ניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה בתאי HEK מהונדסים גנטית

Summary

לחקר תגובות של תאים מעוררים במבחנה, הפרוטוקול מתאר ניטור אופטי של שינויים ביצירת פוטנציאל הפעולה עקב אלקטרופורציה במודל תא מעורר פשוט של תאי HEK מהונדסים גנטית וכן שינויים במתח הטרנסממברני עם מיצוי אוטומטי של פרמטרים רלוונטיים.

Abstract

תאים מעוררים כגון תאי עצב ושריר יכולים להיות מטרות עיקריות בטיפולים מבוססי אלקטרופורציה המתפתחים במהירות. עם זאת, הם יכולים להיות מושפעים מפולסים חשמליים גם בטיפולים שבהם הם אינם המטרות העיקריות, וזה יכול לגרום לתופעות לוואי שליליות. לכן, כדי לייעל את הטיפולים מבוססי האלקטרופורציה ברקמות מעוררות ולא מעוררות, יש צורך לחקור את ההשפעות של פולסים חשמליים על תאים מעוררים, תעלות היונים שלהם וריגוש במבחנה. למטרה זו, פותח פרוטוקול לניטור אופטי של שינויים ביצירת פוטנציאל הפעולה עקב אלקטרופורציה במודל תא מעורר פשוט של תאי HEK מהונדסים גנטית. עם שימוש בצבע פוטנציומטרי פלואורסצנטי, השינויים במתח הטרנסממברני נוטרו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ופרמטרים רלוונטיים של תגובות התא חולצו אוטומטית עם יישום MATLAB. בדרך זו, ניתן היה להעריך ביעילות את תגובות התאים המעוררים לפולסים חשמליים שונים ואת יחסי הגומלין בין עירור ואלקטרופורציה.

Introduction

באלקטרופורציה, פולסים חשמליים במתח גבוה גורמים לעלייה בחדירות קרום הפלזמה עבור מולקולות שאחרת אינן מוכשרות בצורה גרועה¹. טכניקות מבוססות אלקטרופורציה נמצאות כיום בשימוש נרחב ביישומים ברפואה², ביוטכנולוגיה³ וטכנולוגיית מזון⁴.

תאים מעוררים כגון תאי עצב ושריר הם בין המטרות העיקריות בטיפולים מבוססי אלקטרופורציה המתפתחים במהירות בלב, במוח ובשרירי השלד⁵. יתר על כן, הם יכולים להיות מושפעים מפולסים חשמליים גם בטיפולים שבהם הם אינם המטרות העיקריות, וזה יכול לגרום לתופעות לוואי שליליות כגון כאב, עוויתות שרירים ונזק עצבי⁶. כלומר, פולסים חשמליים יכולים לגרום לגירוי חשמלי של תאים מעוררים: הם מפעילים תעלות יונים מגודרות מתח ומפעילים פוטנציאל פעולה (AP). עם זאת, בשדות חשמליים גבוהים יותר, קרום הפלזמה של התאים הופך לחדירה, וזרם יוני נוסף דרך נקבוביות/פגמים מתרחש⁷. זרם יוני נוסף זה משפיע על ריגוש התאים במשחק גומלין מורכב בין עירור לאלקטרופורציה. לכן, כדי לייעל את הטיפולים מבוססי האלקטרופורציה ברקמות מעוררות ולא מעוררות, יש צורך לחקור את ההשפעות של פולסים חשמליים על תאים מעוררים, תעלות היונים שלהם וריגוש במבחנה.

במחקר שנערך לאחרונה⁸, חקרנו תאי כליה עובריים אנושיים מהונדסים גנטית (HEK) שפותחו על ידי כהן ואחרים ^9,10, ככלי רב ערך לחקר אלקטרופורציה בתאים מעוררים. בתאים אלה שאינם ניתנים לריגוש, מתבטא השלמה מינימלית של תעלות נתרן ואשלגן (Na_V1.5 ו- K_ir2.1) הדרושה להתרגשות. הביטוי של K_ir2.1 בתאים אלה נשלט על ידי מערכת tet-on המושרה על ידי דוקסיציקלין המאפשרת הקמה של שתי גרסאות תאים: S-HEK מעורר (המכיל Na_V1.5 ו-K_ir2.1) ותאי NS-HEK שאינם מעוררים (המכילים רק Na_V1.5 ערוצים). זה מאפשר לנו להשוות את ההשפעות של פולסים חשמליים על גרסאות מעוררות ולא מעוררות של אותו סוג תאים. בהשוואה לתאים מעוררים ראשוניים מבודדים, תאים מעוררים המובחנים מתאי גזע פלוריפוטנטיים עובריים או מושרים, וקווי תאים שמקורם ברקמות מעוררות, לתאי S-HEK יש מספר יתרונות: הם קלים לטיפול, טיפוח והפצה, בעלי תעלות נתרן ואשלגן מוגדרות היטב ומייצרים APs חזקים⁸.

עיצבנו פרוטוקול לניטור שינויים במתח טרנסממברני (TMV) המופעלים על ידי פולסים חשמליים של אמפליטודות שונות באמצעות צבע פוטנציומטרי פלואורסצנטי. בדרך זו, אנו יכולים לחקור כיצד אלקטרופורציה משפיעה על יצירת AP בתאי S-HEK ושינויים אחרים ב-TMV הן בתאי S-HEK והן בתאי NS-HEK. בקצרה, תאי S-HEK או NS-HEK נחשפים לפולס חשמלי יחיד של 100 מיקרון כל 2 דקות, ושינויים יחסיים בקרינה נרשמים במשך כ-3 שניות סביב כל יישום פולס. הפולסים המופעלים הם של מתח הולך וגובר, מפעילים תחילה APs בתאים, ובשדה חשמלי גבוה יותר, אלקטרופורציה. המרווח של 2 דקות בין יישום הדופק נבחר כדי למזער את ההשפעות המצטברות האפשריות של פולסים עוקבים תוך שמירה על ניסויים קצרים מספיק כדי לא לדרדר את התאים. עיבוד התמונה היה אוטומטי עם יישום MATLAB מותאם אישית כדי לחלץ פרמטרים רלוונטיים של תגובות הקרינה של הצבע הפוטנציומטרי, ומכאן להעריך את השינויים ב-TMV (APs ודפולריזציה מתמשכת עקב אלקטרופורציה) בתאי S-HEK ו-NS-HEK.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים ותרביות תאים

1. הכן את מדיום תרבית התאים על ידי השלמת גלוקוז בינוני-גבוה של Dulbecco עם 10% סרום בקר עוברי, 2 מ"מ גלוטמין, פניצילין-סטרפטומיצין (פניצילין 100 יח'/מ"ל, סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל), 2 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין, 5 מיקרוגרם/מ"ל בלסטיצידין ו-200 מיקרוגרם/מ"ל גנטיצין.
2. הכן תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) עם 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na₂HPO₄ ו-1.8 מ"מ KH₂PO₄, pH 7.4. סנן אותו דרך מסנן ממברנה מעקר בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
3. הכן תמיסת Tyrode עם 2 מ"מ KCl, 125 מ"מ NaCl, 2 מ"מ CaCl₂, 1 מ"מ MgCl₂, 10 מ"מ HEPES, 30 מ"מ גלוקוז, pH 7.3. הכן תמיסת Tyrode נמוכה אשלגן עם 0.5 מ"מ KCl, 126.5 מ"מ NaCl, 2 מ"מ CaCl₂, 1 מ"מ MgCl₂, 10 מ"מ HEPES, 30 מ"מ גלוקוז, pH 7.3. סנן את שתי התמיסות דרך מסנן ממברנה מעקר בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
4. הכן תמיסת מלאי פולי-L-ליזין של 1 מ"ג/מ"ל על ידי הוספת 5 מ"ל PBS בבקבוקון המכיל 5 מ"ג פולי-L-ליזין.
5. הכינו תמיסת מלאי דוקסיציקלין של 2 מ"ג/מ"ל במים מזוקקים וסננו אותה דרך מסנן ממברנה מעקר בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
6. הכן תמיסת מלאי צבע פוטנציומטרי של 4 מ"מ ElectroFluor630 באתנול טהור (הוסף 25 מיקרוליטר אתנול טהור לצינור המכיל 100 ננומטר - 73 מיקרוגרם של הצבע).
7. תרבית תאי HEK מהונדסים גנטית בבקבוק T25 ב-6 מ"ל של מדיום תרבית התאים כפי שתואר קודם לכן⁸. המרכיבים של מדיום התרבות רגישים לאור; לפיכך, שמור על המדיום מוגן מפני אור (עטפו את הבקבוק הבינוני בנייר אלומיניום) ובצעו מעבר בתנאי תאורה חלשים.
8. העבירו את התאים כל 3-4 ימים על ידי זריעת 3 x 10⁵ או 5 x 10⁵ תאים לבקבוק T25 טרי. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. שמור על תאים בבקבוק ראשי כתאי NS-HEK שאינם מעוררים ללא תוספת דוקסיציקלין מכיוון שהם אינם סובלים ביטוי מתמשך של K_ir2.1. השתמש בתאים ממעברים נמוכים מ-14 בניסויים.

2. הכנת מדגם

1. ציפוי פולי-L-ליזין של שקופיות תא זכוכית כיסוי
   1. פיפטה 1 מ"ל של PBS לבאר אחת של שקופיות תא הזכוכית עם 2 בארות, הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת פולי-L-ליזין סטרילית של 1 מ"ג/מ"ל וערבב היטב עם פיפטה.
   2. דגירה למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר בתנאים סטריליים במכסה זרימה למינרית. הסר את ה-PBS עם פולי-L-ליזין ללא כל כביסה נוספת.
2. זריעת התאים
   1. הכן דילול של 1:10 של תמיסת מלאי דוקסיציקלין במדיום תרבית בצינור של 1.5 מ"ל. עבור כל באר יש צורך בדילול של 30 מיקרוליטר של 1:10 דוקסיציקלין (3 מיקרוליטר של תמיסת מלאי דוקסיציקלין ו-27 מיקרוליטר של מדיום תרבית), הכינו את הנפח הסופי בהתאם למספר הכולל של בארות הניסוי.
   2. הסר את מדיום התרבות מבקבוק T25 ונסה את התאים עם 2.5 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA בחממת CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
   3. הוסף 2.5 מ"ל של מדיום תרבית טרי ועל ידי פיפטינג עדין נתק את התאים מהשטח. מערבבים היטב את מתלה התאים.
   4. ספרו את התאים בעזרת המוציטומטר וקבעו את צפיפות התאים בהשעיה.
   5. חשב את נפח תרחיף התאים הטריפסיני הדרוש לביסוס התרבית. לתרבית של יומיים, זרע 2.5 x 10⁵ תאים, ולתרבית של 3 ימים, זרע 1 x 10⁵ תאים לבאר. התאם את מספר התאים המדויק במידת הצורך.
   6. חשב את נפח מדיום התרבות על ידי הפחתת נפח תרחיף התאים שחושב בעבר מ -1470 מיקרוליטר. 30 מיקרוליטר הנותרים מייצגים את הנפח של דילול דוקסיציקלין 1:10. הנפח הכולל בכל באר יהיה 1500 מיקרוליטר (תאים, דוקסיציקלין ומדיום תרבית).
   7. להכנת דגימות עם תאי S-HEK מעוררים, פיפטה את הנפח המחושב של מדיום התרבות ותרחיף התאים הטריפסיני לבאר אחת והוסף 30 מיקרוליטר של דילול דוקסיציקלין 1:10. השתמש רק בבאר אחת מבין שני תאי הבארות מכיוון שהניסוי לוקח זמן רב (בסביבות 40 דקות). מערבבים היטב על ידי פיפטינג עדין ממש לפני הכנסת התאים לחממת CO₂ .
   8. להכנת דגימות עם תאי NS-HEK שאינם מעוררים, פיפטה את הנפח המחושב של מדיום התרבות לבאר והוסף 90% מהנפח המחושב של תרחיף התאים לתאי S-HEK ללא דוקסיציקלין. תאי NS-HEK גדלים מעט מהר יותר מתאי S-HEK.
   9. דגרו את התאים בחממה של 5% CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים לפני הניסוי. עבור דגימות עם דוקסיציקלין, זמן הדגירה הזה מספיק כדי להפוך את התאים למעוררים.
3. תיוג התאים
   1. לפני הניסוי, פיפטה 3 מיקרוליטר של תמיסת מלאי צבע פוטנציומטרי לצינור של 1.5 מ"ל והשאיר את הצינור הפתוח בטמפרטורת החדר במכסה זרימה למינרי כדי לאפשר לאתנול להתאדות ולצבע הפוטנציומטרי להתייבש (כ-15 דקות). מוסיפים לצינור 997 מיקרוליטר של מדיום תרבית קרה (ממקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס) וממיסים את הצבע לריכוז סופי של 12 מיקרומטר.
   2. הסר את מדיום התרבות מהבאר והוסף 1 מ"ל תמיסת צבע פוטנציומטרית לתאים. מקררים אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומדגרים למשך 20 דקות.
   3. הסר את תמיסת הצבע הפוטנציומטרית ושמור אותה בשפופרת לשימוש חוזר נוסף (עד שישה ניסויים עוקבים ביום אחד).
   4. שטפו בעדינות את התאים פי 3 עם תמיסת Tyrode, ולאחר הכביסה האחרונה, פיפטה 1 מ"ל של תמיסת Tyrode דלת אשלגן לבאר.

3. גירוי חשמלי ואלקטרופורציה

1. הגדר סנכרון של אספקת הדופק עם רכישת תמונה באמצעות אות TTL ממערכת המיקרוסקופ המפעילה את מחולל הדופק. ליצירת פולסים במתח גבוה, השתמש במחולל דופק מותאם אישית¹¹ או בכל מחולל דופק שניתן להפעיל חיצונית עם אות TTL.
   הערה: בתצורה הניסיונית המוצגת, תוכנת LAS X משמשת לרכישת תמונה, אותה ניתן להגדיר לשליחת אות TTL בזמן שנבחר מראש במהלך רכישת זמן-lapse.
2. הנח שתי אלקטרודות חוט Pt/Ir מקבילות, בקוטר 0.8 מ"מ ומרחק של 5 מ"מ בין הקצוות הפנימיים, בתחתית החדר וקבע את החדר מתחת למיקרוסקופ.
3. חבר את האלקטרודות למחולל הדופק. חבר את הפלט של מחולל הדופק לאוסילוסקופ באמצעות בדיקת מתח וזרם כדי לאפשר אימות שהפולסים הועברו כהלכה במהלך הניסוי.
4. מקד את התאים בשדה בהיר. דמיינו את התאים שנמצאים בערך באמצע בין האלקטרודות.
5. התחל את הרכישה הראשונה של תמונות פלואורסצנטיות במצב זמן-lapse עם מטרה של פי 40, תוך הקלטת אות הקרינה בכל שדה הראייה. המצלמה צריכה להיות מהירה מספיק כדי לרכוש מהלך זמן ברור של פוטנציאל פעולה (באופן אידיאלי גבוה מ-25 פריימים לשנייה).
   1. השג 80 תמונות במצב דולג זמן, עם לפחות 25 פריימים לשנייה כדי לפתור את מהלך הפעולה בזמן אמת. משך הזמן הכולל של רכישת התמונה מביא לסביבות 3 שניות. במהלך רכישת התמונה, האירו את התאים באורך גל עירור של 635 ננומטר, זמן חשיפה של 10 אלפיות השנייה וזהו את הפליטה בסביבות 700 ננומטר. ברכישה ראשונה זו, אל תפעיל שום דופק - רכישה זו תשמש לתיקון הרכישות הבאות להלבנת צבע. לאחר רכישה זו, המתן 2 דקות.
      הערה: ניסוי זה משתמש ב-27.8 פריימים לשנייה, כלומר תקופה של 36 אלפיות השנייה, שהוא הזמן מתחילת רכישת התמונה הראשונה ועד לתחילת רכישת התמונה הבאה בהקלטת זמן-lapse).
6. כל 2 דקות, הקלט דולג זמן באותו אופן כמו בשלב 3.5. עבור רכישות אלה, החל פולס יחיד של 100 מיקרון בזמן רכישת התמונה העשירית (ב-324 אלפיות השנייה). רכוש תמונות עם מתחי הפולסים הבאים: 63 וולט, 75 וולט, 88 וולט, 100 וולט, 125 וולט, 150 וולט, 175 וולט ו-200 וולט. הערך את השדה החשמלי שאליו נחשפים התאים כיחס המתח למרחק האלקטרודה המופעל (E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 ו-400 וולט/ס"מ).
   הערה: בשדות חשמליים נמוכים יותר, הפולסים יפעילו פוטנציאל פעולה; בשדות חשמליים גבוהים יותר, הם יפעילו אלקטרופורציה, המתבטאת בדפולריזציה ממושכת. משך הניסוי על כל דגימת תאים הוא כ-40 דקות (20 דקות לתיוג ו-20 דקות למיקרוסקופיה).

4. ניתוח נתונים

1. ייצא את הקלטות ה-Time-lapse לפורמט tiff.
2. מקם הקלטות זמן-lapse של כל המתחים המופעלים במהלך ניסוי בודד (דגימה אחת של תאים) בתיקיה אחת. שנה את שמות הקלטות ה-Time-lapse בצורה כזו שניתן יהיה לזהות את השדה החשמלי E על ידי יישום MATLAB: Vcm (למשל, 126Vcm עבור 126 V/cm). החלקים הנותרים של השם יכולים להיות שרירותיים. לרכישה בתחילת הניסוי שבו לא מופעל דופק, שנה את השם באמצעות הביטוי 000Vcm. דוגמה לשמות ההקלטה של זמן-lapse: 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm וכו'.
3. פתח את היישום, אותו ניתן להוריד מ
   https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. לחץ על בחר תיקיית נתונים כדי לבחור את התיקיה המכילה הקלטות זמן-lapse של ניסוי אחד.
4. בחר את הפיקסלים שישמשו להמשך ניתוח הנתונים. לשם כך, השתמש בשני מחוונים כדי לקבוע את הסף הנמוך לתמונה ברורה של הממברנות (בסגול) ואת הסף הגבוה לסילוק פסולת (כתמים גדולים עם פלואורסצנטיות גבוהה) מהניתוח (בירוק).
5. בחר נתח נתונים. בכרטיסיה ניתוח, מופיעה טבלה עם פרמטרים שחולצו. בצד ימין של הטבלה מופיעים גרפים של פלואורסצנטיות יחסית בזמן עבור כל E בשימוש. בחר גרפים עבור E נתון מהתפריט הנפתח בצד שמאל מעל הטבלה.
6. בדוק את כל הגרפים ובצע תיקון ידני במקרה של זיהוי שיא שגוי. בחר נקה פסגות אוטומטיות בחלק התחתון בכרטיסיה ניתוח, והפסגות שזוהו באופן אוטומטי ינוקו. לחץ על הגרף כדי לקבוע ידנית נקודת זמן שיא חדשה.
7. בחר הפעל מחדש זיהוי שיא אוטומטי בחלק התחתון בכרטיסיה ניתוח כדי לבצע שוב זיהוי שיא אוטומטי. הפרמטרים שחולצו יותאמו כעת לשיא החדש.
8. בחר Export Data בפינה השמאלית התחתונה בכרטיסייה Analysis כדי לייצא נתונים לאותה תיקייה בצורת קובץ .mat, קובץ גיליון אלקטרוני ותמונות PNG עבור כל E בשימוש.

Results

ניתן לנטר אופטית שינויים ב-TMV בתאים מעוררים במבחנה המופעלים על ידי פולסים חשמליים באמצעות פרוטוקול זה, וניתן לנתח את אותות הקרינה כדי לחלץ את הפרמטרים הרלוונטיים שלהם.

מערך הניסוי מוצג באיור 1A. אות טיפוסי של פולס חשמלי של 100 מיקרון-שניות המשמש בניסויים מוצג באיור 1B. תאים בתאים שממוקמים מתחת למיקרוסקופ בדרך כלל נראים כמו התאים באיור 1C (תמונת שדה בהיר) ובאיור 1D (תמונת פלואורסצנטיות). אנו מבצעים ניסוי שבו כל 2 דקות מופעל פולס חשמלי עם מתח הולך וגדל על אותם תאים. שימו לב שזמן הדחף של 2 דקות עשוי שלא להיות ארוך מספיק כדי לאפשר איטום מחדש והתאוששות מלאה של קרומי התאים, במיוחד כאשר משתמשים בפולסים בעלי המשרעת הגבוהה ביותר, הקשורים לאלקטרופורציה בולטת. לפיכך, ניתן לצפות לכמה השפעות מצטברות של הפולסים. כדי להימנע מהשפעות מצטברות אלה, ניתן להאריך את עיכוב הדחף, אך על חשבון הפחתת מספר אמפליטודות הדופק שנבדקו והימנעות מהשארת התאים במיקרוסקופ זמן רב מדי.

לאחר לכידת תמונות פלואורסצנטיות בניסויים, נתח אותן עם אפליקציית MATLAB המותאמת אישית. ראשית, קבע את ספי הפיקסלים (איור 2A); על ידי התאמת הסף הנמוך, אנו מקבלים תמונה ברורה של הממברנות סביב התאים (בסגול), ועל ידי התאמת הסף הגבוה אנו מסירים את אות הפסולת (ירוק). לאחר מכן, היישום קובע את עוצמת הקרינה הממוצעת של כל פיקסלי הסף עבור כל פולס עוקב שנמסר כדי לקבל אות תלוי זמן של השינוי היחסי בקרינה F/F0. אות זה מתוקן עבור פוטו-הלבנת צבע על ידי הפחתת שיפוע הירידה הליניארית של F שנקבע מהקלטת זמן-lapse של הבקרה שבה לא הופעל פולס (איור 2B). לאחר תיקון האות, הפרמטרים של התגובות מופקים בצורה של טבלה בתוך האפליקציה וגרף של אות הקרינה המתוקן (איור 2C). במקרים נדירים, האלגוריתם אינו מזהה שיא ברור או מזהה אותות רעש מזויפים כחיוביים כוזבים. במקרים אלה, למשתמש יש אפשרות לבחור ידנית את הנקודה המתאימה באות הקרינה כשיא או להסיר את השיא הכוזב שזוהה (איור 2D - הסרה של שיא קטן שזוהה באופן חריג לפני הפעלת הפולס החשמלי).

על ידי שימוש ביישום MATLAB, אנו יכולים לקבל תמונות של תגובות TMV לפולסים חשמליים הן בתאי S-HEK מעוררים (איור 3A) והן בתאי NS-HEK שאינם מעוררים (איור 3B). פרמטרי התגובה הבאים מופקים (טבלה 1): מספר פסגות (NoPeaks), זמן שיא לשיא ממוצע (כאשר מזוהה יותר משיא אחד, MPPT), תגובה מקסימלית (MR), זמן לשיא ראשון (TtFP) וזמן משיא ל-25%, 50%, 75% ו-90% התאוששות (T25, T50, T75, T90, בהתאמה). פרמטרים אלה מאפשרים להעריך את התגובות לפולסים חשמליים שונים (למשל, לקבוע את מספר הפסגות המופעלות על ידי פולסים חשמליים של E שונה, איור 3C) ואת יחסי הגומלין בין עירור לאלקטרופורציה.

איור 1: המערך, צורת הגל ותאי S-HEK. (A) תמונת החדר על במת המיקרוסקופ. (ב) דוגמה לצורת הגל של פולס ששימש במחקר (מתח (U) לאורך זמן). (ג, ד) התמונה של תאי S-HEK ((C): שדה בהיר, (D): פלואורסצנטי), סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: יישום ניתוח נתונים. (א) התמונה של ממשק היישום - סף. (B) הגרף של האות הגולמי והמתוקן של שינוי הקרינה. (C) התמונה של ממשק היישום - נתונים שחולצו. (ד) תיקון ידני של גילוי שיא (הסרת שיא קטן שזוהה באופן חריג לפני הפעלת הפולס החשמלי, מסומן בחץ אדום). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תוצאות מייצגות. (A, B) הפעלת שינויים ב-TMV ב-(A) S-HEK מעורר ו-(B) NS-HEK לא-מעורר עם פולסים חשמליים של 100 μs של אמפליטודות שונות, תוצאות מניסויים מייצגים. לשם הבהרה, מוצגות רק תגובות לפולסים נבחרים ברצף הדופק המיושם. (C) הפרמטרים של תגובות TMV המופעלות על ידי פולסים של 100 מיקרומטר של אמפליטודות שונות: דוגמה מראה את מספר הפסגות. התוצאות מבוטאות כממוצע ± SE, מספר הניסויים: N = 13. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מדד	חוזק E (אנכי/ס"מ)	אין פסגות (-)	MPPT (מ.ס)	אדון (-)	TtFP (מ.ס)	T25 (מ.ס)	T50 (מ.ס)	טי75 (מ.ס)	טי90 (מ.ס)
1	0
2	126	9	224	0.104	360	72	108	144	180
3	150	6	354	0.097	108	72	108	144	180
4	176	2	144	0.089	36	72	108	144	180
5	200	1		0.075	0	108	144	180	252
6	250	2	396	0.064	0	108	216	432	2052
7	300	1		0.059	0	180	1188	2448
8	350	1		0.053	0	1008	2340
9	400	1		0.047	0	1512

טבלה 1: פרמטרים של תגובות TMV המופעלות על ידי פולסים של 100 מיקרון של אמפליטודות שונות.

Discussion

תאי S-HEK הם מודל פשוט של תאים מעוררים עם תעלות נתרן ואשלגן מוגדרות היטב, Na_V1.5 ו- K_ir2.1⁹. זה מאפשר לנו לבצע מחקרי עומק על האופן שבו תאים מעוררים מגיבים לפולסים חשמליים מופעלים ולקשר את נתוני הניסוי למודלים מתמטיים המבוססים על המאפיינים התיאורטיים הידועים של הערוצים המתבטאים בתאי S-HEK. במחקר הקודם שלנו⁸, תיארנו את התגובות של תאים אלה לפולסים של 100 מיקרון של עלייה ב-E הן בניסוי והן בתיאוריה. ב-E נמוך יותר, תאי S-HEK מגיבים עם פוטנציאל פעולה יחיד או מרובה, ואילו ב-E גבוה יותר, APs מתארכים והופכים לדפולריזציה מתמשכת. מכיוון שהדפולריזציה המתמשכת נראית בבירור גם בגרסה שאינה מעוררת של תאים אלה (NS-HEK), היא מיוחסת לאלקטרופורציה ולעלייה הנלווית בזרם היוני הלא סלקטיבי.

השימוש בצבע הפוטנציומטרי הפלואורסצנטי הוכיח את עצמו כדרך יעילה מאוד לחקור APs ואלקטרופורציה בתאים מעוררים. בהשוואה לשיטות אלקטרופיזיולוגיות קלאסיות, כגון מהדק תיקון, מדידות אופטיות נוחות בהרבה, חסכוניות בזמן ואינן דורשות מיומנויות טכניות מיוחדות. יתר על כן, השימוש בפולסים חשמליים במתח גבוה אינו מפריע למדידות, מה שעלול להפוך לבעיה במדידות מהדק תיקון¹². עם זאת, החסרונות העיקריים של פרוטוקול זה קשורים לאופי הצבע. בשל ההלבנה שלו, אות הקרינה שנלכד זקוק לתיקון. הצבע מתפזר באופן ספונטני לתוך התא, כך שהאות מהממברנות פוחת עם הזמן. מסיבה זו, הצבע מתאים לניטור פוטנציאל פעולה ושינויים קצרי טווח אחרים ב-TMV (~3 שניות בניסויים אלה). מכיוון שהצבע מאפשר הדמיה רציומטרית¹³, הדמיה כזו יכולה למנוע בעיות מסוימות עם דיפוזיה של צבע, אך על חשבון מהירות הדמיה נמוכה יותר שניתן להשיג. בתצורה ניסיונית זו, הדמיה רציומטרית תהיה איטית מכדי ללכוד נכון את צורת פוטנציאל הפעולה. יתר על כן, השינויים הנמדדים בפלואורסצנטיות הצבע מספקים מידע איכותי על השינוי ב-TMV; עם זאת, ניתן לכייל את הצבע כדי לאפשר מדידות כמותיות.

ניתוח התמונה האוטומטי באמצעות אפליקציית MATLAB מותאמת אישית מאפשר לנו לנתח כמות גדולה של נתונים ולחלץ ביעילות מאפיינים יקרי ערך של תגובות TMV בפרק זמן קצר. האפליקציה מוגדרת ללכוד את אות הקרינה מהממברנות של כל התאים בשדה הראייה. זה משפר את יחס האות לרעש אך על חשבון אובדן מידע על האופן שבו TMV משתנה ברמת התא הבודד. בתצורת הניסוי הנתונה, האות מתאים בודדים היה רועש מכדי לאפשר מדידות שימושיות. יתר על כן, היה קשה להבחין בין הממברנות של תאים סמוכים. עם זאת, תאי HEK מבטאים באופן אנדוגני צמתים מרווחים שדרכם הם מחוברים חשמלית. מודלים מתמטיים, שהוצגו במחקר הקודם⁸ הראו כי בשל החיבורים החשמליים שלהם, התאים בשדה הראייה קרובים מספיק כדי להפעיל AP בו זמנית. יתר על כן, AP מופץ לאורך שכבת התא במהירות גבוהה (בערך 34 מ"מ לשנייה, מוערך על סמך הדמיה בהגדלה אובייקטיבית פי 5)^8,9. בהתחשב באורך הצד של שדה הראייה (~0.33 מ"מ), ה-AP יעבור אורך זה בכ-10 אלפיות השנייה, שהוא קצר יותר מתקופת רכישת התמונה שלנו. לפיכך, לא ניתן לראות את אפקט התפשטות ה-AP עם הגדלה ומהירות הקלטה זו. עם זאת, התפשטות ה-AP מהאלקטרודות לשדה הראייה עלולה לגרום לעיכוב בין הדופק המופעל ל-AP⁸ שנלכד.

במחקר הקודם⁸, כמו גם בפרסום זה, מתוארות ההשפעות של פולסים של 100 מיקרון על יחסי הגומלין בין ריגוש ואלקטרופורציה. עם זאת, ניתן להתאים פרוטוקול זה לחקר פולסים חשמליים עם פרמטרים אחרים (בעלי משך זמן, מתח, מספר, קצב חזרה או צורה שונים) או תאים מעוררים אחרים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
צינור 1.5 מ"ל	Ratiolab	5615000
2 בארות Nunc Lab-Tek II Chambered #1.5 מערכת כיסוי גרמנית	Thermo Fisher Scientific
155379 ADP305 בדיקת מתח דיפרנציאלי	Teledyne LeCroy
AP015 בדיקת זרם	Teledyne LeCroy
Blasticidin	תרמו פישר סיינטיפיק
חממת CO2	PHCbi	MCO -230AICUV
דוקסיציקלין	סיגמא-אולדריץ'/מרק	D9891
דולבקו s Modifed Eagle' s בינוני גבוה גידול גלוקוז	בינוני Sigma-Aldrich/Merck	D5671
ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)	בדיקות פוטנציומטריות	31795
סרום בקר עוברי	Sigma-Aldrich/Merck	F2442
גנטיצין	תרמו פישר מדעי
גלוטמין	סיגמא-אולדריץ'/Merck	G7513
קולט אדים למינרי Iskra	Pio	MC 15-2
MATLAB	Mathworks
פניצילין– סטרפטומיצין	סיגמא-אולדריץ'/Merck	P07681
פולי-L-ליזין הידרוברומיד	סיגמא-אולדריץ'/מרק	P9155-5MG
מחולל פולסים	בהתאמה		ראה התייחסות11
Puromycin	Thermo Fisher Scientific
T25 25 ס"מ ו-sup2; בקבוק תרבית רקמה	TPP	90026
תאי HEK מזנקים Tet-on	אוסף תרבית מסוג אמריקאי ATCC	CRL-3479
מערכת תאים חיים של Thunder Imager למיקרוסקופיה פלואורסצנטית	Leica Microsystems
פתרון Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich/Merck	T3924
WavePro 7300A אוסילוסקופ	Teledyne LeCroy