מאמר שיטה

פרוטוקול לתרביות אקספלנט של גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1

DOI:

10.3791/67260

⸱

9 במאי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut de Génomique Fonctionnelle, Université de Montpellier, CNRS, INSERM, 2Department of Neurosurgery, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University of Chongqing, 3Department of Neurosurgery, Gui de Chauliac Hospital, Montpellier University Medical Center, 4Jingfeng laboratories of Chongqing

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1 הן גידולים נדירים שקשה לתרבת. אנו מציגים שיטה פשוטה ולא אנזימטית המשמרת ביטוי חלבון מוטנטי IDH1 ומקיימת תרביות במשך חודשים. חשוב לציין, טכניקה זו עובדת עם גידולים שמורים בהקפאה, ומציעה משאב רב ערך לחקר גליומה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גליומות מפושטות, גידולי המוח הראשוניים הנפוצים ביותר, מסווגים לדרגות נמוכות וגבוהות על סמך קריטריונים היסטופתולוגיים ומוטציות גנטיות. גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה מהוות תת-קבוצה, הפוגעת בעיקר במבוגרים צעירים ונוטה לגליומות בדרגה גבוהה. ישנם שני סוגים עיקריים של גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה: אסטרוציטומה ואוליגודנדרוגליומות, כל אחת מוגדרת על ידי מאפיינים גנטיים והיסטולוגיים מובחנים. גידולים אלה מציגים באופן אופייני גרסה מוטנטית של האנזים המטבולי IDH1, המשבשת את ההתמיינות התאית. הם הטרוגניים, וכוללים גם תאי גזע מתרבים וגם תאי גליה ממוינים ושקטים יותר.

מודלים ספציפיים לחולה, גידולים במבחנה מחזיקים בפוטנציאל משמעותי לחשיפת מנגנונים אונקוגניים והתאמת בחירת תרופות לטיפול מותאם אישית. עם זאת, היעדר מודלים אמינים במבחנה במיוחד עבור גליומות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1 עיכב מחקר בסיסי ותרגומי. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לתרבית גידולים מוטנטיים IDH1 כאקספלנטים במדיה מוגדרת ללא צורך בדיסוציאציה אנזימטית. ניתן לשמור על אקספלנטים אלה לתקופות ממושכות, תוך שמירה על ביטוי חלבון מוטנטי IDH1 וכן סמנים לתאי אב אוליגודנדרוציטים כגון ASCL1 (MASH1), OLIG1 ו-OLIG2 ולאסטרוציטים (GFAP, SOX9). הם יכולים להיווצר גם מגידולים קפואים ב-DMSO. תרביות אלו יכולות לשמש פלטפורמה רבת ערך לסינון תרופות, מיקרוסקופיה ומחקרי גנים, ובכך להקל על התקדמות בהבנה וטיפול בגידולים מאתגרים אלה. הם גם מציעים את הפוטנציאל להפיק קווי תאים מוטנטיים IDH1.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גליומות מפוזרות הן גידולי המוח הראשוניים השכיחים ביותר. גידולים אלה חשוכי מרפא כיום למרות טיפול אינטנסיבי מאוד (ניתוח, רדיו וכימותרפיה)1. ראיות הולכות וגדלות תומכות בהשערה שגליומגנזה מקורה בתאי גזע בוגרים או תאי אב גליה השוכנים במוח2. למרות שגליובלסטומה מייצגת את הסוג האגרסיבי ביותר, גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה (DLGG, גידולים בדרגה 2) נפוצות גם הן (15% מהגליומות המפוזרות)1,3. DLGGs גדלים לאט ונודדים לאורך מסלולים של חומר לבן, סימן היכר של ניאופלזמה4. DLGG אלה חוזרים לעתים קרובות למרות הטיפול, ובסופו של דבר מתקדמים לממאירות בדרגה גבוהה (כיתות 3 ו-4)5.

DLGG מאופיינים במוטציה שגויה בגן איזוציטראט דהידרוגנאז 1 או 2 (IDH1 או IDH2), וכתוצאה מכך ייצור חריג של האונקומטבוליט 2-הידרוקסיגלוטראט (2HG). זה משבש את התמיינות התאים באמצעות חוסר רגולציה אפיגנטית6. גליומות מוטנטיות IDH1 מסווגות עוד יותר לתת-סוגים: לאסטרוציטומה יש בדרך כלל מוטציות ב-ATRX ו-P53, בעוד שאוליגודנדרוגליומות מאופיינות ב-1p19q מחיקות7. גידולים אלה מציגים הטרוגניות של תאים גידוליים. ריצוף RNA של תאים בודדים ואפיון אימונולוגי חשפו אוכלוסייה מגוונת של תאי גידול, המציגים פנוטיפים דמויי תאי גזע, דמויי אסטרוציטים ודמויי אוליגודנדרוציטים בתוך גידולים אלה8,9.

בניגוד לגליובלסטומה, הנהנית מתרביות וקווי תאים זמינים לטווח ארוך, קיים מחסור בולט בכלים תאיים המותאמים לחקירת גידולים מוטנטיים IDH11. זה מהווה מכשול משמעותי לקידום הפיתוח הטיפולי ולהעמקת ההבנה שלנו לגבי גליומגנזה עם מוטציה IDH1 והתקדמות המחלה. קווי תאים מסורתיים שגדלו בסרום, בעוד שהם מנוצלים זמן רב, אינם משכפלים כראוי גידולים מקוריים, ומציגים פרופילי שעתוק ששונו. לחלופין, תנאי תרבית ללא סרום, בין אם במודלים דו-ממדיים או תלת-ממדיים, משמרים בצורה יעילה יותר את פרופילי השעתוק של תאי הגידול ואת הפנוטיפים שלהם in vivo, כגון פלישה לרקמת מוח רגילה10,11.

בנוסף, תרביות תאים לטווח קצר שמקורן בדגימה כירורגית של המטופל משמרות את הפרופיל המולקולרי והמגוון התאי של הגידול, ובכך מייצגות טוב יותר את התכונות הביולוגיות של הגידולים בהשוואה לקווי תאים12. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ולא אנזימטית לתרבית תרבית גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1 כצמחים שמקורם בכריתות חולים טריים או קפואים, במטרה לענות על הצורך במודלים משופרים במבחנה למחקר גליומה ופיתוח טיפולי. הם גם מציעים את הפוטנציאל להפיק קווי תאים מוטנטיים IDH1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקטעי הגידול ששימשו בפרוטוקול זה התקבלו מאוסף מאופיין היטב ומאושר מבחינה אתית, בהסכמת המטופל. מחקר זה נערך במסגרת הפרויקט שכותרתו Gliomacult: אפיון ותרבויות ראשוניות של גליומות בדרגה נמוכה (פרויקט מס. RECH/P722/1-5) ואושר על ידי המועצה המדעית של הבנק הביולוגי של הגידול ב-28 באוגוסט 2023.

1. הכנת צלחות תרבות

הערה: בצע את השלבים הבאים מתחת למכסה זרימה למינרי של תרבית רקמות סטרילית.

  1. לפחות שעה לפני התרבית, הכינו צלחות פולי-D-ליזין (PDL) ומצופות למינין 24 בארות.
    1. יש לדלל 10 מ"ג של אבקת PDL ב-100 מ"ל של חוצץ בוראט (pH 8.4) לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם/מ"ל. לאחר המסה, סנן את התמיסה (0.22 מיקרומטר) לסטריליות. PDL מוכן לשימוש; הכינו 3 מ"ל מנות ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    2. הפשירו את צינור הלמינין של 1-2 מ"ג/מ"ל ב-4 מעלות צלזיוס כדי למנוע היווצרות ג'ל. מכינים 50 מיקרוליטר מנות ומאחסנים אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.< br/> הערה: יש להימנע מחזרה על הפשרה והקפאה.
    3. ציפוי צלחת
      1. שלב אופציונלי: הניחו כיסויים סטריליים Ø, 13 מ"מ, מתאימים לכלי תרבית תאים, בצלחת של 24 בארות, כיסוי אחד לבאר.
        הערה: שלב זה מיועד לצביעה חיסונית נוספת של אקספלנטים של גליומה.
      2. לציפוי הבארות מערבבים את 3 מ"ל תמיסת ה- PDL ב -9 מ"ל של 1x PBS ומוסיפים 50 מיקרוליטר למינין. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסה זו לכל באר לריכוז ציפוי של 1-2 מיקרוגרם/סמ"ר. דגרו את הלוחות המצופים בטמפרטורת החדר, רצוי עם נדנדה איטית (15 סל"ד), למשך שעה לפחות.
      3. מיד לפני התרבית, יש להסיר את תמיסת ה-PDL-laminin ולשטוף פעמיים עם PBS.
        סטרילי הערה: אל תתנו לבארות להתייבש.

2. מדיה

  1. תרבית צמחים עם מוטציה IDH1 בתווך מוגדר המורכב מ-DMEM/F12 בתוספת L-גלוטמין, יחד עם תערובת תחליפי סרום המורכבת מ-N2 ו-B27 ללא ויטמין A. השתמש באנטיביוטיקה, כולל ציפרופלוקסצין, גנטמיצין ופטריות, כדי למנוע זיהום חיידקי ופטרייתי. בנוסף, שלבו את גורמי הגדילה הפרין, EGF ו-FGF2 במדיום, סננו אותו (0.2 מיקרומטר) ואחסנו אותו עד שבועיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס><. הערה: לפרטים על מרכיבי המדיה וההכנה, עיין בטבלה 1 ובטבלת החומרים.

3. הכנת אקספלנט

  1. לפני עיבוד הדגימה, הכן את סביבת העבודה והכלים הסטריליים כפי שמתואר ב<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1A. חיטוי חפיסה קרירה על ידי ריסוס 70% אתנול. עקרו מספריים ומלקחיים על ידי טבילתם באתנול 70% ושטיפתם עם PBS.
  2. העבר מיד את כריתת הגידול לתרבית על קרח, באופן אידיאלי תוך שעתיים לאחר מיצוי כירורגי (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1B).
    הערה: דגימת הגידול צריכה להיות בקוטר מינימלי של 9-10 מ"מ כדי להבטיח תוצאות טובות יותר. הרקמה מועברת ללא מדיום תרבית מכיוון ששיטה זו מועדפת למטרות היסטולוגיות. היעדר נוזל מונע היווצרות גבישי קרח במהלך הקפאת הבזק, ובכך שומר על שלמות הרקמה לבדיקה היסטולוגית לאחר מכן במידת הצורך.
  3. מניחים את צלחת התרבית עם דגימת הגידול מעל האריזה הקרירה ושוטפים אותה בעדינות עם 1X PBS כדי להסיר עודפי דם.
  4. הגידול שנכרת מפגין לעתים קרובות גודל והטרוגניות משמעותיים, הכוללים מסת גידול, רקמה שחדרה ורכיבים לא גידוליים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1C). בחר חלקים המציגים צבע אפור עם מרקם רך או דמוי ג'לי לבידוד תאי גידול, מכיוון שהם נוטים להכיל יותר תאי גידול. לעומת זאת, הימנע מאזורים קשים ולבנים מכיוון שהם עשויים להכיל פחות תאי גידול המתאימים לתרבית (איור 1D), כמו גם אזורים מושחרים, מכיוון שהם ככל הנראה תוצאה של צריבה חשמלית ועשויים שלא לספק תוצאות אמינות לניתוח.
  5. העבירו את הדגימות שנבחרו למיקרו-צינור של 1.5 מ"ל או קריוביאל לטחינה. הוסף 1 מ"ל של מדיה סטרילית למיקרו-צינור או קריוביאל של 1.5 מ"ל וקוצץ את הדגימה עם המספריים הסטריליים עד לקבלת חתיכות קטנות (1-2 מ"מ3).
    הערה: יש צורך בכ-1-2 דקות של קיצוץ כדי להשיג שברים זעירים, בדרך כלל בגודל 1-2 מ"מ3 (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1E).
  6. בעזרת מספריים סטריליים, חתוך בזהירות את קצה הפיפטה הכחול של 1,000 מיקרוליטר ליצירת פתח רחב, בקוטר של 3-4 מ"מ בערך. תוך שימוש בקצה שונה זה, פיפטה 50-200 מיקרוליטר משברי הרקמה הטחונה ומפזר אותם באופן שווה על פני כל באר. מכיוון שהחלקים הקטנים יותר נוטים להתיישב במהירות, הומוגניזציה עדינה של המתלה בכל באר כדי להבטיח פיזור אחיד.
    הערה: הימנעו מצפיפות יתר ושמרו על איזון על ידי הימנעות מהכנסת מספר מוגזם של שברים לכל באר (איור 1F).
  7. לדגור את שברי הגידול ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% CO2 עם 100% לחות. החלף את המדיה מדי יום אם הפעילות המטבולית של הגידול (המסומנת על ידי הצהבה מהירה של המדיה) ומספר השברים בכל באר דורשים זאת. במהלך החלפת מדיה, יש לנקוט משנה זהירות על ידי שאיבה עדינה של המדיה באמצעות פיפטה המצוידת בקצה של 200 מיקרוליטר, תוך הקפדה על הימנעות מהפרעה לשברי הגידול הנצמדים.

figure-protocol-1
<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1: הליך תרבית אקספלנט של גידול. כריתת גליומה מפוזרת בדרגה נמוכה התקבלה מחולה בן 44 שאובחן עם אסטרוציטומה בדרגה II על פי סיווג ארגון הבריאות העולמי 2021. הגידול הציג מוטציה IDH1 (Exon 4 c.395 G>A, p.Arg132His) ומוטציה TP53 (Exon 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis), יחד עם היעדר צביעת ATRX. לא זוהו מוטציות באתרי הקישור של Ets/TCF (C250T ו-C228T) של הגן TERT. (א) משטח העבודה מורכב מחבילה קרירה, המספקת סביבה הממזערת את פירוק הדגימה ושומרת על כדאיות הרכיבים הביולוגיים. אמצעי זהירות אלה חשובים לשמירה על איכות ושלמות הרקמה. (ב) הובלת הדגימה מבית החולים למעבדה צריכה להיעשות על קרח. (C) שבר כריתת גידול. החצים מראים את החלקים המתאימים ביותר לתרבות. (ד) דיסקציה של הגידול מבוצעת כדי לבחור את החלק הרלוונטי ביותר לטחינה. מניסיוננו, חומר לבן בדרך כלל נוטה פחות לייצר אקספלנטים מוצלחים. (E) שברי גידול בקוטר של כ-1-2 מ"מ³ בצינור של 15 מ"ל לאחר טחינה מכנית במספריים. (F) מספר חלקי הגידול הנדרשים לזריעה נכונה מוצג עבור בארות על צלחת של 24 בארות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. שימור והפשרה של גידול טחון

הערה: שימור בהקפאה מבטיח גיבוי במקרה של זיהום ואובדן תרביות אקספלנט או לעיבוד דגימות הגידול מאוחר יותר.

  1. שימור בהקפאה: הכן את אמצעי ההקפאה (20% v/v תמיסת DMSO) על ידי הוספת 2 מ"ל של DMSO ל-8 מ"ל של מדיום תרבית תאים.
  2. שלב נפח אחד של תרחיף הגידול הטחון עם נפח שווה של מדיום ההקפאה של 20% DMSO כדי להשיג ריכוז סופי של 10% DMSO. פיפטה בזהירות את התערובת למעלה ולמטה כדי להבטיח ערבוב יסודי, ולאחר מכן לחלק כ-1 מ"ל לקריוביאל.
  3. העבירו במהירות את הקריובילים למיכל קריוגני להפחתת טמפרטורה הדרגתית, ולאחר מכן דגירה למשך הלילה ב-80 מעלות צלזיוס לפני האחסון הסופי בחנקן נוזלי.
    הערה: שלב זה חייב להתבצע מיד לאחר הכנסת התאים למדיום ההקפאה, מכיוון שחומרים מסוימים, כמו DMSO, עלולים להזיק אם התאים נחשפים אליהם בטמפרטורת החדר למשך זמן רב מהנדרש.
  4. הפשרה: הוציאו את הקריוביאלים מהחנקן הנוזלי והניחו אותם מיד באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד שכ-80% מהתאים יופשרו.
  5. כדי להסיר את ה-DMSO, הכניסו במהירות את המתלה לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של PBS 1x מחומם מראש וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות.
  6. הסר את הסופרנטנט וחזור על הכביסה עם 1X PBS ואחריו צנטריפוגה (שלב 4.5). שאפו את הסופרנטנט, הקפידו לא להפריע לגלולה, והוסיפו את הכמות המתאימה של מדיום להעברה לצלחת PDL-Laminin מצופה מראש עם 24 בארות והניחו באינקובטור.
  7. לאחר 24 שעות, ודא שהתאים התחברו. לאחר מספר ימים, הסר שברים שאינם דבקים על ידי החלפת אמצעי התרבות.

5. מעבר התרבות

הערה: לאחר הקמתם, ניתן להשתמש באקספלנטים למיקרוסקופיה או צביעה חיסונית. לחלופין, אם תאי הגידול נדדו מהאקספלנט ונראים בריאים, ניתן להעביר את האקספלנט דרך דיסוציאציה אנזימטית ולזרוע אותו מחדש בבארות לצורך ניסויים נוספים. עם זאת, חשוב לציין שפרוטוקול זה אינו מיועד למעבר חוזר. בדרך כלל, ניתן לנסות רק מעבר אחד לפני שתאי הגידול מזדקנים או מתים. לא כל תרביות האקספלנט יביאו למעבר מוצלח.

  1. כדי לעבור, הסר מדיה ישנה, שטוף עם 1X PBS, והוסף (125 מיקרוליטר) 0.05% טריפסין-EDTA לבארות ודגירה למשך 3-4 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן תוספת של 6.5 מיקרוליטר של מעכב טריפסין, 12 מיקרוליטר של 20 מ"מ CaCl2 (דילול סופי ל-2 מ"מ), ו-1 מיקרוליטר של DNAse I.
    הערה: זמן הדגירה הדרוש לדיסוציאציה עשוי להשתנות בהתאם לתרבות. חשוב לבדוק אם התאים מנותקים לאחר 3 דקות לפחות. בדרך כלל, ייתכן שהאקספלנט לא יפורק לחלוטין לתרחיף של תא בודד, ולעתים קרובות נשמרים אשכולות קטנים, מה שיכול ליצור תרביות אקספלנט חדשות.
  2. עם p1000 מוגדר על 500-600 מיקרוליטר, יש לשטוף בעדינות כדי לפרק את הצמחים. הימנע מהיווצרות בועות.
  3. הוסף 5 מ"ל של 1x PBS וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב -300 × גרם. שאפו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הכדור במדיום טרי שחומם מראש, וספרו לזריעה.
  4. זהה תרביות בעלות פוטנציאל ליצור קווי תאים על ידי התבוננות בתאים מתחלקים תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה. לתאים המתחלקים האלה יש בדרך כלל מורפולוגיה מעוגלת וכרומוזומים גלויים, כפי שמוצג ב<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2A.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר מספר ימים, חלק משברי הגידול יידבקו למשטחי הבאר, ויתחילו את צמיחת התאים מהאקספלנטים. הזמן בין הציפוי הראשוני להופעת תאים גדלים גידוליים שונה מדגימה לדגימה. התרביות הראשוניות מכילות לעתים קרובות פסולת תאית משמעותית, מה שמקשה על הערכת נוכחותם של תאים ברי קיימא. כתוצאה מכך, יש לשמור על התרבות למשך 4 שבועות לפחות. ברגע שהתאים מתחילים לגדול, נצפים תאים מוארכים עם מראה דו-קוטבי או רב-קוטבי (איור 2B,C).

בעת הפשרת גידולים טחונים בהקפאה, שיעור ההצלחה ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח מודלים במבחנה ופרה-קליניים לגליומות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1 הוא מאתגר במיוחד בשל הצמיחה האיטית של גידולים אלה והמורכבות של שכפול השינויים הגנומיים והאפיגנומיים הנרחבים הנגרמים על ידי מוטציית IDH. יתר על כן, תאי גידול חודרניים אלה מקיימים אינטראקציה פעילה עם תאים מסביב, כולל תאי חיסון, אנדותל, גליה ותאי עצב, ועלולים להסתמך עליהם להישרדות. קשה לשכפל את האינטראקציה המורכבת הזו בסביבה מעבדתית.

כדי לחשוף תובנות ביולוגיות חדשות לגבי גליומות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1 ולקדם את הפיתוח של טיפו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שברי הגידול המשמשים כאן הם חלק מאוסף NEUROLOGY של דגימות רקמה טריות המנוהל על ידי מרכז המשאבים הביולוגיים בבית החולים האוניברסיטאי מונפלייה (CRB@chu-montpellier.fr). מחקר זה נערך במסגרת הפרויקט שכותרתו "Gliomacult: אפיון ותרבויות ראשוניות של גליומות בדרגה נמוכה", בהובלת פרופ' J. P. Hugnot (פרויקט מס. RECH/P722/1-5). עבודה זו נתמכה על ידי La ligue contre le cancer, ARC (האגודה לחקר הסרטן), ARTC, ARTC SUD, Les Etoiles dans la mer, EMBALL'ISO, Région Occitanie, INCA. KAC נתמך על ידי המועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה במדעי הרוח (CONAHCYT), מקסיקו, והאגודה לחקר גידולי מוח (ARTC), צרפת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנטי-ASCL1BD Pharmingen ומסחר;דילול 5566041:500
דילול אנטי-ATRXסיגמא-אולדריץ'HPA0019061:100
דילול אנטי-CD68אג'ילנטM081401-21:500
דילול אנטי-GFAPAves LabsAB_2313547דילול 1:500
נוגדנים נגד IBA1פוג'יפילם וואקו019-19741דילול 1:1000
נוגדן חד שבטי נגד IDH1 (R132H) עכברDianovaDIA-H09
Anti-Ki67BD Pharmingen™556003Dilituion 1:1000
Anti-OLIG1R& D Systems®AF2417Dulituion 1:300
דילול Anti-OLIG2Sigma-AldrichMABN501:250
Anti-SOX9Abcam®EPR14335-78דילול 1:100
תוסף B-27 (פי 50), פחות ויטמין AThermo Fisher Scientific12587010
בקר סרום אלבומין (BSA)CiteAbA-421-100
Ciprofloxacin HClSigma-AldrichPHR1044-1G
CoolCellCorning®432000מיכל הקפאת תאים, עבור בקבוקונים קריוגניים 12 x 1 מ"ל או 2 מ"ל
כיסוי החלקה Ø, 13 מ"מKarl Hecht™ סיוע ומסחר;
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אולדריץ'D8418
DMEM/F-12, ללא גלוטמיןתרמו פישר 21331020
DNA Iסיגמא-אולדריץ'10104159001
דולבקו ופריים; s פוספט חוצץ מלח (PBS) 1xSigma-AldrichD8537
Falcon 100 מ"מ TC מטופל צלחת תרבית תאיםCorning®
353003 Falcon 24-well Clear Flat BottomCorning®353047צלחת תרבית תאים Multiwell שטופלה ב-TC, עם מכסה, סטרילי 
FunginInvivoGenant-fn-1
GentamicinThermo Fisher Scientific15750-037
HeparinSigma-AldrichH3149-100KU
HEPESSigma-AldrichH-3375
אנושיEGF PeproTechAF-100-15-1MG
אנושי FGF-basicPeproTech100-18B-1MG
LamininSigma-AldrichL2020
L-גלוטמיןThermo Fisher Scientific25030-024
N-2 תוסף (100x)Thermo Fisher Scientific17502-048
PDLSigma-AldrichP7886
סרום מסנן מזרק 37 מ"מ עם GF/0.2 ומיקרו; m SuporPALL Corporation4525
מעכב טריפסיןThermo Fisher Scientific17075-029
Trypsin-EDTA (0.05%), פנול אדוםThermo Fisher Scientific25300054
Zeiss Z1 Apotome 3 מיקרוסקופZeissמיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בשדה רחב ישר
328017

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dasgupta, P., Balasubramanyian, V., De Groot, J. F., Majd, N. K. Preclinical models of low-grade gliomas. Cancers (Basel). 15 (3), 596(2023).
  2. Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
  3. Jooma, R., Waqas, M., Khan, I. Diffuse low-grade glioma - changing concepts in diagnosis and management: A review. Asian J Neurosurg. 14 (2), 356-363 (2019).
  4. Louis, D. N. Molecular pathology of malignant gliomas. Annu Rev Pathol. 1, 97-117 (2006).
  5. Adenis, L., Plaszczynski, S., Grammaticos, B., Pallud, J., Badoual, M. The effect of radiotherapy on diffuse low-grade gliomas evolution: Confronting theory with clinical data. J Pers Med. 11 (8), 818(2021).
  6. Pirozzi, C. J., Yan, H. The implications of idh mutations for cancer development and therapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (10), 645-661 (2021).
  7. Van Den Bent, M. J., Smits, M., Kros, J. M., Chang, S. M. Diffuse infiltrating oligodendroglioma and astrocytoma. J Clin Oncol. 35 (21), 2394-2401 (2017).
  8. Suva, M. L., Tirosh, I. The glioma stem cell model in the era of single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (5), 630-636 (2020).
  9. Augustus, M., et al. Identification of CRYAB+ KCNN3+ SOX9+ astrocyte-like and EGFR+ PDGFRA+ OLIG1+ oligodendrocyte-like tumoral cells in diffuse idh1-mutant gliomas and implication of NOTCH1 signalling in their genesis. Cancers (Basel). 13 (9), 2107(2021).
  10. Hubert, C. G., Rich, J. N. Patient-derived explants as tumor models. Cancer Cell. 40 (4), 348-350 (2022).
  11. Abdullah, K. G., et al. Establishment of patient-derived organoid models of lower-grade glioma. Neuro Oncol. 24 (4), 612-623 (2022).
  12. Yuzhakova, D. V., et al. Development of a 3d tumor spheroid model from the patient's glioblastoma cells and its study by metabolic fluorescence lifetime imaging. Sovrem Tekhnologii Med. 15 (2), 28-38 (2023).
  13. Kloosterman, D., et al. Morphology of microglia across contexts of health and disease. Cell. 187, 5336-5356.e30 (2024).
  14. Thomas, D. L. 2021 updates to the World Health Organization classification of adult-type and pediatric-type diffuse gliomas: A clinical practice review. Chin Clin Oncol. 12 (1), 7(2023).
  15. Azar, S., et al. Cellular and molecular characterization of IDH1-mutated diffuse low grade gliomas reveals tumor heterogeneity and absence of EGFR/PDGFRalpha activation. Glia. 66 (2), 239-255 (2018).
  16. Bhaduri, A., et al. Outer radial glia-like cancer stem cells contribute to heterogeneity of glioblastoma. Cell Stem Cell. 26 (1), 48-63.e6 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

IDH1Cryopreservation

מאמרים קשורים