מאמר שיטה

הבהרת שינויים פרוטאומיים ספציפיים לרקמות ולפלזמה בבריאות ובמחלות

695 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67240

⸱

23 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NRC Fellow, 2Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 3ORISE Fellow, 4The Geneva Foundation, 5AEOP Fellow, 6Culmen International, LLC

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטאומיקה היא הערכה בעלת תפוקה גבוהה של האינטראקציות, התפקוד, ההרכב והמבנים של חלבונים ופעילותם התאית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת סך השינויים הפרוטאומיים בדגימות ביולוגיות שונות, כולל פלזמה ורקמות. המתודולוגיה המדווחת כאן חלה על כל הדגימות הביולוגיות המכילות חלבונים.

תקציר

פרוטאומיקה היא מחקר רחב היקף של חלבונים מבוטאים, המתמקד במבנה, בתפקוד, באינטראקציות, בשפע ובשינויים שלאחר התרגום בתוך מערכת ביולוגית. לדוגמה, פוספופרוטאומיקה, תת-קבוצה חיונית של פרוטאומיקה כוללת, היא חקר דפוסי זרחון ושינויים בחלבונים. המתודולוגיה המתוארת כאן מדגימה גישה פרוטאומיקה כוללת להבהרת שינויים בפרופילי ביטוי החלבון הכוללים, כולל דפוסי זרחון, ברקמות הפלזמה, המוח, הריאות, הטחול והכבד שנאספו ממודלים של חיות מחקר (כלומר, חמוסים ועכברים). טכניקה זו ישימה לסוגי רקמות אחרים, כמו גם כמעט לכל דגימה ביולוגית המכילה חלבונים (למשל, תאים מתורבתים). לאחר הדיסקציה, רקמות מעניינות הוקפאו בזק ואוחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הרקמות הומוגניות באמצעות מכתש ועלי עם חנקן נוזלי כדי לשמר את שלמות החלבון ושינויי זרחון. סך החלבון הופק מההומוגנטים של הרקמה באמצעות מאגר ליזה עם נוקלאז אוניברסלי ומעכבי פרוטאז/פוספטאז. חלבונים שהופקו מרקמה ופלזמה מקבילה הומרו לפפטידים כוללים על ידי עיכול פרוטאז מבוקר באמצעות ערכת הכנת דגימת ספקטרומטר מסה מסחרית. פפטידים נותחו ישירות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד/ספקטרומטריית מסה טנדם של Orbitrap-tribrid. זהויות החלבונים המרכיבים שוחזרו מהנתונים הספקטרליים של מסת הפפטיד, באמצעות תוכנת ביואינפורמטיקה של פרוטאומיקה, כפי שהותאמו לספריית רצף חומצות אמינו ספציפיות למין. לאחר מכן, הניתוח צריך לכלול קריטריוני חיתוך מחמירים, במיוחד באמצעות זיהוי חלבון בביטחון גבוה בלבד. ניתן לקבוע הבדלים פרוטאומיים מובהקים סטטיסטית (>שינוי פי 2; p < 0.05) בין קבוצת הביקורת לקבוצת הניסוי.

מבוא

פרוטאומיקה, כשילוב של ניסוי פרוטאום וניתוח נתונים, מתמקדת בזיהוי וכימות חלבונים, אפיונם על סמך הרכב, אינטראקציה, שינויים טרום-תרגומיים ופוסט-תרגומיים (למשל, זרחון), לוקליזציה תת-תאית ומבנה בתנאים פיזיולוגיים1. פרוטאומיקה של ביטוי עוסקת בהשוואות כמותיות של חלבונים השונים בתנאים ביולוגיים משתנים2. יש לו גם חשיבות רבה ביצירת פרופיל של מפה של מסלולים, רשתות ומערכות מולקולריות מורכבות ומחוברות זו לזו, השולטות ישירות בפונקציות הביולוגיות העיקריות כגון התפשטות תאים, התמיינות, הזדקנות ומנגנוני מוות תאי. עם ההתקדמות המשמעותית של הטכנולוגיה הניסיונית בשנים האחרונות, שיטות פרוטאומיקה התפתחו מגישות קונבנציונליות - כולל אימונוהיסטוכימיה ובדיקת אימונוסורבנט מקושרת לאנזים - לטכניקות בעלות תפוקה גבוהה כגון כרומטוגרפיה נוזלית 3,4. גישות מבוססות פרוטאומיקה צוברות תאוצה בקביעת פנוטיפים ותת-סוגים ייחודיים של מחלות, כמו גם זיהוי אינטראקציות מטרה חדשות לתרופות טיפוליות (פרמקופרוטומיקה). לדוגמה, ריבוד המטופלים התמקד בעיקר בגישות גנומיות להגדרת קבוצות הומוגניות ולהנחיית משטרי טיפול. עם זאת, מצב השעתוק לבדו אינו מנבא את גורל החלבונים המתורגמים לאחר מכן (למשל, יציבות או שינוי); וכך, מנגנונים לא גנומיים תורמים יותר להתפתחות המחלה, התקדמותה, חומרתה ועמידותה לטיפולים 5,6,7.

תחום מחקר אחד כזה שהפיק תועלת רבה מהשוואות כמותיות של ביטוי ופעילות חלבונים הוא גילוי סמנים ביולוגיים בתחום של מחלות ניווניות ופגיעה מוחית טראומטית (TBI). הבסיס לגילוי סמנים ביולוגיים הוא פיתוח טכניקות אבחון המאפשרות גילוי מוקדם ויעדים פוטנציאליים להתערבות. פרוטאומיקה כמותית מבוססת LC/MS-MS בשילוב עם ביואינפורמטיקה סייעה לגילוי סמנים ביולוגיים של חלבונים מרכזיים, כולל חלבון חומצי סיבי גליה (GFAP) ואיזואנזים L1 של הידרולאז יוביקוויטין קרבוקסיל טרמינלי (UCH-L1), עם פגיעה חמורה או חודרת TBI 8,9. לדוגמה, אנשי צבא סובלים לעתים קרובות מתקריות TBI במהלך המשימות שלהם, כתוצאה מחשיפה לפיצוצי פצצות (כלומר, פיצוץ TBI). עם זאת, הפתוביולוגיה הבסיסית של ליקויים נוירולוגיים הנגרמים על ידי TBI קלה הנגרמת על ידי פיצוץ נותרה לא ברורה. לפיכך, הבנת המנגנונים המולקולריים והאולטרה-מבניים של פגיעה מוחית הנגרמת על ידי פיצוץ דורשת זיהוי טוב יותר של סמנים ביולוגיים ספציפיים. עם התבוננות בשינויים פרוטאומיים, מחקרים הראו מנגנונים אפשריים של מתח חמצוני המושרה על ידי פיצוץ במוח קשורים לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, כולל דינמיקת ביקוע-היתוך לקויה, ירידה בזרחון חמצוני ופעילויות אנזימים רלוונטיות לנשימה10. תובנות על הפתוגנזה המוקדמת של חוסר ויסות המושרה על ידי פיצוץ של שינויים לאחר תרגום כגון אצטילציה, ניטרוזילציה, דה-אמינציה וזרחון יכולות גם לספק אפיון נוסף של השפעותיו על תפקוד החלבון המעורב בנזק אקסונלי, דלקת והפרעה במחסום הדם-מוח11,12. עם התקדמות גישות הביולוגיה של המערכות, מיפוי מידע כולל של פרוטאום מהמוח ומהרקמות ההיקפיות במינים שונים של בעלי חיים, כולל מכרסמים וחמוסים, הפך להליך מפתח בחקר פציעות פיצוץ.

במאמר זה, אנו מתמקדים בזרימת העבודה המתודולוגיה להערכת היבטים כמותיים של פרוטאומיקה של ביטוי והשינויים שלאחר התרגום שלה החל מרקמה או פלזמה, אשר שימשה באופן נרחב לניטור תופעות פיזיולוגיות ומצבים פתולוגיים. שימוש במתודולוגיה שלהלן מאפשר עקביות ואמינות בהכנת הדגימה ורכישת הנתונים. על ידי מתודולוגיה סטנדרטית זו, ניתן לבצע השוואות כדי לקבוע דפוסים פרוטאומיים שהשתמרו על פני סוגי רקמות ודפוסי זרחון ייחודיים לרקמות ספציפיות. יחד עם זאת, ניתן לבצע ניתוח על פני מספר מודלים פרה-קליניים של בעלי חיים ודגימות קליניות אנושיות כדי להשיג דפוסי זרחון משומרים שיכולים לשמש כסמנים ביולוגיים ולהתאים משטרי טיפול תרופתיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

המחקר נערך תחת פרוטוקול שימוש בבעלי חיים שאושר על ידי IACUC במתקן מוסמך בינלאומי של AAALAC עם הבטחת רווחת בעלי חיים של שירותי בריאות הציבור ובהתאם לחוק רווחת בעלי חיים וחוקים ותקנות פדרליים אחרים הנוגעים לחיות מעבדה. כל האספקה הנדרשת להליך זה מפורטת בטבלת החומרים. ההליך מחולק לשבעה מרכיבים.

זהירות. ודא שפרוטוקולי בטיחות נאותים מבוצעים בעת עבודה עם חנקן נוזלי להומוגניזציה של רקמות. צוות המעבדה לבש כפפות מקפיא, סינר מקפיא, מסכת פנים כירורגית ומגן פנים במהלך הומוגניזציה של רקמות קפואות. ניתן להשתמש בטכניקת הומוגניזציה זו עבור כל סוג רקמה, כולל חומרים קשים במיוחד כמו עצם, פשוט על ידי התאמת גודל המרגמה והעלי בהתאם. ראה איור 1A להגדרת שולחן העבודה הראשונית. עיין בטבלת החומרים לגדלים המשמשים בעת הומוגניזציה של רקמות עכבר וחמוסים.

1. טחינה קריוגנית של רקמות עם מכתש ועלי

  1. קח את המשקל של צינור איסוף ריק ורשום אותו. בעודכם בצינור האיסוף, שקלו את הרקמה באמצעות איזון אנליטי ורשמו את המשקל במחברת מעבדה. הפחיתו את משקל הצינור הריק מהרקמה בתוספת משקל הצינור כדי להשתמש במ"ג הרקמה.
    הערה: הרקמות שנבדקו למחקרים פרוטאומיים כוללות מוח, ריאות, כבד וטחול. הרקמה כולה נטחנה באופן קריוגני לצורת אבקה באמצעות מכתש ועלי.
  2. שפכו חנקן נוזלי לתוך הקריופוד, אך וודאו שהוא מלא פחות ממחצית הדרך.
  3. העבירו את הצינור המכיל את הדגימה ואת צינורות המיקרו-צנטריפוגה הריקים בנפח 1.5 מ"ל שעברו חיטוי בעבר על מתלה הצינור הממוקם בקריופוד. זה מבטיח שהדגימה תישאר קפואה תוך קירור המרגמה והעלי, ומונע את הפשרת הדגימה בעת העברת הרקמה ההומוגנית לתוך צינורות המיקרו-צנטריפוגה הריקים בנפח 1.5 מ"ל.
  4. יוצקים חנקן נוזלי על המרגמה והעלי כדי לקרר את המכשירים הללו לפני השימוש. המרגמה והעלי יושבים מחוץ לקריופוד (איור 1A,B).
  5. העבירו את הרקמה לתוך המרגמה המקוררת שמכילה חנקן נוזלי (איור 1B).
  6. הפעילו שוב ושוב לחץ על הרקמה הקפואה באמצעות העלי, ובצעו תנועת סיבוב וטחינה עם העלי כנגד הרקמה עד שהרקמה נטחנת לאבקה דקה (איור 1C).
    1. ודא שלא מופעל כוח מופרז, מה שעלול לגרום לדגימות להישפך מהמרגמה. הקפד על שליטה איתנה על העלי.
    2. הוסף חנקן נוזלי נוסף למרגמה תוך הומוגניזציה של רקמות גדולות כדי להפחית את הסיכוי להפשרת הדגימה בזמן הטחינה.
    3. בזמן טחינת הטישו, בדוק כדי לוודא שהוא לא מפשיר. אם הוא מפשיר, הניחו חנקן נוזלי נוסף בטיט.
  7. טובלים את קצות מרית המתכת בחנקן הנוזלי כדי לצנן אותם. זה עוזר להעביר בקלות את הרקמה ההומוגנית לצינור של 1.5 מ"ל. זה מונע מהרקמה להפשיר ולהיצמד למרית במהלך ההעברה.
  8. לאחר שהרקמה הומוגנית לאבקה דקה ומרית המתכת מקוררת, העבירו בזהירות את אבקת הרקמה ההומוגנית לצינורות החדשים של 1.5 מ"ל.
    1. פצל את המדגם למכסים בהתאם למספר הבדיקות שיש להשלים.
      הערה: לדוגמה, ארבע בדיקות היו אמורות להסתיים עבור הדגימות במחקר זה, כך שהרקמה ההומוגנית הוקצתה באותה מידה לארבעה צינורות של 1.5 מ"ל.
    2. אחסן כל רקמה הומוגנית נוספת בצינור איסוף חיטוי של 5 מ"ל.
  9. אחסן את הרקמות המוקצפות במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד לניתוח עתידי, עם שימוש מציאותי תוך שנה כדי למזער אוויר כמו גם חמצון קל של חלבונים.
  10. שקלו את צינור האיסוף הריק.
  11. הפחיתו את משקל צינור האיסוף הריק מהמדידה הראשונית (צינור איסוף בתוספת דגימה) כדי לקבל את משקל דגימת הרקמה.

2. ליזיס רקמות לבידוד חלבונים

  1. גרפו קרח יבש לתוך מיכל מחבת קרח.
  2. מניחים מתלה צינורות בקרח היבש ומניחים לו להתקרר.
  3. הסר דגימות רקמה הומוגניות מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס והנח במדף הצינור המצונן. זה מונע את הפשרת הדגימות, מה שעלול לגרום לפירוק חלבון ו/או לשינויים בזרחון במהלך תהליך השקילה.
    1. ודא שהצינורות בנפח 1.5 מ"ל המכילים את הדגימה נשארים קפואים על מתלה הצינור בקרח יבש.
  4. הניחו צינור קנוני חדש של 50 מ"ל בקרח היבש.
  5. הסר את המכסה מהצינור הקנוני של 50 מ"ל והנח מרית פלסטיק חד פעמית בצינור הקנוני של 50 מ"ל כדי לשמור על קרירותם. זה מונע מהדגימה להיצמד למרית במהלך העברתן לצינורות ההומוגניזציה.
  6. לליזה של רקמות ובידוד חלבונים, השתמש בצינורות של 2 מ"ל המכילים חמישה חרוזי קרמיקה בגודל 2.8 מ"מ (המכונים צינורות הומוגניזציה בפרוטוקול זה).
  7. סמן את המכסה ואת הצד של הצינור ההומוגני עם מזהה הדגימה באמצעות עט סימון דיו קבוע.
  8. הנח את הצינורות המסומנים וההומוגניים במדף הצינורות הממוקם בקרח היבש כדי לשמור על הצינורות קרים ולמנוע הפשרת דגימה.
  9. הנח צינור הומוגניזציה אחד על סולם אנליטי וטרף את המשקל.
  10. החזר את הצינור ההומוגניזציה למתלה הצינור על קרח יבש.
  11. הסר את המכסה מצינור ההומוגניזציה המכיל את החרוזים, ובעזרת אחת ממרית הפלסטיק המקוררת, העביר 5 מ"ג עד 10 מ"ג של דגימת רקמה אבקתית לצינור ההומוגניזציה המתאים.
  12. הנח את המכסה בחזרה על הצינור ההומוגניזציה.
  13. שקלו את הצינור ההומוגניזציה על האיזון האנליטי ורשמו את כמות הדגימה בצינור ההומוגניזציה.
    1. השתמש במשקל זה כדי לקבוע את כמות מאגר הליזיס הנדרשת למיצוי חלבון כולל יעיל.
  14. לאחר רישום המשקל, הנח את הצינור ההומוגני המכיל את הדגימה בחזרה למתלה הצינור על קרח יבש כדי לשמור עליו קר.
  15. השלך את מרית הפלסטיק המשומשת.
  16. השתמש במרית פלסטיק חדשה ונקייה עבור כל דגימה שתועבר ותשקלול כדי למנוע זיהום צולב. חזור על שלבים 2.9 עד 2.15 עבור כל הדגימות.
  17. לאחר העברת כל הדגימות לצינורות הומוגניזציה בודדים, חשב את כמות תערובת מאסטר ליזה של חלבון הדרושה.
    1. הכן את הנפח הנדרש של Protein Lysis Master Mix, המחושב על סמך מספר הדגימות שצריך לעבד והמשקל של כל דגימת אבקה. הוסף 100 מיקרוליטר של Protein Lysis Master Mix לכל 5 מ"ג רקמה לכל צינור.
    2. עיין בהנחיות החברה לנפחי ריאגנטים להכנת תערובת המאסטר של ליזיס חלבון (עיין בטבלת החומרים).
  18. הנח את הצינורות ההומוגניזציה המכילים את הדגימות ההומוגניות והאבקתיות בבלוק קר של 4 מעלות צלזיוס. הצינורות ההומוגניזציה כבר לא יכולים להישאר על קרח יבש. הנחת הצינורות ההומוגניזציה על הבלוק הקר מונעת את הקפאת תמיסת הליזה.
  19. הסר את המכסה מהצינורות ההומוגניזציה והעביר את הכמות המחושבת של Protein Lysis Master Mix הדרושה לצינור ההומוגניזציה המתאים באמצעות פיפטת הקיבולת המתאימה.
    1. החזירו את המכסה לצינורות ההומוגניזציה וסובבו את המכסים עד שהם מהודקים.
  20. הנח את צינורות הדגימה לתוך ההומוגנייזר והנח אותו על תוכנית רקמות רכות (מהירות 4500 סל"ד, 2 x 30 שניות למחזור, הפסקה של 30 שניות) ב-4 מעלות צלזיוס להומוגניזציה.
  21. לאחר השלמת מחזור ההומוגניזציה, הסר את הצינורות מהמכשיר והנח אותם בחזרה בבלוק הקר של 4 מעלות צלזיוס.
    1. בדוק ויזואלית את צינורות הדגימה. ודא שעדיין לא נראית דגימת אבקה. אם הדגימה עדיין מדומיינת לאורך כל Protein Lysis Master Mix, השלם שוב את ליזיס הרקמות על המכשיר.
    2. בצע אופטימיזציה של ההגדרות לסוג הרקמה שבה נעשה שימוש. לדוגמה, רקמה אבקתית שמקורה באיברים סיביים (למשל, לב) עשויה להזדקק למחזורים נוספים או לסל"ד גבוה יותר.
  22. העבירו את הצינורות ההומוגניזציה לצנטריפוגה. הזן את ההגדרות הבאות בצנטריפוגה: 16,000 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ולחץ על התחל בצנטריפוגה.
  23. לאחר השלמת הצנטריפוגה, העבירו בזהירות את הצינורות ההומוגניזציה בחזרה לגוש הקר של 4 מעלות צלזיוס.
  24. סמן צינורות חדשים של 1.5 מ"ל על המכסה והצד עם מזהה המדגם וכל מידע רלוונטי אחר. לאחר התווית, הנח את צינורות ה-1.5 מ"ל הללו בבלוק קר של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: הצינורות סומנו עם הפרטים הבאים לפחות: מזהה בעל חיים, נקודת זמן מחקר, סוג בעל חיים וסוג רקמה.
  25. העבירו את ליזט החלבון המתאים מהצינורות ההומוגניזציה לצינורות המסומנים בהתאמה של 1.5 מ"ל הנשמרים על בלוק קר של 4 מעלות צלזיוס.
  26. אחסן דגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס להמשך ניתוח. זוהי נקודת עצירה בטוחה.

3. כימות חלבון כולל

  1. הוציאו דגימות מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס והפשירו את הדגימות על קרח רטוב בדלי קרח.
  2. לאחר ההפשרה, מערבל את כל הדגימות והתקנים מערכת כימות החלבון למשך 3 שניות לפחות.
  3. הוסף 10 μL מכל שכפול של דגימות סטנדרטיות, דגימות וחסר מתאים לתוך לוחית מיקרוטיטר של 96 בארות בהתבסס על הפריסה הסכמטית (איור 2A).
    הערה: עבור כל דגימת רקמה, נעשה שימוש בדילול של 1:100 של ליזאט החלבון למי מלח רצוי עם פוספט בניתוח בדיקת החלבון. ניתן לשנות את הפריסה הסכמטית בהתאם למספר הדגימות המשמשות בבדיקת החלבון. הדגימות, התקנים והחסר המתאים נטענים לתוך צלחת מיקרוטיטר של 96 בארות בשלוש עותקים להערכת דיוק ריכוז החלבון, אך אם דגימות רבות צריכות להתאים לצלחת, כפילויות מקובלות.
    1. עבור דגימות עם כמות נמוכה של רקמת התחלה (כלומר, פחות מ-5 מ"ג), השתמש רק בשכפול בודד או בשכפולים עבור בדיקת החלבון כדי למקסם את כמות החלבון ליזאט הזמינה לעיכול החלבון שלאחר מכן.
    2. ודא שנעשה שימוש בפיפטינג מדויק ובפיפטות מכוילות.
  4. הפוך את בקבוק המגיב לבדיקת חלבון מספר פעמים כדי לערבב היטב, ולאחר מכן שפך אותו למאגר ריאגנטים של 10 מ"ל.
  5. באמצעות פיפטה רב-ערוצית בקיבולת מקסימלית של 200 מיקרוליטר, הוסף 150 מיקרוליטר של מגיב בדיקת החלבון לעמודה 1.
  6. פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב את מגיב בדיקת החלבון עם 10 מיקרוליטר של תוכן שכבר נמצא בבאר כדי לסייע בהפחתת המשקעים בבארות.
  7. השליכו את קצות הפיפטה והניחו קצות חדשים על הפיפטה הרב-ערוצית בעלת הקיבולת המקסימלית של 200 מיקרוליטר.
  8. חזור על שלבים 3.5-3.7 עד להוספת מגיב בדיקת חלבון לכל צלחת 96 הבארות.
    1. השתמש בקצות פיפטה טריות לכל עמוד בארות כדי למנוע זיהום צולב.
    2. ודא שלפחות באר אחת נשארת ריקה ללא ריאגנטים או דגימה נוספת לשימוש כערך ספיגה ריק לכימות חלבון.
  9. לאחר הוספת מגיב בדיקת החלבון לכל הבארות הדרושות, יש לכסות את צלחת 96 הבארות באטם צלחת נייר אלומיניום.
  10. מערבל את צלחת 96 הבארות על מכשיר מערבולת למשך דקה אחת במהירות בינונית, ולאחר מכן דגר אותה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות לפני קריאת הצלחת.
  11. בדוק את צלחת 96 בארות ואטם רדיד האלומיניום. אם המגיב נשאר דבוק לאטם נייר האלומיניום, הנח אותו עם איזון מתאים בתוך צנטריפוגה.
    1. לחץ והחזק את הסיבוב המהיר עד שהוא מגיע לכ -200 גרם.
    2. הוצא את צלחת 96 הבארות ובדוק ויזואלית את אטם נייר האלומיניום כדי לוודא שלא נשאר נוזל על נייר הכסף.
  12. הסר לאט את אטם רדיד האלומיניום והנח את המכסה השקוף בחזרה על צלחת 96 הבארות (איור 2B).
  13. קרא את הלוח בן 96 הבארות בספקטרופוטומטר ב-660 ננומטר, לאחר שאפשר לתגובה הקולורימטרית להתפתח במשך 5 דקות.
    הערה: קריאות הספיגה באמצעות ספקטרופוטומטר UV/Visible נמדדות בטמפרטורת החדר. בדיקת החלבון של 660 ננומטר מבוססת על קשירה של קומפלקס מתכת צבע קנייני לחלבון בתנאים חומציים הגורם לשינוי במקסימום הספיגה של הצבע, הנמדד ב-660 ננומטר.
  14. השתמש בקריאות הספיגה של התקנים הידועים כדי ליצור את העקומה הסטנדרטית באמצעות תוכנת גרפים (איור 2C-E), המיושמת עוד יותר לחישוב ריכוזי החלבון עבור כל הדגימות.

4. עיכול חלבון

זהירות. ודא שמקפידים על פרוטוקולי בטיחות נאותים בעת עבודה עם הכימיקלים המסוכנים המשמשים בפרוטוקול שלהלן. אנשי המעבדה לבשו ציוד מגן אישי (PPE) והשלימו את השלבים הללו במכסה אדים כימי. עיין בכל גיליונות נתוני הבטיחות לפני העבודה עם כימיקלים אלה.

  1. סמן סט חדש של צינורות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם מזהי הדגימה על המכסה ובצד הצינורות בדיו קבוע. כלול כל מידע רלוונטי אחר.
    1. בהתבסס על משוואת העקומה הסטנדרטית, קריאות ספיגת הדגימה ומקדם הדילול, מחשבים את ריכוז החלבון של כל דגימה במיקרוגרם למיקרוליטר (μg/μL). השתמש בערך זה כדי לחשב את הנפח הנדרש של ליזאט דגימה המכיל 100 מיקרוגרם חלבון (איור 2C-E). העבירו את הנפח המחושב הזה של ליזאט הדגימה לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  2. להרכיב את הנפח הסופי ל -100 מיקרוליטר עם מאגר הליזיס; זהו נפח ההתחלה הדרוש לפרוטוקול העיכול.
    הערה: הנפח הסופי של דגימת החלבון בתוספת מאגר ליזה צריך להיות שווה ל-100 מיקרוליטר.
  3. על פי ספרות שפורסמה בעבר, השתמש ב -1.5 מיקרוליטר מהפלזמה לעיכול, השווה בערך ל -100 מיקרוגרם חלבון.
  4. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת הפחתה (10 מ"מ דיתיותרייטול) לכל צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, סגור את החלקים העליונים ומערבל לזמן קצר למשך 3 שניות. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת אלקילציה (30 מ"מ יודואצטמיד) לכל דגימה, סגור את החלקים העליונים ומערבולת למשך 3 שניות.
  5. דגירה של דגימות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס באמצעות גוש חום למשך 11 דקות כדי להפחית ולאלקלט, בהתאמה, את דגימת החלבון. זה מבקע את כל גשרי הדיסולפיד ומכסה אותם בקבוצת אצטמיד, מונע את הרפורמציה שלהם, ובכך מנטרל את החלבון למצב פרוש לחלוטין וממקסם את החשיפה של אתרי עיכול פפטידים.
  6. לאחר הדגירה, הסר דגימות מגוש החום ואפשר להן להתקרר ל-RT.
  7. בזמן ההמתנה להתקררות הדגימות יש להרכיב מחדש את תערובת הפרוטאז של טריפסין/Lys-C (יחס של 1:1, 50 מיקרוגרם כל אחד) עם תמיסת בנייה מחדש של אנזים על ידי הוספת 515 מיקרוליטר מהנוזל לבקבוקון אחד של המגיב המוצק, כלומר 0.1 מיקרוגרם/מיקרוליטר כל אחד. הימנע ממגע ישיר של העור עם תמיסת הפרוטאז וכל השלבים לאחר מכן, מכיוון שטריפסין יכול להיות מגרה ואלרגן חמור.
  8. לאחר קירור הדגימות ל-RT, הוסף 50 מיקרוליטר של תערובת פרוטאז טריפסין/Lys-C משוחזרת (2.5 מיקרוגרם כל אחת) לתמיסת דגימת החלבון המופחתת והאלקילית ולמערבולת לזמן קצר.
  9. יש לדגור על תרמו-מיקסר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ולהגדיר ל-1000 סל"ד למשך 3 שעות כדי לעכל את דגימת החלבון.
    הערה: פרוטאז Lys-C כלול כדי לסייע בפיצול כל האתרים העמידים לעיכול על ידי טריפסין, עקב קיפול או רצף חומצות אמינו (למשל, קשרי Lys-Pro). זה לא רק מפחית כל חלבון למספר רב של פפטידים ידועים בגודל קטן למדי ובמטען כולל, אלא גם ניתן לשחזור במידה רבה אם מקפידים על אותם תנאי עיכול. זמן הדגירה של 3 שעות במהלך העיכול הוא הזמן המינימלי שאנו ממליצים עליו להבטחת פיצול מלא של כל החלבונים.
  10. לאחר 3 שעות הדגירה, הוציאו מהתרמו-מערבל בעזרת זוג מלקחיים כדי למנוע כוויות באצבעות.
  11. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת עצירת עיכול (6% חומצה טריפלואורואצטית או חומצה פורמית במים) לדגימה ולמערבולת בקצרה.
    הערה: זה מעכב את התגובה, מכיוון שלשני הפרוטאזות יש פעילות מקסימלית ב-pH ניטרלי 7-8.
  12. אחסן דגימות במקפיא של -80 מעלות צלזיוס מכיוון שזה גם עוצר כל פעילות פרוטאז שיורית. זוהי נקודת עצירה בטוחה.

5. ניקוי, ייבוש והשעיה מחדש של פפטידים

הערה: הליך זה נועד בעיקר להסרת ריאגנטים לעיכול, במיוחד מלחים לא נדיפים, העלולים לפגוע בקלות במכשיר LC/MS-MS, כמו גם לסייע בבידוד וריכוז הפפטידים המיוצרים. ניקוי הפפטידים מתבצע באמצעות עמודי ספין התפלה המסופקים על ידי ערכה, אשר ארוזים מראש בשרף הרחקת גודל (סינון ג'ל) הלוכד בתחילה את הפפטידים ולאחר מכן מאפשר לשטוף מלחים במיוחד. העברה מלאה של ריאגנטים של הערכה לעמודי הסיבוב במכסה אדים כימי, מכיוון שהם מכילים ממיסים אורגניים רעילים.

זהירות. ודא כי נהלי בטיחות נאותים, כולל לבישת PPE ותקנות הכלת פסולת מסוכנת, מבוצעים בעת עבודה עם הכימיקלים המסוכנים בפרוטוקול שלהלן. השלימו את השלבים הללו בקולט אדים כימי ועיינו בכל גיליונות נתוני הבטיחות לפני העבודה עם כימיקלים אלה.

  1. הסר דגימות מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס ואפשר לדגימות להגיע ל-RT.
  2. הסר את המכסה הלבן בתחתית עמודת ניקוי הפפטיד, שחרר את המכסה העליון הירוק והנח אותו בצינור איסוף של 2 מ"ל.
  3. הנח אותם בצנטריפוגה, סגור את המכסה, לחץ על התחל וצנטריפוגה ב-3000 גרם למשך 2 דקות כדי להסיר את כל נוזל המיזוג לפני המשלוח.
  4. השליכו את הזרימה במיכל פסולת מסוכנת והניחו את עמודת ניקוי הפפטידים בצינור איסוף חדש של 2 מ"ל.
  5. סמן את המכסים הירוקים של עמודת ניקוי הפפטידים עם המזהים לדוגמה, באמצעות עט סימון דיו קבוע.
  6. העבירו בעדינות את תכשיר עיכול החלבון, שנפחו כ-300 מיקרוליטר לתוך עמודת ניקוי הפפטידים היבשים, באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר (למשל, 150 מיקרוליטר פעמיים).
    1. ודא שלא נצפות בועות בחלק העליון של השרף של עמוד הסיבוב. אם נצפות בועות, הסר את הבועות על ידי הקשה עדינה על העמודה או שימוש בקצה פיפטה נקי של 10 מיקרוליטר כדי לפזר את הבועות.
      הערה: בועות אוויר כלואות עלולות לעכב את המעבר החלק של הדגימה לשרף, ובכך להשפיע לרעה על יעילות הניקוי והתפוקה של הפפטיד.
  7. מניחים אותם בצנטריפוגה, סוגרים את המכסה, לוחצים על התחל וצנטריפוגה בחום של 1,500 גרם למשך 2 דקות.
  8. השליכו את הזרימה במיכל פסולת מסוכנת והניחו את עמודת ניקוי הפפטידים בצינור איסוף חדש של 2 מ"ל.
  9. הוסף 300 מיקרוליטר מתמיסת הכביסה A (מים, 0.1% חומצה טריפלואורואצטית / TFA) על גבי שרף העמוד, שוב באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר.
    1. ודא שלא נצפות בועות בחלק העליון של השרף של עמוד הסיבוב. אם נצפות בועות, הסר את הבועות על ידי הקשה עדינה על העמודה או השתמש בקצה פיפטה נקי של 10 מיקרוליטר כדי לפזר את הבועות.
  10. מניחים אותם בצנטריפוגה, סוגרים את המכסה, לוחצים על התחל וצנטריפוגה בחום של 1,500 גרם למשך 2 דקות.
  11. השליכו את הזרימה במיכל פסולת מסוכנת והניחו את עמודת ניקוי הפפטידים בצינור איסוף חדש של 2 מ"ל.
  12. הוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת כביסה B (5% מתנול, 0.1% TFA) על גבי שרף העמודה, שוב באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר.
    1. ודא שלא נצפות בועות בחלק העליון של השרף של עמוד הסיבוב. אם נצפות בועות, הסר את הבועות על ידי הקשה עדינה על העמודה או השתמש בקצה פיפטה נקי של 10 מיקרוליטר כדי לפזר את הבועות.
  13. מניחים אותם בצנטריפוגה, סוגרים את המכסה, לוחצים על התחל וצנטריפוגה בחום של 1,500 גרם למשך 2 דקות.
  14. השליכו את הזרימה במיכל פסולת מסוכנת והניחו את עמודת ניקוי הפפטידים בצינור איסוף חדש של 2 מ"ל.
  15. חזור על שלבים 5.12-5.14 פעם נוספת כך שהעמודה תישטף פעמיים עם תמיסת כביסה B.
  16. העבירו את עמודת ניקוי הפפטידים לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 2 מ"ל.
    1. ודא שצינורות המיקרו-צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל המשמשים בשלב זה הם צינורות האיסוף הנמוכים לקשירת חלבון המסופקים על ידי הערכה.
    2. כדי לשמר את הכמות הזמינה של צינורות איסוף בעלי חלבון נמוך, השתמש בצינורות מעבדה סטנדרטיים לשלבי הכביסה הקודמים.
  17. הוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת אלוטיון (50% אצטוניטריל, 0.1% TFA) על גבי שרף העמוד, שוב באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר.
    1. ודא שלא נצפות בועות בחלק העליון של השרף של עמוד הסיבוב. אם נצפות בועות, הסר את הבועות על ידי הקשה עדינה על העמודה או השתמש בקצה פיפטה נקי של 10 מיקרוליטר כדי לפזר את הבועות.
  18. הנח אותם בצנטריפוגה, סגור את המכסה, לחץ על התחל וצנטריפוגה ב-1,500 גרם למשך 3 דקות כדי לאסוף את דגימת הפפטיד הנקייה בצינור האיסוף החדש של 2 מ"ל קושר חלבון נמוך.
    1. אם תרצה, העבירו 125 מיקרוליטר (כמחצית) מתמיסת הפפטיד הנקייה המנוקה לבקבוקון זכוכית של 1 מ"ל, באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר, ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן להשתמש ב-aliquot זה מאוחר יותר לניתוח נוסף, כגון תיוג תג מסה טנדם (TMT) של הפפטידים, כפי שנעשה על ידי ערכה זמינה מסחרית, לכימות מדויק יותר על פני דגימות, במיוחד סטים שהוכנו באופן עצמאי.
  19. אחסן את הדגימה הנותרת, כ-175 מיקרוליטר, בטמפרטורה של -30 מעלות צלזיוס בצינורות קושרים חלבון נמוך של 2 מ"ל עד שהם מוכנים להמשיך בייבוש ובבנייה מחדש. זוהי נקודת עצירה בטוחה.
  20. כדי לייבש את הדגימה, הפשירו את דגימת הפפטיד מ-30 מעלות צלזיוס ל-RT. אם ממשיכים בייבוש ובבנייה מחדש מיד לאחר ניקוי הפפטיד, התעלמו משלב זה.
  21. פתח את צינורות המיקרו-צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל והנח אותם לרכז צנטריפוגה ואקום.
    1. הקפד לאזן את רכז צנטריפוגת הוואקום אם מספר לא זוגי של דגימות מופעל בו זמנית.
    2. סגור את מכסה רכז צנטריפוגת הוואקום ולחץ על התחל.
    3. אפשר לדגימות לפעול על רכז צנטריפוגת הוואקום למשך 3 שעות, ללא הפעלת חימום.
    4. בדוק את הצינורות מעת לעת כדי לוודא שלא נשאר נוזל בפנים, מכיוון שהדבר עלול להפריע לקשירת הפפטידים לעמוד ההפרדה של מכשיר ה-LC/MS-MS.
    5. אם עדיין נצפה נוזל, המשך לסובב את הדגימות למשך זמן נוסף.
    6. בדוק בין 30 דקות לשעה כדי לראות אם נשאר נוזל בצינור.
      הערה: הפפטידים יציבים מאוד במהלך תהליך זה מכיוון שהם נמצאים בתנאי ואקום ולא יתדרדרו על ידי תקופה קצרה של יובש או חום מתון שנוצר על ידי פעולת רכז צנטריפוגת הוואקום בלבד.
  22. לאחר הייבוש, השעו מיד את הדגימה ב-50 מיקרוליטר של 0.1% חומצה פורמית במים בדרגת MS (למשל, 5 מיקרוליטר של 100% חומצה פורמית ב-5 מ"ל מים).
    1. הוסף 50 מיקרוליטר של 0.1% חומצה פורמית לתחתית הצינור קושר החלבון הנמוך של 2 מ"ל המכיל את דגימת הפפטיד המיובשת, באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר.
  23. סגור את הכובעים ואז מערבולת למשך 15 שניות.
  24. העבירו את הדגימות המשוחזרים לבקבוקוני הזכוכית של 1 מ"ל המתאימים, באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר.
  25. אחסן את בקבוקוני הזכוכית המכילים את הדגימות המשוחזרים ב-30 מעלות צלזיוס, ונתח אותם בגישה מבוססת LC-MS/MS בהקדם האפשרי.
    הערה: דגימות הפפטיד הקפואות יציבות ב-30 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח קצר ו-80 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך יותר.

6. רכישת נתונים של דגימות פפטיד במכשיר UHPLC/MS-MS

זהירות. ודא שמתקיימים פרוטוקולי בטיחות נאותים בעת עבודה עם מערכת ספקטרומטר מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית/אורביטרפ בעלת ביצועים גבוהים במיוחד. אנשי המעבדה לבשו PPE ועברו הכשרה רשמית ומעשית של מכשירים שסופקה על ידי יצרן UHPLC/MS-MS. האזהרות העיקריות הן טיפול נכון בשלבים הניידים של הממס החומצי והאורגני עבור UHPLC ומקור יינון במתח גבוה עבור MS.

  1. בצע הפרדות פפטידים באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UHPLC). עמודת ה-LC היא פאזה הפוכה C18 בעלת יכולת אלקטרו-ספריי, תכן הפרדה מהירה (RSLC), במידות 2 מיקרומטר, 100 Å, 50 מיקרומטר x 15 ס"מ, כפי שהוצב בשורה לאחר עמוד קדם-מגן מאותו חומר.
  2. השתמש בשלבים הניידים הבאים של UHPLC: 0.1% חומצה פורמית במים (ממס A), 0.1% חומצה פורמית באצטוניטריל (ממס B) ו-0.1% חומצה פורמית ב-90% מים ו-10% מתנול (ממס C).
    הערה: כל הממיסים כמו גם חומצה פורמית, המשמשים להכנת השלבים הניידים מאושרים בדרגת LC/MS ומיוצרים רק לפי הצורך. ל-UHPLC יש יחידת סינון ומסיר גז לפני המשאבות, כך שהשלבים הניידים אינם מסוננים ידנית ומטוהרים מאוויר.
  3. הגדר זריקות מתוכנתות של סך הפפטידים שהוכנו עבור דגימות הפלזמה והרקמות ב-3 מיקרוליטר מלכתחילה, השווה ערך ל~3 מיקרוגרם של חומר פפטיד כפי שנקבע על ידי הכמות ההתחלתית של החלבון בשימוש.
    הערה: זה אמור לייצר עוצמת אות MS אידיאלית לזיהוי חלבון מקסימלי. ניתן להגדיל את נפח ההזרקה עד 15 μL כדי להגביר עוד יותר את פלט האות או להקטין עד 1 μL אם ניכר עומס יתר.
  4. שמור על העמודה והדגימה האוטומטית ב-40 מעלות צלזיוס ו-10 מעלות צלזיוס, בהתאמה.
  5. הגדר את קצב זרימת הממס לרכישת הפרוטאומיקה ב-0.3 μL/min קבוע, באמצעות משאבות הננו-UHPLC, עם שיפוע הפרדה ליניארי של השלבים הניידים של המים (A) לאצטוניטריל (B).
  6. בצע שטיפות של מזרק ההזרקה ולולאת הדגימה (קיבולת 20 מיקרוליטר) באמצעות השלב הנייד של המים והמתנול (C), כאשר משאבת הטעינה UHPLC מוגדרת בתחילה ל-5 מיקרוליטר לדקה.
  7. במהלך הפרדת הדגימה על פני 80 דקות בסך הכל, הגדר את שיפוע ה-LC (עקומות ליניאריות) כדלקמן: התחלתי - 5% B; 0-60 דקות - 32% B; 60-61 דקות - 95% B; 61-65 דקות - 95% B; 65-66 דקות - 2% B; ו-66-80 דקות - 2% B. כמו כן, הפעל את משאבת הטעינה ב-100% קבוע מ-A, אך התאם את קצב הזרימה באופן ליניארי באופן הבא: ראשוני - 5 מיקרוליטר לדקה; 0-5 דקות - 1 מיקרוליטר לדקה; 5-61 דקות - 5 מיקרוליטר לדקה; ו-61-80 דקות - 5 מיקרוליטר לדקה (איור 3A).
  8. הזרקת דגימות פפטיד לא ידועות כריצות כפולות עוקבות.
  9. כדי למנוע העברה, בצע לפחות שתי זריקות ריקות ברצף של 0.1% חומצה פורמית במים בין דגימות באמצעות שיפוע LC קטום (עקומות ליניאריות) במשך 35 דקות בסך הכל כדלקמן: ראשוני - 5% B; 0-23 דקות - 32% B; 23-24 דקות - 95% B; 24-30 דקות - 95% B; 30-31 דקות - 2% B; ו-31-35 דקות - 2% B (איור 3B).
    1. ודא שההגדרות של שיפוע LC של משאבת הטעינה נשארות ללא שינוי.
    2. עבור דגימות פפטיד בעלות רמות גבוהות של מזהמים אנדוגניים, כגון כבד (למשל, חומצות מרה), כלול ריק שלישי כל 3 עד 5 דגימות ובסוף הריצה כדי לסייע בניקוי עמודת ה-LC. זה מורכב מהזרקת 1 עד 2 מיקרוליטר של תמיסה המכילה 25% כל אחד של אצטוניטריל, איזופרופנול, מתנול ומים.
    3. לחלופין, או בשילוב עם השלב לעיל, בצע שינוי באחוזים של שיפוע LC משופר (כלומר, נדנדה) על פני 35 דקות בסך הכל כשטיפת מערכת כדלקמן: ראשוני - 2% B; 0-3 דקות - 2% B; 3-4 דקות - 95% B; 4-10 דקות - 95% B; 10-11 דקות - 2% B; ו-11-15 דקות - 2% B; 15-16 דקות - 95% B; 16-20 דקות - 95% B; 20-21 דקות - 2% B; 21-25 דקות - 2% B; 25-26 דקות - 95% B; 26-30 דקות - 95% B; 30-31 דקות - 2% B; ו-31-35 דקות - 2% B (איור 3C).
  10. בצע את זיהוי הפפטידים, כלומר מסות מולקולריות מתאימות, כאשר הם מופרדים על ידי עמודת ה-LC ונפלטים ממנה, באמצעות מערכת ספקטרומטר מסה מרובע מרובע טנדם (MS-MS) בשילוב מלכודת יונים.
    1. לפני ביצוע ריצות הדגימה, חבר את עמודת ה-LC ישירות לפנים של מקור יינון ננו ריסוס להחלפה (NSI) של מכשיר ה-MS, הממוקם בפינה הקדמית השמאלית העליונה של המכשיר.
      הערה: זה חושף את מחט האלקטרו-ספריי המובנית של עמודת ה-LC המספקת את הפפטידים, כפי שהם תלויים בתוך מיקרו-טיפות טעונות של ממס פאזה נייד LC, לתוך הכניסה של צינור העברת היונים של הגלאי.
    2. כמו כן, כדי לשפר את יעילות נידוף האלקטרוספריי, הפעל את יחידת החימום המובנית של מקור ה-NSI והגדר אותה ל-40 מעלות צלזיוס.
  11. כמו כן, לפני הפעלת הדגימה, בדוק שיש קלט חיצוני משביע רצון של חנקן דחוס וגז הליום למכשיר MS. השג זאת באמצעות מיכלי צילינדר פלדה בגודל 300 בדרגת טוהר גבוהה במיוחד של כל גז, שמדדי הרגולטור שלהם מוגדרים ללחצי זרימה סטטיים של 60 ו-40 psi, בהתאמה.
  12. אם מכשיר ה-MS מוציא אזהרות על חוסר יציבות של כניסת גז החנקן, העלה את הלחץ עד למקסימום של 100 psi. ודא שהטנקים מלאים לפחות 10-20%, שהיא קריאת מד שסתום עליון של ~250-500 psi; ואם לא, החלף אותם לחדשים. ירידה מתחת ל-10% מהקיבולת המלאה טומנת בחובה סיכון למשוך מזהמים למכשיר MS, שיכולים להתיישב בתחתית מיכלי הדלק.
  13. הכינו מראש את שיטת ספקטרומטר המסה באמצעות תבנית המסופקת על ידי תוכנת בקרה המיועדת לזיהוי אופטימלי של פפטידים והשינויים שלאחר התרגום (איור 3D-H), והיכנסו לתנאים הסטנדרטיים הבאים:
    1. הגדר את תקופת הזיהוי הכוללת ל-80 דקות.
    2. הגדר את מצב הזיהוי הכללי לפפטידים.
    3. הגדר את מקור ה-NSI למצב חיובי (כלומר, מטען יוני הפפטיד).
    4. הגדר את מתח מחט הננו-ריסוס ל-2000 וולט ושמור אותו כסטטי.
    5. הגדר את כניסת גז החנקן ל-NSI והגדר את הגלאים לסטטיים.
    6. הגדר את טמפרטורת צינור העברת היונים ל-275 מעלות צלזיוס.
    7. לזהות את המסות של כל הפפטידים (כלומר, יוני הורים; MS1) על ידי הגדרת טווח הסריקה ל-350-2000 m/z, עדשת RF ל-30%, זמן הזרקה מקסימלי לאוטומטי ומנתח המסה של Orbitrap לרזולוציה של 120,000.
      הערה: יכולת מלכודת היונים האלטרנטיבית של המכשיר אינה משמשת כאן לסינון מסות הפפטיד, מכיוון שהיא פחות רגישה לניטור סוג זה של מולקולה בהשוואה לאורביטרפ.
    8. הגדר את מסנני היונים כך שיבחינו בין אותם פפטידים בעלי מצבי טעינה מרובים בטווח של 2-7. זה מאפשר למכשיר, תוך כדי הקלטת הנתונים, להמיר אוטומטית את יחסי המסה על המטען (m/z) שזוהו באופן אינהרנטי של המולקולות למסות המדויקות שלהן. באופן דומה, פפטיד עם מצב מטען יחיד בלבד (m/z = 1) אינו דורש שום גורם המרה כדי להשיג את המסה המדויקת שלו.
    9. הגדר את שערי ההרחקה הדינמיים עבור היונים למעבר אחד במשך 60 שניות, סובלנות מסה של ±10 ppm ולהשמטת כל מולקולה עם אטומים איזוטופיים טבעיים (למשל, 14C).
    10. לזהות את המסות של שברי אישור הזהות שנוצרו עבור הפפטידים (כלומר, יוני בת; MS2) על ידי הגדרת המכשיר לרכישה תלוית נתונים (מצב DDA).
    11. ללכוד את כל הפפטידים (כלומר, יוני הורים) על ידי בידוד ארבע-קובי, תוך שימוש בהגדרה עבור חלון הסובלנות לשונות המסה של m/z = 1.6.
    12. בצע את הפיצול של הפפטידים שנלכדו על ידי הגדרת מצב השפעת האלקטרונים ל-HCD (כלומר, דיסוציאציה התנגשות באנרגיה גבוהה יותר באמצעות גז חנקן והליום כסוכן העברת אלקטרונים), אנרגיית התנגשות ל-30%, טווח סריקה לאוטומטי, זמן הזרקה מקסימלי לאוטומטי ומנתח המסה של Orbitrap לרזולוציה של 30,000.
    13. רכוש את הנתונים הסופיים (יוני MS1 ו-MS2) על ידי הגדרת צורת שיא האות לפורמט צנטרואידי.
  14. שמור על קביעות מסה מדויקות עבור פפטידים שזוהו על ידי כיול שגרתי של המכשיר, בדרך כלל לפני כל הפעלת אצווה של דגימה, כמתואר להלן.
    1. הנח את מכשיר ה-MS במצב כיבוי מקור יונים, באמצעות תוכנת הבקרה, והעבר את מקור ה-NSI למקור יינון אלקטרו-ספריי מחומם פנימי (HESI) החלופי של המכשיר. זהו המקור המשמש ליישומים שיכולים לדרוש נפחי הזרקת דגימה גדולים מאוד וקצב זרימה גבוה מתאים (1-2500 מיקרוליטר לדקה) עבור משאבת LC, למשל, ניסויים מטבולומיים ופרמקוקינטיקה של תרופות.
    2. בחר באפשרות בדיקת הכיול המלאה בתוכנת השליטה.
    3. מלאו מזרק זכוכית של 500 מיקרוליטר בעל בוכנה מצופה טפלון ומחט קהה מנירוסטה בתמיסה סטנדרטית MS זמינה מסחרית, ולאחר מכן חבר את קו הצינור הנימי PTFE למקור HSEI (כשהוא כבוי).
      הערה: התקן המשמש כאן מכיל תערובת של מולקולות טבעיות וסינתטיות (16 בסך הכל, למשל, קפאין) המשתרעות על טווח מסה של m/z = 50-2800 ומכסות מגוון רחב של סוגי קשרים כימיים אפשריים, במיוחד אלה הקשורים לפפטידים (למשל, קבוצות אמיד).
    4. התחל עירוי קבוע של תקן MS למקור HSEI (כשהוא מופעל), תוך שימוש בקצב של 3-5 מיקרוליטר לדקה כפי שנעשה באמצעות משאבת מזרק. לאחר שצוין דפוס יציב של פסגות סטנדרטיות בתוכנת הבקרה Live view, הפעל את בדיקת הכיול האוטומטית.
      הערה: אם לא נמצאו בעיות עם הרגישות והדיוק של קביעות המסה עבור התקן, כיול מלא מוצלח אורך בדרך כלל < 40 דקות. כמו כן, רק אם המכשיר עובר את כל פרמטרי החומרה של MS שנבדקים הוא נחשב אמין להפעלת דגימות.
    5. אשר את הצלחת הכיול על ידי איפוס מקור ה-NSI ועמודת ה-LC, ולאחר מכן הפעלת תמיסה סטנדרטית של [Glu 1]-Fibrinopeptide B (Glu-Fib) אנושי בכמויות הזרקה כוללות המכסות 1-10 ננוגרם (למשל, 1, 2, 6 ו-10 ננוגרם). השתמש באותן שיטות הפרדת LC וזיהוי MS כמו אלה שתוארו לעיל עבור הדגימות הלא ידועות.
    6. בדוק את תקן Glu-Fib עבור זמן שימור LC מתאים (~20 דקות), נוכחות של יוני MS1 ו-MS2 (m/z = 1285.54, 813.39, 785.84, 445.12, 333.19 ו-175.12), וליניאריות של הגדלת אזורי שיא עם כמות מוזרקת.
    7. לאחר מכן צור טבלאות רצף, באמצעות תוכנת הבקרה ולכידת הנתונים, עבור הרצת הפפטיד הלא ידוע והדגימות הריקות המכילות עמודות להזנת סוג הדגימה, שם הקובץ, מזהה הדגימה, נתיב הנתונים, שיטת מכשיר LC/MS, מיקום הבקבוקון ונפח ההזרקה (איור 3D-E).
    8. שמור את קובצי הנתונים של MS שהתקבלו (סיומת: RAW; 500 - 800 GB כל אחד) בתיקיית הנתיב הייעודית בכונן הקשיח של מחשב המכשיר. לאחר מכן העבירו את הקבצים הללו למחשב תחנת עבודה חזק מספיק כדי להניע את תוכנת הביואינפורמטיקה, כפי שמתואר בהמשך, הממירה את הנתונים הספקטרליים הנרחבים והמורכבים ביותר של מסת הפפטיד (כלומר, אותות MS1 ו-MS2) לפרופילים תואמים של הרכב החלבון הכולל.

7. המרה של נתוני טרשת נפוצה גולמיים לתוצאות פרוטאום כוללות מייצגות

הערה: נתוני הטרשת הנפוצה הגולמיים שנלכדו עבור דגימות פפטיד מעובדים לפרופילי הרכב חלבון כולל (פרוטאום), באמצעות תוכנת ביואינפורמטיקה. בקצרה, התוכנה הביואינפורמטית משחזרת את החלבונים המקוריים בדגימה על ידי התאמת נתוני הטרשת הנפוצה הגולמיים לספקטרום MS1 ו-MS2 הפפטידי הידוע שלהם שנמצא בספריית התייחסות ספציפית למין ספציפי לאינטרנט, באמצעות כיסוי נרחב וייחודי של רצף חומצות האמינו של החלבון. השפע היחסי של כל חלבון שזוהה נקבע על ידי התוכנית באמצעות עוצמות האות MS1 של הפפטידים הייחודיים התואמים לו. ניתן להשוות באופן אמין שפע שנקבע בין דגימות, אך רק אם הן מופעלות באותה אצווה הכנה ותוך שימוש בהגדרות LC ו-MS זהות. אחרת, יהיה צורך להשתמש בטכניקות כמותיות מוחלטות שהוזכרו קודם לכן המבוססות על התאוששות יונים פנימית של תקן/מדווח, כמו תיוג TMT סלקטיבי של הפפטידים בתוך כל דגימה.

  1. הורד לכונן הקשיח של מחשב תחנת העבודה את קובץ העזר של Proteome מהספרייה מבוססת האינטרנט.
    1. מצא זאת על ידי שימוש במסד הנתונים הממוקם באתר Uniprot עבור מיני הדגימה המעניינים (למשל, חמוסים / Mustela furo). פעולה זו נקראת קובץ PASTA. השתמש בכלי החיפוש Proteomes ובתצוגת טבלה כדי לאתר ולאחר מכן להוריד את קובץ ההפניה של Proteome.
    2. כדי למקסם את המספר האפשרי של זיהויי חלבונים שנוצרו, בחר הן את ערכי הוועדה שנבדקו על ידי עמיתים (Swiss-Prot) והן את הערכים שלא נבדקו (TrEMBL) למסד הנתונים של Uniprot בעת יצירת קובץ FASTA. כמו כן, בחר באפשרות לכלול את כל האיזופורמים שנבדקו עבור החלבונים.
  2. פתח את תוכנת הביואינפורמטיקה, כלומר, Proteome Discoverer, לכרטיסייה דף התחלה ולאחר מכן בחר בכרטיסייה ניהול .
  3. עבור אל הכרטיסייה תחזוקת קבצי FASTA ולאחר מכן הורד לתוכנית את קובץ ה-FASTA הספציפי למין לעיל שנוצר עבור הניסויים שלך.
  4. חזרו ללשונית דף הפתיחה ולחצו על מחקר/ניתוח חדש, ובתיבת הדו-שיח, הקלידו שם מחקר בשדה שם המחקר ובחרו תיקיית קבצים לשמירת המחקר בשדה ספריית השורש של המחקר .
  5. השאר את השדות זרימת עבודה של עיבוד וזרימת עבודה של קונצנזוס ריקים לעת עתה, מכיוון שהם ייבחרו למועד מאוחר יותר.
  6. לחצו על אישור כדי לשמור ולעזוב את תיבת הדו-שיח, שתציג את הדף הגדרת המחקר .
  7. עבור אל הכרטיסייה הגדרת מחקר והקלד את פרטי הפרויקט בתיבה תיאור המחקר הממוקמת בצד שמאל האמצעי.
  8. עבור אל קבצי קלט הכרטיסייה ולחץ על הוסף קבצים.
    1. זה יביא תיבת דו-שיח שבה ניתן לבחור ולהוריד את קבצי הנתונים הגולמיים הנדרשים לעיבוד לתוצאות פרופיל הרכב החלבון הכולל (פרוטאום) מהכונן הקשיח של המחשב.
  9. לחץ על קבצי הנתונים הגולמיים של MS המפורטים כעת תחת הכרטיסייה קבצי קלט , אותם ניתן לבחור ולהדגיש בנפרד או בבת אחת.
  10. גרור אותם ושחרר אותם במקטע קבצים לניתוח של התיבה ניתוח הממוקמת בצד השמאלי האמצעי כחלק מתיבת המשנה שלב עיבוד .
  11. עבור לכרטיסייה זרימות עבודה ולחץ על ערוך, שנמצאת ליד הכותרת שלב העיבוד של תיבת הניתוח הממוקמת בצד ימין באמצע.
  12. לחץ על פתח משותף ומהתיקיה ProcessingWF_Tribrid , בחר את קובץ זרימת העבודה של העיבוד המיועד במיוחד לזיהויי משנה של פוספופרוטאין, כפי שהתקבל תחת זיהוי MS מבוסס פיצול HCD (איור 4A).
    הערה: דיאגרמת שלבי עיבוד המכילה צמתים הניתנים לעריכה תופיע בתיבה עץ זרימת עבודה . יהיו שני צמתים, כמתואר להלן, המסומנים בסימני קריאה המציינים כי יש צורך בהזנה של מידע ספציפי לניסוי על ידי המשתמש.
  13. בדיאגרמת עץ זרימת העבודה של העיבוד, לחץ על ופתח את צומת RC של קבצי ספקטרום .
    1. בקטגוריית הפרמטרים של קבצי ספקטרום RC , מצא ובחר תחת הפרמטר מסד נתונים של חלבונים את קובץ ה-FASTA, שנוצר בעבר באמצעות אתר Uniprot, עבור ספריית הייחוס הספציפית למין של ספקטרום טרשת נפוצה פפטיד שתחפש כדי לזהות את החלבונים בעלי העניין הניסיוני.
  14. לחץ על ופתח את הצומת Sequest HT ובצע את שלושת השינויים הבאים:
    1. תחת הפרמטר Protein Database , בחר את אותו קובץ PASTA, כמתואר לעיל.
    2. תחת הפרמטר Enzyme Name , בחר Trypsin (מלא) או לחילופין Lys-C, שהם הפרוטאזות העיקריות והגיבוי המשמשות להכנת עיכול הפפטיד המקורי.
    3. תחת הפרמטר שינויים דינמיים, ודא שנבחר לפחות Phospho / +79.966 Da (S, T, Y).
      1. השתמש בהגדרה האחרונה כדי לחשוף פפטידים הקשורים לחלבונים שעברו שינוי לאחר תרגום על ידי זרחון, באמצעות חיפוש אחר הפסדי ספקטרום MS תואמים של קבוצת פוספט (m/z = 79.97).
      2. מצא את אתרי חומצות האמינו התפוסים בפוספט (כלומר, סרין, תראונין או טירוזין) לפי השינויים הצפויים בדפוסי הפיצול של MS2 שלהם.
      3. הוסף שינויים אחרים לאחר תרגום חלבון בעלי עניין שגרתי באותו אופן לצומת Sequest HT בשלב זה, למשל, מתילציה, אצטילציה, מיריסטילציה, אם ידוע אובדן המסה המדויק של הקבוצות הקשורות. כמו כן, הרחב את החיפוש אחר אתרי הזרחן לחומצות אמינו אחרות המדווחות בתדירות נמוכה יותר, למשל, היסטידין.
        הערה: הצמתים Spectrum Files RC ו-Sequest HT של עץ זרימת העבודה עבור שלב העיבוד הם השניים היחידים הדורשים התאמה של פרמטרים כלשהם.
    4. השאירו את השאר כהגדרות ברירת המחדל שלהם, מכיוון שאלו כבר עברו אופטימיזציה על ידי היצרן כדי לייצר את המספר הגבוה ביותר של זיהויי חלבון ייעודיים מעניינים. באופן דומה, הדבר חל על כל הצמתים האחרים בעץ זרימת העבודה.
    5. ודא שהצמתים Percolator ו - IMP-ptmRS כלולים בסוף עץ זרימת העבודה.
      הערה: פרקולטור משתמש בהתאמה חוזרת כדי לחדד מאוד את התוצאות הסופיות. IMP-ptmRS חיוני לדיווח על הזיהוי המתאים ולוקליזציה של האתר של כל השינויים שלאחר התרגום של החלבון, כולל זה של זרחון.
  15. חזור לכרטיסייה זרימות עבודה ולחץ על עריכה שנמצאה לצד הכותרת שלב קונצנזוס של תיבת הניתוח הממוקמת בצד ימין למעלה. פעולה זו תציג את דיאגרמת עץ זרימת העבודה עבור שלב הקונצנזוס.
  16. לחץ על Open Common ומהתיקייה ConsensusWF בחר את קובץ זרימת העבודה הקונצנזוס שיפיק את פורמט הפלט הרצוי עבור תוצאות פרופיל הרכב החלבון (פרוטאום) (איור 4B).
    הערה: דיאגרמת שלב קונצנזוס המכילה צמתים הניתנים לעריכה תיפתח בתיבה עץ זרימת עבודה . הדיאגרמה המשמשת לעיבוד הנתונים נוצרת על ידי שינוי זרימת העבודה הבסיסית של הקונצנזוס, שבה נוספו צמתים של ממפה תכונות ומכמת יונים קודמים כהסתעפות מהצומת הראשוני של קבצי MSF , כדי להקל על כימות השפע היחסי של חלבונים. בעוד שכל הצמתים בזרימת העבודה כבר מכילים פרמטרים מותאמים שנקבעו על ידי היצרן, ישנם כמה המכילים ערכים חשובים מאוד כדי לבדוק שוב את הבחירה הנכונה של כמתואר להלן.
  17. בדיאגרמת עץ זרימת העבודה, לחץ על ופתח את הצומת מכמת יונים קודם . זהו הצומת החיוני לכימות השפע היחסי של כל חלבון מזוהה.
    1. תחת הקטגוריה הגדרות כימות כלליות , מצא ובחר תחת הפרמטר פפטידים לשימוש באפשרות ייחודי + סכין גילוח .
      הערה: פפטידים ייחודיים הם אלה המכילים רצפי חומצות אמינו בלעדיים לחלבון יחיד; ולפיכך, משמשים לקביעת כמותו באופן ספציפי על סמך עוצמות האות של MS. פפטידים של סכין גילוח הם אלה המשותפים לקבוצות חלבונים; וכך, משמשים כדי למשוך את השפע היחסי המחושב להסכמה.
    2. תחת הקטגוריה נורמליזציה וקנה מידה שנה את הפרמטרים מצב נורמליזציה ומצב קנה מידה לאפשרות ללא, מכיוון שסוג זה של התאמה מוגבל מדי ליישום אמין על פני כל הפרוטאום.
      הערה: הגדרות אלה מופעלות רק כאשר רוצים לנרמל את השפע היחסי המחושב של חלבונים נבחרים מעניינים כנגד אלה שהם מהותיים ביציבות לתא, למשל, גנים של משק בית, ולאחר מכן לבטא את הערכים המתקבלים כיחס מוקטן.
    3. לאחר מכן, לחץ על ופתח את הצומת מסנן פפטיד וחלבון ותחת הקטגוריה מסנני פפטיד שנה את ביטחון הפפטיד לפחות ושמור על פרמטרי PSM ברמת ביטחון נמוכה יותר לאפשרויות High ו-False, בהתאמה. זה מגדיר את התאמות הפפטידים המשמשות לביצוע זיהויי החלבון לרמה הגבוהה ביותר של מובהקות התאמה (כלומר, ≥ 95%).
      הערה: לחלופין, ניתן להגדיר את הפרמטר הראשון לבינוני כדי להרגיע את המחמירות של התאמות הפפטיד ובכך להגדיל מאוד את תפוקת פגיעות החלבון; אך זה מוביל לסיכון גבוה מאוד ליצירת זיהויים כוזבים רבים. כמו כן, לעולם לא אמור להיות המקרה שערך "נמוך" משמש כאפשרות מקובלת עבור שני הפרמטרים.
    4. אלה הצמתים היחידים של שלב הקונצנזוס שצריכים להתאים פרמטרים, להשאיר את השאר כמשתמשים בהגדרות ברירת המחדל שלהם.
      הערה: בסך הכל, זרימת העבודה של צעד הקונצנזוס מטפלת בכל הניתוח הפוסט-הוק, כלומר, קביעת השפע היחסי של החלבון, ביטחון זיהוי (כלומר, שיעורי גילוי שגוי וציוני התאמה ספקטרלית של פפטידים), וכיסוי פפטידים ממופה. סטטיסטיקות תוצאות והתפלגות נתונים מסופקות גם כטבלאות סיום.
  18. לאחר שזרימות העבודה של העיבוד ושלב הקונצנזוס לעיל נמצאות במקומן, שמור את המחקר כולו ולאחר מכן לחץ על סמל ההפעלה (גלגלי שיניים) הממוקם בחלק העליון של תיבת הניתוח . אם מספר קבצי נתונים גולמיים של MS מעובדים בבת אחת, לפני תחילת ריצת העיבוד, לחץ על וסמן את הסמל הסמוך לפי קובץ (ריבוע).
    הערה: עיבוד של קובץ נתונים גולמי אחד של MS לקובץ תוצאות פרוטאום כולל לוקח בדרך כלל 20-40 דקות, אך הוא יכול להניב רשימה רציפה של אלפים רבים של זיהויי חלבונים הנעים בין התאמות נמוכות, בינוניות ועד גבוהות (כלומר, עם שקלול לכיוון פגיעות גבוהות), יחד עם שינויי הפוספט הקיימים בתוך כל ישות (איור 4C). פרמטרי פלט התוצאה העיקריים עבור החלבונים שזוהו הם FDR (ביטחון), מאסטר (אם קובץ ה-FASTA / ערך הספרייה נבדק), Accession #, Description, Coverage, Coverage Sequence, Peptide Spectral Matchs (למשל, מספר פפטידים ייחודיים), מאפיינים פיזיקליים (למשל, MW ב-kDa), שפע יחסי ושינויים (כלומר, קבוצות זרחון).
    1. סדר העמודות את סך תוצאות הפרוטאום בסדר עולה או יורד או מסונן לחלוטין, באמצעות סמל המשפך בסרגל הכלים (איור 4C), על פי תחומי עניין מחקריים, למשל, הצג רק את אלה עם זיהוי ביטחון גבוה (חלבון FDR) או רמה גבוהה של התאמת פפטידים (למשל, לפי אחוז כיסוי ו/או מספר ייחודי שנמצא
    2. אם יש צורך ספציפי במידע על שינוי לאחר התרגום, סנן חלבונים מזוהים בעלי זרחון להמשך ניתוח.
    3. שמור את התוצאות המסוננות, ללא שינוי שם הקובץ, מכיוון שניתן לשחזר אותן לפלט המקורי פשוט על ידי הסרת המסננים שהוחלו ורענון החלון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הדמיה של תוצאות הפרוטאום הכוללות על ידי עיבוד אופציונלי לחלקות הר געש
ניתן לחפש בקלות את סך תוצאות הפרוטאום עבור כל דגימה על ידי הצטרפות # או תיאור של חלבונים ספציפיים בעלי עניין מחקרי והשפע היחסי הקשור הוא ממוצע ולאחר מכן מושווה בין קבוצות הטיפול להבדלים משמעותיים (למשל, כמו על ידי ערכי p נגזרים ממבחן t). לחלופין, זה יכול להיות בעל ערך מחקרי רב לחפש שינויים גלובליים על פני כל הפרוטאום, כולל כל פוספופרוטאינים, המשותפים באופן מלא בין הדגימות הבודדות המרכיבות את קבוצות הטיפול בניסוי. זה נעשה על ידי המרת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה הנ"ל השתמשה ברקמות שהוקפאו בחנקן נוזלי כדי לעצור מיד את כל הפעילות הביולוגית לפני העברתן ל-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. לאחר איסוף כל הדגימות, התרחשה הומוגניזציה של רקמות. במהלך ההומוגניזציה, זה קריטי לשמור על כל הרקמות והכלים קרים כדי למנוע הפעלה מחדש או פירוק של החלבונים. כמו כן, במהלך המיצוי הראשוני של חלבון מרקמה הומוגנית, הדגימות נשמרות קרות כדי למנוע אובדן פעילות חלבון או פירוק חלבון. השתמשנו במתודולוגיה זו כדי להבהיר שינויים בפרופילי החלבון של רקמות, כולל המוח, הריאות,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

פרויקט זה נתמך בחלקו על ידי מינוי לתוכנית העמיתים של מועצת המחקר הלאומית המנוהלת על ידי משרד המלגות של האקדמיות הלאומיות למדעים, הנדסה ורפואה, ותוכנית מכון אוק רידג' למדע וחינוך במכון המחקר הצבאי וולטר ריד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת בדיקת חלבון 660 ננומטרפירס / תרמו סיינטיפיק22662כדי ש-BCA תקבע את ריכוזי החלבון של הדגימות, מכיל ריאגנט בדיקת חלבון Pierce 660nm ותקני בדיקת חלבון מדולל מראש
אצטוניטריל, בדרגת אופטימה LC/MSתרמו פישר סיינטיפיק047138.K2אצטוניטריל טהור במיוחד המשמש לכרומטוגרפיה נוזלית/ספקטרומטריית מסה
חותם צלחת רדיד אלומיניוםבקמן קולטר538619אטם המשמש במהלך פיתוח לוחית בדיקת חלבון
BioTek Synergy Neo2 קורא רב-מצבי / ספקטרומטר UV-Visזריזhttps://www.agilent.com/en/product/microplate-instrumentation/microplate-readers/multimode-microplate-readers/biotek-synergy-neo2-hybrid-multimode-reader-1623195מכשיר קורא ספקטרופוטומטר/לוחית בדיקה המשמש להשלמת קריאות ספיגה של 660 ננומטר לקביעת ריכוזי חלבון 
פתרון שטיפת מכשירים ChromaCare LC-MSתרמו פישר סיינטיפיקT111101000תמיסה המכילה 25% כל אחד משימוש באצטוניטריל, איזופרופרול, מתנול ומים כדי לסייע בניקוי מערכת ה-LC לאחר הפעלת דגימות
צינור CK28 Precellysברטין קורפ / טכנולוגיותP000911LYSK0A.0רקמות הומוגניות מונחות בצינורות אלה לליזה רקמות ובידוד חלבונים באמצעות מכשיר Precellyis. אלה הצינורות המשמשים את המעבדה שלנו המכונים בפרוטוקול "צינורות הומוגניזציה".
קריופודברוקס / אזנטה מדעי החייםhttps://www.azenta.com/products/cryopod-carrierמיכל המשמש להחזקת חנקן נוזלי לקירור טיט במהלך הומוגניזציה של טיסוזה
ערכת הכנה לדוגמא של EasyPep Mini MSתרמו פישר סיינטיפיקא40006ערכה אחת יכולה לעבד 20 דגימות, התוכן כולל את תמיסת הליזיס למיצוי חלבון, נוקלאז אוניברסלי בתוספת תמיסת המיצוי וחומרים הדרושים לשלבים 1.4 ו-1.5
עמוד EASY-Spray C18 LC (15 ס"מ L, 50 ומיקרו; m Dia, ו-2 ומיקרו; גודל חלקיקים מ')תרמו פישר סיינטיפיקES901עמודת LC Electrospray המשמשת להפרדת פפטידים לפני גילוי טרשת נפוצה
פתרון כיול FlexMixפירס / תרמו סיינטיפיקא39239תערובת של 16 מולקולות סטנדרטיות המשמשות לכיול דיוק הגלאי והרגישות של מכשיר MS לפני ריצת הדגימה
חומצה פורמית, בדרגת LC/MSתרמו פישר סיינטיפיק85178חומצה פורמית טהורה במיוחד המשמשת להפצת כל תמיסות ה-LC והדגימות בריכוז סופי של 0.1% (v/v)
עצור פרוטאז & קוקטייל מעכב פוספוטאז חד פעמי (פי 100)תרמו פישר סיינטיפיק78442תוספת במאגר המיצוי למניעת פירוק של חלבונים ופוספופרוטאינים בדגימה
מתנול, דרגת אופטימה LC/MSתרמו פישר סיינטיפיק047192.K2מתנול טהור במיוחד המשמש לכרומטוגרפיה נוזלית/ספקטרומטריית מסה
טיט חרסינה, 150 מ"לתרמו פישר סיינטיפיקFB961Cקיבולת של 150 מ"ל, המשמשת להומוגניזציה של רקמות חמוס קטנות יותר (כלומר, מוח)
טיט חרסינה, 275 מ"לתרמו פישר סיינטיפיקFB961Dקיבולת של 275 מ"ל, המשמשת להומוגניזציה של רקמות חמוס גדולות (כלומר, כבד)
טיט חרסינה, 50 מ"לתרמו פישר סיינטיפיקFB961אקיבולת 50 מ"ל, המשמשת להומוגניזציה של רקמות עכבר
פסטל פורצלן, 50 מ"לתרמו פישר סיינטיפיקFB961Kלשימוש עם טיט 50 מ"ל
עלי חרסינה, 150 מ"לתרמו פישר סיינטיפיקFB961Mלשימוש עם טיט 150 מ"ל
עלי חרסינה, 275 מ"לתרמו פישר סיינטיפיקFB961Nלשימוש עם טיט 275 מ"ל
Precellysברטין קורפ / טכנולוגיותhttps://www.bertin-technologies.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys-evolution-homogenizer/מכשיר המשמש להומוגניזציה של דגימות רקמה. נעשה שימוש בהגדרות הבאות: 4500 סל"ד, 2 x 30 שניות למחזור, הפסקה של 30 שניות. 
מגיב בדיקת חלבוןפירס / תרמו סיינטיפיק22662מגיב בדיקת חלבון בשימוש בשלבים 3.4 – 3.8
מגלה פרוטאוםתרמו פישר סיינטיפיקCSW0064764תוכנת ביואינפורמטיקה לניתוח נתוני פרוטאומיקה/פוספופרוטאומיקה
בקבוקוני הזרקת LC עם מכסה בורג MSCERT של SureSTART (0.02– קיבולת של 1.5 מ"ל)תרמו פישר סיינטיפיק6PMCK39TRאישור יישום בעל אישור גבוה, בקבוקוני זכוכית עם מכסה בורג (PTFE, מחיצות חריץ מראש) המשמשים להכיל דגימות להזרקה על מכשיר LC/MS     
מערכת אולטימטיבית 3000 UHPLC / Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS (LC/MS)תרמו פישר סיינטיפיקLC: הנחה / MS: FETD2-10002, על פי בקשה מיוחדתמכשיר כרומטוגרפיה נוזלית/ספקטרומטריית מסה (LC/MS) בעל ביצועים גבוהים במיוחד המשמש להפרדה ולאחר מכן זיהוי לפי משקל מולקולרי של הפפטידים בדגימות
נוקלאז אוניברסלי לליזה תאית, 100kU, 400 ומיקרו; Lפירס / תרמו סיינטיפיק88702נרכש נוקלאז אוניברסלי נוסף 
ואקופוגה פלוסאפנדורףhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Centrifugation/Concentrator/Vacufuge-plus-p-PF-25748ואקופוגה המשמשת לייבוש דגימות פפטידים לפני הרכבה מחדש. 
מים, בדרגת אופטימה LC/MSתרמו פישר סיינטיפיק047146.K2מים טהורים במיוחד המשמשים לכרומטוגרפיה נוזלית/ספקטרומטריית מסה

מקורות

  1. Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
  2. Souchelnytskyi, S. Bridging proteomics and systems biology: what are the roads to be traveled. Proteomics. 5 (16), 4123-4137 (2005).
  3. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
  4. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  5. Casado, P., et al. Integrative phosphoproteomics defines two biologically distinct groups of KMT2A rearranged acute myeloid leukaemia with different drug response phenotypes. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 80(2023).
  6. Fazakerley, D., et al. Phosphoproteomics reveals rewiring of the insulin signaling network and multi-nodal defects in insulin resistance. Nat Commun. 14 (1), 923(2023).
  7. Emdal, K. B., et al. Phosphoproteomics of primary AML patient samples reveals rationale for AKT combination therapy and p53 context to overcome selinexor resistance. Cell Rep. 40 (6), 111177(2022).
  8. Boutté, A. M., et al. Proteomic analysis and brain-specific systems biology in a rodent model of penetrating ballistic-like brain injury. Electrophoresis. 33 (24), 3693-3704 (2012).
  9. Peters, M. E., et al. Head injury serum markers for assessing response to trauma: Design of the HeadSMART study. Brain Inj. 31 (3), 370-378 (2017).
  10. Song, H., et al. Proteomic analysis and biochemical correlates of mitochondrial dysfunction after low-intensity primary blast exposure. J Neurotrauma. 36 (10), 1591-1605 (2019).
  11. Attilio, P. J., et al. The effects of blast exposure on protein deimination in the brain. Oxid Med Cell Longev. 2017, 8398072(2017).
  12. Zhao, Z., Zlokovic, B. V. Acetylated tau: A missing link between head injury and dementia. Med. 2 (6), 637-639 (2021).
  13. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. J Vis Exp. (168), e61941(2021).
  14. Blagoev, B., Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Temporal analysis of phosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics. Nat Biotechnol. 22 (9), 1139-1145 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים