הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה בתאי HEK מהונדסים גנטית

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67257

⸱

6 בספטמבר 2024

 ,  , 
1Faculty of Electrical Engineering, University of Ljubljana

במאמר זה

סיכום

לחקר תגובות של תאים מעוררים במבחנה, הפרוטוקול מתאר ניטור אופטי של שינויים ביצירת פוטנציאל הפעולה עקב אלקטרופורציה במודל תא מעורר פשוט של תאי HEK מהונדסים גנטית וכן שינויים במתח הטרנסממברני עם מיצוי אוטומטי של פרמטרים רלוונטיים.

תקציר

תאים מעוררים כגון תאי עצב ושריר יכולים להיות מטרות עיקריות בטיפולים מבוססי אלקטרופורציה המתפתחים במהירות. עם זאת, הם יכולים להיות מושפעים מפולסים חשמליים גם בטיפולים שבהם הם אינם המטרות העיקריות, וזה יכול לגרום לתופעות לוואי שליליות. לכן, כדי לייעל את הטיפולים מבוססי האלקטרופורציה ברקמות מעוררות ולא מעוררות, יש צורך לחקור את ההשפעות של פולסים חשמליים על תאים מעוררים, תעלות היונים שלהם וריגוש במבחנה. למטרה זו, פותח פרוטוקול לניטור אופטי של שינויים ביצירת פוטנציאל הפעולה עקב אלקטרופורציה במודל תא מעורר פשוט של תאי HEK מהונדסים גנטית. עם שימוש בצבע פוטנציומטרי פלואורסצנטי, השינויים במתח הטרנסממברני נוטרו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ופרמטרים רלוונטיים של תגובות התא חולצו אוטומטית עם יישום MATLAB. בדרך זו, ניתן היה להעריך ביעילות את תגובות התאים המעוררים לפולסים חשמליים שונים ואת יחסי הגומלין בין עירור ואלקטרופורציה.

מבוא

באלקטרופורציה, פולסים חשמליים במתח גבוה גורמים לעלייה בחדירות קרום הפלזמה עבור מולקולות שאחרת אינן מוכשרות בצורה גרועה1. טכניקות מבוססות אלקטרופורציה נמצאות כיום בשימוש נרחב ביישומים ברפואה2, ביוטכנולוגיה3 וטכנולוגיית מזון4.

תאים מעוררים כגון תאי עצב ושריר הם בין המטרות העיקריות בטיפולים מבוססי אלקטרופורציה המתפתחים במהירות בלב, במוח ובשרירי השלד5. יתר על כן, הם יכולים להיות מושפעים מפולסים חשמליים גם בטיפולים שבהם הם אינם המטרות העיקריות, וזה יכול לגרום לתופעות לוואי שליליות כגון כאב, עוויתות שרירים ונזק עצבי6. כלומר, פולסים חשמליים יכולים לגרום לגירוי חשמלי של תאים מעוררים: הם מפעילים תעלות יונים מגודרות מתח ומפעילים פוטנציאל פעולה (AP). עם זאת, בשדות חשמליים גבוהים יותר, קרום הפלזמה של התאים הופך לחדירה, וזרם יוני נוסף דרך נקבוביות/פגמים מתרחש7. זרם יוני נוסף זה משפיע על ריגוש התאים במשחק גומלין מורכב בין עירור לאלקטרופורציה. לכן, כדי לייעל את הטיפולים מבוססי האלקטרופורציה ברקמות מעוררות ולא מעוררות, יש צורך לחקור את ההשפעות של פולסים חשמליים על תאים מעוררים, תעלות היונים שלהם וריגוש במבחנה.

במחקר שנערך לאחרונה8, חקרנו תאי כליה עובריים אנושיים מהונדסים גנטית (HEK) שפותחו על ידי כהן ואחרים 9,10, ככלי רב ערך לחקר אלקטרופורציה בתאים מעוררים. בתאים אלה שאינם ניתנים לריגוש, מתבטא השלמה מינימלית של תעלות נתרן ואשלגן (NaV1.5 ו- Kir2.1) הדרושה להתרגשות. הביטוי של Kir2.1 בתאים אלה נשלט על ידי מערכת tet-on המושרה על ידי דוקסיציקלין המאפשרת הקמה של שתי גרסאות תאים: S-HEK מעורר (המכיל NaV1.5 ו-Kir2.1) ותאי NS-HEK שאינם מעוררים (המכילים רק NaV1.5 ערוצים). זה מאפשר לנו להשוות את ההשפעות של פולסים חשמליים על גרסאות מעוררות ולא מעוררות של אותו סוג תאים. בהשוואה לתאים מעוררים ראשוניים מבודדים, תאים מעוררים המובחנים מתאי גזע פלוריפוטנטיים עובריים או מושרים, וקווי תאים שמקורם ברקמות מעוררות, לתאי S-HEK יש מספר יתרונות: הם קלים לטיפול, טיפוח והפצה, בעלי תעלות נתרן ואשלגן מוגדרות היטב ומייצרים APs חזקים8.

עיצבנו פרוטוקול לניטור שינויים במתח טרנסממברני (TMV) המופעלים על ידי פולסים חשמליים של אמפליטודות שונות באמצעות צבע פוטנציומטרי פלואורסצנטי. בדרך זו, אנו יכולים לחקור כיצד אלקטרופורציה משפיעה על יצירת AP בתאי S-HEK ושינויים אחרים ב-TMV הן בתאי S-HEK והן בתאי NS-HEK. בקצרה, תאי S-HEK או NS-HEK נחשפים לפולס חשמלי יחיד של 100 מיקרון כל 2 דקות, ושינויים יחסיים בקרינה נרשמים במשך כ-3 שניות סביב כל יישום פולס. הפולסים המופעלים הם של מתח הולך וגובר, מפעילים תחילה APs בתאים, ובשדה חשמלי גבוה יותר, אלקטרופורציה. המרווח של 2 דקות בין יישום הדופק נבחר כדי למזער את ההשפעות המצטברות האפשריות של פולסים עוקבים תוך שמירה על ניסויים קצרים מספיק כדי לא לדרדר את התאים. עיבוד התמונה היה אוטומטי עם יישום MATLAB מותאם אישית כדי לחלץ פרמטרים רלוונטיים של תגובות הקרינה של הצבע הפוטנציומטרי, ומכאן להעריך את השינויים ב-TMV (APs ודפולריזציה מתמשכת עקב אלקטרופורציה) בתאי S-HEK ו-NS-HEK.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים ותרביות תאים

  1. הכן את מדיום תרבית התאים על ידי השלמת גלוקוז בינוני-גבוה של Dulbecco עם 10% סרום בקר עוברי, 2 מ"מ גלוטמין, פניצילין-סטרפטומיצין (פניצילין 100 יח'/מ"ל, סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל), 2 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין, 5 מיקרוגרם/מ"ל בלסטיצידין ו-200 מיקרוגרם/מ"ל גנטיצין.
  2. הכן תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) עם 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na2HPO4 ו-1.8 מ"מ KH2PO4, pH 7.4. סנן אותו דרך מסנן ממברנה מעקר בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
  3. הכן תמיסת Tyrode עם 2 מ"מ KCl, 125 מ"מ NaCl, 2 מ"מ CaCl2, 1 מ"מ MgCl2, 10 מ"מ HEPES, 30 מ"מ גלוקוז, pH 7.3. הכן תמיסת Tyrode נמוכה אשלגן עם 0.5 מ"מ KCl, 126.5 מ"מ NaCl, 2 מ"מ CaCl2, 1 מ"מ MgCl2, 10 מ"מ HEPES, 30 מ"מ גלוקוז, pH 7.3. סנן את שתי התמיסות דרך מסנן ממברנה מעקר בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
  4. הכן תמיסת מלאי פולי-L-ליזין של 1 מ"ג/מ"ל על ידי הוספת 5 מ"ל PBS בבקבוקון המכיל 5 מ"ג פולי-L-ליזין.
  5. הכינו תמיסת מלאי דוקסיציקלין של 2 מ"ג/מ"ל במים מזוקקים וסננו אותה דרך מסנן ממברנה מעקר בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
  6. הכן תמיסת מלאי צבע פוטנציומטרי של 4 מ"מ ElectroFluor630 באתנול טהור (הוסף 25 מיקרוליטר אתנול טהור לצינור המכיל 100 ננומטר - 73 מיקרוגרם של הצבע).
  7. תרבית תאי HEK מהונדסים גנטית בבקבוק T25 ב-6 מ"ל של מדיום תרבית התאים כפי שתואר קודם לכן8. המרכיבים של מדיום התרבות רגישים לאור; לפיכך, שמור על המדיום מוגן מפני אור (עטפו את הבקבוק הבינוני בנייר אלומיניום) ובצעו מעבר בתנאי תאורה חלשים.
  8. העבירו את התאים כל 3-4 ימים על ידי זריעת 3 x 105 או 5 x 105 תאים לבקבוק T25 טרי. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. שמור על תאים בבקבוק ראשי כתאי NS-HEK שאינם מעוררים ללא תוספת דוקסיציקלין מכיוון שהם אינם סובלים ביטוי מתמשך של Kir2.1. השתמש בתאים ממעברים נמוכים מ-14 בניסויים.

2. הכנת מדגם

  1. ציפוי פולי-L-ליזין של שקופיות תא זכוכית כיסוי
    1. פיפטה 1 מ"ל של PBS לבאר אחת של שקופיות תא הזכוכית עם 2 בארות, הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת פולי-L-ליזין סטרילית של 1 מ"ג/מ"ל וערבב היטב עם פיפטה.
    2. דגירה למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר בתנאים סטריליים במכסה זרימה למינרית. הסר את ה-PBS עם פולי-L-ליזין ללא כל כביסה נוספת.
  2. זריעת התאים
    1. הכן דילול של 1:10 של תמיסת מלאי דוקסיציקלין במדיום תרבית בצינור של 1.5 מ"ל. עבור כל באר יש צורך בדילול של 30 מיקרוליטר של 1:10 דוקסיציקלין (3 מיקרוליטר של תמיסת מלאי דוקסיציקלין ו-27 מיקרוליטר של מדיום תרבית), הכינו את הנפח הסופי בהתאם למספר הכולל של בארות הניסוי.
    2. הסר את מדיום התרבות מבקבוק T25 ונסה את התאים עם 2.5 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA בחממת CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
    3. הוסף 2.5 מ"ל של מדיום תרבית טרי ועל ידי פיפטינג עדין נתק את התאים מהשטח. מערבבים היטב את מתלה התאים.
    4. ספרו את התאים בעזרת המוציטומטר וקבעו את צפיפות התאים בהשעיה.
    5. חשב את נפח תרחיף התאים הטריפסיני הדרוש לביסוס התרבית. לתרבית של יומיים, זרע 2.5 x 105 תאים, ולתרבית של 3 ימים, זרע 1 x 105 תאים לבאר. התאם את מספר התאים המדויק במידת הצורך.
    6. חשב את נפח מדיום התרבות על ידי הפחתת נפח תרחיף התאים שחושב בעבר מ -1470 מיקרוליטר. 30 מיקרוליטר הנותרים מייצגים את הנפח של דילול דוקסיציקלין 1:10. הנפח הכולל בכל באר יהיה 1500 מיקרוליטר (תאים, דוקסיציקלין ומדיום תרבית).
    7. להכנת דגימות עם תאי S-HEK מעוררים, פיפטה את הנפח המחושב של מדיום התרבות ותרחיף התאים הטריפסיני לבאר אחת והוסף 30 מיקרוליטר של דילול דוקסיציקלין 1:10. השתמש רק בבאר אחת מבין שני תאי הבארות מכיוון שהניסוי לוקח זמן רב (בסביבות 40 דקות). מערבבים היטב על ידי פיפטינג עדין ממש לפני הכנסת התאים לחממת CO2 .
    8. להכנת דגימות עם תאי NS-HEK שאינם מעוררים, פיפטה את הנפח המחושב של מדיום התרבות לבאר והוסף 90% מהנפח המחושב של תרחיף התאים לתאי S-HEK ללא דוקסיציקלין. תאי NS-HEK גדלים מעט מהר יותר מתאי S-HEK.
    9. דגרו את התאים בחממה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים לפני הניסוי. עבור דגימות עם דוקסיציקלין, זמן הדגירה הזה מספיק כדי להפוך את התאים למעוררים.
  3. תיוג התאים
    1. לפני הניסוי, פיפטה 3 מיקרוליטר של תמיסת מלאי צבע פוטנציומטרי לצינור של 1.5 מ"ל והשאיר את הצינור הפתוח בטמפרטורת החדר במכסה זרימה למינרי כדי לאפשר לאתנול להתאדות ולצבע הפוטנציומטרי להתייבש (כ-15 דקות). מוסיפים לצינור 997 מיקרוליטר של מדיום תרבית קרה (ממקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס) וממיסים את הצבע לריכוז סופי של 12 מיקרומטר.
    2. הסר את מדיום התרבות מהבאר והוסף 1 מ"ל תמיסת צבע פוטנציומטרית לתאים. מקררים אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומדגרים למשך 20 דקות.
    3. הסר את תמיסת הצבע הפוטנציומטרית ושמור אותה בשפופרת לשימוש חוזר נוסף (עד שישה ניסויים עוקבים ביום אחד).
    4. שטפו בעדינות את התאים פי 3 עם תמיסת Tyrode, ולאחר הכביסה האחרונה, פיפטה 1 מ"ל של תמיסת Tyrode דלת אשלגן לבאר.

3. גירוי חשמלי ואלקטרופורציה

  1. הגדר סנכרון של אספקת הדופק עם רכישת תמונה באמצעות אות TTL ממערכת המיקרוסקופ המפעילה את מחולל הדופק. ליצירת פולסים במתח גבוה, השתמש במחולל דופק מותאם אישית11 או בכל מחולל דופק שניתן להפעיל חיצונית עם אות TTL.
    הערה: בתצורה הניסיונית המוצגת, תוכנת LAS X משמשת לרכישת תמונה, אותה ניתן להגדיר לשליחת אות TTL בזמן שנבחר מראש במהלך רכישת זמן-lapse.
  2. הנח שתי אלקטרודות חוט Pt/Ir מקבילות, בקוטר 0.8 מ"מ ומרחק של 5 מ"מ בין הקצוות הפנימיים, בתחתית החדר וקבע את החדר מתחת למיקרוסקופ.
  3. חבר את האלקטרודות למחולל הדופק. חבר את הפלט של מחולל הדופק לאוסילוסקופ באמצעות בדיקת מתח וזרם כדי לאפשר אימות שהפולסים הועברו כהלכה במהלך הניסוי.
  4. מקד את התאים בשדה בהיר. דמיינו את התאים שנמצאים בערך באמצע בין האלקטרודות.
  5. התחל את הרכישה הראשונה של תמונות פלואורסצנטיות במצב זמן-lapse עם מטרה של פי 40, תוך הקלטת אות הקרינה בכל שדה הראייה. המצלמה צריכה להיות מהירה מספיק כדי לרכוש מהלך זמן ברור של פוטנציאל פעולה (באופן אידיאלי גבוה מ-25 פריימים לשנייה).
    1. השג 80 תמונות במצב דולג זמן, עם לפחות 25 פריימים לשנייה כדי לפתור את מהלך הפעולה בזמן אמת. משך הזמן הכולל של רכישת התמונה מביא לסביבות 3 שניות. במהלך רכישת התמונה, האירו את התאים באורך גל עירור של 635 ננומטר, זמן חשיפה של 10 אלפיות השנייה וזהו את הפליטה בסביבות 700 ננומטר. ברכישה ראשונה זו, אל תפעיל שום דופק - רכישה זו תשמש לתיקון הרכישות הבאות להלבנת צבע. לאחר רכישה זו, המתן 2 דקות.
      הערה: ניסוי זה משתמש ב-27.8 פריימים לשנייה, כלומר תקופה של 36 אלפיות השנייה, שהוא הזמן מתחילת רכישת התמונה הראשונה ועד לתחילת רכישת התמונה הבאה בהקלטת זמן-lapse).
  6. כל 2 דקות, הקלט דולג זמן באותו אופן כמו בשלב 3.5. עבור רכישות אלה, החל פולס יחיד של 100 מיקרון בזמן רכישת התמונה העשירית (ב-324 אלפיות השנייה). רכוש תמונות עם מתחי הפולסים הבאים: 63 וולט, 75 וולט, 88 וולט, 100 וולט, 125 וולט, 150 וולט, 175 וולט ו-200 וולט. הערך את השדה החשמלי שאליו נחשפים התאים כיחס המתח למרחק האלקטרודה המופעל (E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 ו-400 וולט/ס"מ).
    הערה: בשדות חשמליים נמוכים יותר, הפולסים יפעילו פוטנציאל פעולה; בשדות חשמליים גבוהים יותר, הם יפעילו אלקטרופורציה, המתבטאת בדפולריזציה ממושכת. משך הניסוי על כל דגימת תאים הוא כ-40 דקות (20 דקות לתיוג ו-20 דקות למיקרוסקופיה).

4. ניתוח נתונים

  1. ייצא את הקלטות ה-Time-lapse לפורמט tiff.
  2. מקם הקלטות זמן-lapse של כל המתחים המופעלים במהלך ניסוי בודד (דגימה אחת של תאים) בתיקיה אחת. שנה את שמות הקלטות ה-Time-lapse בצורה כזו שניתן יהיה לזהות את השדה החשמלי E על ידי יישום MATLAB: Vcm (למשל, 126Vcm עבור 126 V/cm). החלקים הנותרים של השם יכולים להיות שרירותיים. לרכישה בתחילת הניסוי שבו לא מופעל דופק, שנה את השם באמצעות הביטוי 000Vcm. דוגמה לשמות ההקלטה של זמן-lapse: 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm וכו'.
  3. פתח את היישום, אותו ניתן להוריד מ
    https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. לחץ על בחר תיקיית נתונים כדי לבחור את התיקיה המכילה הקלטות זמן-lapse של ניסוי אחד.
  4. בחר את הפיקסלים שישמשו להמשך ניתוח הנתונים. לשם כך, השתמש בשני מחוונים כדי לקבוע את הסף הנמוך לתמונה ברורה של הממברנות (בסגול) ואת הסף הגבוה לסילוק פסולת (כתמים גדולים עם פלואורסצנטיות גבוהה) מהניתוח (בירוק).
  5. בחר נתח נתונים. בכרטיסיה ניתוח, מופיעה טבלה עם פרמטרים שחולצו. בצד ימין של הטבלה מופיעים גרפים של פלואורסצנטיות יחסית בזמן עבור כל E בשימוש. בחר גרפים עבור E נתון מהתפריט הנפתח בצד שמאל מעל הטבלה.
  6. בדוק את כל הגרפים ובצע תיקון ידני במקרה של זיהוי שיא שגוי. בחר נקה פסגות אוטומטיות בחלק התחתון בכרטיסיה ניתוח, והפסגות שזוהו באופן אוטומטי ינוקו. לחץ על הגרף כדי לקבוע ידנית נקודת זמן שיא חדשה.
  7. בחר הפעל מחדש זיהוי שיא אוטומטי בחלק התחתון בכרטיסיה ניתוח כדי לבצע שוב זיהוי שיא אוטומטי. הפרמטרים שחולצו יותאמו כעת לשיא החדש.
  8. בחר Export Data בפינה השמאלית התחתונה בכרטיסייה Analysis כדי לייצא נתונים לאותה תיקייה בצורת קובץ .mat, קובץ גיליון אלקטרוני ותמונות PNG עבור כל E בשימוש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתן לנטר אופטית שינויים ב-TMV בתאים מעוררים במבחנה המופעלים על ידי פולסים חשמליים באמצעות פרוטוקול זה, וניתן לנתח את אותות הקרינה כדי לחלץ את הפרמטרים הרלוונטיים שלהם.

מערך הניסוי מוצג באיור 1A. אות טיפוסי של פולס חשמלי של 100 מיקרון-שניות המשמש בניסויים מוצג באיור 1B. תאים בתאים שממוקמים מתחת למיקרוסקופ בדרך כלל נראים כמו התאים באיור 1C (תמונת שדה בהיר) ובאיור 1D (...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תאי S-HEK הם מודל פשוט של תאים מעוררים עם תעלות נתרן ואשלגן מוגדרות היטב, NaV1.5 ו- Kir2.19. זה מאפשר לנו לבצע מחקרי עומק על האופן שבו תאים מעוררים מגיבים לפולסים חשמליים מופעלים ולקשר את נתוני הניסוי למודלים מתמטיים המבוססים על המאפיינים התיאורטיים הידועים של הערוצים המתבטאים בתאי S-HEK. במחקר הקודם שלנו8, תיארנו את התגובות של תאים אלה לפולסים של 100 מיקרון של עלייה ב-E הן בניסוי והן בתיאוריה. ב-E נמוך יותר, תאי S-HEK...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי סוכנות המחקר והחדשנות הסלובנית (ARIS) במסגרת תוכנית המחקר P2-0249, תוכנית התשתית I0-0022 ופרויקט המחקר J2-2503. העבודה נתמכה בחלקה על ידי ARIS ואוניברסיטת לובליאנה באמצעות מימון תוכניות מחקר לסטארט-אפים. העבודה נתמכה בחלקה על ידי האיחוד האירופי ו-ARIS באמצעות מימון NextGenerationEU ו-NOO במסגרת פרויקט MN-0023. העבודה נתמכה בחלקה על ידי האיחוד האירופי באמצעות מענק התחלתי של ERC (מס' 101115323 - גלגול נשמות) ומלגת מארי סקלודובסקה-קירי (מס' 893077 - EPmIC). עם זאת, ההשקפות והדעות המובעות הן של המחברים בלבד ואינן משקפות בהכרח את אלה של האיחוד האירופי או מועצת המחקר האירופית. לא האיחוד האירופי ולא הרשות המעניקה לא יכולים לשאת באחריות להם. המחברים מודים לקבוצה של אדם א. כהן מאוניברסיטת הרווארד על שסיפקה באדיבות את תאי ה-HEK המקפיצים את ה-tet-on, ולדושה הודג'יץ' על עזרתה במעבדת תרביות התאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור 1.5 מ"לRatiolab 5615000
2 בארות Nunc Lab-Tek II Chambered #1.5 מערכת כיסוי גרמניתThermo Fisher Scientific 
155379 ADP305 בדיקת מתח דיפרנציאליTeledyne LeCroy
AP015 בדיקת זרםTeledyne LeCroy
Blasticidin תרמו פישר סיינטיפיק 
חממת CO2 PHCbi MCO -230AICUV
דוקסיציקלין סיגמא-אולדריץ'/מרקD9891
דולבקו s Modifed Eagle' s בינוני גבוה גידול גלוקוזבינוני Sigma-Aldrich/MerckD5671
ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)בדיקות פוטנציומטריות31795
סרום בקר עובריSigma-Aldrich/MerckF2442
גנטיציןתרמו פישר מדעי 
גלוטמיןסיגמא-אולדריץ'/MerckG7513
קולט אדים למינרי IskraPio MC 15-2
MATLABMathworks
פניצילין– סטרפטומיציןסיגמא-אולדריץ'/MerckP07681
פולי-L-ליזין הידרוברומיד סיגמא-אולדריץ'/מרקP9155-5MG   
מחולל פולסים בהתאמהראה התייחסות11
PuromycinThermo Fisher Scientific 
T25 25 ס"מ ו-sup2; בקבוק תרבית רקמהTPP 90026
תאי HEK מזנקים Tet-onאוסף תרבית מסוג אמריקאי ATCCCRL-3479
מערכת תאים חיים של Thunder Imager למיקרוסקופיה פלואורסצנטיתLeica Microsystems 
פתרון Trypsin-EDTASigma-Aldrich/MerckT3924
WavePro 7300A אוסילוסקופTeledyne LeCroy
A111390310131035 אישית A1113803

מקורות

  1. Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavčič, D. Membrane electroporation and electropermeabilization: Mechanisms and models. Ann Rev Biophys. 48 (1), 63-91 (2019).
  2. Yarmush, M. L., Golberg, A., Serša, G., Kotnik, T., Miklavčič, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Ann Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
  3. Kotnik, T., et al. Electroporation-based applications in biotechnology. Trend Biotechnol. 33 (8), 480-488 (2015).
  4. Mahnič-Kalamiza, S., Vorobiev, E., Miklavčič, D. Electroporation in food processing and biorefinery. J Memb Biol. 247 (12), 1279-1304 (2014).
  5. Reddy, V. Y., et al. Pulsed field or conventional thermal ablation for paroxysmal atrial fibrillation. New Engl J Med. 389 (18), 1660-1671 (2023).
  6. Cvetkoska, A., Maček-Lebar, A., Trdina, P., Miklavčič, D., Reberšek, M. Muscle contractions and pain sensation accompanying high-frequency electroporation pulses. Sci Rep. 12 (1), 8019(2022).
  7. Tung, L., Tovar, O., Neunlist, M., Jain, S. K., O'neill, R. J. Effects of strong electrical shock on cardiac muscle tissue. Ann New York Acad Sci. 720 (1), 160-175 (1994).
  8. Batista Napotnik, T., et al. Genetically engineered HEK cells as a valuable tool for studying electroporation in excitable cells. Sci Rep. 14 (1), 720(2024).
  9. McNamara, H. M., Zhang, H., Werley, C. A., Cohen, A. E. Optically controlled oscillators in an engineered bioelectric tissue. Phys Rev X. 6 (3), 031001(2016).
  10. Tian, H., et al. Video-based pooled screening yields improved far-red genetically encoded voltage indicators. Nat Methods. 20 (7), 1082-1094 (2023).
  11. Sweeney, D. C., et al. Quantification of cell membrane permeability induced by monopolar and high-frequency bipolar bursts of electrical pulses. Biochim Biophys Acta Biomembranes. 1858 (11), 2689-2698 (2016).
  12. Pakhomov, A. G., et al. Long-lasting plasma membrane permeabilization in mammalian cells by nanosecond pulsed electric field (nsPEF). Bioelectromagnetics. 28 (8), 655-663 (2007).
  13. Lee, P., et al. In vivo ratiometric optical mapping enables high-resolution cardiac electrophysiology in pig models. Cardiovasc Res. 115 (11), 1659-1671 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

השפעות אלקטרופורציהמערכת Tet-Onתאים עירוריםמיקרוסקופיית פלורסצנציהצבע פוטנציומטריגירוי באמצעות פולסים חשמלייםפעילות תעלות יוניםניתוח MATLAB
ניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה בתאי HEK מהונדסים גנטית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.