מאמר שיטה

הדמיה של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים בוורידים מזנטריים לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה מזנטרית באמצעות מיקרוסקופ תוך חיוני

DOI:

10.3791/67264

⸱

27 בספטמבר 2024

 ,  ,  ,  , 
1Center for Thrombosis and Hemostasis (CTH), University Medical Center Mainz, Johannes Gutenberg-University Mainz, 2German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Rhine-Main

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג שיטה לגרימת פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה מזנטרית ולהדמיית מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) בוורידים מזנטריים באמצעות מיקרוסקופ תוך-חיוני. זרימת הדם בעורק המזנטרי העליון הוגבלה למשך שעה אחת, ואחריה רפרפוזיה, המאפשרת כימות ישיר של הידבקות לויקוציטים ו- NETosis.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה של המעי (I/R) היא מצב אקוטי המאופיין בנזק לרקמות הנובע מזרימת דם מוגבלת לכלי הדם המזנטריים, מה שמוביל לפתולוגיות מקומיות וסיסטמיות עם פרוגנוזה גרועה. הן איסכמיה והן רפרפוזיה מעוררות סדרה של תגובות תאיות ומולקולריות, כאשר תאים דלקתיים משמשים כרגולטורים מרכזיים של הפתולוגיה. אינטראקציות אלה עם האנדותל האיסכמי מתווכות על ידי קולטני הידבקות מרובים. מספר מודלים של בעלי חיים הוקמו כדי לחקות פתולוגיה זו ולחקור את המסלולים המולקולריים המעורבים. במחקר זה, מודל מיקרוכירורגי של פגיעת I/R משולב עם מיקרוסקופ תוך חיוני כדי להמחיש גלגול לויקוציטים, הידבקות והיווצרות מלכודת חוץ-תאית של נויטרופילים (NET). מודל זה מיושם על עכברים טרנסגניים עם מחסור באנדותל PAR1 (F2r) כדי להעריך את ההשפעה של PAR1 על גלגול לויקוציטים והיווצרות NET שעה אחת לאחר איסכמיה ומיד לאחר רפרפוזיה. In vivo, נעשה שימוש בצביעת לויקוציטים כתומים של אקרידין, ו- NETs הודגמו באמצעות כתם חומצת גרעין. באופן מעניין, ירידה בהידבקות לויקוציטים והיווצרות NET נצפו בעכברים חסרי קולטן PAR1 אנדותל. מודל זה מאפשר ניתוח in vivo של רגולטורים מרכזיים המעורבים בפגיעות I/R.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איסכמיה מזנטרית חריפה (AMI) היא פתולוגיה נדירה1 עם סיכון תמותה גבוה2, המאופיינת בזרימת דם מופחתת במזנטריה עקב טרומבי בציר הצליאק, או העורק המזנטרי העליון או הנחות. ב 60%-70% מהמקרים, חסימות חריפות של העורק המזנטרי העליון עקב פקקת או אמבוליזציה אחראים לאיסכמיה חריפה של המעי 3. לעומת זאת, ב 5-15% מהמקרים, פקקת ורידים mesenteric מהווה איסכמיה mesenteric מעורבים הווריד mesenteric העליון, ולעתים רחוקות יותר, את הווריד mesenteric התחתון4. היפוקסיה ותת תזונה הנובעות מאיסכמיה מובילות להפרעות מטבוליזם באנרגיה ברמה התאית5. לדוגמה, תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי מפעיל מסלולי איתות מרובים, ומפעיל מנגנוני מוות תאי6. למרות שרפרפוזיה מהירה מאפשרת את שיקום חילוף החומרים האירובי, שיקום זרימת הדם לאזור איסכמי גורם לעיתים קרובות לפגיעה נרחבת ברקמה עקב ייצור חמצן תגובתי (ROS)7, עומס סידן8, תפקוד לקוי של האנדותל9 ותגובות דלקתיות10.

מודלים ניסיוניים רבים של בעלי חיים המשתמשים בחסימת כלי דם זמנית של העורק המזנטרי העליון הוקמו כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים במהלך פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (I/R)11. השימוש במודלים כאלה בשילוב עם מיקרוסקופ תוך-חיוני (IVM) הוא בסיסי להשגת תובנות לגבי האינטראקציות התאיות הבסיסיות והתקדמות המחלה11. תפקוד לקוי של מחסום המעי נצפה זמן קצר לאחר איסכמיה12, כאשר האפיתל מאבד את שלמותו13, וכתוצאה מכך טרנסלוקציה חיידקית לאתרים מחוץ למעיים כגון בלוטות הלימפה המזנטריות, הטחול, הכבד והכליות12,14. רפרפוזיה מחמירה עוד יותר את הפגיעה ברירית15. תגובה דלקתית בעורקים מתבטאת בהידבקות מתגלגלת ומוצקה של לויקוציטים על שכבת תאי האנדותל, התלויה במולקולות כגון L-selectin16, P-selectin (CD62P)17, GPIIb/IIIa טסיות ופיברינוגן18. באופן מעניין, הידבקות לויקוציטים לוורידים מזנטריים מושפעת מנוכחות של מיקרוביוטת מעיים19 וקולטן דמוי אגרה 4 המסמן10. פגיעת I/R מפעילה גם היווצרות מלכודת נויטרופילים חוץ-תאיים (NET)10. מיקוד טיפולי של הדנ"א החוץ תאי, שמקורו בלויקוציטים פעילים כגון נויטרופילים, משפר את התוצאה של פגיעה ב- I/R במעי20. בכבד, פגיעת I/R מוצתת על ידי מיקרופאגים מקומיים21, ועיכוב מיקרו-רנ"א מחליש באופן משמעותי אפופטוזיס22. יש לציין כי פגיעת I/R במזנטריה גורמת לדיסביוזיס של המעי, שהוא הפיך ונפתר לאחר רה-וסקולריזציה23.

האנדותל מושפע גם מההשפעות המזיקות של פגיעת I/R, כאשר ROS ממלא תפקיד מרכזי בתהליך24. הידבקות לויקוציטים לשכבת תאי האנדותל, נזק לאנדותל ושינויים במטבוליזם של תחמוצת החנקן (NO) נצפים9. עם זאת, המסלולים המולקולריים המעורבים עדיין לא נחקרו במלואם.

קולטן המופעל על ידי פרוטאז 1 (PAR1, F2r), הוא קולטן ממברנה המתבטא במגוון תאים, כולל תאי אנדותל, ומופעל בתנאי דלקת25. הפעלתו מתרחשת כאשר פרוטאזות סרין קורעות את הקולטן ב-N-terminus, חושפות את הליגנד הקשור שבתורו מפעיל את הקולטן על ידי קשירה ללולאה החוץ-תאית השנייה של מולקולה26. מסלול האיתות של קולטן האנדותל C (EPCR)-PAR1 משפיע על הומאוסטזיס NO אנדותל ומקל על שיקום זרימת הדם באיסכמיה היקפית27.

במחקר זה, פגיעת I/R יושמה על מודל עכבר גנטי המאופיין במחסור ספציפי לתאי אנדותל PAR1 כדי להמחיש גלגול לויקוציטים, הידבקות והיווצרות רשת. השילוב של מודל עכבר גנטי ומיקרוסקופ תוך חיוני לאחר מיקרו-כירורגיה I/R מספק תובנות חשובות על ידי הדגשת סוגי התאים הספציפיים המעורבים בהתקדמות המחלה. יישום פגיעת I/R במודלים גנטיים של עכברים הוא חיוני בזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות שניתן להשתמש בהן כדי לשפר את מהלך המחלה. יתר על כן, הודגמה המשמעות של PAR1 אנדותל ב- NETosis.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים המערבים עכברים אושרו על ידי הוועדה המקומית לחקיקת בעלי חיים (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, קובלנץ, גרמניה; G21-1-041). B6 זכר ונקבה בני 6-8 שבועות. FVB-F2rtm1a(EUCOMM) Tg/Cdh5-cre)7Mlia/Tarc עכברים שימשו למחקר. הוויסות הספציפי לתאי אנדותל של F2r (PAR1) מתרחש באמצעות מקדם VE-Cadherin Cre28. במחקר זה, flox-F2r x VE-Cadherin Cre+ (F2RΔEC) הציג ביטוי מופחת של F2r (PAR1) על תאי אנדותל, ו-flox-F2r x VE-Cadherin Cre- (WT) מבטאים רמות F2r אנדותל נורמליות (PAR1). פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה לניתוח

  1. לעקר את כלי הניתוח הדרושים (מספריים צרים במיוחד ישר, מלקחיים, מהדק כלי דם וכו ').
  2. הכינו את מערכת ההרדמה מבוססת חמצן ואיזופלורן עם חרוט אף ופלטת חימום.

2. הכנת בעלי חיים

  1. לשקול את החיה.
  2. ביצוע הרדמה: הרדמת עכברים באמצעות הזרקה תוך צפקית (I.P.) של תמיסה המכילה מידזולם (5 מ"ג/ק"ג), מדטומידין (0.5 מ"ג/מ"ל) ופנטניל (0.5 מ"ג/ק"ג) (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות).
  3. הסירו את השיער מאזור ניתוח הצוואר והבטן בעזרת מכונת גילוח חשמלית לבעלי חיים קטנים.
  4. מקמו את העכבר בשכיבה גבית על כרית החימום וחברו אותו למערכת החמצן דרך חרוט אף. אבטח איברים של העכבר לכרית מחוממת עם סרט כירורגי. ודא כי קרום חרוט הלטקס מתאים היטב מעל ראש העכבר. עקוב אחר טמפרטורת הגוף של בעל החיים באופן רקטלי באמצעות מדחום ספציפי למכרסמים.
  5. יש למרוח קרם להסרת שיער כדי להסיר את שאריות השיער מאזור ניתוח הצוואר ולנגב את העור של אזור הניתוח עם אתנול 70%.
  6. בצע בדיקת צביטת בוהן (רפלקס דוושה) כדי לוודא שבעל החיים מורדם לחלוטין.

3. הליך כירורגי

  1. השתלת קטטר בווריד הצוואר
    1. בצע חתך רוחבי (~ 0.5 ס"מ) מעל קנה הנשימה, הסר את העור המכסה את הצוואר ובודד את הווריד הצווארי הימני.
    2. השתמש חוט משי של כ 5 ס"מ, לסגור את הקצה הדיסטלי של הווריד, ולתקן אותו עם מלקחיים כירורגיים. מניחים שלושה חוטי משי כ-2 ס"מ מתחת לווריד: אחד קרוב לקצה הדיסטלי ושניים קרוב לקצה הפרוקסימלי של הווריד הצווארי. לקשור קשר כירורגי, אבל לא לסגור את כלי השיט.
    3. הכינו קטטר פוליאתילן (0.28 מ"מ ID, 0.61 מ"מ OD) מלא ב-0.9% NaCl ומחובר למזרק 1 מ"ל. השתמש במספריים כדי לחתוך חור בין הקשר השני והשלישי ולהשתיל את הצנתר לתוך הווריד הצווארי. שאפו את המזרק כדי לוודא שהדם נמצא בצנתר.
    4. תקן את הצנתר בווריד על ידי קשירת חוט המשי, וודא שהוא מהודק היטב. השתמש בסרט רפואי כדי לאבטח את המזרק.
    5. הכן תפוז Acridine: לדלל 1: 4 תמיסת מלאי 2 מ"ג / מ"ל עם מלוחים סטריליים (ריכוז סופי 0.5 מ"ג / מ"ל) במזרק 1 מ"ל. שמור את המזרק בחושך והזריק 50 μL בעכבר.
    6. הכנת צבע חומצת גרעין: לדלל 1:1000 תמיסת ציר 5 מ"מ עם מלח סטרילי (ריכוז סופי 5 מיקרומטר) במזרק 1 מ"ל. שמור את המזרק בחושך והזריק 50 μL בעכבר.
    7. הזריקו ב-vivo Acridine orange (50 מיקרוגרם/μL, 50 μL לעכבר) דרך צנתר הווריד הצווארי כדי להמחיש לויקוציטים מוכתמים וצבע פלואורסצנטי חוץ-תאי של DNA בדומה למלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) (5 מיקרומטר, 50 מיקרוליטר לעכבר). NETs ו leukocytes מצולמים בו זמנית.
  2. מודל פגיעת I/R מזנטרית
    1. לחטא את עור הבטן עם אתנול 70%.
    2. בצע laparotomy 3-5 ס"מ לאורך linea alba באמצעות מספריים כירורגיים.
    3. בעזרת שני קצוות כותנה לחים במי מלח, הסר בעדינות את המעי וזהה מיקום עם כיסוי שומן מינימלי. מקם ענפי מעיים קטנים על בצק שחור כדי להפחית את אות הרקע.
    4. רכוש את הסרטונים לפני I/R (טרום איסכמיה).
    5. לעשות לדחוס לחות עם NaCl ומניחים את המעי בתוכו. ודא כי המעי מוקף בדחיסה ושמר על לחות במהלך שלב 5.6.
    6. לחסום את העורק mesenteric העליון עם מהדק כלי דם קטן.
    7. דחפו בעדינות את המעי חזרה לחלל הבטן באמצעות צמר גפן לח במי מלח, והשתמשו בתפר 7-0 כדי לסגור את דופן הבטן כדי למנוע אובדן לחות וטמפרטורה. לשמור על איסכמיה במשך 60 דקות, לבדוק הרדמה לפחות כל 20 דקות.
    8. לאחר 1 שעה, ליזום reperfusion על ידי הסרת מהדק.
      הערה: ביצוע נכון של הליך איסכמיה גורם לשינוי נראה לעין. בתחילה, האזור הפגוע ייראה חיוור או לבן בשל חוסר זרימת הדם. עם הסרת המהדק, זרימת הדם תחזור בהדרגה לאזור האיסכמי, אשר יחזיר את צבעו הרגיל, המסמן חסימה מוצלחת. זה הכרחי כדי לבחון מקרוב את העכבר ברציפות לאורך כל שלב איסכמיה.
    9. לאחר התקופה האיסכמית, יש למרוח כמה טיפות של מי מלח על האזור החתוך, ולאחר מכן להסיר בעדינות את האטבים המיקרו-וסקולריים באמצעות יישום קליפס.
    10. באמצעות קצות כותנה לחים מלוחים, להסיר בעדינות את המעי שוב, למקם את הענפים הקטנים של הווריד על בצק שחור, להזריק 50 μL של כתום Acridine שוב, וללכוד את קטעי וידאו של אותו וריד באותו מיקום (פוסט-איסכמיה).

4. מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי וידאו תוך חיוני במהירות גבוהה

  1. דמיינו לויקוציטים ורשתות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה במהירות גבוהה המצויד במעבה למרחקים ארוכים, מונוכרומטור, יעד טבילה במים פי 10 ומצלמת מכשיר מצומדת טעינה. רכישת התמונה בוצעה עם זמן חשיפה של 30ms ומסננים Alexa Fluor 488(495/519) ו-Rhodamine Red (570/590).
  2. השתמש בתוכנת הדמיה לרכישה וניתוח של תמונות.
  3. כמת גיוס תאים בתוך אזור עניין של 0.06 מ"מ².
  4. כמת לויקוציטים דבקים כתאים הנותרים נייחים או מחוברים לרירית האנדותל למשך תקופת תצפית של 20 שניות.
  5. זהה NETs כמבנים חוץ-תאיים המסומנים הן עם לויקוציטים והן עם צבעים פלואורסצנטיים של חומצות גרעין חוץ-תאיות.
  6. המתת חסד של בעלי חיים על ידי פריקת צוואר הרחם בסוף הניסוי (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות).

5. בידוד תאי אנדותל בכבד (LEC) ו-RT-PCR כמותי

  1. בודד LECs באמצעות מיון תאים מגנטי (MACS)29.
  2. בודדו את סך הרנ"א.
  3. בצע סינתזת DNA משלימה (cDNA)27 על ידי ערבוב 2 מיקרוגרם של RNA כולל עם 2 μL של RT Buffer, 0.8 μL של dNTP Mix, 2 μL של RT Random Primers, 1 μL של Reverse Transcriptase, ו 4.2 μL סטרילי מזוקק H2O.
  4. שעתוק cDNA בוצע תוך יישום התנאים הבאים: 25°C למשך 10 דקות, 37°C למשך 120 דקות, 85°C למשך 5 דקות.
  5. השתמש 20 ng של cDNA עבור qPCR.
  6. השתמש בפריימרים הבאים: F2r (קדימה): TGAACCCCCGCTCATTCTTTT, F2r (הפוך): CCAGCAGGACGCTTTTTTTTT, L32 (קדימה): CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC, L32 (הפוך): TCTGGGTTTCCGCCAGTTT. השתמש בתנאים הבאים: 95 ° C 30 שניות, 45 מחזורים של (95 ° C עבור 10 שניות, 60 ° C עבור 25 שניות), 60 ° C עד 95 ° C עבור 6 שניות עם ΔΤ 1 ° C.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לחקור את ההשפעות התלויות בתאי אנדותל על גלגול והיצמדות לויקוציטים, כמו גם על היווצרות NET, בתחילה, נבדקה היעילות של מחסור ב- VE-Cadherin Cre inducible F2r בתאי אנדותל. נעשה שימוש במיון תאים מגנטיים כדי לבודד תאי אנדותל בכבד. לאחר מכן, RNA בודד, ואחריו PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR). עכברי F2r ΔEC, שבהם נעדר ה-Cre recombinase המתבטא תחת שליטתו של מקדם VE-Cadherin, הראו רמות mRNA נמוכות משמעותית של F2r (PAR1) (כשליש) בהשוואה לבקרות WT (איור 1).

לאחר אישור המחסור בקו העכברים, בוצעה פגיעת I/R מזנטרית כדי לבחון את ההשפעה של PAR1 המתבטאת בתאי אנדותל וסקולריים על גלגול והדבקת לויקוציטים, כפי שהודגם במיקרוסקופ תוך-חיוני (איור 2A,B). לאחר שעה אחת של איסכמיה, המהדק הוסר, ואת הכלי הורשה reperfuse. גלגול לויקוציטים והדבקה נצפו ותועדו (ירוק מוכתם, מסומן על ידי חצים לבנים). אף על פי ששתי הקבוצות הראו מספר מוגבר של לויקוציטים דבקים לאחר פגיעת I/R, מחסור ב-F2r אנדותל (PAR1) הביא לירידה ניכרת אך לא משמעותית בהידבקות לויקוציטים לאנדותל המזנטרי המופעל על ידי I/R, מה שמרמז על תפקיד פעיל של הפעלת PAR1 אנדותל בגיוס לויקוציטים לוורידים המזנטריים האיסכמיים (איור 2C).

המטרה הבאה הייתה לבחון האם ביטוי PAR1 אנדותל מווסת את היווצרות הרשת הנגרמת על ידי פגיעת I/R. לכן, חומצות גרעין חוץ-תאיות הוכתמו בצבע30 אטום לתאים, ודמיינו את הרשתות שנוצרו באמצעות מיקרוסקופ תוך-חיוני (מסומן על-ידי חצים שחורים) (איור 2A,B). לאחר פגיעת I/R, נצפו NETs רק בקבוצת WT המבטאים רמות נורמליות של PAR1 על תאי האנדותל, מה שמצביע על תפקיד רגולטורי של PAR1 ב-NETosis (איור 2C,D). יש לציין כי כאשר ביטוי F2r של האנדותל דוכא, לא היו NETs בוורידים המזנטריים הפגועים I/R.

figure-results-1
איור 1: ביטוי mRNA F2r (PAR1). ביטוי תאי אנדותל בכבד F2r של עכברי WT (n = 6) ו- F2rΔEC (n = 9) ביחס לגן משק הבית L32. הנתונים מוצגים כחציון עם רווח בר-סמך של 95%. מבחן מאן-ויטני שימש להשוואה בין שתי קבוצות עצמאיות, *p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: PAR1 אנדותל משפיע על הידבקות לויקוציטים ועל היווצרות רשת בוורידים מזנטריים פגועי I/R. תמונות מייצגות במיקרוסקופ תוך-חיוני של לויקוציטים נצמדים מוכתמים בכתום אקרידין (חיצים לבנים) ו-NETs מוכתמים בכתום Sytox (חיצים שחורים) של עכברי WT ו-F2rΔEC לפני (לפני) ואחרי (אחרי) פגיעת I/R (A) פי 10 ו-(B) הגדלה פי 20. מוטות קנה מידה: A, 50 מיקרומטר; B, 20 מיקרומטר. (C) הידבקות לויקוציטים ו-(D) NETs למ"מ2 של עכברי WT (n = 7) ו-F2rΔEC (n = 4) לפני (לפני) ואחרי (אחרי) פגיעת I/R. כל הנתונים הוצגו כחציון עם רווח בר-סמך של 95%. השוואות סטטיסטיות בוצעו באמצעות מבחן ANOVA הדו-כיווני, **p< 0.01, ובדיקות ההשוואה המרובות של סידאק כדי להשוות את האמצעים של גנוטיפים שונים בכל נקודת זמן (לפני ואחרי איסכמיה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פגיעת I/R מזנטרית בשילוב עם מיקרוסקופ תוך חיוני יושמה על מודל עכבר גנטי של מחסור ב- F2r (PAR1) בתאי אנדותל לניתוח in vivo של לויקוציטים ו- NETs לאחר שעה אחת של איסכמיה. מודל פגיעת I/R מזנטרית משמש לעתים קרובות במכרסמים עם זמני איסכמיה ורפרפוזיה המשתנים בין דקות למספר שעות23,31, ומשפיעים על התוצאה הדלקתית32 ותמותה33. המודל תלוי גם במספר גורמים, כולל מיקרוביוטה19,34, קולטני מערכת החיסון 10,35,36,37, מין38,39 וגיל35. מלבד זמני I/R משתנים, משתנה נוסף במודל זה הוא התגובה הדיפרנציאלית של חלקים שונים של המעי לפציעה, כאשר המעי הדק מראה נזק רירית גדול יותר מאשר המעי הגס40. המיקום של קליפ כלי הדם המשפיעים על האזור האיסכמי הוא קריטי עבור שחזור של השיטה32,33. חשוב לציין, חסימת עורק מזנטרי מעולה בשילוב עם הפרעה בזרימה בטחונית מניבה שיעורי תמותה הקשורים באופן עקבי למשך איסכמיה41.

במחקר זה, עכברים היו נתונים לשעה אחת של איסכמיה, והידבקות לויקוציטים in vivo והיווצרות NET הודגמו מיד לאחר הרפרפוזיה כדי לבחון את התגובה הדלקתית המוקדמת המופעלת על ידי המצב האיסכמי בהיעדר ביטוי F2r אנדותליאלי. יישום שיטות אלה על מודלים גנטיים של עכברים מאפשר לחקור כיצד מולקולות מטרה מסוימות משפיעות על ההתנהגות התאית ועל התגובה הדלקתית הן לאחר איסכמיה והן במהלך רפרפוזיה.

ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול, כולל שמירה על שלמות המעי. הטיפול במעי חייב להיעשות בעדינות כדי למנוע נזק לרקמות. לשם כך, צמר גפן לח הוא הכלי המתאים לניתוק זמני של המעי מחלל הבטן. זה חיוני כי המעי נשאר לח עד שהוא ממוקם מחדש בבטן. פציעות טיפול קלות יכולות לעורר הפעלה של סוגי תאים שונים, כגון טסיות דם ותאי אנדותל, אשר יכולים להשפיע על התוצאות.

עבור עקביות, זה חיוני כדי לדמיין את אותו אתר של קטעי מעיים לפני ואחרי איסכמיה. זה יכול להיות מאתגר מכיוון שהמעי ממוקם מחדש בחלל הבטן לאחר איסכמיה. כדי לטפל בבעיה זו, גישה אחת היא להניח חתיכה קטנה של דחיסה לחה על החלק של המעי כי היה דמיינו לפני איסכמיה.

כדי לדמיין גלגול והדבקה של לויקוציטים, כמו גם היווצרות NET in vivo, הוזרקו לעכברים גם לויקוציטים וגם צבע פלואורסצנטי של חומצת גרעין דרך וריד הצוואר. צבע לויקוציטים (ראו טבלת חומרים) הוא צבע פלואורסצנטי מטאכרומטי חדיר לתאים הנקשר לתאי דם לבנים אך לא לתאי דם אדומים ונמצא בשימוש נרחב להכתמת לויקוציטים in vivo 17,42. הצבע מוחל תוך ורידי ומספק צביעת לויקוציטים חזקה תוך שניות. עם זאת, ספציפיות יכולה להיות מגבלה כפי שהוא גם מכתים תאים גרעין אחרים, כגון תאי אנדותל. עם זאת, תאי הדם שומרים על הכתם זמן רב יותר בשל אפקט שטיפה43. צבע פלואורסצנטי של חומצת גרעין (באנגלית: Nucleic acid fluorescence dye) הוא כתם חומצת גרעין בלתי חדיר המשמש בדרך כלל להמחשת היווצרות רשת 30,44,45. זה יכול להיות מיושם גם תוך ורידי, נקשר עם זיקה גבוהה, והוא מהיר וקל לשימוש. שוב, ספציפיות היא חיסרון מכיוון שהצבע ייקשר לכל תא עם קרום לא שלם. באופן אידיאלי, יש לשלב אותו עם סמן נויטרופילים (למשל, CD15, CD11b) או סמן NETosis (למשל, נוגדנים נגד citH3) כדי לשפר את הספציפיות. צבעים אלה מאפשרים הדמיה in vivo של לויקוציטים בוורידים mesenteric של חיות מעבדה.

המגבלה העיקרית של הטכניקה היא נוכחות של שומן הקרביים, אשר מגביל את הדמיה של נימי מעיים מאוד מעכב רכישת תמונה. כדי למנוע סיבוך זה, יש צורך להשתמש בחיות ניסוי צעירות (6-8 שבועות) שיש להם הפחתת היווצרות שומן הקרביים. בנוסף, ניתוח היסטולוגי ex vivo נפגע על ידי השימוש בצביעת in vivo . מגבלה נוספת היא ההשפעה של מיקרוביוטת המעי והתזונה על מודל זה, אשר עשוי להשתנות מאוד בין גידולי עכברים שונים46. כדי להתמודד עם מגבלה זו, המחקר של מודלים של עכברים גנוטוביוטיים יכול להיחשב10.

במחקר זה, התגובה התאית המיידית נחקרה לאחר איסכמיה, ונצפתה שקיעת לויקוציטים מופחתת לאנדותל המזנטרי המופעל והיווצרות NET in vivo. פירוק נטו על ידי מתן תוך ורידי של DNase 1 שעה לאחר איסכמיה מפחית את התגובה הפרו-דלקתית המוקדמת ומקל על הפרעה במחסום המעי47. יש לציין כי הטיפול בטרומבומודולין, גליקופרוטאין טרנסממברנה המעכב את פעילות התרומבין48, שיפר את הישרדותם של עכברים עם פגיעה חמורה ב- I/R במעי, החליש את התגובה הדלקתית של תפקוד לקוי של האנדותל והפחית את הצטברות ההיסטון האינטנסיבית באיברים מרוחקים49. כאן, קולטן תרומבין אנדותל הוכח כמשפיע על תוצאת I/R, והדגיש את המשמעות של שילוב מודל פגיעת I/R במעי עם מיקרוסקופ תוך חיוני בעכברים מהונדסים גנטית כדי לחקור מתווכים חשובים של פתולוגיית המחלה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם חושפים ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.R. מודה על מימון מיוזמת Forschungsinitiative Rheinland-Pfalz ו- ReALity (פרויקט MORE), BMBF Cluster4Future CurATime (פרויקט MicrobAIome; 03ZU1202CA), קרן וילהלם סנדר (Nr. 2022.131.1), וקרן החדשנות Deutsche Zentren der Gesundheitsforschung (DZG) "מיקרוביום" (81X2210129). C.R. הוא מדען במרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם (DZHK). C.R. הוא חבר במרכז לביולוגיה תרגומית של כלי הדם (CTVB), במרכז המחקר לאימונותרפיה (FZI), וב- Potentialbereich EXPOHEALTH באוניברסיטת יוהנס גוטנברג במיינץ. C.R. הוא חבר ביחידת המחקר DFG 5644 INFINITE (RE 3450/15-1). C.R. זכה במלגת מחקר ממכללת המחקר גוטנברג באוניברסיטת יוהנס גוטנברג במיינץ. ק.ק. נתמכת על ידי תוכנית המצוינות "קידום מדעניות נשים" של DZHK והיא חברה ב- DZHK הצעיר. Z.G ו- O.D. הם דוקטורנטים בבית הספר למחקר של מיינץ לביו-רפואה תרגומית (TransMed).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תפוז אקרידיןסיגמא-אולדריץ'   A-6014
צלחת 96 בארות כפל PCR-Platten Sarstedt721977202.00
מערכות הרדמה למכרסמיםGROPPLER medizintechnikUni Vet -Porta T-8
Aqua ad injectabilia IVMB Braun Melsungen53402101
בצק שחורStaedtlerדוגמנות חימר
CD146 מיקרו-חרוזים, עכברMiltenyi Biotec130-092-007
cellSensאולימפוסאולימפוס cellSense Dimension Desktop 2.3תוכנה
מצלמת מכשיר מצמד טעינהHamamatsu PhotonicsמצלמתORCA-R2
צמר גפן Bö TTGER09-119-9100
המוסטט מעוקל 125 מ"מ/5 אינץ'אינדיגו אינסטרומנטס 22466
קרם אפילציהBaleaלא ישים
Dorbene Vetzoetis
Dumont FineScience Tools11251-35
אתנול p.a. 99,5Roth5504.20
מספריים צרים במיוחד – ישר/חד-חד/10.5FST14088-10
פנטנילJanssen-Cilag GmBH
מלקחיים "Dumont #5" (Inox, קצה 0.1 מ"מ, אורך 11 ס"מ)FST11251-20
GentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-236
GraphpadprismGraphpadPrism 10תוכנה
isoflurane Piramal4150097146757.00
iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5mlBioRad1725125.00
קלטת רפואית LeukofixBSNMedical0213600
ערכת דיסוציאציה לכבד, עכברMiltenyi Biotec130-105-807
עמודות הפרדת LS MACSMiltenyi Biotec130-042-401
MACS מסננת חכמה 100 ומיקרו; mMiltenyi Biotec130-098-463
אטמי חותם Microseal BBioradMSB1001
Midazolamhameln5918501.00
מחזיקBraun2350748
FST12001-13
תפר משי קלוע שאינו נספג, גודל: 7/0, 91 מטר Fine Science Tools18020-70
Olympus BX51WI מיקרוסקופ פלואורסצנטימיקרוסקופאולימפוס
PCR לרצועות צינורSarstedt72985002.00
PCR מכסי צינורSarstedt65989002.00
קטטר פליאתילןסמית 'רפואי דויטשלנד GmbH800/100/100
פרולן (8648G), פוליפרופילן 6-0, Nahtmaterial ג'ונסון & ג'ונסון מדיקל GmbH 8695H
Relia Prep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6112
ערכת Tanscription הפוכה (cDNA בקיבולת גבוהה)Applied Biosystems4368813.00
סולם בית ספר קרן & SOHN GmbHEMB 500-1
מספריים קפיצים - זווית לצדFST15006-09
מיקרוסקופ סטריאוLeicaM50
המוסטטים ישרים 135 מ"מ/5.5 אינץ'אינדיגו אינסטרומנטס 22468
מזרק 1 מ"לבראון9166017V
SYTOX כתוםתרמו פישר מדעיS11368
בקר טמפרטורה TC-1000FMI Fö hr מכשירים רפואיים GmbHלא ישים
מלקחיים לרקמות - 1x2 שינייםFST18057-14
מהדק כלי דםFine Science Tools18055-02
Vetiva miniWAHL1584-0480
% מחט NaCl

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cudnik, M. T., et al. The diagnosis of acute mesenteric ischemia: A systematic review and meta-analysis. Acad Emerg Med. 20 (11), 1087-1100 (2013).
  2. Kassahun, W. T., Schulz, T., Richter, O., Hauss, J. Unchanged high mortality rates from acute occlusive intestinal ischemia: Six-year review. Langenbecks Arch Surg. 393 (2), 163-171 (2008).
  3. Florim, S., Almeida, A., Rocha, D., Portugal, P. Acute mesenteric ischemia: A pictorial review. Insights Imaging. 9 (5), 673-682 (2018).
  4. Kumar, S., Sarr, M. G., Kamath, P. S. Mesenteric venous thrombosis. N Engl J Med. 345 (23), 1683-1688 (2001).
  5. Dugbartey, G. J. Cellular and molecular mechanisms of cell damage and cell death in ischemia-reperfusion injury in organ transplantation. Mol Biol Rep. 51 (1), 473(2024).
  6. Ikeda, H., et al. Apoptosis is a major mode of cell death caused by ischemia and ischemia/reperfusion injury to the rat intestinal epithelium. Gut. 42 (4), 530-537 (1998).
  7. Gutierrez-Sanchez, G., Garcia-Alonso, I., Gutierrez Saenz De Santa Maria, J., Alonso-Varona, A., Herrero De La Parte, B. Antioxidant-based therapy reduces early-stage intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Antioxidants (Basel). 10 (6), 853(2021).
  8. Jia, Z., Chen, Q., Qin, H. Ischemia-induced apoptosis of intestinal epithelial cells correlates with altered integrin distribution and disassembly of f-actin triggered by calcium overload. J Biomed Biotechnol. 2012, 617539(2012).
  9. Gordeeva, A. E., et al. Vascular pathology of ischemia/reperfusion injury of rat small intestine. Cells Tissue Organs. 203 (6), 353-364 (2017).
  10. Ascher, S., et al. Gut microbiota restricts netosis in acute mesenteric ischemia-reperfusion injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 40 (9), 2279-2292 (2020).
  11. Kiouptsi, K., Casari, M., Mandel, J., Gao, Z., Deppermann, C. Intravital imaging of thrombosis models in mice. Hamostaseologie. 43 (5), 348-359 (2023).
  12. Wang, B., Huang, Q., Zhang, W., Li, N., Li, J. Lactobacillus plantarum prevents bacterial translocation in rats following ischemia and reperfusion injury. Dig Dis Sci. 56 (11), 3187-3194 (2011).
  13. Guan, Y., Worrell, R. T., Pritts, T. A., Montrose, M. H. Intestinal ischemia-reperfusion injury: Reversible and irreversible damage imaged in vivo. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297 (1), G187-G196 (2009).
  14. Joao, S. A., Medeiros, A. C., Diniz, S. O. F., Cardoso, V. N., Brandt, C. T. Translocation of 99mTc labelled bacteria after intestinal ischemia and reperfusion. Acta Cir. Bras. 19 (4), (2004).
  15. Parks, D. A., Granger, D. N. Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation. Am J Physiol. 250 (6 Pt 1), G749-G753 (1986).
  16. Kurose, I., et al. Molecular determinants of reperfusion-induced leukocyte adhesion and vascular protein leakage. Circ Res. 74 (2), 336-343 (1994).
  17. Massberg, S., et al. Platelet-endothelial cell interactions during ischemia/reperfusion: The role of p-selectin. Blood. 92 (2), 507-515 (1998).
  18. Salter, J. W., Krieglstein, C. F., Issekutz, A. C., Granger, D. N. Platelets modulate ischemia/reperfusion-induced leukocyte recruitment in the mesenteric circulation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281 (6), G1432-G1439 (2001).
  19. Bayer, F., et al. Colonization with altered schaedler flora impacts leukocyte adhesion in mesenteric ischemia-reperfusion injury. Microorganisms. 9 (8), 1601(2021).
  20. Boettcher, M., et al. Therapeutic targeting of extracellular DNA improves the outcome of intestinal ischemic reperfusion injury in neonatal rats. Sci Rep. 7 (1), 15377(2017).
  21. Li, T. T., et al. Fbxw5 aggravates hepatic ischemia/reperfusion injury via promoting phosphorylation of ask1 in a traf6-dependent manner. Int Immunopharmacol. 99, 107928(2021).
  22. Huang, Z., et al. Inhibition of mir-450b-5p ameliorates hepatic ischemia/reperfusion injury via targeting cryab. Cell Death Dis. 11 (6), 455(2020).
  23. Munley, J. A., et al. Chronic mesenteric ischemia-induced intestinal dysbiosis resolved after revascularization. J Vasc Surg Cases Innov Tech. 9 (2), 101084(2023).
  24. Rubio-Gayosso, I., Platts, S. H., Duling, B. R. Reactive oxygen species mediate modification of glycocalyx during ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (6), H2247-H2256 (2006).
  25. Grimsey, N. J., et al. Ubiquitin plays an atypical role in gPCR-induced p38 map kinase activation on endosomes. J Cell Biol. 210 (7), 1117-1131 (2015).
  26. Weithauser, A., Rauch, U. Role of protease-activated receptors for the innate immune response of the heart. Trends Cardiovasc Med. 24 (6), 249-255 (2014).
  27. Bochenek, M. L., et al. EPCR-PAr1 biased signaling regulates perfusion recovery and neovascularization in peripheral ischemia. JCI Insight. 7 (14), e157701(2022).
  28. Alva, J. A., et al. Ve-cadherin-cre-recombinase transgenic mouse: A tool for lineage analysis and gene deletion in endothelial cells. Dev Dyn. 235 (3), 759-767 (2006).
  29. Formes, H., et al. The gut microbiota instructs the hepatic endothelial cell transcriptome. iScience. 24 (10), 103092(2021).
  30. Tanaka, K., et al. In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model. PLoS One. 9 (11), e111888(2014).
  31. How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells alleviate lung injury from mesenteric ischemia-reperfusion. J Trauma Acute Care Surg. 79 (4), 592-601 (2015).
  32. Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. J Vis Exp. 111, e53881(2016).
  33. Henein, L., Clevenger, R., Keeran, K., Brinster, L. Rodent model of intestinal ischemia-reperfusion injury via occlusion of the superior mesenteric artery. J Vis Exp. (200), e64314(2023).
  34. Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301 (6), G1020-G1030 (2011).
  35. Watanabe, T., et al. Activation of the myd88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303 (3), G324-G334 (2012).
  36. Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PLoS One. 9 (10), e110441(2014).
  37. Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45 (6), 1246-1255 (2010).
  38. Wu, M., Rowe, J. M., Fleming, S. D. Eicosanoid production varies by sex in mesenteric ischemia-reperfusion injury. Clin Immunol. 220, 108596(2020).
  39. Mester, A., et al. gender-related hemorheological alterations in intestinal ischemia-reperfusion in the rat. J Surg Res. 225, 68-75 (2018).
  40. Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E., Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263 (3 Pt 1), G301-G305 (1992).
  41. Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49 (2), 168-173 (1990).
  42. Von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  43. Cahoon, J. M., et al. Acridine orange leukocyte fluorography in mice. Exp Eye Res. 120, 15-19 (2014).
  44. Jiang, D., Saffarzadeh, M., Scharffetter-Kochanek, K. In vitro demonstration and quantification of neutrophil extracellular trap formation. Bio Protoc. 7 (13), e2386(2017).
  45. Westhorpe, C. L., et al. In vivo imaging of inflamed glomeruli reveals dynamics of neutrophil extracellular trap formation in glomerular capillaries. Am J Pathol. 187 (2), 318-331 (2017).
  46. Rausch, P., et al. Analysis of factors contributing to variation in the c57bl/6j fecal microbiota across German animal facilities. Int J Med Microbiol. 306 (5), 343-355 (2016).
  47. Wang, S., et al. DNase-1 treatment exerts protective effects in a rat model of intestinal ischemia-reperfusion injury. Sci Rep. 8 (1), 17788(2018).
  48. Li, Y. H., Kuo, C. H., Shi, G. Y., Wu, H. L. The role of thrombomodulin lectin-like domain in inflammation. J Biomed Sci. 19 (1), 34(2012).
  49. Hayase, N., et al. Recombinant thrombomodulin on neutrophil extracellular traps in murine intestinal ischemia-reperfusion. Anesthesiology. 131 (4), 866-882 (2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PAR1

מאמרים קשורים