מאמר שיטה

ניתוח אינטראקציות חלבון-דנ"א טלומריות באמצעות פינצטה מגנטית של מולקולה אחת

DOI:

10.3791/67251

⸱

30 באוגוסט 2024

 ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Pharmacy, Nankai University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים שימוש בפינצטה מגנטית של מולקולה אחת כדי לחקור אינטראקציות בין חלבונים קושרי DNA טלומריים (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] ו-TRF2) לבין טלומרים ארוכים שהופקו מתאים אנושיים. הוא מתאר את שלבי ההכנה לטלומרים ולגורמים קושרים חוזרים טלומריים, ביצוע ניסויים במולקולות בודדות ושיטות איסוף הנתונים וניתוחם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טלומרים, מבני ההגנה בקצות הכרומוזומים, חיוניים לשמירה על אריכות ימים תאית ויציבות הגנום. תפקודם התקין תלוי בתהליכים מוסדרים היטב של שכפול, התארכות ותגובת נזק. קומפלקס המקלטים, במיוחד גורם קושר חוזר לטלומרים 1 (TRF1) ו-TRF2, ממלא תפקיד מרכזי בהגנה על הטלומרים והתגלה כיעד אנטי-סרטני פוטנציאלי לגילוי תרופות. חלבונים אלה נקשרים למוטיב הדנ"א הטלומרי החוזר על עצמו TTAGGG, מה שמקל על היווצרות מבני הגנה וגיוס חלבונים טלומריים אחרים. שיטות מבניות וטכניקות הדמיה מתקדמות סיפקו תובנות לגבי אינטראקציות טלומריות בין חלבון לדנ"א, אך חקירת התהליכים הדינמיים דורשת גישות של מולקולה אחת. כלים כמו פינצטה מגנטית, פינצטה אופטית ומיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) שימשו לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א טלומריים, וחשפו פרטים חשובים כגון עיוות DNA תלוי TRF2 וקטליזה של טלומראז. עם זאת, הכנת מבנים של מולקולות בודדות עם מוטיבים טלומריים חוזרים ממשיכה להיות משימה מאתגרת, ועלולה להגביל את רוחב המחקרים המשתמשים בשיטות מכניות של מולקולה אחת. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו שיטה לחקור אינטראקציות באמצעות דנ"א טלומרי אנושי באורך מלא עם פינצטה מגנטית. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבטא ולטהר TRF2, להכין דנ"א טלומרי, להגדיר בדיקות מכניות של מולקולה בודדת ולנתח נתונים. מדריך מפורט זה יועיל לחוקרים בביולוגיה של הטלומרים ובגילוי תרופות ממוקדות טלומרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טלומרים הם מבני הגנה בקצות הכרומוזומים 1,2,3. שחיקת הטלומרים במהלך חלוקת התא מובילה להזדקנות התא ולהזדקנותו, בעוד התארכות חריגה של הטלומרים תורמת לסרטן 4,5. כדי שהטלומרים יתפקדו כראוי, תגובות השכפול, ההתארכות והנזק שלהם חייבות להיות מווסתות מאוד 6,7,8. Shelterin, המורכב משש יחידות משנה, ממלא תפקיד מרכזי בהגנה על הטלומרים 9,10,11. הבנה מעמיקה יותר של הטלומרים תספק תובנות חשובות על הביולוגיה של הטלומרים.

TRF1 ו-TRF2, תת-יחידות ליבה של Shelterin, הן חלבוני קישור טלומריים12,13. גם TRF1 וגם TRF2 נקשרים למוטיב הדנ"א החוזר TTAGGG בטלומרים דרך תחומי Mybשלהם 14. הם יוצרים דימרים דרך תחומי TRFH המשותפים שלהם, המאפשרים להם להקיף דנ"א טלומרי דו-גדילי ולגייס חלבונים טלומריים 15,16,17,18,19. TRF2 חשוב במיוחד ליצירת לולאות D טלומריות ולולאות T20,21. בשל תפקידם המכריע בהגנה מפני טלומרים, TRF1 ו-TRF2 התגלו כמטרות פוטנציאליות לתרופות אנטי-סרטניות 22,23,24,25.

נעשו מאמצים משמעותיים לחקור את אינטראקציות החלבון-דנ"א בטלומרים. שיטות ביוכימיות כגון Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) ו- Surface Plasmon Resonance (SPR) שימשו לבחינת זיקות קשירה20,26. מבנים רבים של חלבוני קישור טלומריים המורכבים עם DNA הובהרו באמצעות מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים (cryo-EM), קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ותהודה מגנטית גרעינית (NMR)27,28,29. טכניקות הדמיה ברזולוציית על כמו מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM) חשפו היווצרות לולאת T תלוית TRF221. לאחרונה פותח ריצוף ננו-נקבוביות לפרופיל רצפים טלומריים 4,30,31. תובנות מבניות אלה שיפרו מאוד את הבנתנו את יחסי הגומלין בין חלבון לדנ"א טלומריים. כדי להמשיך לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות חלבון-דנ"א טלומריות, פיתוח טכנולוגיות חדשות הוא חיוני.

כלים חד-מולקולתיים הם טכניקות רבות עוצמה לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א בטלומרים 32,33,34. שיטות מכניות של מולקולות בודדות, כגון פינצטה מגנטית, פינצטה אופטית ו-AFM, שימשו כדי לחקור עיוות DNA תלוי TRF2, לחשוף ערימה טורית בתיווך TRF2 של כרומטין טלומרי אנושי ולצפות בקטליזה טלומראז תהליכית, בין יישומים אחרים 35,36,37,38,39,40. שיטות אלה שימושיות במיוחד לחקר קונפורמציות טופולוגיות ולקינטיקה של קשר חלבון-דנ"א ודיסוציאציה.

עם זאת, הכנת מבנים של מולקולה בודדת עם מוטיבים חוזרים טלומריים עדיין מציבה אתגרים, מה שמגביל מחקרים המשתמשים בשיטות מכניות של מולקולה אחת. כדי להתמודד עם מגבלה זו, פיתחנו שיטה מכנית של מולקולה אחת לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א גלובליות על טלומרים אנושייםבאורך מלא 41. שיטה זו מחלצת ישירות DNA טלומרי מתאים אנושיים, תוך עקיפת ההכנה המייגעת של DNA טלומרי מלאכותי. זה מקל על חקירת תהליכים קינטיים על טלומרים מקומיים ארוכים המשתרעים על פני כמה קילובסיסים.

בפרוטוקול זה, אנו מספקים תיאור מפורט של השלבים לחקירת אינטראקציות חלבון-דנ"א טלומריים באמצעות פינצטה מגנטית, כלי מכני פופולרי בעל מולקולה אחת 42,43,44. אנו מדגימים כיצד לבטא ולטהר חלבונים טלומריים, תוך שימוש ב-TRF2 כדוגמה, וכיצד להכין דנ"א טלומרי מתאים אנושיים. בנוסף, אנו מראים כיצד להגדיר בדיקה של מולקולה אחת בפינצטה מגנטית כדי לחקור אינטראקציות טלומריות בין חלבון לדנ"א, ואנו מכסים את ניתוח הנתונים הבא של ניסויים במולקולות בודדות. פרוטוקול זה יועיל לחוקרים בתחום הביולוגיה של הטלומרים וגילוי תרופות ממוקדות טלומרים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. חומרים ושיטות כלליים

  1. עיין בקובץ טבלת החומרים עבור מלחים, כימיקלים, אנטיביוטיקה, אנזימים, נוגדנים וחומרי שרף המשמשים בפרוטוקול זה.
  2. הכינו מדיום נוזלי Luria-Bertani (LB), צלחות אגר LB, חיץ HEPES, אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד SDS (SDS-PAGE), מלח חוצץ פוספט (PBS), חיץ Tris-EDTA (TE) על פי המתכונים מפרוטוקולי קולד ספרינג הארבור 45,46,47,48,49,50,51,52,53.
  3. רכוש את וקטור pET28a (Addgene), פרוקריוטי וקווי תאים אאוקריוטים (ATCC) באמצעות מקורות מסחריים. לאחר מכן, תרבית ברציפות ולהעביר אותם במעבדה.
  4. עבור כמויות גדולות של נוזל, autoclave ב 120 ° C במשך 20 דקות. עבור נפחים קטנים, השתמש במסנן סטרילי עם גודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
  5. התאם את ה- pH של התמיסות לרמה הרצויה באמצעות HCl או NaOH לפני הבאתם לנפחים הסופיים שלהם.
    הערה: פינצטה מגנטית בנויה בהתאמה אישית ומופעלת בסביבה של LabVIEW 2017, בעוד ניתוח נתונים של מולקולה בודדת מתבצע ב- MATLAB 2017 2,54,55.
  6. מטעמי בטיחות, יש ללבוש מעילי מעבדה עם שרוולים ארוכים, כפפות ניטריל (או כפפות העשויות מחומר אטום ועמיד בפני החומר), משקפי בטיחות או משקפי מגן ונעליים סגורות.

2. ביטוי וטיהור חלבונים של חלבונים קושרי DNA טלומריים

  1. לבצע תרבית תאים ולגרום לביטוי חלבון.
    1. הכניסו את רצף הקידוד של החלבונים קושרי הדנ"א הטלומרי (איור 1A), TRF2 כדוגמה במקרה הזה, לתוך וקטור pET28a על ידי עיכול וקשירה של אנזימים, כאשר SUMO משמש כתג היתוך. הכניסו בין אתרי ההגבלה של BamHI ו-HindIII, והניבו את הפלסמיד של pET28a-SUMO-TRF2 (איור 1B).
    2. הפוך תאי BL21(DE3) עם פלסמיד pET28a-SUMO-TRF2.
      1. הפשירו אליציטוט של 50 μL של תאי BL21(DE3) מוכשרים על קרח.
      2. הוסף 1 μL של DNA של פלסמיד pET28a-SUMO-TRF2 (המכיל 50 ng של DNA) לתאים המוסמכים. מערבלים בעדינות כדי לערבב מבלי לערבב למעלה ולמטה.
        הערה: אין מערבולת.
      3. דוגרים על התערובת על קרח במשך 30 דקות.
      4. להלם חום, חממו את תערובת התאים ב-42°C למשך 45 שניות בדיוק באמבט מים. מיד להחזיר את התאים לקרח במשך 2 דקות כדי לייצב את התאים מותמרים.
      5. הוסף 950 μL של טמפרטורת החדר (RT) LB בינוני לתאים כדי להקל על ההתאוששות.
      6. יש לדגור על התאים שעברו טרנספורמציה בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת תוך כדי רעידות ב-220 סל"ד.
      7. מורחים 100 מיקרוליטר של תערובת הטרנספורמציה על צלחת אגר LB המכילה 50 מיקרוגרם / מ"ל קנמיצין (85.8 מיקרומטר).
      8. לדגור את התאים המצופים לילה ב 37 ° C. לאחר הדגירה, בחרו מושבות נפרדות לשימוש בחיסון תרביות ראשונות.
        הערה: מושבות על צלחות ניתן לאחסן ב 4 ° C עד שבועיים.
    3. הרימו מושבה של תאי BL21(DE3) שעברו טרנספורמציה ותרבו אותה ב-5 מ"ל של LB בינוני בתוספת קנמיצין של 50 מיקרוגרם/מ"ל (85.8 מיקרומטר). יש לדגור במשך 18 שעות ב-37°C עם רעידות ב-220 סל"ד.
    4. כדי להגדיל את קנה המידה, העבר 2 מ"ל של תרבית הלילה ל -200 מ"ל של מדיום LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל קנמיצין (85.8 מיקרומטר). המשך הדגירה ב-37°C עם רעידות ב-220 סל"ד עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר (OD 600) תגיע ל-0.6-0.8.
    5. קח 1 מ"ל של התרבית כדגימת ביקורת בלתי מושרית.
    6. יש לגרום לתרבית הנותרת עם איזופרופיל β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לריכוז סופי של 1 mM ולדגור ב-20°C למשך 17 שעות כדי לקדם ביטוי חלבונים.
    7. ביצוע SDS-PAGE באמצעות ג'ל ערימה 5% וג'ל הפרדה 10%. טען דוגמאות באמצעות מאגר טעינת SDS-PAGE והפעל SDS-PAGE תחילה ב- 100 V למשך 30 דקות, ולאחר מכן 120 V למשך 50 דקות במאגר Tris-Glycine. צבעו בכחול קומאסי כדי להמחיש ביטוי חלבונים (ראו מתכונים בטבלה משלימה 1) (איור 1C).
      הערה: ראה דיון לפתרון בעיות אם ביטוי אינו נצפה.
  2. לטהר את החלבון.
    1. קצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C, 8500 x גרם במשך 10 דקות. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הגלולה ב-200 מ"ל PBS. צנטריפוגה שוב, להשליך את supernatant, ולהשהות מחדש את גלולת התא ב 25 מ"ל של חיץ ליזה (20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, 10% גליצרול, 0.5 mM DTT, 1 mM פניל sulfonyl פלואוריד [PMSF]).
      אזהרה: PMSF הוא חומר מאכל ורעיל הגורם לכוויות. יש ללבוש ביגוד מגן מתאים, כפפות והגנה על העיניים/פנים.
      הערה: יש להקפיא בטמפרטורה של -80°C אם לא להמשיך מיד.
    2. הוסף 5 μL של 100 מ"ג / מ"ל lysozyme, 5 μL של 1 U/μL DNase I, ו 5 μL של 10 מ"ג / מ"ל RNase A לתאים מרחפים מחדש.
    3. בצעו סוניקציה על קרח, עם התפרצויות של 1 שניות ב-250 ואט ואחריה הפסקה של 2 שניות, למשך 30 דקות בסך הכל.
    4. צנטריפוגה ב 38,000 x גרם, 4 ° C למשך 40 דקות (30-60 דקות מקובל) ולסנן את supernatant דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
    5. הכן 500 מ"ל של חיץ קישור Ni-column על ידי המסת 8.76 גרם של NaCl (ריכוז סופי 300 mM) ו 0.68 גרם של imidazole (ריכוז סופי 20 mM) ב 20 mM HEPES (pH 8.0). סנן את התמיסה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.
      אזהרה: אימידזול מסוכן ועלול לגרום לגירוי בעור ובעיניים. זה עלול גם לפגוע בילד שטרם נולד. יש להימנע ממגע עם העיניים, העור והבגדים. אין לבלוע או לשאוף. יש ללבוש ציוד מגן אישי, כולל הגנה על הפנים.
    6. הכן מאגרי אלוציה של Ni-column (20 mM HEPES (pH 8.0), 300 mM NaCl) עם ריכוזים הולכים וגדלים של imidazole (100 mMM, 200 mM, 300 mM ו- 500 mM) להדבקה הדרגתית, וודא שכל המאגרים מסוננים כראוי.
    7. טען את הסופרנאטנט המסונן על עמודת Ni המאוזנת מראש במאגר קשירה (20 mM HEPES (pH 8.0),300 mM NaCl,20 mM imidazole). שטפו עם חיץ קשירה והדליקו את החלבון עם שיפוע האימידזול המוכן, ואספו 12 שברים, כל אחד עם 1 מ"ל (איור 1C). שלבו שברים עם טוהר של >95%.
    8. מדוד את ריכוז חלבון ההיתוך 6xHis-sumo-TRF2 המדולל ב- A280 בספקטרופוטומטר.
    9. עבור החלבון המשמש בבדיקות של מולקולה אחת, הוסף פרוטאז סומו בהתאם להוראות היצרן (בדרך כלל 0.125 U של פרוטאז לכל 2 מיקרוגרם של חלבון היתוך) ולאפשר עיכול לילה ב 4 ° C.
    10. לאחר טיפול בפרוטאז סומו, טענו את התערובת בחזרה לעמודת Ni כדי לקשור כל חלבון פיוז'ן לא מעוכל ואת הסומו המתויג שלו, מה שמאפשר לחלבון TRF2 ללא תגים לזרום דרכו. אסוף את הזרימה.
  3. לקבוע את ריכוז החלבון ולאחסן את החלבון.
    1. רכז את חלבון TRF2 המטוהר באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלית בחיתוך 30 kDa והחלף אותו במאגר אחסון המכיל 20 mM HEPES (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, כדי להפחית את ריכוז האימידזול מתחת ל -150 mM.
    2. חזור על תהליך הריכוז עד שהנפח מצטמצם לפחות מ -1 מ"ל.
    3. נתחו דגימות מכל שלב טיהור באמצעות SDS-PAGE כדי להעריך את הטוהר והשלמות של החלבון (איור 1C).
      הערה: כרומטוגרפיית זיקה משמשת לטיהור חלבונים, איסוף ושטיפה של דגימות מדוללות וביצוע SDS-PAGE כדי להעריך את שלמות החלבונים ולהבטיח בקרת איכות. כאשר כרומטוגרפיית זיקה לבדה אינה עומדת בדרישות הטוהר, כרומטוגרפיית אי הכללת גודל משמשת לשיפור נוסף של טוהר החלבון. עקומות ספיגת UV מסייעות להעריך שברי אלוציה, ו- SDS-PAGE מוודא את שלמות החלבון, ומבטיח בקרת איכות קפדנית לאורך כל התהליך.
    4. הוסיפו גליצרול לריכוז סופי של 50% לחלבון מרוכז ומוחלף חוצץ לאחסון.
    5. אחסנו את החלבון בטמפרטורה של -80°C.

3. הכנת שברי הגבלה טלומרית אנושית

  1. לחלץ DNA גנומי.
    1. בעקבות תרשים הזרימה (איור 2A), צנטריפוגה 1 x 107 תאים ב 1000 x גרם במשך 3 דקות ולזרוק את supernatant. לשטיפה, להשהות מחדש את התאים ב 200 μL של PBS, צנטריפוגה שוב ב 1000 x גרם במשך 3 דקות, ולהשליך את supernatant.
    2. הוסף 760 μL של חיץ המכיל 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 100 mM EDTA ו- 1% SDS לצינור המכיל 1 x 107 תאים והשהה מחדש בעדינות על ידי צנרת כדי למנוע בועות אוויר.
      הערה: אין מערבולת.
    3. לעיכול חלבונים ולחיסול DNases ו-RNases בדגימה, יש להוסיף את Proteinase K לריכוז סופי של 0.5 מ"ג/מ"ל, המקביל ל-40 מיקרוליטר של תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל. הקש על תחתית הצינור כדי לערבב (לא מערבולת).
    4. לדגור לילה ב 37 °C (77 °F).
    5. הוסף 265 μL של 5.4 M NaCl. מערבבים במשך 5 דקות על ידי היפוך הצינור חמש פעמים בכל דקה, ואז מניחים על קרח למשך 20 דקות.
    6. צנטריפוגה במהירות מרבית (למשל, 16,900 x גרם) למשך 10 דקות ב-RT.
    7. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה ומוסיפים נפח שווה של איזופרופנול (כ-750 מיקרוליטר), תוך הימנעות משומנים צפים או משקעים. הדנ"א נמצא בסופרנטנט.
    8. הפוך את הצינור חמש פעמים כדי לערבב. לאשר חזותית את נוכחותו של גלולה של DNA מזרז בצינור הצנטריפוגה.
    9. צנטריפוגה ב-RT במהירות מרבית למשך 10 דקות.
    10. השליכו את הסופרנטנט. לשטוף את גלולת ה- DNA עם 500 μL של 70% אתנול על ידי היפוך צינור הצנטריפוגה חמש פעמים.
      הערה: הגלולה היא DNA.
    11. צנטריפוגה ב-RT במהירות מרבית (למשל, 16,900 x גרם) למשך 10 דקות.
    12. בזהירות להסיר את כל supernatant, משאיר את גלולת DNA. תנו לגלולה להתייבש באוויר ב-RT למשך 5 דקות.
      הערה: הימנע מתייבשות יתר, מכיוון ש- DNA גנומי יכול להיות קשה להתמוסס.
    13. השהה מחדש את גלולת הדנ"א ב-475 מיקרוליטר של חיץ TE (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA). ערבבו בעדינות על ידי הקשה על תחתית הצינור. לעיכול RNA במהלך הכנת DNA, הוסף 25 μL של 10 מ"ג / מ"ל RNase A (ריכוז סופי 0.5 מ"ג / מ"ל) וערבב על ידי הקשה עדינה עד שגלולת ה- DNA התמוססה לחלוטין.
      הערה: הימנע מערבולות כדי למנוע גזירת DNA.
    14. דגרו על דגימת הדנ"א בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
    15. בצע מיצוי פנול רווי טריס בנפח שווה: הוסף 500 מיקרוליטר פנול לצינור הצנטריפוגה, ערבב בעדינות עם פיפט וצנטריפוגה במהירות מרבית למשך 10 דקות ב-4°C.
      אזהרה: חשיפה לפנול עלולה לגרום לגירוי בעור, בעיניים, באף, בגרון ובמערכת העצבים. יש להימנע ממגע עם העיניים, העור והבגדים. אין לבלוע או לשאוף. יש ללבוש ציוד מגן אישי, כולל הגנה על הפנים.
      הערה: הדנ"א נמצא בשלב המימי העליון, חלבונים נמצאים בשלב הביניים, והשלב האורגני נמצא בתחתית.
    16. חזור על הפעולה שלוש פעמים. קח את supernatant של DNA (כ 280 μL).
    17. על פי נפח דגימת ה- DNA, הוסף נפח 1/10 (28 μL) של 3 M נתרן אצטט (ריכוז סופי 0.3 M, pH 5.2) ו -2 נפחים (616 μL) של אתנול קר 100%. מניחים את צינור הצנטריפוגה ב -80 ° C למשך 2-3 שעות.
    18. צנטריפוגה במהירות מרבית (למשל, 16,900 x גרם) למשך 10 דקות ב-4°C. הפשירו את התמיסה על קרח אם קפאו לפני הצנטריפוגה.
    19. יש להשליך את הסופרנאטנט ולשטוף 3-4 פעמים עם 70% אתנול על ידי היפוך צינור הצנטריפוגה. צנטריפוגה במהירות מרבית למשך 5 דקות ב-4°C.
    20. מוציאים את האתנול ומניחים לגלולה להתייבש באוויר ב-RT למשך 5 דקות.
    21. הוסף 100 μL של מאגר TE, הקש על הצינור כדי לערבב, ותן לו לשבת ב 4 ° C במשך 2 שעות כדי להתמוסס לחלוטין.
      הערה: בחנו את שלמות הדנ"א הגנומי על ג'ל אגרוז 1% (איור 2B).
    22. אחסנו את הדנ"א בטמפרטורה של -20°C במקפיא. זה יישאר יציב לפחות 1 שנה.
  2. לבצע עיכול DNA גנומי ושינוי.
    1. קח 4 מיקרוגרם של DNA גנומי ושלב אותו עם 1 μL של CviAII (10 U), 2 μL של 10x חיץ עיכול (ראה טבלה משלימה 1 למתכונים), והוסף מים כדי להגיע לנפח כולל של 20 μL. לדגור על התערובת ב 25 ° C במשך 12 שעות.
      הערה: FatI יכול להחליף את CviAII, אשר הופסק כעת על ידי NEB.
    2. הוסף 1 μL של NdeI (20 U), 1 μL של MseI (10 U) ו 1 μL של BfaI (10 U) לאותה צינור המכיל את התערובת הקודמת (20 μL). כמו כן, הוסף 2 μL של 10x חיץ עיכול ו 15 μL של מים כדי להשיג נפח כולל של 40 μL. לדגור ב 37 ° C במשך 12 שעות, ולאחר מכן לחמם להשבית את כל האנזימים ב 80 ° C למשך 20 דקות.
      הערה: ניתן לבחון את העיכול של דנ"א גנומי באמצעות שיטת מקטע הגבלת מסוף (TRF) (איור 2C). השילוב של ארבעת אנזימי ההגבלה (CviAII, NdeI, MseI ו-BfaI) מעכלים את הדנ"א הגנומי למקטעים של כ-800 bp ומניבים את TRFs עם זיהום DNA תת-טלומרי מינימלי.
    3. לשינוי דיגוקסיגנין, קח 40 μL של הדנ"א הגנומי המעוכל והוסף 4 μL של 1 mM dATP (ריכוז סופי 0.08 mM), 4 μL של 1 mM digoxigenin-11-dUTP (ריכוז סופי 0.08 mM), 1 μL של מקטע Klenow (5 U), 0.5 μL של 100 mM DTT (ריכוז סופי 1 mM), ו 1 μL של 10x חיץ עיכול. דגירה ב 37 ° C במשך 12 שעות, ולאחר מכן חימום ב 75 ° C במשך 20 דקות כדי להשבית את קטע Klenow.
    4. עבור תיוג ביוטין, לקחת 12.5 μL של DNA גנומי מהונדס Digoxigenin (1 מיקרוגרם) ולהוסיף 1 μL של 1 μM biotinylated טלומרית בדיקה (כלומר, 1 pmol) כי הם משלימים את חד גדילי טלומרי חד-גדילי. הוסף 611.5 μL של חיץ TE Li (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 50 mM LiCl) כדי לדלל את יוני 50 mM K ל 1 mM, מה שהופך נפח כולל של 625 μL, אשר ניתן לחלק 16 צינורות עם 39 μL כל אחד.
    5. חממו ב-75°C למשך 3 דקות במחזור תרמי, ולאחר מכן הפחיתו את הטמפרטורה ב-0.1°C כל 30 שניות עד שתגיעו ל-25°C.
    6. אחסנו את דגימות הדנ"א בטמפרטורה של -20°C למשך שנה לפחות.

4. הגדרת תא זרימה לדגימת DNA טלומרית בפינצטה מגנטית

  1. צור תא זרימה עבור בדיקות של מולקולה אחת.
    1. השתמש במטחנה חשמלית כדי לקדוח חורים כאשר הכניסה והשקע בכיסויים העליונים מחליקים (# 2 זכוכית כיסוי בעובי של 0.2 מ"מ).
    2. נקו את הכיסויים בחומר ניקוי על ידי סוניקציה למשך 30 דקות.
    3. שטפו את החלקות הכיסוי במים טהורים במיוחד 3 פעמים.
    4. נקו את הכיסויים באיזופרופנול על ידי סוניקציה למשך 30 דקות.
    5. שטפו את הכיסויים במים טהורים במיוחד 3 פעמים.
    6. נקו את הכיסויים בצורה טהורה במיוחד באמצעות סוניקציה למשך 15-30 דקות.
    7. יבשו את הכיסויים בחנקן.
      הערה: ניתן לעצור את הפרוטוקול כאן ולאחסן את הכיסויים המנוקים לשימוש מאוחר יותר.
    8. מצפים את הכיסויים התחתונים (ללא חורים) ב-20 מיקרוליטר של 0.1% ניטרוצלולוז ומוסיפים חרוזי ייחוס (דילול 20x, קוטר 3 מיקרומטר). אופים בחום של 100 מעלות במשך 4 דקות.
    9. השתמש באזמל כדי לחתוך ספייסרים פרפילם דו-שכבתיים על פי תבנית מתכת. התבנית היא פיסת סגסוגת אלומיניום מלבנית עם מידות זהות לאלה של הכיסוי, הכוללת מרכז חלול כדי להקל על חיתוך התעלה.
    10. הרכיבו את כריך תא הזרימה (איור 3A). חממו בחום של 85°C והשתמשו בשני מטושים כדי לעסות עד שהפרפילם אוטם את התעלה.
    11. מצפים את תא הזרימה בנוגדן. הזריקו 70 מיקרוליטר של נוגדן אנטי-דיגוקסיגנין (0.1 מ"ג/מ"ל) ישירות לתא הזרימה. השאר ב- RT למשך שעה אחת.
    12. פסיבי את תא הזרימה. הזריקו 70 μL של 10 מ"ג/מ"ל BSA כדי להחליף את הנוגדן נגד דיגוקסיגנין. השאירו ב-RT למשך 12 שעות. נוגדנים אנטי-דיגוקסיגנין לא קשורים יישטפו בשלבים הבאים בשטיפה קפדנית.
      הערה: אחסן את תא הזרימה בטמפרטורה של 4°C למשך שבוע-שבועיים.
    13. בדוק קשירה לא ספציפית על ידי שטיפה של 5 μL של MyOne שטוף (10 מ"ג / מ"ל) (או 5 μL של M270 שטוף (10 מ"ג / מ"ל)) חרוזים ללא DNA לתוך תא הזרימה. להשאיר למשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף חרוזים באמצעות חיץ עובד (20 mM HEPES (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). ספור את מספר החרוזים הדבוקים למשטח בשדה ראייה אחד. משטח מטופל היטב צריך להראות אפס או רק כמה חרוזים.
  2. לבודד ולשתק קשירת DNA טלומרית בתא זרימה.
    1. קח 10 μL של חרוזי M270 (10 מ"ג / מ"ל) או 5 μL של 10 מ"ג / מ"ל MyOne ושטוף אותם חמש פעמים עם 50 μL של חיץ עבודה (20 mM HEPES [pH 7.5], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) באמצעות מגנט.
    2. קח 500 ננוגרם של דנ"א גנומי מעוכל והכנס אותו לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. הוסף את כל החרוזים (50 μL) על גבי דגימת ה- DNA.
    3. ללא פיפטינג, העבירו בעדינות את צינור הצנטריפוגה כמה פעמים כדי לערבב את החרוזים ואת דגימת הדנ"א. השאירו את התערובת על קרח למשך שעה. שטפו עם 500 מיקרוליטר של חיץ עבודה שלוש פעמים באמצעות מגנט כדי למשוך את החרוזים למטה, עם מרווחים של 10 דקות בין כביסה.
    4. השהה מחדש את הדגימה באמצעות 30 μL של חיץ עבודה וטען את התערובת לתוך תא הזרימה. להשאיר למשך 30 דקות. שוטפים חרוזים מגנטיים לא קשורים.
      הערה: דנ"א טלומרי קשור בין חלקת הכיסוי התחתונה לבין החרוז המגנטי באמצעות אינטראקציות זיקה בתיווך נוגדן דיגוקסיגנין וביוטין-סטרפטאבידין (איור 3B).
  3. הגדרת תא זרימה בפינצטה מגנטית
    1. נקו את תא הזרימה עם 70% אתנול וייבשו את פני השטח באמצעות רקמת העדשה. הניחו את תא הזרימה הנקי על מחזיק הדגימה התחתון והרכיבו בעדינות את מדף הדגימות העליון באמצעות מברג.
    2. יש למרוח טיפת שמן עדשה על המשטח התחתון של תא הזרימה, שם הוא מתיישר עם עדשת המטרה. לאחר מכן, הניחו את מחזיק הדגימה על גבי עדשת המטרה ואבטחו אותו באמצעות מברג.
    3. בחר זוג מגנטים מעוקבים 5 מ"מ מסודרים בתצורה אנכית. ישרו את מחזיק המגנט עם ציר ה-X של נתיב האור של הפינצטה המגנטית לצורך הדמיה.
      הערה: זהו שלב קריטי. כיוון השדה המגנטי מיושר ולכן נקבע על ידי כיוון מחזיק המגנט.
    4. הפעל את תוכנת התכנות הגרפית וחבר את הבקרים לפינצטה המגנטית. התאימו את שדה הראייה כדי לאתר חרוז ייחוס בתחתית תא הזרימה וכווננו מעט את עדשת המטרה כך שחרוז הייחוס יציג טבעות עקיפה ברורות.
    5. הזיזו את המגנטים כלפי מטה לחלק העליון של תא הזרימה.
      הערה: זהו שלב קריטי. שינויים פתאומיים בתבנית עקיפת החרוזים מצביעים על כך שהמגנטים נגעו זה עתה בפני השטח של תא הזרימה. מיקום זה נחשב להיסט של נקודת האפס למדידה.
      הערה: הנמיכו את המגנטים בזהירות, התחילו בצעדים גדולים יותר ועברו בהדרגה לצעדים קטנים יותר. עבור במרווחים של 0.1 מ"מ כדי למנוע נזק לתא הזרימה בעת התקרבות לתא הזרימה.
    6. הרימו את המגנטים למיקומם הגבוה ביותר והוציאו את מחזיק המגנט.
    7. הפעל את המשאבה הפריסטלטית המחוברת לבקבוק הפסולת והשלך את הנוזל. הוסף 100 μL של חיץ עבודה לכניסה והגדר את קצב זרימת המשאבה הפריסטלטית ל- 100 μL / min כדי למלא את תא הזרימה בחיץ.

5. מדידות של טלומר באמצעות פינצטה מגנטית בעלת מולקולה בודדת

  1. הגדר את המצלמה.
    1. הגדר את גווני האפור של מצלמת המוליכים למחצה המשלימים של תחמוצת מתכת (CMOS) עם כוונון בהירות ל- 150 רמות.
    2. הגדר את גודל אזור העניין (ROI).
    3. הגדר את קצב המסגרות ל- 200 הרץ עם זמן חשיפה של 5000 μs.
      הערה: זהו שלב קריטי. ודא שהזמן המת בתריס מוגדר לאפס.
    4. הזיזו את מיקום המגנט ל-3 ס"מ (כ-8 pN) וכווננו את המיקוד האובייקטיבי בחרוזים.
  2. צור את טבלת בדיקת המידע (LUT).
    1. הזיזו את המגנטים למיקום המתאים ל-8 pN כדי למתוח בחוזקה את החרוז המגנטי הקשור לדנ"א.
    2. הגדר את LUT ל -200 שלבים עם גודל צעד של 0.05 מיקרומטר.
    3. השתמש במצלמת CMOS כדי ללכוד את הפרופילים של החרוזים המגנטיים במיקומים שונים כדי לבסס את ה- LUT.
      הערה: זהו שלב קריטי. חרוזי פוליסטירן הקבועים בתא הזרימה משמשים כחרוזי ייחוס כדי למנוע סחף עבור החרוזים המעניינים.
  3. תכנן ניסוי מכני של מולקולה אחת.
    1. כתוב סקריפט ב- MATLAB כדי לשלוט בתנועות מוטוריות עבור מבחני כבש כוח או קפיצת כוח.
      הערה: זהו שלב קריטי. סקריפט זה מקודד את הפקודות לתנועות מגנט. קצב העמסת הכוח נקבע בשלב זה עבור בדיקת כבש כוח. הרמות ומשכי הזמן של מבחני קפיצת הכוח נקבעים גם כאן (איור 4, קובץ משלים 1, קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3).
    2. ייבא את הסקריפט לתוכנת תכנות גרפית כדי לבדוק את ניסויי המולקולה היחידה.
    3. בדוק את סך המסגרות הדרושות להפעלת ניסוי המולקולה הבודדת וודא שהזיכרון הזמין עולה על דרישה זו.
      הערה: הנתונים יאבדו אם הזיכרון המוקצה קטן מהנדרש מכיוון ששמירת נתונים אורכת זמן.
    4. בדוק את מהירות ההדמיה המרבית כדי לקבוע את המספר המרבי של חרוזים שניתן לנטר בו זמנית.
      הערה: הניסוי יופסק במקרה של חריגה ממהירות ההדמיה המותרת.
    5. באמצעות בדיקת קפיצת כוח כדוגמה, הפעל את הניסוי המכני של מולקולה אחת. כוחות מופעלים בפתאומיות על החרוז המגנטי, אשר מעביר כוחות אלה למולקולת הדנ"א, ומיד מותח אותה כלפי מעלה.

6. מדידות TRF1/2 על טלומר באמצעות פינצטה מגנטית

  1. בדיקת כבש כוח
    1. אם נשתמש ב-TRF1 כדוגמה, טען 200 μL של 10 ננומטר TRF1 לתוך תא הזרימה בקצב זרימה איטי (למשל, 30 מיקרוליטר/דקה). המתינו 30 דקות עד ש-TRF1 ייקשר לדנ"א הטלומרי.
    2. בחר סקריפט לניסוי כבש כוח עם קצב טעינת כוח של ±1 pN/s.
    3. תן שמות לקובצי הנתונים בהתאם והפעל את הניסוי. הנתונים יישמרו ביעד שצוין לצורך ניתוח (איור 5).
      הערה: במהלך ניסוי זה, הכוח גדל באופן ליניארי ויורד בין 0 pN ל 17 pN, אשר מותח ומרפה את הדנ"א הטלומרי ושובר את לולאות הדנ"א בתיווך TRF1/2.
  2. בדיקת קפיצת כוח
    1. בחר סקריפט להפעלת בדיקת קפיצת כוח.
      הערה: כוחות שונים מופעלים כדי למתוח את הדנ"א הטלומרי, לדוגמה, "כוח מנוחה" (Frest) ב-0 pN במשך 40 שניות, "כוח בדיקה" (Ftest) הנע בין 2-8 pN עבור 60 שניות, "כוח גבוה" (Fhigh) ב-10 pN עבור 30 שניות, ו"כוח מרבי" (Fmax) ב-20 pN עבור 30 שניות.
    2. תן שמות לקובצי הנתונים בהתאם והפעל את הניסוי. הנתונים יישמרו ביעד שצוין לצורך ניתוח (איור 5).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1A מדגים את התחומים והמבנים הסכמטיים של TRF1 ו-TRF2, המורכבים מ-439 ו-542 חומצות אמינו בהתאמה, שיכולות להתבטא בתאים פרוקריוטים. הכנת TRF1 תוארה בעבר בספרות41. כאן, אנו מספקים תיאור מקיף ותוצאות מייצגות של הכנת TRF2. איור 1B מראה את מפת הפלסמיד ששימשה לביטוי TRF2 ב-E. coli. הערכנו ביטוי TRF2 לפני ואחרי אינדוקציה בחיידק E. coli, כפי שמתואר באיור 1B. תהליכי הטיהור ומחשוף התגים נותחו גם הם באמצעות SDS-PAGE (איור 1C). בעקבות פרוטוקול זה, שני חלבוני הקישור הטלומריים, TRF1 ו-TRF2, בוטאו בהצלחה ב-E. coli.

דנ"א טלומרי, בצורת מקטעי הגבלה טרמינליים (TRFs), מופק מגנומים אנושיים באמצעות שילוב של ארבעה אנזימי הגבלה. בעקבות תרשים הזרימה שמוצג באיור 2A, חילצנו גנומים מתאים אנושיים. האנזימים מעכלים באופן סלקטיבי את הדנ"א הגנומי תוך השארת הדנ"א הטלומרי באורך מלא שלם, ובכך מספקים חומר לבדיקות של מולקולה בודדת. בדקנו בהרחבה את הכנת הדנ"א TRF באמצעות קווי תאים אנושיים שונים. שלמות הדנ"א הגנומי נבדקה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, כפי שניתן לראות באיור 2B. ה-TRFs נותחו לאחר מכן על-ידי כתם דרומי, תוך שימוש באוליגונוקלאוטידים בעלי תווית פלואורסצנטית המשלימה את הרצף הטלומרי החוזר TTAGGG (איור 2C), בעקבות שיטה שתוארה במקום אחר41,56. בממוצע, אורך TRFs אנושיים הוא סביב כמה קילו-בסיסים.

בדיקות של מולקולות בודדות מתרחשות בתא זרימה שהורכב כפי שמתואר באיור 3A. ציפוי ניטרוצלולוז מכסה את משטח הזכוכית הטעון שלילית, ומספק מטריצה הידרופילית לספיחת נוגדנים. פסיבציה של BSA חוסמת אזורים במטריצת הניטרוצלולוז שאינם קשורים לנוגדנים אנטי-דיגוקסיגנין. חרוזי פוליסטירן, שאינם מכילים ננו-חלקיקי ברזל, משמשים כחרוזי ייחוס. קשרי TRF נוצרים באמצעות אינטראקציות זיקה בין נוגדן דיגוקסיגנין על מטריצת הניטרוצלולוז וביוטין-סטרפטאבידין על משטח החרוז המגנטי (איור 3B). TRF1 או TRF2 מוכנסים לתא הזרימה, ונקשרים לקשירת הדנ"א של TRF באמצעות דיפוזיה חופשית. פינצטה מגנטית משמשת לווסת את השדה המגנטי, ומייצרת כוחות על החרוזים המגנטיים למתוח ולהרפות את קשירת TRF, ובכך מאפשרת חיטוט באינטראקציות חלבון-דנ"א.

בדיקה מכנית של מולקולה אחת מתוכננת על ידי פיתוח סקריפט לשליטה בתנועות מנועי הפינצטה המגנטית. תרשים זרימה מספק גישה מובנית ליצירת הסקריפט הזה ב-MatLab עבור בדיקה של מולקולה אחת באמצעות פינצטה מגנטית (איור 4A). המגנטים נעים לאורך ציר z בטווח של 0-25 מ"מ. הכוחות מחושבים על בסיס מיקומי המגנט, על פי תצורת המגנט, באמצעות משוואות המתוארות בספרות54. עבור קצב העמסת כוח מסוים, מיקומי המגנט ומהירויות התנועה מתוכננים ומתוכנתים ב-MatLab כדי להשיג את פרופיל מניפולציית הכוח הרצוי, כפי שמודגם בדוגמה של בדיקת כבש הכוח (איור 4B-D).

באמצעות TRF1 כדוגמה, חקרנו את אינטראקציות הדנ"א-חלבון הטלומריות עם פינצטה מגנטית של מולקולה יחידה. ניתן להגדיר את מערך הניסוי כמבחן כבש כוח, כפי שמוצג באיור 5A, שבו עקומות הארכת הכוח מציגות תכונות זיגזג במהלך מתיחה עקב שבירת אינטראקציות חלבון-דנ"א ועקבות חלקות במהלך הרפיה, המשקפות את סיבי הדנ"א ללא לולאות בתיווך חלבון. ניתן להגדיר את המערך גם כבדיקת קפיצת כוח, כפי שמוצג באיור 5B,C, מה שמאפשר לנו למדוד שינויים בהארכה ובמשך הזמן של אינטראקציות חלבון-דנ"א תחת כוחות מסוימים. ניתן לגזור את קינטיקה הדיסוציאציה של קומפלקסים טלומריים של חלבוני דנ"א ממדידות אלה (איור 5D). נוסף על כך, היווצרות לולאות בקומפלקסים של חלבוני דנ"א יכולה להתגלות על-ידי שינויים בהרחבה (איור 5E). יתר על כן, ריכוז החלבון יכול להיות טיטרציה בתוך מערך ניסוי DNA טלומרי זה. יתר על כן, הטרוגניות האורך של דנ"א טלומרי מתאים אנושיים מאפשרת לנו לחקור את מנגנון היווצרות הלולאה בטלומרים באורכים שונים (איור 6).

figure-results-1
איור 1: הביטוי והטיהור של TRF1/2. (A) ארכיטקטורת התחום של TRF1 ו-TRF2. (B) מפת הפלסמיד של pET28a-SUMO-TRF2 לביטוי TRF2 ב-E. coli. (C) ניתוח SDS-PAGE של הדגימות שהתקבלו בשלבים שונים של ביטוי וטיהור. נתיב 1: לא מושרה על ידי IPTG. נתיב 2: משקע המושרה על ידי IPTG המתקבל על ידי ליזה של תאים. נתיב 3: סופרנאטנט המושרה על ידי IPTG המתקבל לאחר ליזה של תאים. נתיב 4: זרימה דרך עמוד Ni. נתיב 5: יש לשטוף עם חיץ אימידזול נמוך כדי להסיר חלבוני טומאה. נתיב 6: Elution של 6xHis-SUMO-TRF2 עם חיץ המכיל 300 mM imidazole. נתיב 7: עיכול תגי SUMO על ידי אנזים פרוטאז SUMO. נתיב 8: טיהור מחדש עם עמודת Ni ושחרור TRF2 (6xHis ותגי SUMO הוסרו) עם מאגר המכיל 20 mM imidazole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הכנת מקטעי הגבלת מסוף (TRF). (A) תרשים זרימה להכנת TRFs מתאים אנושיים. (B) בדיקת שלמות הדנ"א הגנומי באמצעות ג'ל אגרוז 1% עבור 5 קווי תאים אנושיים. (C) ניתוח TRF המבוצע על ידי כתם דרומי עבור 5 קווי תאים אנושיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הכנת בדיקות מכניות של מולקולה אחת. (A) תרשים זרימה המתאר את הכנת תא זרימה לבדיקות מכניות של מולקולה אחת. (B) ייצוג סכמטי של בדיקות מכניות של מולקולה בודדת באמצעות פינצטה מגנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: תכנון ניסוי מכני של מולקולה בודדת. (A) תרשים זרימה ליצירת סקריפט לביצוע בדיקת כבש כוח. (B) פרופיל התנועה של מגנטים לאורך ציר z. (C) פרופיל הכוח המתאים לתנועת מגנט. (D) המתאם בין מיקומי המגנט לבין הכוחות הנובעים מכך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: אינטראקציות דנ"א-חלבון טלומריות שנבדקו על-ידי פינצטה מגנטית של מולקולה יחידה. (A) אינטראקציות TRF1-טלומרים נבדקו במבחני כבש כוח (N=10) במאגר המכיל 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA ו-100 mM NaCl ב-23°C. הריכוז של TRF1 היה 10 ננומטר, עם קצב העמסת כוח של ±1 pN/s. (B) קשירת TRF נמתחה ונרגעה במבחני קפיצת כוח. פרוטוקול הכוח המופעל היה Frest = 0 pN, Ftest = 2 pN - 8 pN, Fhigh = 10 pN ו- Fmax = 20 pN. תנאי החיץ והטמפרטורה היו זהים לאלה שב-(A). קצב פריימים = 200 הרץ. (C) אינטראקציות TRF1-טלומרים נבדקו במבחני קפיצת כוח עם ריכוז TRF1 של 10 ננומטר. (D) קינטיקה דיסוציאציה של קומפלקסים TRF1-telomere. הלוגריתם של קצב הדיסוציאציה בכוחות שנבדקו (ממוצע ± SD, n = 206) עוקב אחר מודל קרמר-בל-אוונס (עקומה אדומה ומשוואת האגדה). הכניסה מציגה את זמן הדיסוציאציה הממוצע (<τ>) ב- Ftest. (E) התפלגות שינויים בהרחבה (ΔL) על אירועי קרע של קומפלקסים TRF1-טלומרים. קימורים שחורים ואדומים מייצגים אביזרים גאוסיאניים. נתון זה שונה באישור Li et al.41. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: המספר והגדלים של לולאות דנ"א שנוצרות על-ידי TRF1 בטלומר. (A) תלות באורך הטלומרים של גדלי לולאות DNA (ΔL) ב-[TRF1] = 20 ננומטר. עקומות מייצגות אביזרי גאוס. (B) תלות באורך הטלומרים של ΔL ב-[TRF1] = 40 ננומטר. (C) מתאם בין ΔL למספר אירועי הקרע לטלומר, N. המתאם מסדר אפס הוא r = -0.20, עם p < 0.001 (גודל מדגם = 1496). (D) קריקטורה המדגימה מנגנון אפשרי המסביר את המתאם השלילי בין ΔL ו-N, ומציעה כי TRF1 יכול לדחוס טלומר יחיד עם תחומי לולאה ראשוניים לטופולוגיה מסדר גבוה. נתון זה שונה באישור Li et al.41. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: קוד MatLab ליצירת scripts.m אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 2: סקריפט לכוח קבוע assay.txt. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: סקריפט לכבש כוח assay.txt. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 1: מתכונים אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משתמש בפינצטה מגנטית למניפולציה של TRFs ברמת המולקולה הבודדת 57,58,59. אנו משתמשים בחרוזים מגנטיים כדי להפריד TRFs ממקטעי DNA גנומיים. לאחר הגבלת העיכול, TRFs נקשרים לחרוזים המגנטיים, מה שמאפשר את הפרדה קלה שלהם מקטעי DNA גנומיים. גישה זו מאפשרת מניפולציה באמצעות פינצטה מגנטית, אשר יכולה ללכוד ביעילות חרוזים מגנטיים, בניגוד לפינצטה אופטית המוגבלת על ידי בעיות שקיפות. יתר על כן, בעוד AFM יכול לשמש למניפולציה של מולקולה יחידה, נדרשים צעדים נוספים כדי לנתק TRFs מחרוזים מגנטיים ולשתק אותם בין משטח נציץ לקצה הנציץ. לעומת זאת, פינצטה מגנטית מציעה שיטה פשוטה ויעילה יותר למניפולציה של מולקולות בודדות של TRFs, ומבטלת את הצורך בשלבים נוספים אלה41.

שמירה על שלמות הדנ"א הגנומי וה-TRF היא חיונית, שכן מניפולציה של מולקולות בודדות תלויה ב-TRF שלמים. באמצעות פינצטה מגנטית, אנו מותחים ומרפים TRFs על ידי החזקת שני הקצוות שלהם כדי לחקור אינטראקציות חלבון-דנ"א. מדידת כוח מדויקת על חרוזים מגנטיים היא בסיסית עבור בדיקות מכניות של מולקולה בודדת54. לפיכך, מגנטים בצורת קובייה צריכים להיות מיושרים במקביל או באורתוגונלי לנתיב האור של המצלמה בפינצטה מגנטית (הערה להלן שלב 4.3.3), מה שמבטיח רישום מיקום חרוזים תלת ממדי מדויק לכל משוואותמבוססות 54,60. היסט מגנט חיוני לקביעת מיקומם והכוחות הנובעים מכך על חרוזים מגנטיים. אנו משתמשים בזכוכית כיסוי #2 בעובי של כ 0.2 מ"מ לעקביות או מתאימים את ההיסט במשוואה למשקפי כיסוי שונים54. קצב פריימים חיוני ללכידת הדינמיקה של אינטראקציות חלבון-דנ"א, ומחייב זמן מת של אפס עבור נתוני תנועת חרוזים מלאים. התנועות המוטוריות, המקודדות על ידי סקריפט, הן מרכזיות בתכנון בדיקות מכניות של מולקולה אחת. פרמטרים קריטיים כגון קצב העמסת כוח, כוחות ומשכי זמן צריכים להיות מוגדרים וממוטבים באופן איטרטיבי. ריכוזי חלבונים המשמשים בבדיקות של מולקולות בודדות דורשים טיטרציה נרחבת כדי לקבוע את הרמה האופטימלית לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א. בדיקות כוח ראשוניות יכולות להתבצע באמצעות מבחני כבש כוח עם ספקטרוסקופיית כוח, בעוד שמבחני קפיצת כוח מעריכים כוחות עניין ברמה קבועה.

ניתן להיתקל במספר אתגרים בעת התאמת פרוטוקול זה. אם TRF1 או TRF2 אינם באים לידי ביטוי ב- E. coli, התחל בניסוי בקנה מידה קטן, תאי ליז, ונתח חלבונים באמצעות SDS-PAGE וצביעה, אישור עם Western Blot באמצעות נוגדנים ספציפיים לתג. יש לוודא את המבנה והפלסמיד כדי להבטיח שיבוט נכון ללא מוטציות, שינויי מסגרת או קודוני עצירה מוקדמים, ולבדוק את התאמת המקדם ל- E. coli. יש למטב את הביטוי על ידי בדיקת זני E. coli שונים (למשל, BL21(DE3), Rosetta), התאמת טמפרטורת הצמיחה (15-25 מעלות צלזיוס), זמן השראות (2-16 שעות) וריכוז IPTG (0.1-1 מילימול). יש לטפל בגופי ההכללה על ידי ניתוח כדורי התא לפני ואחרי סוניקציה. יש להתמודד עם הטיית קודון עם זנים המספקים tRNA נדיר או אופטימיזציה של קודון. נסה מדיות גדילה שונות (LB, שחפת, אינדוקציה אוטומטית) ושפר את האוורור על ידי התאמת מהירות הרעידה ונפח התרבית. עבור בעיות רעילות, השתמש במקדמים מוסדרים היטב או בווקטורים בעלי מספר העתקה נמוך יותר והוסף גלוקוז (0.2%) כדי לדכא ביטוי מקדם lac דולף. שמור על שלמות פלסמיד עם בחירה אנטיביוטית נכונה ולהבטיח שחרור חלבון מלא על ידי אופטימיזציה של שיטת ליזה התא61,62.

אם לא נמצאו קשירי TRF בבדיקות של מולקולות בודדות, אפשרות אחת היא שלא נעשה שימוש מספיק בדנ"א גנומי ראשוני. נסה להשתמש ב- 500 ננוגרם של דנ"א גנומי שווה ערך ל- TRFs כדי להגדיר בדיקה מכנית של מולקולה יחידה. בעיות מתמשכות במציאת קשירת TRF בפינצטה מגנטית עשויות לנבוע מזמני עיכול ארוכים מדי של DNA גנומי. שמור על הליך העיכול מתחת ל -12 שעות כדי למנוע פעילות כוכבים. נוסף על כך, היווצרות של מרובעי G במעטפת החד-גדילית של דנ"א טלומרי עשויה לעכב את חישולם של אוליגונוקלאוטידים המסומנים בביוטין לצורך קשירה לחרוזים מגנטיים. כדי למנוע זאת, שמור על ריכוזי יוני אשלגן או נתרן מתחת ל- 1 mM כדי למנוע היווצרות G-quadruplex ולהגדיל את הסבירות ליצירת קשרי TRF במערך המולקולה היחידה. בנוסף, העלאת טמפרטורת החימום במהלך שלב החישול (שלב 3.2.5) מסייעת לערער את יציבות G-quadruplexes ומקלה על קשירת אוליגונוקלאוטידים המסומנים בביוטין ל-TRFs.

בנוכחות חלבוני TRF1 או TRF2, קשירת דנ"א TRF עלולה להיות דחוסה היטב וקשה מדי למתוח בפינצטה מגנטית בשל שפע אתרי הקישור על הטלומרים עבור חלבונים אלה. טיטרציה של ריכוזי החלבונים יכולה לסייע בזיהוי רמות אופטימליות עבור בדיקות מכניות של מולקולה בודדת. ניתן להעריך את הזיקה בין חלבון לדנ"א באמצעות מבחני EMSA או SPR כדי לקבוע את קבוע הדיסוציאציה (Kd), אשר לאחר מכן יכול לספק ריכוזים מתאימים לבדיקות של מולקולה בודדת.

הכמות המוגבלת של TRFs המופקים מדנ"א גנומי עלולה לעכב את היעילות של בדיקות של מולקולות בודדות. כתוצאה מכך, איסוף נתונים של מולקולה בודדת עשוי להימשך זמן רב יותר בהשוואה לשימוש במבני דנ"א טלומריים מסונתזים באופן מלאכותי. עם זאת, שימוש בטלומרים שמקורם ישירות מהגנום האנושי מספק מספר יתרונות שדנ"א טלומרי מלאכותי, המוכן בדרך כלל על ידי פלסמיד בחיידקים או בשיטות PCR, אינו יכול להציע. יתרון אחד הוא ש-TRFs אנושיים הם הטרוגניים באורכם, ומאפשרים לבחון את התלות באורך הטלומרים באינטראקציות חלבון-דנ"א. לעומת זאת, דנ"א טלומרי מלאכותי הוא בדרך כלל אחיד באורכו, ויצירת דנ"א טלומרי מלאכותי באורכים שונים תהיה גוזלת זמן ועבודה רבה. בנוסף, TRFs אנושיים מכילים רצפים מקוריים מהתאים, כולל סמנים טבעיים כגון שינויים, מוטציות ונזקים. זה מאפשר לחקור אינטראקציות חלבון-דנ"א בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים, דבר שאינו אפשרי עם DNA טלומרי מלאכותי.

פרוטוקול זה חיוני למחקרים בתחום הביולוגיה של הטלומרים ברמת המולקולה הבודדת ועשוי להועיל לגילוי תרופות ממוקדות טלומר.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין [מענק 32071227 ל- Z.Y.], הקרן העירונית למדעי הטבע של טיאנג'ין של סין (22JCYBJC01070 עד Z.Y.), ומעבדת המפתח הממלכתית של טכנולוגיית מדידה מדויקת ומכשירים (אוניברסיטת טיאנג'ין) [Grant pilab2210 to Z.Y.].

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנטי דיגוקסיגניןRoche11214667001
BfaIניו אינגלנד ביולאב (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
מצלמת CMOS MikrotronMC1362
CviAIIניו אינגלנד ביולאב (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
פתרון מיצוי DNAG-CLONEEX0108
Dnase I, ללא Rnase, Hc EaThermo Fisher ScientificEN0523
תערובת dNTPNanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)P032-02
DTTSolarbioD1070
Dynabeads M-270  חרוזיםThermo Fisher Scientific65305חרוזי סטרפטווידין
Dynabeads MyOne חרוזיםתרמו פישר סיינטיפיק65001חרוזי סטרפטווידין
אתנולטיאנג'ין מס' 6 מפעל ריאגנטים כימיים1083
גליצרולבייג'ינג Hwrkchemical ושות'. בע"מSMG66258-1
ImidazoleSolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
איזופרופנולטיאנג'ין מס' 6 מפעל ריאגנטים כימייםA1079
KanamycinThermo Fisher ScientificEN0523
שבר Klenow (3′-5′ exo-)New England Biolab (NEB)M0212S
LabViewNational Instrumentshttps://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.htmlתוכנת תכנות גרפית 
LiClBide Pharmatech Co., Ltd (בידפארם)BD136449
LysozymeSolarbioL8120-5
MseIניו אינגלנד ביולאב (NEB)R0525S
NaClשנחאי אלאדיןC111533
NanoDropתרמו פישרספקטרופוטומטר
NdeIניו אינגלנד ביולאב (NEB)R0111S
Ni NTA חרוזים 6FFצ'אנגג'ואו Smart-Lifesciences ביוטכנולוגיה ושות', בע"מSA005025
ניטרוצלולוז ממברנהABclonalRM02801
PMSFSolarbioP8340
Proteinase KBeyotime Biotech Inc (beyotime)ST535-500mg
rCutSmart Bufferניו אינגלנד Biolab (NEB)B6004S
Rnase ASigma-AldrichR4875
נתרן אצטטSERVA Electrophoresis GmbH2124902
סומו פרוטאזBeyotime Biotech Inc (beyotime)P2312M
מדעי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human telomere biology: A contributory and interactive factor in aging, disease risks, and protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
  2. Li, N., et al. The dynamics of forming a triplex in an artificial telomere inferred by DNA mechanics. Nucleic Acids Res. 47 (15), e86(2019).
  3. Yu, Z., et al. Click chemistry assisted single-molecule fingerprinting reveals a 3d biomolecular folding funnel. J Am Chem Soc. 134 (30), 12338-12341 (2012).
  4. Karimian, K., et al. Human telomere length is chromosome end-specific and conserved across individuals. Science. 384 (6695), 533-539 (2024).
  5. Maciejowski, J., De Lange, T. Telomeres in cancer: Tumour suppression and genome instability. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (3), 175-186 (2017).
  6. Kinzig, C. G., Zakusilo, G., Takai, K. K., Myler, L. R., De Lange, T. Atr blocks telomerase from converting DNA breaks into telomeres. Science. 383 (6684), 763-770 (2024).
  7. Takai, H., Aria, V., Borges, P., Yeeles, J. T. P., De Lange, T. Cst-polymerase α-primase solves a second telomere end-replication problem. Nature. 627 (8004), 664-670 (2024).
  8. De Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
  9. De Lange, T. Shelterin-mediated telomere protection. Annual Review of Genetics. 52 (1), 223-247 (2018).
  10. Liu, B., et al. Structure of active human telomerase with telomere shelterin protein TPP1. Nature. 604 (7906), 578-583 (2022).
  11. Sfeir, A., De Lange, T. Removal of shelterin reveals the telomere end-protection problem. Science. 336 (6081), 593-597 (2012).
  12. Sarek, G., et al. Cdk phosphorylation of trf2 controls t-loop dynamics during the cell cycle. Nature. 575 (7783), 523-527 (2019).
  13. Myler, L. R., et al. DNA-PK and the TRF2 IDDR inhibit MRN-initiated resection at leading-end telomeres. Nat Struct Mol Biol. 30 (9), 1346-1356 (2023).
  14. Hanaoka, S., Nagadoi, A., Nishimura, Y. Comparison between TRF2 and TRF1 of their telomeric DNA-bound structures and DNA-binding activities. Protein Sci. 14 (1), 119-130 (2005).
  15. Chen, Y., et al. A shared docking motif in TRF1 and TRF2 used for differential recruitment of telomeric proteins. Science. 319 (5866), 1092-1096 (2008).
  16. Wan, B., et al. SLX4 assembles a telomere maintenance toolkit by bridging multiple endonucleases with telomeres. Cell Reports. 4 (5), 861-869 (2013).
  17. Rai, R., et al. NBS1 phosphorylation status dictates repair choice of dysfunctional telomeres. Molecular Cell. 65 (5), 801-817.e4 (2017).
  18. Benarroch-Popivker, D., et al. Trf2-mediated control of telomere DNA topology as a mechanism for chromosome-end protection. Mol Cell. 61 (2), 274-286 (2016).
  19. Poulet, A., et al. The n-terminal domains of TRF1 and TRF2 regulate their ability to condense telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 40 (6), 2566-2576 (2012).
  20. Schmutz, I., Timashev, L., Xie, W., Patel, D. J., De Lange, T. TRF2 binds branched DNA to safeguard telomere integrity. Nat Struct Mol Biol. 24 (9), 734-742 (2017).
  21. Doksani, Y., Wu, J. Y., De Lange, T., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence imaging of telomeres reveals TRF2-dependent t-loop formation. Cell. 155 (2), 345-356 (2013).
  22. Di Maro, S., et al. Shading the TRF2 recruiting function: A new horizon in drug development. J Am Chem Soc. 136 (48), 16708-16711 (2014).
  23. Gao, J., Pickett, H. A. Targeting telomeres: Advances in telomere maintenance mechanism-specific cancer therapies. Nat Rev Cancer. 22 (9), 515-532 (2022).
  24. Bejarano, L., et al. Inhibition of TRF1 telomere protein impairs tumor initiation and progression in glioblastoma mouse models and patient-derived xenografts. Cancer Cell. 32 (5), 590-607.e4 (2017).
  25. Chen, X., et al. Cyclic peptidic mimetics of apollo peptides targeting telomeric repeat binding factor 2 (TRF2) and apollo interaction. ACS Med Chem Lett. 9 (5), 507-511 (2018).
  26. Erdel, F., et al. Telomere recognition and assembly mechanism of mammalian shelterin. Cell Rep. 18 (1), 41-53 (2017).
  27. Pendlebury, D. F., et al. Dissecting the telomere-inner nuclear membrane interface formed in meiosis. Nat Struct Mol Biol. 24 (12), 1064-1072 (2017).
  28. Court, R., Chapman, L., Fairall, L., Rhodes, D. How the human telomeric proteins trf1 and trf2 recognize telomeric DNA: A view from high-resolution crystal structures. EMBO Rep. 6 (1), 39-45 (2005).
  29. Hu, H., et al. Structural basis of telomeric nucleosome recognition by shelterin factor trf1. Sci Adv. 9 (34), eadi4148(2023).
  30. Nurk, S., et al. The complete sequence of a human genome. Science. 376 (6588), 44-53 (2022).
  31. Rhie, A., et al. The complete sequence of a human y chromosome. Nature. 621 (7978), 344-354 (2023).
  32. Chang, T. R., Long, X., Shastry, S., Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule mechanical analysis of strand invasion in human telomere DNA. Biochemistry. 61 (15), 1554-1560 (2022).
  33. Kaur, P., et al. TIN2 is an architectural protein that facilitates TRF2-mediated trans- and cis-interactions on telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 49 (22), 13000-13018 (2021).
  34. Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule studies of telomeres and telomerase. Annu Rev Biophys. 46, 357-377 (2017).
  35. Zhao, X., et al. Exploring TRF2-dependent DNA distortion through single-DNA manipulation studies. Commun Biol. 7 (1), 148(2024).
  36. Patrick, E. M., Slivka, J. D., Payne, B., Comstock, M. J., Schmidt, J. C. Observation of processive telomerase catalysis using high-resolution optical tweezers. Nat Chem Biol. 16 (7), 801-809 (2020).
  37. Soman, A., et al. Columnar structure of human telomeric chromatin. Nature. 609 (7929), 1048-1055 (2022).
  38. Jansson, L. I., et al. Telomere DNA G-quadruplex folding within actively extending human telomerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (19), 9350-9359 (2019).
  39. Soranno, A., et al. Shelterin components modulate nucleic acids condensation and phase separation in the context of telomeric DNA. J Mol Biol. 434 (16), 167685(2022).
  40. Wong, S. Y., et al. The shelterin component TRF2 mediates columnar stacking of human telomeric chromatin. EMBO J. 43 (1), 87-111 (2024).
  41. Li, X., et al. Dynamics of TRF1 organizing a single human telomere. Nucleic Acids Res. 49 (2), 760-775 (2021).
  42. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of g-quadruplexes by magnetic tweezers. J Vis Exp. (127), e56328(2017).
  43. Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for the measurement of twist and torque. J Vis Exp. (87), e51503(2014).
  44. Ma, K., et al. A DNA force circuit for exploring protein-protein interactions at the single-molecule level. Chinese Journal of Chemistry. 42 (13), 1456-1464 (2024).
  45. LB liquid medium. Cold Spring Harb Protoc. 2016 (9), (2016).
  46. LB agar plates. Cold Spring Harb Protoc. 2024 (4), (2024).
  47. HEPES buffer. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).
  48. SDS-PAGE gel. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), (2015).
  49. 10x PBS. Cold Spring Harb Protoc. 2007 (4), (2007).
  50. TE buffer (1x). Cold Spring Harb Protoc. 2016 (5), (2016).
  51. Green, M. R., Sambrook, J. Buffers. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (2), (2018).
  52. Tris buffer (1 M, pH 7.5). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), (2011).
  53. EDTA. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  54. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Rev Sci Instrum. 85 (12), 123114(2014).
  55. Wang, Z., et al. Reading time and DNA sequence preference of TET3 CXXC domain revealed by single-molecule profiling. Chinese J Chem. 41 (10), 1177-1184 (2023).
  56. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  57. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: Calibration and applications for DNA dynamics. Biophys J. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  58. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophys J. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  59. Te Velthuis, A. J., Kerssemakers, J. W., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophys J. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  60. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Rev Sci Instrum. 85 (10), 103712(2014).
  61. Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2021 (11), (2021).
  62. Haneskog, L. Purification of histidine-tagged proteins using stepwise elution with imidazole. Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Telomeric Protein DNAMagnetic TweezersSingle Molecule MethodsTRF2 PurificationTelomeric DNA PreparationShelterin ComplexForce Ramp AssayDNA Protein InteractionsDissociation KineticsSouthern Blotting

מאמרים קשורים