Method Article

אבלציה בתיווך לייזר דו-פוטוני של אוסטאובלסטים בהתפתחות זחלי דגי זברה

DOI:

10.3791/67279

⸱

September 6th, 2024

 , 
1CRTD - Center for Regenerative Therapies TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, Faculty of Medicine, TU Dresden

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר גישת אבלציה בלייזר של שני פוטונים המתבצעת בזחלי דגי זברה, המשמשת מודל לחקר התחדשות העצם והשפעות התגובה החיסונית לאבלציה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לדגי זברה (Danio rerio) יש יכולת יוצאת דופן לחדש איברים ונספחים שונים. התחדשות עצם בדגי זברה נחקרה בשיטות שונות כגון קטיעת סנפירים, מריטת אבנית, טרפנציה של גולגולת וגישות מיקרוסקופיות. באמצעות מערך סריקת לייזר קונפוקלי המצויד בלייזר דו-פוטון, פותחה שיטת אבלציה בלייזר כפרדיגמת נגע לעיבוד תאים יוצרי עצם (אוסטאובלסטים) באופרקל המתפתח של זחלי דגי זברה. השיטה המתוארת כאן מאפשרת אבלציה של תאים בצורה מדויקת, שכן ניתן לכוונן את השטח, הצורה והעומק בצורה עדינה. בנוסף, שיטה זו מאפשרת הדמיה של האזור לפני ומיד אחרי האבלציה, כך שניתן לנתח השפעות קצרות טווח של הפציעה. במערך ניסויי זה, נחקרה התגובה החיסונית לאחר אבלציה של אוסטאובלסטים באזור הפגוע. עלייה בגיוס מקרופאגים נצפתה לאחר אבלציה, מה שמצביע על הרלוונטיות של נוכחותם במהלך התחדשות העצם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגי זברה מחדשים איברים מגוונים כגון הרשתית, המוח, הלב והלבלב1. בנוסף, דגי זברה מחדשים אלמנטים שלדיים, ולכן הם שימשו לחקר התחדשות סנפירים, קשקשים וקלוואריה (כובעי גולגולת)2. פרדיגמות ניסיוניות שונות שימשו לחקר התחדשות רקמות ועצמות, כגון כריתת סנפיר (קטיעה), שבר סנפיר, טרפנציהגולגולת 3,4, קריופציעת קריו-פציעה 5,6 או אבלציה גנטית 7,8,9. לאחרונה, גישות אבלציה בלייזר נמצאות בשימוש נרחב בדגי זברה כדי לחקור את תגובת הריפוי וההתחדשות לאחר פציעה 10,11,12,13,14.

אבלציה בתיווך לייזר שימשה בתחומים שונים של מחקר ביולוגי, כגון מכנוביולוגיה, ביולוגיה התפתחותית, מחקר התחדשות וניתוחי גידולים 10,11,12,15,16,17,18,19. ישנן מתודולוגיות שונות של אבלציה בלייזר, כגון שימוש בלייזרים YAG (איטריום אלומיניום גארנט), UV (אולטרה סגול), או 2p (שני פוטונים)לייזרים 20. אבלציה בלייזר מאפשרת הסרה של תאים בודדים או חלקים גדולים יותר של רקמות בצורה מדויקת מאוד, ומאפשרת לחקור תהליכים שונים, כגון תגובת מערכת החיסון לאבלציהסרטנית 21 או במהלך התחדשות אופרקל של דגי זברה. בדוגמה האחרונה, אבלציה אושרה על ידי היעלמות אות פלואורופור גרעיני וציטופלזמי ומכתים נמק10,22.

ידוע היטב כי התגובה החיסונית המולדת והקינטיקה המווסתת שלה חיוניות להתחדשות רקמות מתאימה. נויטרופילים ומקרופאגים הם התאים הראשונים שגויסו לאתר הפגיעה, שם הם מבצעים תפקידים שונים, כגון שחרור ציטוקינים וגורמי גדילה, הסרת פסולת תאית ועיצוב מחדש של מטריצה חוץ-תאית23. גיוס זה ותפקוד המקרופאגים שבא בעקבותיו נצפו גם בסנפירי זברה קטועים24 ובאופרקל המתפתח, שהיה נתון ל"ננודיסקציה" בלייזר שהובילה לאבלציה10 של אוסטאובלסט. בניסוי האחרון נצפתה התאוששות של מספר האוסטאובלסט, התפתחות אופרקל תקינה וגיוס תאי מערכת החיסון המולדת (נויטרופילים, מקרופאגים ותאים דמויי אוסטאוקלסט) לאזור הפגוע לאחר לייזר UV ואבלציה בתיווך לייזר דו-פוטון10. ניסויים בדגי זברה שבהם מערכת החיסון דוכאה פרמקולוגית על ידי שימוש בגלוקוקורטיקואידים הראו פגיעה בהתחדשות על חסינות לא מווסתת, מה שתומך בתפקיד התפקודי של מערכת החיסון בתיקון רקמות 3,10,25,26.

כאן מתוארת מתודולוגיית אבלציה בתיווך לייזר של שני פוטונים לחקר הביולוגיה של התחדשות עצם בפיתוח עצמות דגי זברה. בפרט, ההשפעה של גישת אבלציה אוסטאובלסט באופרקל מוצגת במונחים של התגובה החיסונית, אשר נחקרת על ידי ניטור גיוס מקרופאגים לאתר אבלציה.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול המחקר קיבל אישור מ- Landesdirektion Sachsen, מספרי היתר 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. זני דגי הזברה שבהם נעשה שימוש נשמרו על פי החוק הלאומי ובתנאים סטנדרטיים כפי שתואר קודם לכן27,28. הפרטים של כל הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת חומרים ופתרונות

  1. שמור על העוברים במדיה E3 1x. הכן את המדיה 1x E3 על ידי דילול 170 מ"ל של ציר 60x E3 ב 10 L של מים deionized והוספת 2 מ"ל 0.1% methylene כחול.
    1. הכן את מלאי המדיה 60x E3 על ידי ערבוב 17.2 גרם של NaCl, 0.76 גרם של KCl, 2.90 גרם של CaCl2·2 H2O, 4.90 גרם של MgSO4·7 H2O ב 1 L של מים autoclaved deionized.
  2. להטמעת הזחלים הכינו מראש אליציטוטים של אגרוז 1% נקודת התכה נמוכה (LMA) ושמרו אותם בטמפרטורת החדר.
    1. כדי להכין aliquots, להמיס LMA במדיה 1x E3, למשל, 500 מ"ג של LMA ב 50 מ"ל של 1x E3 בבקבוק Erlenmeyer, לחמם את התמיסה במיקרוגל עד agarose מתמוסס לחלוטין, ולחלק אותו לתוך 1 מ"ל aliquots בצינורות 1.5 מ"ל.

2. גידול דגי זברה ואיסוף עוברים

הערה: זחלי זברה טרנסגניים כפולים המדווחים על נוכחות אוסטאובלסטים מחויבים [osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 ומקרופאגים [mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23] שימשו כאן30 (איור 1A).

  1. הציבו דגי זברה הוריים עם הטרנסגנים היחידים הרצויים בכלובי הזדווגות סטנדרטיים בערב שלפני ההזדווגות.
    הערה: כלובי הזדווגות סטנדרטיים מאפשרים לביצים לעבור לתא תחתון שבו דגי הזברה ההורים אינם יכולים להגיע אליהן.
    1. יש להפריד בין זכרים לנקבות עד להזדווגות באמצעות מחיצה בכלוב ההזדווגות. הסר את המחיצה בבוקר של היום הבא כדי להתחיל הזדווגות.
  2. בצהריים, לכל המאוחר, מוציאים את דגי הזברה ההוריים ממכלי הרבייה ואוספים את העוברים, תוך שהם מסננים את המים מכלוב ההזדווגות דרך מסננת.
    הערה: במקרה שהגיל המדויק של הזחלים הוא הקובע, קצרו עוברים במרווחי זמן קבועים של כ-30 דקות. יש להשתמש בבני זוג למצמד בניסויים עם קבוצות ניסוי שונות.
  3. הניחו את העוברים בכלי בקוטר 100 מ"מ המכיל מדיה E3 1x ושמרו אותם באינקובטור בטמפרטורה של28°C 31.
  4. הסר ביצים לא מופרות ועוברים מתים מהצלחת באמצעות פיפטה פלסטיק בעזרת סטריאומיקרוסקופ ושנה מדיה E3 1x מדי יום.
  5. לפני הניסוי, מיין זחלים חיוביים עבור טרנסגנים הכתב באמצעות סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי.

3. הטמעת זחלים באגרוז נמס נמוך

  1. להמיס LMA aliquots ב thermoblock או אמבט מים ב 65 ° C. ברגע שה-LMA נמס, שמרו אותו בטמפרטורה של 42°C עד להטמעה (איור 1B). הוסף 50 μL של 0.4% MS-222 ל- 1 מ"ל המומס של LMA aliquot כדי להשיג ריכוז MS-222 של 0.02% להרדמה.
  2. הרדימו 4 dpf (ימים לאחר ההפריה) זחלים (או זחלים מבוגרים יותר) במדיה 0.02% MS-222 E3.
  3. העבירו את הזחלים המורדמים לצלחת מיקרווול עם תחתית זכוכית באמצעות פיפטת פסטר מפלסטיק בנפח 3 מ"ל והוציאו את עודפי המדיה E3 עם אותה פיפטה (איור 1B). הימנעו מהתייבשות הזחלים.
    הערה: ניתן להטמיע יותר מזחל אחד בצלחת בו זמנית; מומלץ להטמיע 3 עד 5 זחלים כדי לאפשר מספיק זמן למיקום.
  4. קחו את אגרוז ה-LMA המומס מאמבט המים / תרמובלוק והוסיפו טיפה (מקררת) של LMA לצלחת, תוך כיסוי תחתית הזכוכית שבה מוקמו הזחלים. שימו לב שה-LMA לא חם מדי אבל עדיין נוזלי.
  5. לאחר מכן, מניחים את הזחלים במצב הרוחבי הרצוי לפני שהאגרוז מתמצק. כאן, ודאו תנוחה צידית שבה האופרקל קרוב ככל האפשר לתחתית הזכוכית של הצלחת כהכנה למערך המיקרוסקופ ההופכי (איור 1B).
  6. הניחו לאגרוז להתמצק ולאחר מכן הוסיפו מדיה E3 (המכילה מקסימום 0.02% MS-222) לצלחת כדי למנוע התייבשות של האגרוז (איור 1B).

figure-protocol-1
איור 1: ייצוג סכמטי של הליך ההטבעה. (A) Tg מהונדס כפול (osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30 זחלי דגי זברה עם אוסטאובלסטים אופרקולריים מסומנים בירוק ומקרופאגים המסומנים באדום. (ב) זרימת העבודה של הליך ההטבעה, כמתואר בשלב 3 של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. הדמיה In vivo של הזחלים ואבלציה בלייזר

  1. לאוסטאובלסטים בלייזר באופרקל המתפתח של דגי זברה טרנסגניים Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30, השתמש במיקרוסקופ הפוך לסריקת לייזר עם שני פוטונים עם מטרת מים 25x/0.95 או מערך שווה ערך.
  2. מניחים את המנה עם הזחלים המשובצים על הבמה המיקרוסקופית במיקרוסקופ ההפוך וממקמים את האזור הרצוי לאבלציה במרכז שדה הראייה. ניתן לזהות בקלות את האופרקל בעזרת האות הפלואורסצנטי GFP.
  3. לאחר שהאופרקל ממוקד וממורכז בשדה הראייה של המיקרוסקופ, בחר את הגדרות מחסנית z (לעתים קרובות נעשה שימוש במרווחי z של 1-2 מיקרומטר) כדי לצלם את כל רוחב האופרקל. יחד עם זאת, בחר את האזור במישור z ספציפי להיות ablated (בדרך כלל באזור האחורי של האופרקל). אבלציה של לייזר דו-פוטוני מופעלת רק במישור זה.
    הערה: רזולוציה גבוהה יותר בממד z תוביל לזמני הדמיה ארוכים יותר, אך תאפשר ניתוח נפחי של הנתונים שנרכשו מאוחר יותר.
  4. דמיינו את אזור העניין של האופרקל לפני אבלציה. עבור זיהוי GFP, השתמש בלייזר אור לבן ב- 488 ננומטר וגלאי היברידי הנע בין 495 ננומטר ל- 550 ננומטר או שווה ערך. דמיינו את המקרופאגים באמצעות עירור של 555 ננומטר (לייזר אור לבן), עם טווח זיהוי mCherry של 595 עד 780 ננומטר על גלאי היברידי (או שווה ערך).
    1. השתמש בפורמט התמונה 512 x 512 לקבלת יחס איכות / זמן טוב (ניתן להשתמש בפורמטים אחרים אם רוצים רזולוציה גבוהה יותר או לחילופין מהירות גבוהה יותר).
      הערה: ניתן להשתמש באינקובטור מבוקר טמפרטורה המותקן במיקרוסקופ ולכוונן, למשל, ל -28 מעלות צלזיוס.
  5. צייר אזור מעגלי בקוטר של 25 מיקרומטר (ניתן לבחור צורות וגדלים אחרים בהתאם לניסוי) במישור דו-ממדי נבחר, תוך מיקוד האופרקל באמצעות הכלי החזר השקעה.
  6. כדי לבצע את האבלציה, יש להפעיל עוצמת אבלציה (נמדדת ללא מטרה) ב-450 mW ולחשוף את האזור שנבחר ללייזר דו-פוטוני במהירות סריקה של 400 הרץ ומשך כולל של 10 שניות. במהלך אבלציה, ניתן לדמיין את האזור באמצעות גלאי היברידי בטווח של 401-443 ננומטר או שווה ערך.
  7. לאחר אבלציה, אשר את האבלציה מבחינה מבנית על ידי הדמיה שוב של אותה מחסנית z עם אותן הגדרות שבהן נעשה שימוש לפני האבלציה. האזור האבלאט אינו מכיל יותר תאים פלואורסצנטיים.

5. התאוששות הזחלים והדמיה למעקב אחר גיוס תאי מערכת החיסון

  1. אם יש צורך לבצע את ההדמיה של גיוס תאי מערכת החיסון באיחור, יש לשחזר את הזחלים מההדמיה ומההרדמה. הסר את הזחלים בזהירות מה- LMA באמצעות מלקחיים או מחט דיסקציה.
    1. ראשית, להסיר שכבה של agarose המכסה את הזחלים. שנית, הסר את האגרוז במגע ישיר עם הזחלים. השמיט שלב זה אם מתרחש הדמיה מיידית של גיוס תאי מערכת החיסון.
  2. החזירו את הזחלים לצלחת עם מצע E3 טהור ובדקו את התאוששותם. ההתאוששות ניכרת על ידי שחייה של הזחלים.
  3. ב 4 או 6 hpl (שעות לאחר הנגע), צלם שוב את אזור האופרקל באמצעות אותן הגדרות באותו מיקרוסקופ כדי לבדוק את ההשפעות של אבלציה על גיוס מקרופאגים. לשם כך, חזור על ההטבעה (שלב 3) וההדמיה כפי שבוצעו קודם לכן (שלב 4).
  4. לאחר ההדמיה, הסר את הזחלים מה- LMA. הקרבת הזחלים יכולה להתבצע על ידי דגירה במי קרח או עם מנת יתר של MS-222 ב- E3, בהתאם לדרישות החוק. לאחר מכן ניתן להשתמש בדגימות למחקרי מעקב או להיפטר מהן.

6. ניתוח תמונות וניתוח סטטיסטי

  1. עבד את התמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה כגון פיג'י32. בהתאם לרזולוציית z של הנתונים שנרכשו, ניתן לבצע ניתוחים בדו-ממד או בתלת-ממד.
  2. כמת את המקרופאגים באופן ידני על ידי הכללת תאים נפרדים בבירור, כגון על ידי הבחנה בגופי התא הראשיים, או לחילופין כימות תאים עם תווית גרעינית או על ידי מדידת השטח במקרה שהתאים חופפים (השלב הבא).
  3. לכימות האזור, צרו מסיכה המקיפה את המקרופאגים. לשם כך, השתמש בכלי Image > Adjust > Threshold וצור החזר השקעה (Analyze > Tools > ROI Manager > Add) בפיג'י. אין לכלול חלקיקים קטנים ברקע לצורך כימות.
    1. לאחר מכן, מדדו את השטח (Analyze > Measure). שקול אם אזורים של פלואורסצנטיות תאית חופפת צריכים להיכלל במדידה.
      הערה: כאן, אזור האבלציה המעגלי הושמט ממדידות השטח מכיוון שלא ניתן להבחין בין מקרופאגים מגויסים באזור זה.
  4. צור גרפים המשרטטים את תוצאות המדידה באמצעות תוכנה מתאימה. כדי להשוות את הנתונים לפני ואחרי אבלציה, בצע בדיקה סטטיסטית מתאימה (כאן, בוצע מבחן t חד זנבי זוגי).
    הערה: ניתן להכין את האיורים באמצעות תוכנות לעריכת תמונות ועיצוב גרפי.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אבלציה בלייזר בוצעה כמצוין בפרוטוקול לעיל. אות ה-GFP של האוסטאובלסטים באזור האבלטים נעלם מיד לאחר אבלציה. כדי לחקור את התגובה של אבלציה אוסטאובלסט במונחים של התגובה החיסונית, נוכחות של מקרופאגים ב 6 זחלי dpf לפני וב 6 hpl היה תמונה. לפני אבלציה, מעט מאוד מקרופאגים נצפו באזור האופרקל10 (איור 2). ב-6 hpl זוהתה הצטברות חזקה של מקרופאגים באזור האופרקל האבלאטד ומספר מוגבר של מקרופאגים בשדה הראייה, כולל האופרקל והאזור שמסביב לאופרקל,10 (איור 2).

figure-results-1
איור 2: גיוס מקרופאגים ב-6 HPL ב-6 זחלי דגי זברה DPF. אזור אופרקל ללא אבלציה וב 6 hpl. אוסטאובלסטים אופרקולריים מסומנים בירוק, מקרופאגים במגנטה, והעיגול המקווקו מציין את האזור המשופע בלייזר. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

גיוס מקרופאגים נותח גם ב-4 זחלי dpf עם אופרקלים קטנים בהרבה ב-4 HPL שצפו בתוצאות דומות (איור 3). כימות מספר המקרופאגים (מחוץ לאתר האבלציה המיידי בלייזר) הראה עלייה במסגרת הזמן הנחקרת (4.00 ±-2.37 מקרופאגים לפני אבלציה לעומת 7.00 ±-2.76 מקרופאגים ב-4 hpl) (איור 3B). באופן דומה, שטח המקרופאגים (שנמדד במיקרומטר2, 785.8 מיקרומטר2 ± 723.1 מיקרומטר2 לפני אבלציה לעומת 1553 מיקרומטר2 ± 869.9 מיקרומטר2 ב-4 hpl) גדל (איור 3C). מכיוון שלפעמים קשה להבדיל בין מקרופאגים, מומלץ למדוד את אזור המקרופאגים במקום את מספר המקרופאגים, כפי שנעשה כאן.

figure-results-2
איור 3: גיוס מקרופאגים ב-4 HPL ב-4 זחלי דגי זברה DPF. (A) אזור אופרקל ללא אבלציה וב-4 hpl. אוסטאובלסטים אופרקולריים מסומנים בירוק, מקרופאגים במגנטה, והעיגול המקווקו מציין את האזור המשופע בלייזר. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (B) כימות מספר המקרופאגים באזור האופרקל ישירות לפני (0 hpl) ואחרי אבלציה (4 hpl). (C) כימות אזור המקרופאגים (לא כולל אתר אבלציה בלייזר). זוג מבחני t חד-זנביים. כל נקודה מייצגת את הנתונים של זחל אחד, והממוצע ± SD מוצג, n = 6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אבלציה בלייזר יושמה בתחומים שונים של מחקר ביולוגי. בפרט, זה היה שימושי כשיטה לחקור התחדשות רקמות 10,11,12. לדוגמה, שינויי הגיוס והפנוטיפ של תאי מערכת החיסון המולדת נותחו לאחרונה לאורך זמן באמצעות מבחני אבלציה בלייזר UV או בלייזר דו-פוטון, יחד עם התאוששות אוסטאובלסטים באתר אבלציה בלייזר10. הדמיה חיה של גיוס תאי מערכת החיסון בוצעה עד 12 שעות לאחר הנגע (hpl); עם זאת, ניתן לתכנן תקופות הדמיה ארוכות יותר עם התאמות מתאימות בהרדמה ואישור מהרשויות המתאימות. ב- Geurtzen et al., הניתוחים בוצעו עד מספר ימים לאחר אבלציה בלייזר ועזרו להגדיר את הסביבה הדלקתית באתר האבלציה, כמו גם לבסס את התפקיד התומך של מקרופאגים בהתחדשות עצם10. יישומים רבים אחרים, כגון חקר התפקיד של מיני חמצן תגובתי לשחרר33 עם מוות התא ברקמת העצם, הם מתקבל על הדעת.

אחד היתרונות בשימוש באבלציה של תאים בתיווך לייזר של שני פוטונים הוא האפשרות לשלב אותו עם הדמיה קונפוקלית. ניתן להגדיר את התוכנה המשמשת כאן (ראה טבלת חומרים) למצב (מצב נתונים חיים) שבו הדמיה ואבלציה מתרחשות ברצף, ומאיצות את התהליך. יתרון נוסף של הטכנולוגיה הוא דיוק האבלציה. ניתן להתאים בקלות את גודל וצורת האבלציה בתוכנה בצורה מדויקת מאוד. במסגרת הניסוי שהוצגה כאן, נבחר שטח מעגלי בקוטר של 25 מיקרומטר לאבלציה. עם זאת, ניסויי אבלציה אחרים בדרוזופילה השתמשו באבלציות ליניאריות של 25 מיקרומטר על מנת להפחית את מתח הרקמה באפיתל העוברי על ידי חיתוך צמתים תאיים של שכן-שכן34. דיוק זה מאפשר אבלציה של מספר מסוים ומבוקר של תאים, תאים בודדים או אפילו קרומי תאים.

יש לציין כי סוג הנגע המבוצע בלייזר בעל שני פוטונים אינו דומה לפציעות ומוות תאי המתרחשים באופן טבעי, דבר שיש לזכור במחקר רגנרציה אך גם בדיסציפלינות אחרות. בפרט, אבלציות לייזר יוצרות נגעים ממוקדים מאוד על ידי הרס מוחלט (צריבה) של התאים באזור עניין20 עם נזק מינימלי ברקמות הסובבות, בעוד סוגים מכניים או אחרים של פציעות נוטים להשפיע על מספר סוגי רקמות ושכבות בקנה מידה רחב יותר. זה יכול להוביל לתוצאות רבות הכרוכות בסוגים שונים של מוות תאי (למשל, נמק, אפופטוזיס, אוטופגיה)35 ותוצאות רגנרטיביות שונות. יתר על כן, תגובות לאבלציה בלייזר עשויות להיות שונות במונחים תאיים ומולקולריים. לדוגמה, הוכח כי למרות שתאים המקיפים את אתר נגע הלייזר עלולים לאבד את שלמות קרום הפלזמה, הם יכולים לשרוד את הנזק ולהחזיר את שלמות36. אבלציה בלייזר מובילה גם לאזורים של המטריצה החוץ תאית הפגועה, שעלולה לנבוע מ"פיצוצים תרמיים" במרכז קרן הלייזר המופעלת וגם מחשיפה חזקה לחום בתאים השכנים ישירות10,37. עם זאת, תאים המקיפים אתרי אבלציה בלייזר מראים מספר מוגבר של גופים אפופטוטיים, כפי שמוצג עבור רקמת לב בלייזר38, ותגובה חיסונית מופעלת, כפי שמוצג כאן. בנוסף להבדלים המתוארים, מגבלה נוספת של בדיקות אבלציה בסיוע לייזר עשויה להיות העומק שבו ניתן לבצע את הפציעה והגודל המוגבל של הדגימות. מבנים החבויים בדגימות עבות עשויים שלא להיות מובטלים כראוי, וההדמיה תהיה קשה. זה, עם זאת, יהיה תלוי מאוד במיקרוסקופ ובלייזר המשמשים, כמו גם במטרה ובהטבעה.

הטבעה של הזחלים באופן כזה שהאופרקל ממוקם בסמיכות לתחתית הזכוכית של המנה היא חיונית במקרה שנעשה שימוש במערך הפוך, כמו בפרוטוקול המוצג. יתר על כן, חשוב מאוד לבדוק את הטמפרטורה של LMA לפני החלתו כדי לכסות את הזחלים (שלב 3.4) שכן אגרוז חם יפגע בזחלים. כדי להימנע מכך, קח את aliquot LMA מן thermoblock מוקדם, למשל, תוך הסרת שאריות מדיה E3 מן צלחת תחתית זכוכית, ולבדוק את הטמפרטורה, כגון על העור של פרק כף היד. ה- LMA אמור להיות חם אך לא חם.

ברגע שהזחלים מכוסים ב-LMA, חשוב לשים אותם במהירות במיקום הנכון לפני שה-LMA מתחיל להתמצק. המיקום הרוחבי הוא הקל ביותר להשגה; במחקר המוצג, המיקום הרצוי היה לרוחב עם הטיה קלה לצד הגחון. במקרה שה-LMA מתמצק לפני שהזחלים ממוקמים נכון, ניתן להסיר את ה-LMA (כמו בשלב 5.1) ולחזור על ההטבעה. כמו כן, חשוב שהאזור שיש לצלם (ולייזר אבלאט) יהיה קרוב ככל האפשר לתחתית הזכוכית של הצלחת לאיכות תמונה מקסימלית ואבלציה של התא, אם כי זה יהיה תלוי גם במרחק העבודה של המטרה.

ניתן להטמיע יותר מזחל אחד באותה צלחת לצורך הדמיה. זה יחסוך זמן ויעשה שימוש טוב יותר ב- LMA. מספר הזחלים שניתן להטמיע יהיה תלוי בניסיון של הנסיין, אבל מומלץ 3-5 זחלים.

אבלציה בלייזר יכולה להתבצע גם עם תצורות מיקרוסקופיות זקופות המשתמשות בעדשות טבילה. במקרה זה, חשוב להטמיע את הזחלים עם מבט מעט גחוני (מלמעלה) כדי לאפשר איכות הדמיה טובה והצלחת אבלציה בלייזר של האופרקל. בנוסף, רק שכבה דקה של LMA צריכה לכסות את הזחלים כדי לאפשר עירור טוב וזיהוי של אותות פלואורסצנטיים.

בפרוטוקול זה, מערך אבלציה בתיווך לייזר של שני פוטונים עבור אוסטאובלסטים מתואר כמתודולוגיה לביצוע נגעים בעצמות מתפתחות, במיוחד באופרקל. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לתאי אבלאט בעצמות אחרות של דגי זברה מתפתחים. יתר על כן, זוהי בדרך כלל גישה שימושית לחקר התחדשות של רקמות פגועות 11,12. הקלות של ביצוע אבלציות וחתכי רקמות בגדלים וצורות שונות מאפשרת את השימוש בו במערכי ניסוי שונים ובתחומי מחקרשונים 15,17,18,19,21,34. בסך הכל, אבלציה בתיווך לייזר של שני פוטונים היא שיטה מאוד ניתנת להתאמה - לרקמות שונות, אורגניזמים ואפילו בסביבות מבחנה שונות - והיא מהווה כלי חשוב במחקר הביולוגי.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG) Transregio 67 (פרויקט 387653785), DFG SPP 2084 μBone (פרויקט KN 1102/2-1) ל- FK. עבודה זו נתמכה על ידי מתקן מיקרוסקופיה קלה (פרויקט DFG 413875620), מתקן ליבה של פלטפורמת הטכנולוגיה CMCB ב- TU דרזדן. העבודה ב- TU Dresden מומנה במשותף עם הכנסות ממסים בהתבסס על התקציב שהוסכם על ידי הפרלמנט הסקסוני ('Landtag').

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
סידן כלוריד דיהידרט, CaCl2· H2Oקארל רוט5239.1
צלחת תרבית תאים, PS, 100/20 מ"מגריינר ביו-וואן664160
דומונט #55 FocepsFST11295-51צורת קצה ישרה, 11 ס"מ, 0.05 x 0.02 מ"מ
פלקון צלחת 6 בארותקורנינג353502
צלחת מיקרובאר תחתונה זכוכיתMattekP35G-1.5-14-Cצלחת 35 מ"מ, כיסוי מס' 1.5, קוטר זכוכית 14 מ"מ,
לייזר מולטיפוטון Insight X3ספקטרה-פיזיקה
Leica ApplicationSuite LAS X, Leica Microsystems
אגרוז נמס נמוך Biozyme840101רובד Biozym, אגרוז
מגנזיום גופרתי, הפטאהידרט, MgSO4· 7H2OSigma-AldrichM5921
הזדווגותזנים רבים, למשל Tecniplast
MethyleneblueCarl RothA514.1
MS-222SIGMA AldrichA5040
אשלגן כלורי, KClPanReac AppliChem131494
נתרן כלורי, NaClCarl Roth3957.1
SP8 פלקון Leica Microsystemsמצויד בלייזר מולטיפוטון Insight X3 ותוכנת Leica Application Suite
מחט ניתוח נירוסטהBochem12010140 מ"מ
SZX16אולימפוסמצויד בבסיס תאורת LED SZX2-ILLTQ
ארונות תרמוסטטיים TS - WTWxylemTS 608/2-iלדגירה (עובר)
העברה פיפטה, 3.5 מ"לSARSTEDT861171155 x 15 מ"מ, LD-PE, שקוף
Zeiss SteREO Discovery.V12 גרסה 4.7.1.0.Zeissמצויד במצלמת Axiocam MRm ובתוכנת AxioVision
לא מצופה , כלובי מערכת מיקרוסקופ סטריאו

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. Model systems for regeneration: Zebrafish. Dev. 146 (18), dev167692(2019).
  2. Dietrich, K., Fiedler, I. A. K., Kurzyukova, A. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. J Bone Miner Res. 36 (3), 436-458 (2021).
  3. Geurtzen, K., Knopf, F. Adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue. J Vis Exp. (140), e58429(2018).
  4. Sousa, S., Valerio, F., Jacinto, A. A new zebrafish bone crush injury model. Biol Open. 1 (9), 915-921 (2012).
  5. González-Rosa, J. M., Mercader, N. Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish. Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).
  6. Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage. Biol Open. 5 (6), 819-828 (2016).
  7. Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts. Dev Cell. 22 (4), 879-886 (2012).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. Ando, K., Shibata, E., Hans, S., Brand, M., Kawakami, A. Osteoblast production by reserved progenitor cells in zebrafish bone regeneration and maintenance. Dev Cell. 43 (5), 643-650.e3 (2017).
  10. Geurtzen, K., López-Delgado, A. C., Duseja, A., Kurzyukova, A., Knopf, F. Laser-mediated osteoblast ablation triggers a pro-osteogenic inflammatory response regulated by reactive oxygen species and glucocorticoid signaling in zebrafish. Dev. 149 (8), 1998030(2022).
  11. Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells. J Vis Exp. (159), e60966(2020).
  12. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. (54), e2845(2011).
  13. Goldstein, A. M., Fishman, M. C. Notochord regulates cardiac lineage in zebrafish embryos. Dev Biol. 201 (2), 247-252 (1998).
  14. Zhang, J., Jeradi, S., Strähle, U., Akimenko, M. A. Laser ablation of the sonic hedgehog-a-expressing cells during fin regeneration affects ray branching morphogenesis. Dev Biol. 365 (2), 424-433 (2012).
  15. Marshall, A. R., et al. Two-photon cell and tissue level laser ablation methods to study morphogenetic biomechanics. Methods Mol Biol. 2438, 217-230 (2022).
  16. Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
  17. Lee, J., Lee, S., Truong, V. G., et al. Laser ablation of pancreatic cancer using a cylindrical light diffuser. Lasers Med Sci. 37 (6), 2615-2621 (2022).
  18. Luther, E., Mansour, S., Echeverry, N., et al. Laser ablation for cerebral metastases. Neurosurg Clin N Am. 31 (4), 537-547 (2020).
  19. Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo. Methods Mol Biol. 1189, 219-235 (2015).
  20. Vogel, A., Venugopalan, V. Mechanisms of pulsed laser ablation of biological tissues. Chem Rev. 103 (2), 577-644 (2003).
  21. Wu, F. Heat-based tumor ablation: Role of the immune response. Adv Exp Med Biol. 880, 131-153 (2016).
  22. Renvoizé, C., Biola, A., Pallardy, M., Bréard, J. Apoptosis: Identification of dying cells. Cell Biol Toxicol. 14 (2), 111-120 (1998).
  23. Julier, Z., Park, A. J., Briquez, P. S., Martino, M. M. Promoting tissue regeneration by modulating the immune system. Acta Biomater. 53, 13-28 (2017).
  24. Petrie, T. A., Strand, N. S., Tsung-Yang, C., Rabinowitz, J. S., Moon, R. T. Macrophages modulate adult zebrafish tail fin regeneration. Dev. 141 (13), 2581-2591 (2014).
  25. Geurtzen, K., Vernet, A., Freidin, A. Immune suppressive and bone inhibitory effects of prednisolone in growing and regenerating zebrafish tissues. J Bone Miner Res. 32 (12), 2476-2488 (2017).
  26. Fleischhauer, L., López-Delgado, A. C., Geurtzen, K., Knopf, F. Glucocorticoid effects in the regenerating fin reflect tissue homeostasis disturbances in zebrafish by affecting Wnt signaling. Front Endocrinol. (Lausanne). 14, 1122351(2023).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. https://books.google.de/books?id=Iy8PngEACAAJ (2002).
  28. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  29. Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Dev. 135 (22), 3765-3774 (2008).
  30. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  31. JoVE Science Education Database. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
  32. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  34. Blanchard, G. B., Scarpa, E., Muresan, L., Sanson, B. Mechanical stress combines with planar polarised patterning during metaphase to orient embryonic epithelial cell divisions. Dev. 151 (10), dev202862(2024).
  35. Park, W., Wei, S., Kim, B. -S., et al. Diversity and complexity of cell death: A historical review. Exp Mol Med. 55 (8), 1573-1594 (2023).
  36. O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds. PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).
  37. Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues. APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).
  38. Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two Photon AblationOsteoblast AblationZebrafish LarvaeBone RegenerationConfocal MicroscopyMacrophage RecruitmentImmune ResponseOpercle ImagingLow Melting AgaroseTransgenic Zebrafish

Related Articles