהאריך דו-צדדית לקו האמצע.
- מקם את החולדה במצב שכיבה על משטח ניתוח מחומם ואבטח את גפיה בחבלי גומי.
- עטפו יריעה סטרילית לשמירה על שדה סטרילי. הכן את העור עם תמיסת פובידון-יוד. בצע חתך עור בקו האמצע לאורך הבטן, המשתרע מהאזור התת-קסיפי ועד ממש מתחת לטבור, כדי לספק חשיפה נאותה של הכליות והשופכנים העליונים.
- חותכים את הרקמות התת עוריות והפאשיה לאורך קו האמצע באמצעות מספריים כירורגיים. לנתח בקפידה את העור והרקמות שמתחתיו שכבה אחר שכבה, ולחשוף את החלל הרטרופריטונאלי במלואו באמצעות מלקחיים לרקמות.
2. ניתוח חסימתי לחסימת שופכן חד צדדית הפיכה
- החזר את המעי לצד ימין של חלל הבטן באמצעות ספוגית סטרילית כדי להקל על הדמיה ישירה של השופכן השמאלי. מכסים את השופכן בגזה ספוגה במי מלח כדי למנוע התייבשות.
- לנתח ולגייס את השופכן השמאלי באמצעות מלקחיים מיקרוסקופיים, לשחרר כ -1.5 ס"מ מהרקמות שמסביב.
- הניחו צינור סיליקון באורך 1 ס"מ (קוטר פנימי: 1.5 מ"מ, קוטר חיצוני: 2.5 מ"מ) מתחת לשופכן המשוחרר. השתמש במלקחיים כדי להבטיח מעטפת מלאה בתוך הצינור.
- קשרו את צינור הסיליקון ואת החלק האמצעי של השופכן באמצעות חוט משי 3-0 כדי לגרום לחסימת שופכה. הימנע מכוח קשירה מוגזם. משוך בהדרגה את צינור הסיליקון לאורך ציר האורך של השופכן כדי להבטיח קשירה בטוחה אך לא מחליקה.
- מקם מחדש את המעי בתוך חלל הצפק בזהירות, תוך הקפדה על יישור נכון ללא מתח או חסימה.
- לתפור את שריר הבטן ושכבות הפאשיות באמצעות תפר 2-0 שאינו נספג עם מחט חיתוך מעוקלת בצורה רציפה כדי לספק חוזק מתיחה נאות. סגור את העור עם תפר 4-0 שאינו נספג, מה שמבטיח יישור אנטומי ומתח אחיד כדי לקדם ריפוי ולמזער את הסיכון להתפרקות פצעים.
- יש לחטא את מקום החתך בתמיסת פובידון-יוד. אפשר לחולדות להתאושש בתנאים מבוקרים בטמפרטורה קבועה למשך 7 ימים.
3. ניתוח הקלה של חסימת שופכן חד צדדית הפיכה
- הכינו את בעלי החיים והמכשירים הדרושים, תוך הקפדה על התקנה סטרילית לפתיחה מחדש של הבטן וחשיפה מלאה של חלל הבטן.
- נתח את הקשר של צינור הסיליקון בזהירות בעזרת להב אזמל. הסר את הצינור והשקה את חלל הבטן במי מלח רגילים כדי למזער הידבקות וסיכון לזיהום.
- מקם מחדש את המעי ותפור את חתך דופן הבטן בשכבות באמצעות 4-0 תפרים שאינם נספגים. עקר את אתר החתך בתמיסת פובידון-יוד. הנח את החולדה בסביבה בטמפרטורה מבוקרת לתקופת התאוששות של 7 ימים לאחר הניתוח.
- ביום ה-14 שלאחר הניתוח, יש להרדים את החולדות (בהתאם להליך שהוזכר בשלב 1.2) ולאסוף דגימות כליה על ידי חיתוך רוחבי של הכליות לשני חצאים9.
- אחסן מחצית אחת ב-4% פרפורמלדהיד לבדיקה היסטופתולוגית, והקפיא במהירות את החצי השני בחנקן נוזלי לאחסון ב-80 מעלות צלזיוס לניתוח מולקולרי לאחר מכן. אסוף דגימות דם לאנליזות ביוכימיות.
- בצע המתת חסד באמצעות חנק CO2 ואחריו פריקת צוואר הרחם בהתאם להנחיות אתיות.
4. הערכות מעקב
- עקבו אחר משקל הגוף לאחר RUUO כדי להעריך את ההתאוששות הכוללת. השווה את שינויי המשקל עם קבוצת הביקורת וקבוצת ה-UUO.
- מדוד את משקל הכליות ונפח הכליות כדי להעריך את התאוששות הכליות.
- עקוב אחר רמות הקריאטינין בסרום (Scr) כאינדיקטור לשיפור בתפקוד הכליות9.
- הזריק מתילן כחול לאגן הכליה כדי לאשר סבלנות של השופכה. התבונן בפריסטלטיקה ובצבע של השופכה כדי להעריך את ההתאוששות לאחר החסימה.
- בצע צביעת H&E כדי להעריך את שלמות הצינוריות ומבנה הכליות לאחר RUUO 8,10.
- בצע את צביעת הטריכרום של מאסון כדי להעריך רגרסיה של פיברוזיס אינטרסטיציאלי כלייתי 8,10.
- השווה ציוני נזק כלייתי 3,8 בין קבוצות UUO ו-RUUO כדי לכמת את התאוששות הרקמות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ההשפעות של UUO ושחרורו לאחר מכן (RUUO) על משקל הגוף, משקל הכליות, נפח הכליות ורמות הקריאטינין בסרום (Scr) הוערכו, כפי שסוכם בטבלה 1. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD), עם n = 5 לקבוצה.
לאחר 6 שבועות, הקבוצה הילידית הציגה משקל גוף ממוצע של 234 גרם ±-16 גרם, משקל כליות של 0.9107 גרם ±-0.0475 גרם ונפח כליות של 0.8962 סמ"ק ±-0.0502 סמ"ק. לאחר 8 שבועות, קבוצת הביקורת הראתה עלייה משמעותית במשקל הגוף (291 גרם ±-20 גרם, P < 0.05), משקל הכליות (1.1443 גרם ±-0.0687 גרם,...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
דגם זה משתמש בצינור סיליקון כדי להקיף את השופכן, ומספק תמיכה מבנית, ואחריו קשירה עם חוט משי כדי לגרום לחסימה מלאה של השופכן באמצעות דחיסה. לאחר שבעה ימים, מסירים את צינור הקשירה והסיליקון כדי להקל על הפחתת לחץ בכליות ושיקום שלמות ותפקוד דרכי השתן.
צינורות סיליקון, המיוצרים מאלסטומרים מסיליקון, מציעים גמישות מצוינת, תאימות ביולוגית, עמידות כימית ויציבות תרמית. גומי סיליקון בדרגה רפואית תוכנן במיוחד עבור יישומים הדורשים תכונות מכניות מעולות, כולל השתלה לטווח ארו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית לחדשנות נוער ברפואת העתיד, האוניברסיטה הרפואית של צ'ונגצ'ינג (W0056), פרויקט החדשנות הטכנולוגית ופיתוח היישומים המשותף למדע ובריאות של צ'ונגצ'ינג (2020ZY023877).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מלקחיים | שנחאי מכשירים רפואיים ושות', בע"מ | 20220032 | |
| גזה | סצ'ואן קלון ושות', בע"מ | 20172140152 | |
| ערכת כתמי המטוקסילין ואאוזין | Solarbio | G1120 | |
| מחטי אינסולין | KDL מכשירים רפואיים | 20193140938 | |
| Masson ' s Trichrome כתמים ערכת | Solarbio | G1340 | |
| כדורי כותנה רפואיים | סצ'ואן Kelun ושות', בע"מ | 20170037 | |
| מקלות כותנה רפואית | סצ'ואן קלון ושות', בע"מ | 20172140026 | |
| מתילן כחול | טיאנג'ין Dengfeng מגיב כימי מפעל | 14038-43-8 | |
| מלקחיים מיקרוסקופיים | Suqian Shifeng מכשירים רפואיים ושות', בע"מ | S50985 | |
| מחזיקי מחט | Suqian Shifeng מכשירים רפואיים ושות', בע"מ | S7005 | |
| Povidone-יוד פתרון | סצ'ואן קלון ושות', בע"מ | 514001 | |
| מלח | סצ'ואן קלון ושות', בע"מ | 20220004 | |
| SD חולדות | SPF (בייג'ינג) ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | D025 | |
| צינורות סיליקון Taizhou | Chunshi חומרים חדשים ושות', בע"מ | CS356 | |
| תפר משי | Qiangsheng מכשירים רפואיים ושות', בע"מ | SA84G | |
| להב כירורגי | Huanan Yunyue מכשירים רפואיים ושות', בע"מ | CE0434 | |
| מספריים כירורגיים | שנחאי מכשור רפואי ושות', בע"מ | J21130 | |
| מזרק | Tongmai מכשירים רפואיים | 20183140304 | |
| רקמות מלקחיים | ג'יאנגשי Yuyuan ציוד רפואי ושות', בע"מ | J36030 |
מקורות
- Chaves, L. D., et al. Contrasting effects of systemic monocyte/macrophage and CD4+ t cell depletion in a reversible ureteral obstruction mouse model of chronic kidney disease. Clin Dev Immunol. 2013, 836989(2013).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Aranda-Rivera, A. K., et al. Sulforaphane protects from kidney damage during the release of unilateral ureteral obstruction (RUUO) by activating nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (nrf2): Role of antioxidant, anti-inflammatory, and antiapoptotic mechanisms. Free Radic Biol Med. 212, 49-64 (2024).
- Narváez Barros, A., et al. Reversal unilateral ureteral obstruction: A mice experimental model. Nephron. 142 (2), 125-134 (2019).
- Cochrane, A. L., et al. Renal structural and functional repair in a mouse model of reversal of ureteral obstruction. J Am Soc Nephrol. 16 (12), 3623-3630 (2005).
- Kaeidi, A., et al. The therapeutic approaches of renal recovery after relief of the unilateral ureteral obstruction: A comprehensive review. Iran J Basic Med Sci. 23 (11), 1367-1373 (2020).
- Liu, Y., et al. A porcine model of relief of unilateral ureteral obstruction: Study on self-repairing capability over multiple time points. Mol Cell Biochem. 419 (1-2), 115-123 (2016).
- Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298 (4), F1024-F1032 (2010).
- Chevalier, R. L., Kim, A., Thornhill, B. A., Wolstenholme, J. T. Recovery following relief of unilateral ureteral obstruction in the neonatal rat. Kidney Int. 55 (3), 793-807 (1999).
- Hesketh, E. E., et al. A murine model of irreversible and reversible unilateral ureteric obstruction. J Vis Exp. (94), e52559(2014).
- Klahr, S., Morrissey, J. Obstructive nephropathy and renal fibrosis. Am J Physiol Renal Physiol. 283 (5), F861-F875 (2002).
- Jin, B., et al. Loss of men1 leads to renal fibrosis and decreases HGF-ADAMTS5 pathway activity via an epigenetic mechanism. Clin Transl Med. 12 (8), e982(2022).
- Fischer, N. G., He, J., Aparicio, C. Surface immobilization chemistry of a laminin-derived peptide affects keratinocyte activity. Coatings (Basel). 10 (6), 560(2020).
- Song, J., et al. Losartan accelerates the repair process of renal fibrosis in UUO mouse after the surgical recanalization by upregulating the expression of tregs. Int Urol Nephrol. 51 (11), 2073-2081 (2019).
- Song, J., et al. Regulatory t cells accelerate the repair process of renal fibrosis by regulating mononuclear macrophages. Am J Med Sci. 361 (6), 776-785 (2021).
- Yao, Y., et al. Interferon-γ improves renal interstitial fibrosis and decreases intrarenal vascular resistance of hydronephrosis in an animal model. Urology. 77 (3), e768-e761.e713 (2011).
- Chevalier, R. L., Thornhill, B. A., Chang, A. Y., Cachat, F., Lackey, A. Recovery from release of ureteral obstruction in the rat: Relationship to nephrogenesis. Kidney Int. 61 (6), 2033-2043 (2002).
- Lucarelli, G., et al. Delayed relief of ureteral obstruction is implicated in the long-term development of renal damage and arterial hypertension in patients with unilateral ureteral injury. J Urol. 189 (3), 960-965 (2013).
- Ito, K., et al. Renal damage progresses despite improvement of renal function after relief of unilateral ureteral obstruction in adult rats. Am J Physiol Renal Physiol. 287 (6), F1283-F1293 (2004).
- Song, J., et al. A modified relief of unilateral ureteral obstruction model. Ren Fail. 41 (1), 497-506 (2019).
- Morrissey, J., et al. morphogenetic protein-7 improves renal fibrosis and accelerates the return of renal function. J Am Soc Nephrol. 13 (suppl_1), S14-S21 (2002).
- Ulm, A. H., Miller, F. An operation to produce experimental reversible hydronephrosis in dogs. J Urol. 88, 337-341 (1962).
- Park, H. C., et al. Postobstructive regeneration of kidney is derailed when surge in renal stem cells during course of unilateral ureteral obstruction is halted. Am J Physiol Renal Physiol. 298 (2), F357-F364 (2010).
- Forni, L. G., et al. Renal recovery after acute kidney injury. Intensive Care Med. 43 (6), 855-866 (2017).
- Varela, S., Omling, E., Borjesson, A., Salo, M. Resolution of hydronephrosis after pyeloplasty in children. J Pediatr Urol. 17 (1), e101-e102.e7 (2021).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
