כאן אנו מציגים פרוטוקול לבניית מערכת איבר-על-שבב (OOC) שנועדה לחקות כריתת ריאות. מערכת זו חוקרת את המתאם הפוטנציאלי בין פגיעה בגליקוקליקס לסיבוכים לאחר כריתת ריאות.
מאמר שיטה
מידול הגליקוקליקס האנדותל לאחר כריתת ריאות בשבב נוזלי תלת מימדי - גישה לייצור מערכת איבר-על-שבב מבוססת כלי דם
במאמר זה
סיכום
תקציר
גליקוקליקס אנדותל (GCX), שכבה עשירה בפחמימות המצפה את פני השטח הלומינליים של תאי אנדותל, ממלאת תפקיד מרכזי בוויסות התגובות התאיות לגירויים. הוא מורכב מחלבונים טרנסממברניים המשמשים כמתמרים מכניים לתגובות תאיות. בעוד שהוא שומר באופן טבעי על מבנהו ויציבותו בתנאים הומאוסטטיים, חשיפה למתח גזירה גבוה עלולה לגרום לנזק עם השלכות רבות. השפעות כלליות של מתח גזירה על תאי אנדותל נחקרו, אך ההיקף וההשפעה של מתח גזירה על מערכות כלי הדם, במיוחד לאחר כריתת ריאות, לא נחקרו היטב. כדי לחקור זאת, ננקטה גישה מקיפה, הכוללת יצירת מודל CAD של כלי דם ריאתיים לפני ואחרי כריתת ריאות. תוך שימוש בהדמיית נוזלים חישובית, אזורי מפתח של מתח ולחץ גזירה מוגברים זוהו ושוכפלו במערכת איבר על שבב (OOC). תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של ריאות אנושיות (HLMVECs) נזרעו על תבנית בצורת החלקים שנבחרו כדי לאפיין את ההשפעות של מתח גזירה מוגבר במבחנה. לאחר ניסויים, HLMVECs עברו צביעה חיסונית כדי להעריך באופן איכותי את בריאות GCX תחת מתחים רגילים ומוגברים הנגרמים על ידי כריתת ריאות. השילוב של מודלים חישוביים וניתוח ניסיוני משפר את ההבנה שלנו כיצד שינויים במתח הגזירה משפיעים על GCX, ומבהיר את השפעותיהם על תפקוד כלי הדם וסיבוכים לאחר הניתוח.
מבוא
כריתת ריאות היא התערבות כירורגית פולשנית ובעלת סיכון גבוה המבוצעת לחילוץ הריאה הימנית או השמאלית1. הליך זה משמש בדרך כלל כאופציה טיפולית למחלות קשות שונות כגון סרטן ריאות, שחפת ריאתית ופציעות ריאה טראומטיות2. בעוד שההליך מבטיח, הוא מהווה סיכונים משמעותיים, המודגשים על ידי שיעורים מוגברים של סיבוכים לאחר הניתוח החל מהפרעות קצב ועד בצקות ריאות1.
לכריתת ריאות יש השפעה עמוקה על הדינמיקה הקרדיווסקולרית על ידי הפניית כל תפוקת הלב של הלב לריאה הנותרת3. ידוע כי ניתוב מחדש זה של זרימת הדם מגביר את הלחץ ואת מתחי הגזירה בתוך כלי הדם הריאתיים הנותרים4. עם השינויים העצומים הללו בדפוסי זרימת הדם, הגליקוקליקס האנדותל (GCX) ממלא תפקיד מרכזי בחישת השינויים הללו בדפוסי זרימת הדם5.
ה-GCX היא שכבה דמוית ג'ל המווסתת את הפעילות הביוכימית בתגובה לשינויים בסביבתה 6,7. הוכח כי ביטויו עולה עם חשיפה ממושכת לזרימה אחידה ויורד עם חשיפה לזרימה מופרעת בהשוואה לתרבית סטטית 8,9. ה-GCX מציג עובי משתנה הנע בין 0.1-1 מיקרומטר על פני כל כלי הדם ומתפקד כשכבת מכני-טרנסדוקציה חיונית המצפה את תאי האנדותל של כלי הדם10. הרשת מורכבת משכבה צפופה של סוכרים, שומנים וחלבונים, כפי שמוצג באיור 1. סוכרים אלו נקשרים ליצירת גליקנים, שיכולים להתקיים בחופשיות בזרם הדם או מחוברים לחלבונים או לשומנים, וכתוצאה מכך נוצרים פרוטאוגליקנים, גליקופרוטאינים או גליקוליפידים 7,11. פרוטאוגליקנים מורכבים משרשראות גליקוזאמינוגליקן (GAG), הנקשרות לקרום התא באמצעות חלבוני פלזמה או קולטנים. GAGs אלה כוללים הפראן סולפט (HS), חומצה היאלורונית (HA), כונדרואיטין סולפט (CS), דרמטן סולפט וקראטן סולפט12. הפראן סולפט הוא ה-GAG השולט, ומהווה למעלה מ-50% מכלל ה-GAGs המצויים ב-GCX. שרשראות צד אלו יכולות להתחבר לחלבוני ליבה משובצים, הכוללים גליפיקנים (מעוגנים על ידי גליקוזילפוספטידילינוזיטול) וסינדקנים (עם תחום משתרע על פני הממברנה), יחד עם CD44 (קולטן הידבקות פני השטח). הקומפלקסים שתוארו לעיל ממלאים תפקיד מכריע בוויסות גורמי גדילה, תגובות אנטי דלקתיות, הקלה על הרחבת כלי הדם ושליטה בחדירות כלי הדם13.
איור 1: דיאגרמת רכיבי GCX. סכמטי המייצג את מרכיבי הגליקוקליקס האנדותל. סכימה זו מציגה את הגליקוקליקס האפיקלי, שנמצא על לומן הכלי, ומראה את הפרוטאוגליקנים והגליקופרוטאינים הקשורים לממברנה. נוצר עם BioRender.com אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
למרות שהקשר המדויק בין כריתת ריאות לנזק GCX אינו נחקר היטב, קיים מתאם סביר בין דפוסי זרימת הדם המשתנים הנגרמים על ידי כריתת ריאות לבין שלמות ה-GCX. ידוע כי הפרעה בזרימת הדם בכלי הדם גורמת נזק ל-GCX6. שיערנו כי הפרעה מוגברת בזרימה ושינויים במתח הגזירה בכלי הדם הנותרים לאחר כריתת ריאות עלולים לגרום נזק ל-GCX לאורך זמן. הידרדרות מואצת זו עלולה לזרז סיבוכים ותחלואה לאחר הניתוח, ובכך להגדיל את הסיכונים הגלומים בבריאותו הכללית של המטופל13.
פרוטוקול זה נועד לדגמן את כלי הדם הריאתיים לאחר כריתת ריאות, בהתאם להליך הכללי המתואר באיור 2. סימולציות נוזלים נערכו על מודל תכנון בעזרת מחשב המשחזר כלי דם ריאתיים אנושיים עם ובלי כריתת ריאות. המודלים של כריתת ריאות נוצרו על ידי תכנון כלי דם ריאתיים תלת מימדיים בתוכנת מידול תלת מימדית, בהתבסס על ממדים שנגזרו מסריקות CT ונתוני ספרות, ולאחר מכן פישוטם עוד יותר עבור סימולציות זרימה בתוכנת דינמיקת נוזלים חישובית (CFD). הסימולציות זיהו תחומי עניין ספציפיים, שנבחרו לפי אזורים שבהם מתח הגזירה הוגבר במודלים של כריתת ריאות בהשוואה לביקורת. תחומי עניין אלה נבחרו לשכפול לבניית מודל במבחנה . המודל במבחנה השתמש בעיצוב תא נוזלי כדי לדמות חלקים מרובים של כלי דם עם גיאומטריה רגילה וגיאומטריית כריתת ריאות כדי לדמות את ההבדל בתנאי הזרימה.
תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של ריאות אנושיות (HLMVECs) תורבבו על מצעי פולידימתילסילוקסן מצופים פיברונקטין (PDMS), שעוצבו כדי לחקות אזור התפצלות נבחר. אמצעי תרבית תאי אנדותל מיקרו-וסקולרי הוחדרו דרך המערכת באמצעות משאבה פריסטלטית. לבסוף, התאים וה-GCX תוקנו, הוכתמו במערכת החיסון עם נוגדן מכתים GCX, והודגמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להעריך את מצבם לאחר חשיפה לזרימת נוזלים. ניתן למצוא ציר זמן כללי של הפרוטוקול בטבלה 1.
איור 2: רצף פיתוח OOC. רצף של פיתוח מערכת OOC חדשה לחקר ההשפעות של כריתת ריאות ריאות (1) סריקת CT שנוצרה מכלי דם ריאתיים אנושיים. (2) גיאומטריית סריקת CT המשמשת לזיהוי אזורי עניין עבור מודל CAD תלת מימדי. (3) סימולציות זרימת נוזלים לקביעת גיאומטריות מעניינות למודל במבחנה . (4) תבנית PDMS מעוצבת המכילה תחומי עניין מתוצאות סימולציה (5) עובש מוכנס למארז אקרילי לתיקון תבנית לזילוף (6) הגדרת תא זרימה הושלמה (7) הגדרת תא זרימה מלאה הועברה לחממה (8) תמונות Brightfield ופלורסנט שצולמו לאחר חשיפה למתח גזירה. נוצר עם BioRender.com אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: ציר זמן כללי לפרוטוקול. רצף כללי של ביצוע שלבים בתוך הפרוטוקול עם משך ממוצע (h) של כל שלב. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה השתמש בנתוני הדמיה של טומוגרפיה ממוחשבת (CT) מספרות קודמת14 שנאספו בהתאם לסטנדרטים האתיים המוסדיים והפדרליים. כל נתוני ההדמיה שהוזכרו קיבלו הסכמה מדעת מהמשתתפים, לאחר אישור מועצת הביקורת המוסדית (IRB) כדי להבטיח הגנה על זכויות המשתתפים ופרטיותם.
1. מידול כלי דם ריאתיים בתוכנת CAD
- לחקור גיאומטריות פיזיולוגיות של כלי הדם העיקריים שיש לדגמן.
- השתמש בתמונות CT של המטופל של כלי הדם שיש לעצב כדי לבחור גיאומטריות ספציפיות לשכפול, המוצגות באיור 2.
הערה: עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש בסריקות CT ריאות במצב קליני מהספרות הקודמת14. פרוטוקול זה מאפשר גם שימוש בכל נתוני סריקת CT ליצירת מודלים במבחנה .- פתחו מציג DICOM וייבאו את תמונות ה-CT. נווט בין הפרוסות כדי לזהות את כלי השיט המעניינים. שמור את התמונות הרלוונטיות להמשך ניתוח.
הערה: הכלי ששוכפל לפרוטוקול זה היה כלי דם ריאתיים, שכן היישום של פרוטוקול זה הוא לדגמן את הגליקוקליקס האנדותל במצבים בריאים ולאחר כריתת ריאות. ניתן להשתמש במיקומים אחרים ליישומים שונים.
- פתחו מציג DICOM וייבאו את תמונות ה-CT. נווט בין הפרוסות כדי לזהות את כלי השיט המעניינים. שמור את התמונות הרלוונטיות להמשך ניתוח.
- באמצעות ImageJ FIJI v1.54f15, מדוד את קוטר הכלי מתמונות CT או ערכי ספרות.
- פתוח ImageJ FIJI וייבא את תמונות ה-CT השמורות: בחר File > Open.
- בחר את הכלי קו מסרגל הכלים כדי לצייר קו המשתרע לאורך סרגל קנה המידה בתמונת ה-CT.
- לאחר מכן בחר נתח > הגדר קנה מידה. הזן את המרחק הידוע (לדוגמה, אם סרגל קנה המידה בתמונה הוא 10 מ"מ, הזן 10 כמרחק הידוע). הזן את יחידת האורך (למשל, מ"מ). לחץ על OK.
- השתמשו בכלי הקו למדידת קטרים. לשם כך, בחר את הכלי Line מסרגל הכלים וצייר קו המשתרע על קוטר הכלי. לאחר מכן בחר נתח > מדידה כדי לקבל את ערך הקוטר.
- חזור על שלבים 1.3 ו-1.4 עבור כל כלי השיט המעניינים ורשום את המדידות.
- הידור מדידות כלי לסוגי מקטעים כדי להקל על הדוגמנות.
- צור גיליון אלקטרוני כדי לסווג את מידות הכלי ולתייג כל שורה עם שם הכלי, המדידה וסוג הקטע (למשל, עורק, וריד).
- צור טבלת התייחסות לאורכים וקטרים של מקטעים וסקולריים על סמך מדידות ספרות ורדיוגרפיה.
- צור מודל תלת מימד באמצעות תוכנת מידול תלת מימד כדי לשכפל את הגיאומטריה והממדים של תמונות ה-CT.
- פתח את התוכנה וצור קובץ חלק חדש: בחר File > New > Part ובחר Sketch > Create Sketch וצייר את הפרופיל באמצעות הממדים מ-ImageJ.
- השתמש בסריקות פני השטח ובעלייה לגיאומטריה תלת-ממדית: עבור סריקות, בחר תכונות > Swept Boss/Base. עבור לופטים, בחר תכונות > בוס/בסיס מוגבה.
- מקד את המודל כך שיתאים למידות המדויקות.
- זהה וריאציות מודל שיש לפתח, כגון מודל בקרה ומודל כריתת ריאות.
- תאר את התנאים השונים (למשל, כריתת ריאות רגילה לעומת כריתת ריאות) ורשום את השינויים המבניים הדרושים לכל וריאציה.
- שכפל את המודל המקורי לשינוי כדי ליצור את המודלים הניסיוניים בהתאם לפרמטרים שלך (כלומר, כריתת ריאות ימנית ושמאלית).
- שמור את הדגם המקורי ולאחר מכן בחר קובץ > שמור כעותק כדי ליצור עותקים עבור כל תנאי ניסוי.
- שנה כל עותק בהתאם לפרמטרים שהוגדרו (למשל, כריתת ריאות ימנית ושמאלית).
- המר את המודל מקובץ חלק לקובץ Parasolid עבור סימולציות דינמיקת נוזלים חישובית (CFD).
- בחר קובץ > שמירה בשם. בחר Parasolid (*.x_t) מהתפריט הנפתח של סוג הקובץ, ולאחר מכן שמור את הקובץ בספרייה הרצויה.
2. סימולציה של זרימת נוזלים
הערה: שלב זה מועיל באיתור אזורים של מתח גזירה שונה לאחר כריתת ריאות כדי לבחור את גיאומטריית כלי הדם לשכפול עבור מערכת המבחנה . בנוסף, רישיון התוכנה חייב לתמוך במודול הייבוא.
- הקים מחקר זרימה למינרית חדש במצב יציב.
- בחר אשף מודלים > תלת מימד (ממד חלל) > זרימת נוזל > זרימה חד פאזית > זרימה למינרית (SPF) > בחר הוסף כדי להוסיף ממשק פיזיקה של זרימה למינרית > בחר מחקר > בחר נייח תחת מחקר כללי > בחר סיום.
- הוסף גיאומטריה ממודל CAD.
- ייבא קובץ Parasolid. בחר Cap Faces, ובחלון Graphics, בחר את היקף הדופן הפנימית של הכלי בכל כניסה ויציאה פתוחה. אלה יהיו הקצוות התוחמים של פני הכובע. בחר איחוד טפסים ובנה הכל.
- בחר הסר פרטים וודא שכל האפשרויות נבחרו תחת פרטים להסרה, ולאחר מכן בחר בנה הכל כדי להסיר גיאומטריה מיותרת.
- יצירת רשת 1 (דופן כלי מרושת + תחום נוזל מרושת).
- הגדר את הגודל למוגדר מראש: עדין במיוחד, כיול לדינמיקת זורמים.
- הגדר את גודל 1 למוגדר מראש: עדין במיוחד, כיול לדינמיקת זורמים, לבחירת ישות גיאומטרית, ציין גבול וידני. בחלון הגרפיקה, בחר את כל הפנים החיצוניות הגלויות של תחום דופן כלי השיט, כולל הפנים דמויות הטבעת סביב פני המכסה. אל תבחר פני כובע בכניסה וביציאות.
הערה: בחר את פני הכובע בסוף החלק שהוסר מימין ומשמאל למודלים של כריתת ריאות מכיוון שאלו נחשבים לגבולות גיאומטריים לאחר כריתת ריאות. - תחת Corner Refinement, בחר Domain and Manual. בחלון גרפיקה, בחר [דומיין] 1 (דופן כלי שיט) ו -[דומיין] 2 (נוזל).
- תחת בחירת גבולות, ודא שהגבולות זהים לאלה שצוינו ב"בחירת ישות גיאומטרית" מתוך "גודל 1".
- תחת 1 טטרהדרלי חופשי, בחר נותר עבור רמת ישות גיאומטרית תחת בחירת תחום.
- תחת שכבות גבול 1 ובחירת ישות גיאומטרית, ציין תחום ובחר ידני בחלון גרפיקה [דומיין] 1 ו -[דומיין] 2. מאפייני שכבת הגבול יהיו אותה בחירה שצוינה בגודל 1.
- בנה את רשת הרשת על-ידי בחירה באפשרות Build All תחת Mesh 1.
- יצירת Mesh 2 (תחום נוזל רשת בלבד).
- לחץ לחיצה ימנית על Mesh 1, בחר Import כדי ליצור "Mesh 2" ומחק את Import 2.
- תחת ייבוא 1, בחר רצף רשת כדי לבחור באופן אוטומטי את Mesh 1. ודא שרשת המקור של Build באופן אוטומטי, ייבוא רכיבי תחום וייבוא דומיינים לא מרושמים מסומנים ולאחר מכן בחר ייבוא. כל ההגדרות המוגדרות ב-Mesh 1 יועברו ל-Mesh 2.
- לחץ לחיצה ימנית על Mesh 2 ובחר מחק ישויות. עבור מחיקת ישויות 1, תחת בחירת ישות גיאומטרית בחר תחום, בחר ידני, בחלון גרפיקה בחר [תחום] 1 (דופן כלי שיט), ולאחר מכן בחר בנה הכל כדי להשאיר רק את גיאומטריית הנוזל מכיוון שפני השטח של רשת תחום הנוזל יהיו בממשק בין זרימת הנוזל לדופן הפנימית של הכלים.
- הוסף חומר זרימה: צור חומר חדש תוך שימוש בתכונות של דם מהספרות. לחץ לחיצה ימנית על Materials ובחר Blank Material. בחר תחום בבחירת רמת הישות הגיאומטרית, בחר כל התחומים. בחר לא מוצק עבור סוג חומר, הוסף את תכונות החומר של הדם, כולל צמיגות וצפיפות.
- הגדר את תנאי הגבול והפרמטרים של מחקר הזרימה הלמינארית.
- בחר זרימה למינרית (spf), תחת בחירת תחום, בחר כל התחומים. רק [דומיין] 1 יופיע ברשימה. תחום 1 במקרה זה הוא הגיאומטריה הנוזלית, לא דופן הכלי. מאפייני נוזל 1 מתמלאים אוטומטית מהחומר המוגדר בשלב 5.
- הגדר ערכים התחלתיים 1 לחץ ללחץ דם פיזיולוגי. הגדר את מצב הגבול עבור קיר 1 למצב ללא החלקה.
- בחר Inlet 1 בחלון Graphics והגדר את תנאי הגבול ל-Fully developed flow. ודא שתנאי היישום על כל בחירה נפרדת נבדק.
- תחת זרימה מפותחת במלואה, בחר קצב זרימה והזן את המהירות.
- עבור שקע 1, בחר את כל השקעים בחלון הגרפיקה, וודא שתנאי הגבול מוגדר ללחץ.
- תחת תנאי לחץ, בחר סה"כ והזן את הלחץ. בחרו 'ממוצע ' ו'העלם זרימה חוזרת'.
- הגדר והפעל את המחקר.
- עבור שלב 1: נייח תחת מחקר, ודא שהקטע פיזיקה ומשתנים תואם את המחקר המיועד, ורכיב בחירת רשת 1 מוגדר כ-Mesh 2. בחר חשב.
- נתח את תוצאות מתח הגזירה.
- לחץ לחיצה ימנית על לחץ (spf) ובחר שכפל. שנה את השם ל-Shear Stress.
- תחת מתח גזירה, בחר משטח ושנה את ערכת הנתונים למחקר 1/פתרון 1 (sol1).
- תחת ביטוי, הקלד spf.sr*spf.mu set units ל- Pa.
הערה: זה מייצג "קצב גזירה של זרימה חד פאזית * צמיגות זרימה חד פאזית". - לאחר מכן, בחר עלילה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על שקיפות 1 ובחר השבת.
- לחץ לחיצה ימנית על מתח גזירה ובחר עוצמת קול כדי לשנות את מערך הנתונים למחקר 1/פתרון 1 (sol1).
- תחת ביטוי, הקלד spf.sr*spf.mu והגדר יחידות ל- Pa.
- בחר עלילה, לחץ לחיצה ימנית על פני השטח ובחר השבת כדי לנתח חזותית את "כרך 1" כדי לקבוע אזורי עניין של כלי שיט למחקר במודל OOC
3. הכנת תבניות PDMS
- באמצעות תוצאות סימולציה של נוזלים, בחר גיאומטריות לבקרה וכריתת ריאות על ידי בחירת אזורים המציגים הבדלים משמעותיים במתח הגזירה בין מודלים של בקרה וכריתת ריאות ושכפל אותם כתבניות שליליות ב-CAD. הממדים של מודלים של CAD של כלי דם בקרה וכריתת ריאות מוצגים באיורים 3 ובאיור 4.
- בנוסף, תכנן תקעים לכניסה ויציאה של התבנית למניעת דליפה במהלך זריעת התאים.
- בעזרת מדפסת תלת מימד מדפיסים את התבניות והתקעים באמצעות נימה PLA.
- השג את תבניות החומצה הפולילקטית (PLA) שהודפסו בתלת מימד (ביקורת + כריתת ריאות) (איור 5A).
- שקלו 10 חלקים בסיס אלסטומר סיליקון וחלק אחד חומר ריפוי אלסטומר סיליקון כדי ליצור בסך הכל 30 מ"ל של תערובת (יחס מסה/מסה של 10:1) למילוי התבניות לעובי של 3 מ"מ (איור 5B).
הערה: אין לערבב תמיסות מלאי במהלך תהליך השקילה. השתמש בחומרי שקילה נפרדים לכל מגיב. - יוצקים יחד את בסיס האלסטומר וחומר הריפוי ומערבבים היטב
הערה: ניתן לעשות זאת בסירת שקילה. - יוצקים את התמיסה המעורבת היטב לתבניות (כ -15 מ"ל לחצי תבנית) (איור 5C).
- הסירו את ה-PDMS על ידי הכנסתו לתא ואקום למשך 30-60 דקות, או עד שלא נשארות בועות (איור 5D).
- הסר PDMS מתא הוואקום ורפא בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות.
הערה: תנור לא שימש לריפוי בשל הקיבולת התרמית של תבניות ה- PLA. - חלץ את ה-PDMS מתבנית ה-PLA.
- שטפו את תבנית ה-PLA בנדיבות עם DI-water כדי להבטיח שלא יישארו זיהומים על פני השטח שלה כדי שניתן יהיה להשתמש בה שוב.
איור 3: שרטוט CAD תלת-ממדי של כלי דם בקרה. מידות, במ"מ, של מודל כלי הדם הבקרה בתצוגה עליונה ובמבט מהצד. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ציור CAD תלת מימדי של כלי דם לכריתת ריאות. מידות, במ"מ, של מודל כלי הדם לכריתת ריאות בתצוגה עליונה ובמבט מהצד. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: יצירת תבניות PDMS. יצירת תבניות PDMS. (A) תבניות PLA מודפסות בתלת-ממד לניסויי בקרה (כתום) וכריתת ריאות (ירוק). (B) משקל שקילה עם חומרים לייצור PDMS. (ג) יציקת תערובת ה-PDMS (בסיס 10:1 + חומר ריפוי) לתוך התבניות המודפסות בתלת מימד. (D) הסרת גז PDMS בתא ואקום. נוצר עם BioRender.com אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
4. תרבית תאים וזריעה
- השתמש בטכניקה אספטית נכונה בהתאם לפרוטוקולי המעבדה המקומיים.
- רססו עם 70% אתנול והכניסו את כל החומרים והרכיבים הדרושים לארון הבטיחות הביולוגית (BSC) (איור 6A) כולל חלקי PDMS וארבע חתיכות של סרט דו-צדדי.
- הניחו שתי חתיכות של הסרט הדו-צדדי בכל צלחת תרבית תאים (איור 6B).
- הניחו כל מחצית כלי דם PDMS בצלחת תרבית תאים משלו על גבי הסרט הדו-צדדי (איור 6C).
- יש לעקר עוד יותר את כל הרכיבים על ידי חשיפה לאור UV למשך 20 דקות ב-BSC.
- הפשירו טריפסין, אמצעי תרבית HLMVEC ו-20 מיקרוגרם/מ"ל פיברונקטין ב-37 מעלות צלזיוס במידת הצורך.
- יש להניח מספר טיפות של 30 מיקרוליטר של 20 מיקרוגרם/מ"ל פיברונקטין לאורך כלי הדם של PDMS באמצעות מיקרופיפטה. הטיית PDMS במידת הצורך, השתמש בקצה פיפטה כדי לצפות את ה-PDMS באופן שווה (איור 7A).
- דגרו את חלקי ה-PDMS למשך 30 דקות ב-BSC.
- לאחר הדגירה, שאפו תמיסת פיברונקטין ואפשרו לחתיכות PDMS להתייבש ב-BSC (איור 7B).
- הביאו בקבוק קונפלואנט של תאי HLMVEC מהחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) לתוך ה-BSC.
- שאפו את המדיה התרבותית של HLMVEC מבקבוק התרבות. יש לשטוף לזמן קצר עם טריפסין או PBS סטרילי.
- שאפו את הכביסה והוסיפו 3 מ"ל טריפסין לבקבוק. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 5 דקות. התבונן בתאים במיקרוסקופ כדי לאשר שכל התאים מנותקים מהבקבוק.
- הוסף 9 מ"ל של מדיום תרבית שלם HLMVEC כדי לעצור את פעולת הטריפסין.
- העבירו את תרחיף התאים לצינור חרוטי של 50 מ"ל, ולאחר מכן שטפו את הבקבוק עם 10 מ"ל של מדיום תרבית HLMVEC כדי לאסוף את התאים שנותרו.
- מעבירים לצינור של 50 מ"ל. תאי צנטריפוגה ב 220 x גרם למשך 5 דקות.
- בסיום, אשר חזותית את גלולת התא בתחתית הצינור. רססו את הצינור ב-70% אתנול והכניסו אותו לארון הבטיחות הביולוגית. שאפו את הסופרנטנט והשאירו את הכדור.
- השעו בעדינות תאים ב-1 מ"ל של מדיום תרבית HLMVEC טרי וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. חשב את מספר התא הכולל באמצעות המשוואות שלהלן, כאשר A-H הוא מספר התאים שנספרו לכל ריבוע המוציטומטר. שמור על תאים על קרח.
- הביאו את ריכוז התאים ל-2 x 106 תאים/מ"ל עם מדיום תרבית HLMVEC.
- הנח את התקעים המודפסים בתלת מימד בקצות כל מחצית כלי דם כדי למנוע דליפת מתלה תאים מתבנית ה-PDMS, כפי שמוצג באיור 5 (4 תקעים בסך הכל, 2 לכל חתיכת PDMS) (איור 7C).
- זרע 300 מיקרוליטר של תרחיף תאי HLMVEC (600 k תאים) באמצעות מיקרופיפטה לתוך כל חתיכת PDMS (איור 7D).
- העבירו בעדינות את חלקי ה-PDMS המכילים תאי HLMVEC לאינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) למשך 1-2 שעות לחיבור (איור 7E).
- בדוק במיקרוסקופ כדי לאשר חזותית חיבור מוצלח של HLMVEC למצעי ה-PDMS.
- החזר את חצאי כלי הדם של PDMS ל-BSC.
- הסר את ארבעת התקעים, הוסף מספיק מדיום תרבית HLMVEC כדי להטביע את חצאי כלי הדם של PDMS, והחזיר את לוחות התרבות המכילים את כלי הדם של PDMS לאינקובטור (איור 7F).
- 6-10 שעות לאחר הזריעה, פיפטה ידנית את מצע תרבית ה-HLMVEC המקיף את ה-PDMS לכלי הדם כדי לרענן את המדיה הקרובה ביותר לתאים.
איור 6: הצמדת תבניות PDMS ללוחות. שלבים בסיסיים בהצמדת כלי הדם PDMS ללוחות תרבית תאים. (A) חומרים הנדרשים להצבת חצאי כלי דם PDMS בלוחות תרבית. (B) שתי חתיכות של סרט דבק דו-צדדי מונחות באלכסון בכל צלחת תרבית סטרילית. (C) חצאי כלי דם PDMS המותקנים על גבי הדבק הדו-צדדי. נוצר עם BioRender.com אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: זריעת HLMVECs לתוך תבניות PDMS. שלבים לזריעת HLMVECs בכלי דם PDMS. (A) מלאו את כלי הדם 150-300 מיקרוליטר ב-20 מיקרוגרם/מ"ל פיברונקטין. (B) שאפו עודפי פיברונקטין באמצעות טכניקת ברז ההטיה. (C) חבר את הקצוות של מחצית כלי הדם PDMS עם תקעים מודפסים בתלת מימד. (D) זרע 500-600K תאים במדיה של 300 מיקרוליטר לכל מחצית כלי דם. (E) הניחו חצאי PDMS באינקובטור למשך 1-2 שעות כדי להקל על חיבור התאים. (F) כסה את חצאי ה-PDMS במדיה ובתקעים להסרת תקעים. נוצר עם BioRender.com אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
5. הרכבה והפעלה של מערכת הזרימה
- בצע את הליך הזרימה לאחר שהתאים בחצאי כלי הדם של PDMS מתכנסים במלואם, כפי שנקבע על ידי בדיקה ויזואלית במיקרוסקופ.
- כיול המשאבה הפריסטלטית על פי פרוטוקול היצרן לפני ביצוע ניסוי.
- חיטוי כל הרכיבים הניתנים לחיטוי, כולל צינורות הזרימה, מחברי הצינורות, מאגר המזרק ופקק הגומי.
- טבלו את הבלוקים האקריליים, הברגים, התקעים, חלקי הצינורות Masterflex L/S 16 באורך 1 אינץ' ומכסה צלחת צלחת פטרי 15 מ"מ ב-70% אתנול למשך 15 דקות וטיפול UV למשך 20 דקות ב-BSC, תוך התהפכות באמצע הדרך.
- לאחר עיקור כל הציוד והחומרים האחרים, הכניסו את חצאי כלי הדם של PDMS לתוך ה-BSC.
- שאפו את אמצעי ה-HLMVEC מצלחת הפטרי המכילה את חצאי כלי הדם (איור 8A,B).
- הנח את חצאי ה-PDMS בשני גושי הפוליקרבונט, וודא שהם מיושרים (איור 8C).
- מרחו איטום סיליקון על קצות כלי הדם, היכן שהצינור יחובר לחצאי ה-PDMS, והניחו את הצינור באורך סנטימטר בשני הקצוות של כלי הדם התחתונים (איור 8D).
- הפוך את הבלוק האקרילי העליון (המכיל את המחצית העליונה של כלי הדם PDMS) על הבלוק האקרילי התחתון (המכיל את החצי התחתון של כלי הדם PDMS) (איור 8E).
- הברג את הבלוקים האקריליים יחד עם בלוק ההברגה בתחתית וחבר את הקצוות החופשיים של הצינורות באורך אינץ' עם התקעים המודפסים בתלת מימד (איור 8F).
- הסר תקע אחד והזריק בעדינות 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית HLMVEC לתוך כלי הדם, הטה אותו כדי למנוע בועות אוויר, ולאחר מכן החלף את התקע.
- הנח את כל השבב המורכב בחממה כדי לאפשר לסיליקון להתרפא למשך 1-2 שעות.
- הכניסו את השבב המורכב וכל שאר החומרים הסטריליים לתוך ה-BSC וחברו הכל כדי להגדיר את מערכת הזרימה לפי איור 9. ודא שהצינור העובר דרך המשאבה הפריסטלטית לכניסת כלי הדם מחובר לתחתית מאגר המזרק. זה יאפשר לכוח הכבידה להזין את הצינורות ולהפחית את בועות האוויר במערכת.
- הפעילו בעדינות את מערכת הזרימה עם מדיית HLMVEC. בעזרת פיפטה סרולוגית של 50 מ"ל, הזריקו 30 מ"ל של מדיה לחלק העליון של מאגר המזרק (איור 10B). הפעל את המשאבה הפריסטלטית בקצב זרימה נמוך כדי למלא את הצינור. המשך להוסיף מדיה למאגר עד שהמערכת תהיה מוכנה במלואה וכל הבועות יוסרו.
הערה: בועות אוויר עלולות לגזור תאים במהלך ניסוי הזרימה. - חבר את הצינור לכניסת המאגר (מיציאת תבנית כלי הדם) באמצעות אביזר המחובר לפקק גומי הממוקם בחלק העליון של המאגר (איור 10C).
- נתק את מערכת הזרימה מהמשאבה הפריסטלטית והנח אותה על תבנית המתכת. העבר בעדינות את כל ההתקנה מה-BSC לחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2). הזינו את הצינור למשאבה הפריסטלטית דרך החלק האחורי של החממה.
- חבר מחדש את המשאבה הפריסטלטית והגדר לקצב הזרימה הרצוי כדי לחקות את קצב זרימת הדם דרך מודל כלי הדם.
- הפעל את המשאבה וודא שאין נזילות. תן למערכת לפעול במשך 24 שעות או למשך הזמן הרצוי. בדוק אם יש נזילות מעת לעת.
איור 8: בניית שבב הזרימה. בניית שבב הזרימה. (A) שאיבה של מדיה מלוח תרבית התאים. (B) PDMS יורד בחצי לאחר שאיפת התקשורת. (ג) הסר חצאי PDMS מהצלחת עם חומרים אחרים הדרושים לבניית השבב (תקע, מסנן מזרק, חלקי צינורות בגודל 1/2 אינץ', איטום סיליקון, ברגים פי 10 ובלוקים אקריליים). (ד) הנח את חצאי ה-PDMS בבלוקים האקריליים ומרח איטום סיליקון על המקומות המסומנים באדום. (ה) הנח את הצינור בחיתוכים המתאימים. (F) חבר את חצאי תא הזרימה וחבר את התקע ומסנן המזרק. נוצר עם BioRender.com אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: הגדרת מערכת זרימה. הגדרת מערכת הזרימה. מערכת הזרימה השלמה בנויה באמצעות צינורות, מחברי צינורות, משאבה פריסטלטית, מאגר מזרק, מעמד תמיכה ושבב הזרימה. נוצר עם BioRender.com אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: תחול מערכת זרימה. תחול מערכת הזרימה במדיה. (א) הגדרה פשוטה של מערכת הזרימה ללא מדיה. (ב) פקק הגומי מוסר ממאגר המזרק, והמדיה מתווספת ברציפות עד למילוי הצינור ויש 20-30 מ"ל של מדיה עודפת במאגר. (ג) מערכת זרימה מוכנה עם מדיה HLMVEC. נוצר עם BioRender.com אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
6. תיקון ומכתים
- שטפו כל חצי כלי דם PDMS ב-PBS למשך 5 דקות. הוסף מספיק כדי להטביע את כל קטע כלי הדם.
- שאפו את ה-PBS מכלי הדם על ידי הטיית הצלחת ואפשרו ל-PBS לברוח, ואז שאפו בוואקום את הנגר.
- הוסף 600 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS לכל חצי כלי דם ודגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות.
- שאפו את תמיסת ה-PFA למיכל פסולת מתאים בשיטה בשלב 2.
- שטפו תאים קבועים 3x ב-PBS למשך 5 דקות כל אחד באמצעות ההליך בשלב 2.
הערה: השלך כל אחת מהשטיפות הללו למיכל פסולת מתאים לפורמלדהיד. - חבר את קצות חצאי כלי הדם של PDMS עם התקעים הנקיים המודפסים בתלת מימד.
- הכן אלבומין סרום בקר 3% (BSA) ב-PBS לחסימה.
- מלאו את חצאי כלי הדם ב-600 מיקרוליטר של תמיסת חסימה ודגרו למשך 30 דקות ב-RT.
- הסר תקעים ופתרון חסימת שאיפה.
- הכן דילול של 1:200 של לקטין אגלוטינין נבט חיטה (WGA) עם ביוטין מצומד (נוגדן ראשוני) בתמיסת BSA 3% כדי להכתים GCX9.
- החזירו פקקים כדי לסתום את קצות כלי הדם והוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל מחצית כלי הדם.
- דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך שעה.
- שאפו את הנוגדן הראשוני בעדינות בהתאם לטכניקה ששימשה בעבר.
- יש לשטוף 3 פעמים עם PBS למשך 5 דקות כל אחת.
- הכן דילול של 1:500 של מצומד סטרפטווידין WGA (נוגדן משני) בתמיסת BSA 3%.
- החזר פקקים כדי לסתום את קצות כלי הדם ולהוסיף 500 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית לכל מחצית כלי דם.
- חזור על שלבים 6.12-6.14.
- הוסף מדיום הרכבה DAPI למשטח כלי הדם על ידי חלוקת טיפות של 30 מיקרוליטר במרווחים כדי למלא לחלוטין את כלי הדם.
- הנח כיסויי זכוכית על ה-PDMS כדי לכסות את תעלות כלי הדם.
- אטום את קצוות הכיסוי בעזרת לק שקוף.
- מכסים את הצלחות בנייר כסף ושומרים בחום של 4 מעלות צלזיוס עד להדמיה.
7. הדמיה
- הפעל את המיקרוסקופ ופתח את אפליקציית הצפייה במחשב המחובר.
- פתחו את המיקרוסקופ והרימו את האור. חבר את הפלטפורמה המתאימה כך שתתאים לדוגמאות (מחזיק צלחת פטרי רב-תכליתי).
- הניחו דגימה על מחזיק הכלים בתוך המיקרוסקופ כשאזור העניין מרוכז מעל המטרה.
- הנמיכו את האור וסגרו את מכסה המיקרוסקופ.
- בתוכנת המיקרוסקופ, בחר באפשרות לכידת תמונת סטילס .
- בחר את סוג הדגימה, השתמש רב תכליתי.
- בחר את המטרה המתאימה בקטע העדשה להדמיה הטובה ביותר.
- בתוכנת המיקרוסקופ, התאם את מיקום המטרה כך שיתאים לאזור עניין (ROI).
- בחר פוקוס אוטומטי, והתאים אמורים להיכנס למיקוד גס.
- כוונן ידנית את המיקוד כדי להבהיר את התמונה במלואה.
- התאם את הבהירות והחשיפה כדי להמחיש את התאים בצורה ברורה יותר.
- הפעל ריבוי צבעים וצבע בתוכנה.
- בהגדרות CH, הפעל את CH1 Floor DAPI ו-CH2 Floor GFP.
- התאימו את הבהירות של כל אחד מהערוצים בנפרד כדי להציג את התמונות בצורה ברורה.
- בחר Z-Stack בתוכנת המיקרוסקופ.
- התאם את המיקוד למישור הגבוה ביותר לתמונה ובחר קבע לקביעת הגבול העליון
- התאם את המיקוד למישור הנמוך ביותר בתמונה ובחר קבע לקביעת הגבול התחתון
- בחרו עובי פרוסה כרצונכם ולחצו על Start Capture כדי לצלם את התמונה.
הערה: תמונות אלה יופקו גם לתוכנת ניתוח מיקרוסקופ לשינוי נוסף.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התוצאות ממחקר המצב היציב של זרימה למינרית של סימולציה נוזלית הראו עלייה במתח הגזירה בהתפצלויות מסוימות במודלים של כריתת ריאות בהשוואה למודל הבקרה, המוצג באיור 11. בשלב 2.8 של הפרוטוקול, האזורים האדומים מציינים אזורים של מתח גזירה גבוה, בעוד שהאזורים הכחולים מראים אזורים של מתח גזירה נמוך.
איור 11: ת...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מודלים וסקולריים הם תחום חדש וחשוב לחקירה. יצירה מוצלחת של מודל כלי דם מדויק טומנת בחובה הבטחה גדולה לקידום תחום הנדסת הרקמות ופיתוח תרופות. מאמר זה מתאר שיטה חדשה ליצירת מערכת כלי דם OOC שניתן להשתמש בה כדי לחקות כריתת ריאות או כל מערכת כלי דם או גיאומטריה אחרת כדי לחקור קשר פוטנציאלי בין ליקוי GCX לסיבוכים לאחר כריתת ריאות. בקנה מידה רחב יותר, מתודולוגיה זו יכולה להיות ישימה גם לחיקוי מערכות כלי דם אחרות על ידי התאמת הגיאומטריה או מצבי מחלה אחרים, כגון טרשת עורקים או מפרצת.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
תודות
המחברים מבקשים להביע את תודתנו העמוקה למחלקה להנדסה ביו-רפואית של המכון הפוליטכני וורצ'סטר על תמיכתם והדרכתם. ברצוננו להודות במיוחד למייגן אוולט, ג'ון מרטל וסודיש ונגאט על המאמצים המשותפים והרעיונות החדשניים ששיפרו מאוד את האיכות והכדאיות של מחקר זה. בנוסף, ברצוננו להודות לסמנתה קוקיארו ולאודיה רטאן על תרומתם במעבדה ועל התמיכה והסיוע החיוניים שלהם.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| #8-32 x 3/4 אינץ' בורג מכונה מצופה אבץ עם ראש עגול משולב (8 חבילות) | אוורבילט | 204274613 | - |
| 0.25% EDTA-טריפסין | תרמו-פישר סיינטיפיק | 25200056 | - |
| צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן סטריליים חרוטיים 15 מ"ל | תרמו סיינטיפיק | 12-565-269 | - |
| צלחת 35x10 מ"מ, Nunclon Delta | תרמו סיינטיפיק | 153066 | - |
| צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן סטריליים חרוטיים 50 מ"ל | תרמו סיינטיפיק | 12-565-271 | - |
| פקקי גומי שונים | פישרברנד | 14-132 | |
| צלוחיות מטופלות בתרבית תאים BioLite (25 ס"מ^2) | תרמו סיינטיפיק | 12-556-009 | - |
| צלוחיות שטופלו בתרבית תאים BioLite (75 ס"מ^2) | תרמו סיינטיפיק | 12-556-010 | - |
| COMSOL מולטיפיזיקה | COMSOL | לא ישים | - |
| דבק דו צדדי | 3 דקות | 16758005 | - |
| זכוכית כיסוי מדעית של אפרדיה ריצ'רד-אלן | תרמו סיינטיפיק | 22-050-218 | - |
| סרום בקר עוברי | תרמו-פישר סיינטיפיק | A5256701 | - |
| פיברונקטין | תרמו-פישר סיינטיפיק | 33016015 | 20 μ דילול גרם/מ"ל |
| אמבטיות מים בקרה דיגיטלית של Fisherbrand Isotemp: דגם 210 | פישרברנד | 15-462-10ש | - |
| מזרק סטרילי פישרברנד (60 מ"ל) | פישרברנד | 14-955-461 | - |
| תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של ריאות אנושיות | סיגמא אולדריץ' | 540-05א | - |
| מיקרוסקופ פלורסנט Keyence BZX810 | קיינס | לא ישים | - |
| ערכת אלסטומטר סיליקון Krayden Dow Sylgard 184. שקוף, (1.1 ליברות) | דאו | 4019862 | - |
| יריעת אקריליק יצוקה של מרגה סיפטה בעובי 1/2 אינץ', 48x96 אינץ' | מרגה צ'יפטה | לא ישים | - |
| ראש משאבה Masterflex L/S Easy-Load II | מאסטרפלקס | 77200-50 | |
| צינורות משאבה מדויקים של Masterflex L/S, סיליקון מרפא פלטינה, L/S 16; 25 רגל | מאסטרפלקס | 96410-16 | - |
| משאבה פריסטלטית סטנדרטית Masterflex L/S | מאסטרפלקס | 07522-20 | |
| מיקרופיפטה 0.2 עד 2 μ L | פישרברנד | FBE00002 | - |
| מיקרופיפטה 10 עד 100 μ L | פישרברנד | FBE00100 | - |
| מיקרופיפטה 100 עד 1000 μ L | פישרברנד | FBE01000 | - |
| מיקרופיפטה 5 עד 50 μ L | פישרברנד | FBE00050 | - |
| מדיום גידול תאי אנדותל מיקרו-וסקולרי (500 מ"ל) | סיגמא - אולדריץ' | 111-500 | - |
| מסנני מזרק סטריליים של Nalgene | תרמו סיינטיפיק | 725-2520 | - |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי Nikon Eclipse TS-100 | ניקון | NI-TS100 | |
| תמיסת מלח עם חומצת פוספט (DPBS, 10X), הנוסחה של Dulbecco | תרמו סיינטיפיק | J61917. K3 | - |
| Prusament PLA פרוסה גלקסי שחור 1 ק"ג | פרוסה | PRM-PLA-GLX-1000 | - |
| מיקרוסקופ היברידי מורד, זקוף והפוך, גלה את אקו | הד | 76376-746 | - |
| איטום סיליקון | לוקטיט | 908570 | - |
| סולידוורקס | דאסו סיסטמס | לא ישים | |
| צנרת סרולוגית חד פעמית מפוליסטירן סטרילי עם פס זכוכית מגדלת (10 מ"ל) | פישרברנד | 13-678-11E | - |
| צנרת סרולוגית חד פעמית מפוליסטירן סטרילי עם פס זכוכית מגדלת (25 מ"ל) | פישרברנד | 13-678-11 | - |
| צנרת סרולוגית חד פעמית מפוליסטירן סטרילי עם פס זכוכית מגדלת (50 מ"ל) | פישרברנד | 13-678-11ו | - |
| צנרת סרולוגית חד פעמית מפוליסטירן סטרילי עם פס זכוכית מגדלת (5 מ"ל) | פישרברנד | 13-678-11ד | - |
| סטרפטווידין, אלקסה פלואור 488 מצומד | Invitrogen | S32354 | |
| סטרפטווידין, אלקסה פלואור 488 מצומד | Invitrogen | S32354 | - |
| מאגר מזרקים | ב.ד. | 300865 | |
| Thermo Scientific Alfa Aesar 1LT אלבומין, בקר, Fraction V, 35% סולן., דרגת ריאגנט, ללא חומצות שומן, עם אזיד כחומר משמר | תרמו סיינטיפיק | N12H004 | - |
| מחברי צינורות | פישרברנד | 01-000-161 | - |
| מדיום הרכבה VECTASHIELD Antifade עם DAPI | וקטשילד | H-1200-10 | - |
| חממת VWR מעטפת מים CO2 | אוונטאר | 10810-744 | - |
| נוגדן ביוטיניל WGA | וקטור | ב-1025 | - |
מקורות
- Sharma, S., Beshara, M., Bora, V. Pneumonectomy. , StatPearls Publishing LLC. (2024).
- Grapatsas, K., et al. Pneumonectomy for primary lung tumors and pulmonary metastases: a comprehensive study of postoperative morbidity, early mortality, and preoperative clinical prognostic factors. Curr. Oncol. 30 (11), 9458-9474 (2023).
- Lucas, G. F. N., James, M. I., David, R. J., Victor, E. L. Chapter 24. Topics in thoracic surgery. Guerreiro Cardoso, P. F. , IntechOpen. (2012).
- Sentenac, P., et al. Pulmonary hypertension after pneumonectomy: a preclinical model in rats and human pulmonary endothelial cells. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 59 (1), 147-154 (2020).
- Russo, T. A., Banuth, A. M. M., Nader, H. B., Dreyfuss, J. L. Altered shear stress on endothelial cells leads to remodeling of extracellular matrix and induction of angiogenesis. PLoS One. 15 (11), e0241040(2020).
- Milusev, A., Rieben, R., Sorvillo, N. The endothelial glycocalyx: a possible therapeutic target in cardiovascular disorders. Front. Cardiovasc. Med. 9, e897087(2022).
- Vittum, Z., Cocchiaro, S., Mensah, S. A. Basal endothelial glycocalyx's response to shear stress: a review of structure, function, and clinical implications. Front. Cell Dev. Biol. 12, e1371769(2024).
- Villalba, N., Baby, S., Yuan, S. Y. The endothelial glycocalyx as a double-edged sword in microvascular homeostasis and pathogenesis. Front. Cell Dev. Biol. 9, e711003(2021).
- Harding, I. C., et al. Endothelial barrier reinforcement relies on flow-regulated glycocalyx, a potential therapeutic target. Biorheology. 56 (2-3), 131-149 (2019).
- Alphonsus, C. S., Rodseth, R. N. The endothelial glycocalyx: a review of the vascular barrier. Anaesthesia. 69 (7), 777-784 (2014).
- Möckl, L. The emerging role of the mammalian glycocalyx in functional membrane organization and immune system regulation. Front. Cell Dev. Biol. 8, e00253(2020).
- Nian, K., Harding, I. C., Herman, I. M., Ebong, E. E. Blood-brain barrier damage in ischemic stroke and its regulation by endothelial mechanotransduction. Front. Physiol. 11, 605398(2020).
- Dietz, N. M. Pathophysiology of postpneumonectomy pulmonary edema. Semin. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 4 (1), 31-35 (2000).
- Bozlar, U., et al. Pulmonary artery diameters measured by multidetector-row computed tomography in healthy adults. Acta Radiol. 48 (10), 1086-1091 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Kataoka, H., et al. Fluorescent imaging of endothelial glycocalyx layer with wheat germ agglutinin using intravital microscopy. Microsc. Res. Tech. 79, 31-37 (2016).
- Wood, K. M., Stone, G. M., Peppas, N. A. Wheat germ agglutinin functionalized complexation hydrogels for oral insulin delivery. Biomacromolecules. 9 (4), 1293-1298 (2008).
- Tarnowski, B. I., Spinale, F. G., Nicholson, J. H. DAPI as a useful stain for nuclear quantitation. Biotech. Histochem. 66 (6), 297-302 (1991).
- Emde, B., Heinen, A., Gödecke, A., Bottermann, K. Wheat germ agglutinin staining as a suitable method for detection and quantification of fibrosis in cardiac tissue after myocardial infarction. Eur. J. Histochem. 58 (4), 2448(2014).
- Hu, Z., Cano, I., D'Amore, P. A. Update on the role of the endothelial glycocalyx in angiogenesis and vascular inflammation. Front. Cell Dev. Biol. 9, e734276(2021).
- Choi, J., Lee, E. J., Jang, W. B., Kwon, S. M. Development of biocompatible 3D-printed artificial blood vessels through multidimensional approaches. J. Funct. Biomater. 14 (10), e14100497(2023).
- Fallon, M. E., Mathews, R., Hinds, M. T. In vitro flow chamber design for the study of endothelial cell (patho)physiology. J. Biomech. Eng. 144 (2), e4051765(2021).
- Basehore, S., Garcia, J., Clyne, A. M. The science, etiology and mechanobiology of diabetes and its complications. Gefen, A. , Acad. Press. 291-312 (2021).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה