מאמר שיטה

מדידה של ארבעה תת-סוגים של תאי NK ברחם באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית פלואורסצנטית מרובת משתתפים בנשים עם כישלון השתלה חוזר

DOI:

10.3791/67284

⸱

25 באוקטובר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynaecology, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 2Department of Pathology, School of Clinical Medicine, The University of Hong Kong, Queen Mary Hospital, 3Reproduction and Development Laboratory, Li Ka Shing Institute of Health Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 4School of Biomedical Sciences, Prince of Wales Hospital, The Chinese University of Hong Kong, 5Chinese University of Hong Kong - Sichuan University Joint Laboratory in Reproductive Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 6Laboratory for Reproductive Immunology, Hospital of Obstetrics and Gynecology, Fudan University, 7NHC Key Lab of Reproduction Regulation, Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, Fudan University, 8Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases, Hospital of Obstetrics and Gynecology, Fudan University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג שיטה חלוצית לכימות תת-קבוצות תאי הרג טבעיים ברחם במהלך חלון ההשתלה באמצעות טכניקות מתקדמות של צביעה אימונוהיסטוכימית פלואורסצנטית מרובה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אימונוהיסטוכימיה (IHC) ממלאת תפקיד מכריע במחקר ביולוגי ובאבחון קליני, ומשמשת כשיטה הנפוצה ביותר לזיהוי והדמיה של אנטיגנים ברקמות. עם זאת, לשיטות צביעה מסורתיות של IHC יש מגבלות בהבחנה בין תת-סוגים שונים של תאי חיסון. אתגר זה הניע מדענים לחקור טכנולוגיות ומתודולוגיות חדשות לזיהוי והתמיינות מדויקים של תת-סוגים של תאי מערכת החיסון. בשנים האחרונות, מולטיפלקס IHC התגלה כפתרון, המאפשר זיהוי בו זמנית של אנטיגנים מרובים והדמיה שלהם בתוך אותה דגימת רקמה. תאי הרג טבעי ברחם (uNK) ממלאים תפקיד מרכזי בתהליכי הריון מוקדמים, כולל דצידואליזציה, עיצוב מחדש של עורקים ספירליים ברחם והשתלת עוברים. תת-סוגים שונים של תאי uNK מציגים תפקידים שונים, המאפשרים להם לתאם אירועים ביולוגיים שונים להתפתחות מוצלחת של עוברים והריון. לכן, מחקר מעמיק על תת-סוגים של תאי uNK חיוני להבהרת מנגנוני ויסות החיסון במהלך ההריון. מחקרים כאלה מספקים תובנות יקרות ערך וגישות חדשניות לטיפול במצבים קשורים כגון פוריות וכישלון רבייה חוזר. מאמר זה מציג פרוטוקול צביעה IHC מפורט לחקר הצפיפות של ארבעה תת-סוגים של תאי uNK בדגימות רירית הרחם במהלך חלון ההשתלה (WOI). הפרוטוקול כולל הכנת דגימות, אופטימיזציה של סמני תת-סוג, הדמיה מיקרוסקופית וניתוח נתונים. פרוטוקול צביעת IHC מרובה משתתפים זה מציע ספציפיות ורגישות גבוהות, ומאפשר זיהוי סימולטני של תת-סוגים שונים של תאי uNK, ובכך מספק לחוקרים כלי רב עוצמה לחקור את המורכבויות והמנגנונים של ויסות חיסוני במהלך ההריון.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לידת החי המתועדת הראשונה לאחר הפריה חוץ גופית והחזרת עוברים (IVF-ET) דווחה בשנת 1978. במהלך 40 השנים האחרונות, יש ביקוש גבוה לסיוע של IVF-ET בקרב זוגות עקרים1. בשנת 2021, 238,126 מטופלים יזמו בסך הכל 413,776 מחזורי הפריה חוץ גופית בארצות הברית. מדובר בעלייה של 25% במחזורים משנתיים קודמות ועלייה של 135% משנת 20122. זינוק זה מיוחס בעיקר לעלייה בשכיחות של אי פוריות ועיכוב בתכנון ההריון. התקדמות בטכניקות תרבית עוברים ופרוטוקולי סופרביוץ הובילו לשיעור לידות חי מוגבר בכל מחזור חוצן, שהגיע ל -30%-50% בנשים מתחת לגיל 40 ופחות מ -30% בנשים מעל גיל 402. עם זאת, למרות התקדמות זו, יותר ממחצית העוברים המועברים עדיין אינם מצליחים להשתרש. כישלון השתלה חוזר (RIF), המוגדר בדרך כלל ככישלון לאחר שלושה ניסיונות רצופים או יותר של החזרת עוברים באיכות גבוהה, משפיע על 15% מהנשים שעוברות הפריה חוץ גופית3. זוגות עם RIF פגיעים מאוד ונוטים יותר לעבור הליכים יקרים ומיותרים שעלולים לחשוף אותם לסיכונים מיותרים4. לכן, הבנת הגורמים ל-RIF ושיפור השתלת העוברים היא חיונית לשיפור ההצלחה של הפריה חוץ גופית, במיוחד עבור נשים עם RIF. הכנת רירית הרחם היא קריטית להשתלת עובר מוצלחת. תהליך זה מאופיין בהצטברות משמעותית של תאי הרג טבעי ברחם (uNK), העוברים מהיותם 30% מסך הלימפוציטים ברירית הרחם בשלב ההפרשה האמצעית ל-70%-80% בשלב ההרעה בתחילת ההריון5. יש לציין כי תאי uNK שונים מתאי NK היקפיים, שהם לימפוציטים ציטוטוקסיים החיוניים למערכת החיסון המולדת לגרימת מוות של התאים הנגועים באמצעות ליזה או אפופטוזיס. בעוד שהתפקודים המדויקים של תאי uNK עדיין אינם מובנים במלואם, מספר שורות של ראיות מצביעות על כך שהם מעורבים בעיצוב מחדש של אנגיוגנזה, פלישת טרופובלסטים והתפתחות עוברית6. הקשר בין אחוז תאי uNK על פני תאי סטרומה לבין RIF זכה למשיכה רבה במהלך 20 השנים האחרונות. מטא-אנליזה עדכנית, שכללה 8 מחקרים שכללו 604 נשים, הראתה כי צפיפות תאי CD56+uNK בשלב האמצע לוטאלי גדלה באופן משמעותי אצל נשים עם RIF בהשוואה לבקרות פוריות7. עם זאת, חשוב לציין כי המאפיינים של תאי uNK בשלב האמצעי-לוטאלי שונים באופן משמעותי מאלה של תאי NK נשירים (dNK). למרות שתאי uNK עשויים להתמיין לתת-קבוצות שונות של תאי dNK לאחר הריון, מדידת תאי uNK בלבד אינה מייצגת במדויק תאי dNK8. תאי uNK עוברים התמיינות דינמית וממלאים תפקידים שונים במחזור החודשי ובתהליכי הדצידואליזציה, מה שהופך אותם למורכבים יותר ממה שניתן לזהות על ידי CD56 בלבד. סמנים מרובים נדרשים כדי להשיג הבנה מקיפה של התנהגות תאי uNK במהלך הכנת רירית הרחם. המחקר האחרון שלנו השתמש בריצוף RNA חד-תאי כדי לזהות את המגוון של תאי uNK במהלך המחזור החודשי. התוצאות, שאומתו באמצעות ציטומטריית זרימה, הראו נוכחות של ארבעה תת-סוגים שונים של תאי uNK, שכל אחד מהם מציג שינויים דינמיים במהלך המחזור החודשי9. ניתוח העשרת גנים והעשרה תפקודית של אונטולוגיה גנטית מצביעים על כך שתת-קבוצות uNK אלה ממלאות תפקידים שונים בשלבים שונים של הווסת. עם זאת, ציטומטריית זרימה אינה נגישה באופן אוניברסלי במעבדות קליניות, והעיבוד המיידי של רקמת רירית הרחם הטרייה לעיכול אנזימים אינו מאפשר לחזור על שלבי ניסוי על גבי טעויות.

מטרת מחקר זה הייתה, אם כן, לחקור את המדידה של ארבע תת-אוכלוסיות אלה של תאי NK באמצעות בדיקת צביעה מרובה, המספקת גישה אבחנתית מעשית יותר. בצביעות מרובות, נוגדנים ספציפיים שונים כנגד כל מטרה מקושרים לתוויות פלואורופור שונות הפולטות אורכי גל שונים של אור כאשר הם מעוררים על ידי אורך גל מסוים של אור. בהשוואה לשיטת הצביעה המסורתית של IHC, שיטה זו יכולה להשוות כמותית את השפע והתפוצה היחסיים של מטרות מרובות במדגם ולספק מידע על אינטראקציה ולוקליזציה משותפת של מטרות שונות, מה שמאפשר לנו לזהות תת-סוגים שונים של תאי uNK. גישה זו לא רק תעמיק את הבנתנו את הקשר בין תאי uNK לבין RIF, אלא גם תספק תובנות לחקר תת-אוכלוסיות אחרות של תאי מערכת החיסון במחלות הקשורות לרירית הרחם.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר הקליני של האוניברסיטה הסינית המשותפת של הונג קונג-הטריטוריות החדשות במזרח (CREC ref no.: 2022.581). נשים עם RIF גויסו מהמרכז לטכנולוגיית רבייה בסיוע, בית החולים פרינס אוף וויילס, האוניברסיטה הסינית של הונג קונג. RIF הוגדר ככישלון להשיג הריון קליני לאחר החזרת לפחות 4 עוברים באיכות טובה במינימום של 3 מחזורים טריים או מוקפאים באישה מתחת לגיל40 שנים 10. הסכמה מדעת התקבלה מהמשתתפים לפני איסוף ביופסיות רירית הרחם.

1. רכישה ועיבוד של דגימות רירית הרחם

  1. עיתוי איסוף דגימות רירית הרחם
    1. איסוף דגימות רירית הרחם בהתאם לפרוטוקול קפדני כדי להבטיח עקביות בקרב משתתפי המחקר. עבור חולים עם מחזורים טבעיים, לבצע בדיקת שתן מהיום ה-9 של המחזור החודשי ולבצע ביופסיה רירית הרחם ביום השביעי לאחר גל LH (LH+7)11 . עבור חולים שעברו מחזורי טיפול הורמונלי חלופי (HRT), יש לתת 6 מ"ג של אסטרדיול ולרט דרך הפה מדי יום החל מהיום השני של המחזור החודשי.
    2. להעריך את עובי רירית הרחם על ידי אולטרה סאונד ביום 13 של המחזור החודשי. כאשר עובי רירית הרחם מגיע או עולה על 8 מ"מ, לנהל פרוגסטרון transvaginally ולבצע ביופסיה רירית הרחם 5 ימים לאחר מתן פרוגסטרון12.
  2. איסוף דגימות רירית הרחם וקיבוע: להכניס דוגם פיפטה לחלל הרחם, לקדם אותו לאזור הקרן; החל יניקה על ידי משיכת הבוכנה הפנימית, בו זמנית לגרד את משטח רירית הרחם באמצעות תנועות סיבוביות ואנכיות בתוך חלל הרחם. שטפו את הדגימות שנאספו במי מלח רגילים כדי לחסל הפרשות צוואר הרחם והרחם. למדוד דגימות ולהעריך את הגודל. עבור דגימות של 3 מ"מ x 15-25 מ"מ, טבלו אותן מיד ב-10 מ"ל של פורמלין חוצץ נייטרלי 10% וקיבעו אותן בטמפרטורת החדר למשך 24-48 שעות.
  3. התייבשות: עם השלמת הקיבוע, יש להעביר את הדגימות לרצף התייבשות שנועד להחליף מים באתנול. כדי לעשות זאת, לטבול רקמות 70%, 80%, 90%, ו 100% אתנול אמבטיות כדי להבטיח התייבשות מוחלטת. לאחר אמבט האתנול הסופי, נקו את הדגימות בקסילן כדי להסיר שאריות אלכוהול והכינו אותן לחדירת פרפין.
  4. הטבעה: לאחר הנחת הרקמה שטוחה בתחתית התבנית, המיסו פרפין והוסיפו אותו בזהירות לדגימות כדי להבטיח שרקמת רירית הרחם עטופה לחלוטין במטריצת הפרפין. לאחר מילוי התבניות בשעוות פרפין, מצננים אותן על שולחן מקפיא כדי לקדם את התמצקות שעוות הפרפין. לאחר שאבני הפרפין מתקשות, יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד לעיבוד נוסף.
    הערה: התבניות בהן נעשה שימוש נבחרו במיוחד כדי להתאים לגודל דגימות רירית הרחם שהתקבלו כדי לאפשר לרקמת רירית הרחם להשתטח על התחתית ללא קיפול, ובכך להבטיח כיוון אופטימלי לחתך הבא וללא יצירת עודפים מיותרים.
  5. חיתוך: כדי להתכונן לחתך, מקררים את קוביות הפרפין ב-4°C למשך שעתיים. פורסים את הדגימות למקטעים של 4 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום, ולאחר מכן משטחים את הפרוסות על פני המים המזוקקים שחוממו ל-42 מעלות צלזיוס ומרכיבים אותן על מגלשות זכוכית דביקות. הניחו את הפרוסות על מייבש שקופיות למשך הלילה ואחסנו בטמפרטורת החדר לפני השימוש.

2. אופטימיזציה של תנאי אימונוהיסטוכימיה מולטיפלקס

  1. אימות IHC: לצורך אימות פרמטרים של צביעת IHC, אמץ גישה שיטתית לכוונון עדין של התנאים לשליפת אנטיגן, ריכוז נוגדנים וזמני דגירה.
    1. במסגרת טווחי הדילול המומלצים של היצרן, יש לבדוק ריכוזים של 2-3 לכל נוגדן. מטב את אחזור האנטיגן על ידי השוואת מאגרים ב- pH 6 ו- pH 9, והערך פרוטוקולי דגירה הן בטמפרטורת החדר למשך 1.5 שעות והן בלילה ב- 4 מעלות צלזיוס.
    2. העריכו כל מצב בקפדנות, תוך התמקדות בעוצמת הצביעה, ספציפיות ורעשי רקע. בחר את השילוב האופטימלי המניב את הצביעה הברורה והספציפית ביותר עם כריכה מינימלית שאינה ספציפית. אימות קפדני זה הבטיח את הדיוק ויכולת השחזור הגבוהים ביותר בפרוטוקול IHC.
  2. צביעת מונופלקס של הגברת אות טירמיד (TSA): לאחר קביעת פרמטרי הצביעה האופטימליים עבור נוגדנים בודדים, מטב את זיווג הנוגדנים עם צבעי TSA שונים. התאימו את הסמן בעל הביטוי הגבוה יותר לצבע בעל עוצמת פלואורסצנטיות נמוכה יותר, או להיפך. במהלך שלב זה, בצע התאמות לריכוז הנוגדנים ולזמן הדגירה בהתאם לעוצמת האות הפלואורסצנטי שנצפה. אם נצפה רקע משמעותי או צביעה לא ספציפית, שנו את הצבע המשויך13.
  3. צביעת מולטיפלקס TSA: עבור פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה מרובת מרבבים (m-IHC), סדר הצביעה הרציף הוגדר בקפידה על פי עקרונות מבוססים. כדי להבטיח שתהליך הריבוב ישקף את הרגישות והספציפיות של צביעה על תווית יחידה, העדיפו נוגדנים עם רמות ביטוי נמוכות יותר בתחילת רצף הצביעה. מקמו נוגדנים הדורשים תיקון בסיס לשליפת אנטיגן בסוף רצף הצביעה, שכן תיקון הבסיס חזק בהשוואה לשיטות מבוססות חומצה, אשר יכולות, במקרים מסוימים, להגביר חפצי צביעה לא ספציפיים.
  4. בעזרת הממצאים משלבים 2.1 ו-2.2, מחליטים על הנוגדנים בהם יש להשתמש ובאיזה שלב, בהתבסס על דרישות שליפת האנטיגן שלהם וצפיפויות הביטוי שלהם. לדוגמה, נוגדן CXCR4, הדורש תיקון בסיס לשליפת אנטיגן, הוצב בשלבים הסופיים של הצביעה. לעומת זאת, נוגדן CD49a, המאופיין בצפיפות ביטוי נמוכה יותר, קיבל את המיקום הראשון ברצף הצביעה. מקסם את הסיכויים לזיהוי מוצלח ומזער את השפעות המיסוך שעלולות להתרחש בשלבים מאוחרים יותר של הליך הריבוב.
  5. עבור שאר הנוגדנים, בדוק שילובים שונים במהלך שלב האופטימיזציה כדי לקבוע את הרצף היעיל ביותר המאזן הן רגישות והן ספציפיות. תוצאות ניתוחים השוואתיים אלה ינחו את ההרכב הסופי של לוח המרובב, כמפורט בטבלה 1, ויבטיחו שהחלונית הנבחרת תספק ביצועים מיטביים תוך מזעור הרקע.

3. תהליך m-IHC

  1. ניקוי, הידרציה וקיבוע: אפו את חלקי הרקמה בטמפרטורה של 60°C במשך שעתיים, ולאחר מכן טבלו ברצף ב-xylene I (10 דקות), xylene II (10 דקות), 100% אתנול (5 דקות), 95% אתנול (5 דקות), 80% אתנול (5 דקות), 75% אתנול (5 דקות), ddH2O (2 דקות עבור 3x), 10% פורמלין חוצץ ניטרלי (לפחות 20 דקות), ו ddH2O (2 דקות עבור 3x).
  2. אחזור אנטיגן: הוסף 200 מ"ל של מאגר AR6 או AR9 בהתאמה, כמפורט בטבלה 1 עבור כל נוגדן, לקלטת אחזור אנטיגן עמידה בחום. מניחים את המקטעים במאגר שליפת האנטיגן המתאים ומחממים במיקרוגל בעוצמה גבוהה כ-2 דקות עד לרתיחה. לאחר מכן, מכסים את הקלטת באופן רופף, מחממים על עוצמה נמוכה במשך 15 דקות, ומצננים לטמפרטורת החדר. שטפו את המקטעים עם ddH2O ו-PBST.
  3. ציור מחסום הידרופובי: לאחר הסרת התמיסה העודפת עם נייר סופג, ציירו עיגול שלם סביב הרקמה באמצעות עט מחסום הידרופובי.
  4. נטרול פעילות אנזימים אנדוגניים: יש לטפל במקטעים עם 3% מי חמצן ולדגור במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף עם PBST 3x למשך 2 דקות כל אחד.
  5. חסימת אתרים לא ספציפיים: לאחר הייבוש בנייר סופג, יש למרוח תמיסת חסימה (1x Antibody Diדלent/Block) ולדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. דגירה עם נוגדן ראשוני: לאחר הסרת התמיסה החוסמת, יש למרוח 150 μL של הנוגדן הראשוני הראשון, CD49a, על כל שקופית בדילול של 1:1000 בדילול נוגדנים 1x. דגירה כפי שמוטב קודם בסעיף 2. לאחר הדגירה, שטפו את המגלשות עם PBST 3x למשך 2 דקות כל אחת. לגבי שאר הנוגדנים, ראו טבלה 1 ליחסי דילול ספציפיים.
  7. דגירה עם נוגדן משני: לפני החלת הנוגדן המשני, השתמש בנייר סופג כדי להסיר לחות עודפת כדי למנוע דילול של מגיב. יש להוסיף 4-5 טיפות (כ-150 מיקרוליטר) של הנוגדן המשני 1x Anti-Ms + Rb HRP לכל שקופית, ולאחר מכן דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש לבצע שלוש שטיפות עם PBST במשך 2 דקות כל אחת לאחר הדגירה.
    הערה: שים לב שהנוגדן המשני 1x Anti-Ms + Rb HRP הוא ספציפי לנוגדנים ראשוניים של ארנב ועכבר.
  8. הגברת אות עם צבע TSA: לאחר הסרת לחות עודפת, לדלל את צבע TSA 1:100 במדלל ההגברה. הוסף 150 μL של תמיסת צבע TSA מדוללת זו לכל שקופית. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף עם PBST 3x למשך 2 דקות כל אחד.
  9. חזור על שלבים 3.2 ו- 3.5-3.8 עבור הליך TSA באמצעות הנוגדן והצבע המתאימים.
  10. צביעת גרעינים: לאחר צביעת הנוגדן האחרון, סלקו פלואורופורים לא קשורים על ידי גלי מיקרו במקטעים ב-200 מ"ל של חיץ AR6 בתוך קסטה עמידה בחום, רותחים למשך 2 דקות, ולאחר מכן חימום בהספק נמוך למשך 15 דקות. יש לקרר את הדגימות לטמפרטורת החדר ולשטוף עם ddH2O ו-PBST. יש להוסיף 150 μL של תמיסת עבודה DAPI מדוללת ב-PBST (1:10) טיפתית, לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף 2x עם ddH2O.
  11. הרכבה: לאחר שהחלקים מיובשים לחלוטין באוויר באזור חשוך למשך כ-30 דקות, יש למרוח טיפה אחת (כ-30 מיקרוליטר) של התושבת הפלואורסצנטית נגד מרווה ולהניח את הכיסויים.
    הערה: הגן על כל הפעולות מפני אור לאחר היישום הראשון של צבע TSA. תצפית מהירה ולכידת תמונה היו חיוניות לאחר השלמת הצביעה כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית.

4. רכישה וניתוח של תמונות

  1. זמן חשיפה: צלם תמונות באמצעות מכונת הדמיה שיורשת אורכי גל עירור ופליטה המתאימים לפלואורופורים. בעת קביעת זמני חשיפה, בדוק שקופיות עם מגוון רחב של ביטויי סמן כדי להבטיח דיוק. עבור כל שילוב סמן/מסנן, התמקד ידנית באזורים שונים של השקופית. השתמש בתכונה חשיפה אוטומטית כדי להגדיר את זמן החשיפה.
  2. בחרו מסננים בהתאם לצבעי TSA ובדקו שקופיות מרובות כדי לקבוע זמני חשיפה מיטביים לערוץ. החל הגדרות אלה באופן עקבי על כל הרכישות הבאות כדי לשמור על יכולת השוואה לאורך ההדמיה.
  3. בחירת אזורי לכידה: כדי להבטיח דגימה בלתי משוחדת על פני חלקי רקמה והכללה עקבית של אפיתל לומינלי בכל שדה מנותח, בחר באופן אקראי את האזור הראשוני לרכישת תמונה, כאשר הקריטריון הקריטי הוא נוכחות גבול האפיתל הלומינלי.
  4. לאחר לכידת שדה ראשוני זה, בחר באופן שיטתי את האזורים הבאים על ידי הזזת שדה אחד שמאלה או ימינה מנקודת ההתחלה (השמטת שדה אחד בין כל תמונה שנתפסה) תוך שמירה על גבול האפיתל הלומינלי בתוך המסגרת. חזור על תהליך זה כדי ללכוד לפחות חמישה אזורים שונים, שכל אחד מהם מכיל לפחות חלק מהאפיתל הלומינלי, כדי לשמור על עומק עקבי של ניתוח לאורך14. גישה זו נועדה לכלול מינימום של כ -10,000 תאי סטרומה בכל השדות שנלכדו כדי להבטיח איסוף נתונים מקיף ומייצג.
  5. ניתוח תמונות
    1. הכנת תמונה: כדי לייבא ולנתח תמונות מולטיספקטרליות, נווט תחילה אל File > Open Image בממשק התוכנה כדי לטעון את הקבצים ואת השקופית Autofluorescence (AF). לאחר העלאת התמונות, המשך לערבב את הפלואורופורים על ידי לחיצה על בחר פלואורים כפתור ובחירת הספרייה הספקטרלית המתאימה. לאחר שכל הפלואורופורים נבחרו, לחץ על אישור כדי לאשר את הבחירה. כדי לבודד את ספקטרום המיקוד האוטומטי, השתמש בכלי הטפטפת של המיקוד האוטומטי כדי לדגום אזור מייצג של רקמה מתמונת המיקוד האוטומטי, תוך הקפדה שלא לכלול פיקסלים שאינם רקמות. לאחר הדגימה, לחץ על הכן תמונה או הכן הכל בפינה השמאלית התחתונה של ממשק15.
    2. פילוח רקמות: התחל את תהליך הסגמנטציה על ידי שרטוט ידני של קו בסיס של 3-5 אזורים לכל סוג רקמה בתמונה, כולל אזורי אפיתל המכילים תאי אפיתל, אזורי סטרומה המכילים תאי סטרומה ואזורים ריקים ללא תוכן תאי. אם תוצאות הפילוח הראשוניות אינן משביעות רצון, הוסף ביאורים ידניים לאזורים נוספים כדי לשפר את מערך נתוני האימון, ובכך להגדיל את הדיוק והאמינות של הניתוחים הבאים. התאמה דינמית זו של אזורים ופרמטרים מבטיחה שהתוכנה תוכל לזהות באופן אוטומטי מבנים דומים בתמונות הנוכחיות ואחרות המיובאות בדיוק רב יותר.
      הערה: הביאור הראשוני משמש כערכת נתוני אימון עבור התוכנה כדי ללמוד את המאפיינים של כל רכיב רקמה. יכולות הפילוח של התוכנה משתכללות באופן איטרטיבי בהתבסס על המורכבות והשונות של הרקמה.
    3. פילוח תאים: לחץ/י על ״פלח תאים ״ כדי להתחיל בפיצול תאים. בהגדרה פילוח תאים, בחר גרעינים וממברנה. בחר DAPI כדי לזהות גרעיני תאים ולהתאים את הגדרת העוצמה כדי לזהות את כל גרעיני התא ללא רעשי רקע. בחר אותות CD16, CD49a ו - CD56 כדי למצוא את הממברנה והשתמש באות זה כדי לסייע בפיצול גרעיני. השתמש בתכונת פיצול הרכיבים הגרעיניים כדי להבחין בין גרעינים הממוקמים קרוב.
      הערה: DAPI מסמן את החלק הפנימי של תאים. תכונת פיצול הרכיבים הגרעיניים מסייעת להבחין בין גרעיני תאים כאשר הם קרובים זה לזה או נראים ממוזגים. שלב זה חשוב לקבלת ספירת תאים אמינה ולשמירה על שלמות הניתוח.
    4. פנוטיפ תאים: אמץ ארבעה סמנים שונים של פני התא כולל CD56, CD49a, CXCR4 ו- CD16 כדי להבדיל בין תת-סוגים שונים של תאי NK. בסכימת הפנוטיפ, תייגו את ארבעת הסמנים הללו כפנוטיפים שיש להמשיך. במקטע Associate View, הקצה צבעים ספציפיים לכל אחד מהפנוטיפים לצורך זיהוי. באמצעות הלחצן 'הוסף', סווג תאים כמבטאים את הסמנים באופן חיובי או שלילי; לדוגמה, בפנוטיפ CD56, תאים יכולים להיות מסומנים כ- CD56+ או CD56-. תייג ידנית לפחות חמישה תאים עבור כל פנוטיפ במהלך תהליך האימון. בצעו תיוג ידני נוסף אם האימון הראשוני אינו מניב תוצאות יעילות.
    5. לאחר הגדרת תצורת הפנוטיפ של התא, כל תא בתמונה יציין אם ארבעת סמני פני השטח מבוטאים באופן חיובי או שלילי. יצא את הנתונים המתקבלים לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף.
    6. עיבוד נתונים: יבא את הנתונים המתקבלים מכל התמונות לגיליון אלקטרוני לצורך עיבוד. חשב אחוזים מכל תת-סוגי תאי uNK ביחס למספר התאים הכולל בתמונה. ספירת התאים הסופית מייצגת את הספירה הממוצעת על פני תמונות מרובות, ומספקת סקירה מקיפה של אוכלוסיית תת-סוגים שונים של תאי uNK בדגימה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לשמור על עקביות בעיתוי איסוף דגימות רירית הרחם לנשים שעברו את המחזור הטבעי, בוצעה בדיקת שתן כדי לזהות במדויק את נחשול הורמון הלוטיניזציה (LH) שלהן, עם ביופסיות רירית הרחם שנערכו 7 ימים לאחר נחשול LH. עבור נשים שעברו מחזורי HRT, הדגימות נקבעו בדיוק 5 ימים לאחר תחילת תוספת פרוגסטרון. כדי לכמת תת-סוגים שונים של תאי NK ברירית הרחם, נעשה שימוש בצביעת m-IHC. מתאר סכמטי של הליך הניסוי מתואר באיור 1.

אופטימיזציה של הליך הניסוי היא קריטית להשגת תוצאות צביעה באיכות גבוהה של m-IHC כדי להבטיח דיוק ועקביות בתוצאות הניסוי. בתחילה, IHC שימש כדי לקבוע את ריכוז הנוגדנים המתאים, עם בחירת פתרונות אחזור אנטיגן AR6 או AR9. עבור נוגדנים כגון CD56, CD16 ו- CD49, מומלצת תמיסת אחזור אנטיגן עם pH 6, ואילו עבור נוגדן CXCR4, תוצאות צביעה מעולות הושגו באמצעות פתרון תיקון אנטיגן עם pH של 9 לעומת חיץ pH 6. לאחר קביעת הפרמטרים, כולל יחס דילול נוגדנים, זמן הדגירה ותנאי שליפת האנטיגן, ניתן לבחור את צבע ה- TSA המתאים ביותר על סמך זיקת הנוגדן. יש לבחור צבע עם בהירות פלואורסצנטית חלשה כדי להשלים את הזיקה הגבוהה של הנוגדן. נתוני ייחוס על עוצמת האות של צבעי TSA ניתן למצוא בטבלה 2. לאחר השלמת בדיקת המונופלקס TSA, ניתן לקבוע את סדר המרבב TSA. בהתחשב בכך שארבעת הנוגדנים נועדו לזהות תת-סוגים שונים של תאי uNK, לוקליזציה משותפת בין הנוגדנים היא בלתי נמנעת. כדי למזער את החפיפה הספקטרלית ולמנוע הפרעה בין מוטות פלואורסצנטיים, נעשה שימוש באסטרטגיה הבאה: בחירת מוטות פלואורסצנטיים עם אורכי גל רחוקים ככל האפשר זה מזה, השוואת המיקום והמספר של אותות חיוביים של מרבב TSA לאלה של מונופלקס TSA כדי להבטיח את זהותם (איור 2), והבטחת רקע ברור (איור 3)16.

לאחר אופטימיזציה והשלמת הליכי צביעה m-IHC, תחנת העבודה להדמיה שימשה לרכישת תמונות ותוכנת ניתוח התמונה יושמה לניתוח מעמיק של התמונות (איור 4). לסיווג תאי uNK נעשה שימוש בשיטות מסורתיות וחדשניות כאחד. הסיווג המסורתי מחלק תאי NK לשתי קטגוריות, CD56+CD16- ו- CD56+CD16+17, בהתבסס על רמת הביטוי של CD16. בהתבסס על בסיס זה, ביקשנו להגדיר עוד יותר את ההטרוגניות של תאי NK באמצעות אסטרטגיית סיווג חדשנית. באמצעות ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) מהמחקר הקודם שלנו, בודדנו תאי NK בודדים על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) וביצענו ריצוף RNA כדי ללכוד את פרופילי השעתוק של כל תא. הניתוח שלנו חשף ארבעה תת-סוגים שונים של תאי NK: NK1 (CD56+CD49a+CXCR4-), NK2 (CD56+CD49a+CXCR4+), NK3 (CD56+CD49a-CXCR4-), ו-NK4 (CD56+CD49a-CXCR4+). תת-סוגים אלה התאפיינו בביטוי דיפרנציאלי של CD49a ו-CXCR4, כאשר CD56 שימש כסמן אוניברסלי לכל תאי ה-NK. CD49a זוהה באופן ספציפי בתת-סוגים NK1 ו-NK2, בעוד ש-CXCR4 היה קיים בתת-סוגים NK2 ו-NK4. כדי לאמת את הסיווג הזה, ביצענו ניתוח ציטומטריית זרימה כדי להבטיח את הדיוק של שיטת תת-ההקלדה שלנו (איור 5)9. החלק היחסי של כל תת-סוג של תא uNK מוצג באחוזים ביחס למספר הכולל של תאי סטרומה.

figure-results-1
איור 1: דיאגרמה של זרימת העבודה של ניתוח תאי NK רירית הרחם. השלבים העיקריים כוללים רכישה ואיסוף של רירית הרחם, אופטימיזציה של פאנל m-IHC, צביעת m-IHC של רירית הרחם, ורכישה וניתוח של התמונה. נוצר באמצעות BioRender.com לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תמונות מייצגות לכימות סמנים ביולוגיים באמצעות DAB, מונופלקס TSA וצביעה מרובת מרבבים TSA. תמונות מייצגות של כל אחד מהנוגדנים המוכתמים על ידי DAB (פאנלים שמאליים), מונופלקס TSA IHC (פאנלים אמצעיים) ומולטיפלקס IHC TSA (פאנלים ימניים) הדגימו סטייה מינימלית במהלך הפיתוח של m-IHC. תמונות IHC המדומות של TSA מתחת מחקות מאוד את תמונות השדה הבהיר המתאימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תוצאות ניסוי לאחר צביעת רירית הרחם m-IHC. (A) תמונה לא מעורבת נרכשה באמצעות מכשיר ההדמיה בהגדלה של פי 200. (B) הגדלה נוספת של תמונה לא מעורבת זו. (ג-ו) התמונות נצפו בתעלות צבע TSA 570 (CD16), צבע TSA 650 (CD56), צבע TSA 620 (CXCR4) וצבע TSA 520 (CD49a) לאחר ביטול הערבוב באמצעות תוכנת ההדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ניתוח תמונות מוכתמות m-IHC. התמונות נותחו באמצעות פילוח רקמות (A) של תוכנת הדמיה, (B) פילוח תאים ו-(C) פונקציות פנוטיפ תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: ניתוח תת-סוג של תאי NK ברירית הרחם. (A) ניתן לסווג תאי NK קונבנציונליים לרירית הרחם לתאי CD56+CD16-NK ולתאי CD56+CD16+NK בהתבסס על ביטוי CD16. (B) שיטת ניתוח תת-הסוגים החדשנית סיווגה תאי NK רירית הרחם לארבע קטגוריות: NK1 (CD56+CD49a+CXCR4-), NK2 (CD56+CD49a+CXCR4+), NK3 (CD56+CD49a-CXCR4-), ו-NK4 (CD56+CD49a-CXCR4+). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מחזור צביעהסמןשיבוטחברהמכפלהדילול נוגדניםמאגר ARפלואורופור
1CD49aCL7207Novus BiologicalsNBP2-764781:1000AR6TSA 520
2CD56CD564לייקהNCL-L-CD56-5041:100AR6TSA 650
3CD16SP175ABCAMab1833541:100AR6TSA 570
4CXCR444716מו"פצרפת1:100AR9TSA 620

טבלה 1: רשימת ריכוזי הנוגדנים וצבע TSA המשמשים ב- m-IHC.

פלואורופורהמנטרה
צבע TSA 520גבוה
צבע TSA 540בינוני
צבע TSA 570בינוני
צבע TSA 620בינוני
צבע TSA 650גבוה
צבע TSA 690נמוך

טבלה 2: צבעי TSA ועוצמת הפלואורסצנטיות המתאימה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתלת עובר כרוכה באינטראקציה מורכבת בין העובר לרירית הרחם. המצב החיסוני של הומאוסטזיס רירית הרחם ממלא תפקיד מרכזי בקביעת קליטת רירית הרחם. במהלך WOI, אוכלוסיית הלויקוציטים השלטת ברירית הרחם היא תאי NK. כ -90% מתאי uNK מציגים ביטוי CD56 גבוה אך חסרים CD16. עם זאת, תת-קבוצה מינורית של תאי uNK דומה לתאי NK היקפיים בדם, ומציגה ביטוי CD56 נמוך אך ביטוי CD16 חיובי18. שני תת-סוגים אלה של תאי uNK מדגימים פונקציות נפרדות. תת-הסוג CD56+CD16 תורם בעיקר לייצור ציטוקינים, עיצוב מחדש של כלי הדם ואינטראקציות עם תאי טרופובלסט, החיוניים לביסוס הריון ולתחזוקתו. לעומת זאת, תת-הסוג CD56+CD16 מציג ציטוטוקסיות גבוהה יותר. באמצעות ריצוף RNA חד-תאי, המחקר האחרון שלנו סיווג עוד יותר תאי uNK לארבע תת-קבוצות, ותת-קבוצות נוספות של תאי NK רגולטוריים CD56+CD16 לשלוש תת-אוכלוסיות בהתבסס על הפנוטיפים והפונקציות הספציפיות שלהם9. תת-הקבוצה NK1, המאופיינת ב-CD56+CD49a+CXCR4-, מעורבת בעיצוב מחדש של רקמות. תת-הקבוצה NK2, המזוהה על ידי CD56+CD49a+CXCR4+, מווסתת את התגובה החיסונית. תת-הקבוצה NK3, המסומנת על-ידי CD56+CD49a-CXCR4-, מקיימת אינטראקציה עם טרופובלסטים. תת-הקבוצה NK4, המציגה CD56+CD49a-CXCR4+, חולקת קווי דמיון עם תאי NK CD56+CD16+, ומציגה פונקציות ציטוטוקסיות9. במחקר הנוכחי, בפעם הראשונה, הצלחנו לבסס פרוטוקול לזיהוי ארבע תת-קבוצות נפרדות אלה של תאי NK באמצעות צביעת m-IHC.

צביעת IHC קונבנציונלית וציטומטריית זרימה הן השיטות הנפוצות ביותר לזיהוי תאי מערכת החיסון, כל אחת עם נקודות החוזק והמגבלות שלה19. בעוד IHC קונבנציונלי נמצא בשימוש נרחב במסגרות קליניות בשל נגישותו הקלה, הוא מתמודד עם אתגרים בזיהוי בו זמנית של אנטיגנים מרובים וכימות אותות חיוביים. הדבר מהווה מכשול משמעותי באפיון מדויק של פנוטיפים של תאי מערכת החיסון, אשר לעתים קרובות מחייבים שימוש בסמנים מרובים למדידה מדויקת. מצד שני, ציטומטריית זרימה מסוגלת לזהות בו זמנית סמני תאים מרובים, אך היא דורשת נפח גדול של דגימות טריות ואינה מספקת מידע מרחבי על מיקום התא בתוך הרקמה. יש לציין כי תאי מערכת החיסון של רירית הרחם אינם מפוזרים באופן אחיד ברקמת רירית הרחם; לדוגמה, תאי uNK מצטברים בצפיפות רבה יותר ליד שכבת הבסיס של רירית הרחם בהשוואה לאזורים הסמוכים לחלל הלומינלי20. ניתן לטפל במגבלות אלה של IHC קונבנציונלי וציטומטריית זרימה באמצעות m-IHC ופלטפורמת ניתוח התמונה המצומדת עם אלגוריתמים של למידת מכונה כדי להשיג פילוח רקמות, פילוח תאים וזיהוי תאים חיוביים. גישה זו משפרת את היעילות על ידי ניתוח עשרות אלפי תאים בתוך דקות, ממזערת את הטיית הצופה על ידי זיהוי אוטומטי של תאים חיוביים, ומאפשרת ניתוח מדויק יותר באמצעות סמנים מרובים. יתר על כן, הוא מבטל את הצורך בדגימות טריות ומאפשר ניסויי אצווה או ניתוחים חוזרים בעת הצורך.

ביצוע הערכה מקיפה של פנוטיפים של תאי uNK באמצעות טכניקת m-IHC יכול לספק הבנה עמוקה יותר של הקשר בין תאי uNK להשתלת עוברים, כמו גם השינויים שלהם אצל נשים עם RIF. מלבד תאי uNK, תאי חיסון אחרים של רירית הרחם תורמים גם הם להומאוסטזיס חיסוני מקומי. לדוגמה, לימפוציטים רגולטוריים מסוג T (תאי Treg) שומרים על סבילות חיסונית על ידי שחרור גורמים מעכבים, כגון IL-10 ו-TGF-β, המדכאים את פעילותם של תאי Th1 ו-Th221. ההתמיינות של מקרופאגים M2, המווסתים על ידי סטרואידים וציטוקינים מסוג Th2, תורמת למצב האימונוסובלני על ידי ויסות פעילות הארגינאז ועיכוב ייצור תחמוצת החנקן22. יתר על כן, תאים דנדריטיים (DCs) מתמיינים לתאים טולרוגניים בוגרים בתוך הרחם, ומשחררים גורמים כגון sFLT1 ו- TGF-β1 המווסתים את הניאוגנזה של כלי הדם ומעכבים את תפקודם של תאי T CD8+, ובכך שומרים על הומאוסטזיס חיסוני ותומכים בהתפתחות העובר18. בדומה לתאי uNK, גם תאי חיסון אלה הם הטרוגניים, וסמן יחיד אינו יכול לזהות במדויק את הפנוטיפים שלהם. היישום של m-IHC להערכת תת-קבוצות של תאי uNK ממחיש את הפוטנציאל לזיהוי תת-קבוצות של תאי חיסון רירית הרחם הללו.

בנוסף אנדומטריום, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על רקמות שונות לזיהוי פנוטיפים של תאי החיסון. כאשר מיישמים אותו על רקמות אחרות, יש צורך רק בהתאמות קלות כדי להבטיח צביעה אופטימלית. יתר על כן, אם החוקרים מתכוונים להחליף סמנים מסוימים, ניתן לשנות את הלוח המקורי כדי לעמוד בדרישות הניסוי הספציפיות. הרבגוניות והגמישות של לוח זה הופכות אותו לכלי הסתגלות לחקר רקמות שונות או תת-קבוצות תאים שונות.

טכנולוגיה זו לא רק מאפשרת להבין את השינויים המפורטים בתאי מערכת החיסון של רירית הרחם כדי לנתח את המנגנון הבסיסי של אי קליטת רירית הרחם, אלא גם מספקת פוטנציאל לפיתוח בדיקות אבחון. הקלות היחסית של השגה ושימור של בלוקים ומקטעים של פרפין סללה את הדרך לשימוש נרחב בטכניקה זו. עם לוחות צביעה סטנדרטיים, בתי חולים יכולים למנף טכנולוגיית צביעה אוטומטית בשילוב עם אלגוריתמי תוכנה מתוחכמים כדי לשפר באופן משמעותי את יעילות הליכי הניתוח שלהם. היתרונות של טכנולוגיית m-IHC הופכים אותה לאופציה בת קיימא עבור פרקטיקות קליניות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי נתמך על ידי הקרן למחקר רפואי ובריאות (10210956).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
CD49aNovus BiologicalsNBP2-76478נוגדנים ראשוניים
CD56LeicaNCL-L-CD56-504נוגדנים ראשוניים
CD16abcamab183354נוגדנים ראשוניים
CXCR4R& DMAB172הגברת נוגדנים ראשוניים
Akoya BiosciencesFP1498מאגר דילול פלואורופור
מדללי נוגדניםAkoya BiosciencesARD1001EAלדלל את תמיסת הנוגדן
ציטראט, pH 6.0 /9.0(10x)Akoya BiosciencesA6001/A9001פתרון אחזור אנטיגן
בטופס תוכנה מתקדמת לניתוח תמונהAkoya BiosciencesinForm Tissue Finder Software 2.2.6תוכנת ניתוח נתונים
Mantra תחנות עבודהAkoya BiosciencesCLS140089מיקרוגל הדמיה ספקטרלית
Akoya Biosciencesמהפךהפשטת מיקרוגל
TSA 520Akoya BiosciencesFP1487001Kריאגנטים פלואורסצנטיים מתאימים על בסיס טירמיד
TSA 620Akoya BiosciencesFP1495001Kריאגנטים פלואורסצנטיים מתאימים על בסיס טירמיד
TSA 650Akoya BiosciencesFP1496001Kריאגנטים פלואורסצנטיים מתאימים על בסיס טירמיד
TSA 570Akoya BiosciencesFP1488001Kריאגנטים פלואורסצנטיים מתאימים על בסיס טירמיד
שקופיות מצופות פולי-L-ליזין FisherTechnologies120-550-15שקופיות לשימוש היסטולוגי שגרתי
PolyHRP ספקטרום רחבפרקין אלמרARH1001EAנוגדנים משניים
Invitrogen ומסחר;   פלואורומאונט ג'י אנד טרייד; הרכבה בינוניתThemoFisher Science495802 התקנה
ספקטרלי DAPIAkoya BiosciencesFP1490Aצביעת חומצות גרעין
מדלל סדרת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Geyter, C. Assisted reproductive technology: Impact on society and need for surveillance. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 33 (1), 3-8 (2019).
  2. State-Specific Assisted Reproductive Technology Surveillance. CDC. , https://www.cdc.gov/art/state-specific-surveillance/2021/index.html (2024).
  3. Busnelli, A., et al. How common is real repeated implantation failure? An indirect estimate of the prevalence. Reprod Biomed Onl. 40 (1), 91-97 (2020).
  4. Ben Rafael, Z. Repeated implantation failure (RIF): an iatrogenic meaningless definition that generates unnecessary and costly use of add-on procedures. Human Reprod. 35 (7), 1479-1483 (2020).
  5. Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).
  6. Vento-Tormo, R., et al. Single-cell reconstruction of the early maternal-fetal interface in humans. Nature. 563 (7731), 347-353 (2018).
  7. Von Woon, E., et al. Number and function of uterine natural killer cells in recurrent miscarriage and implantation failure: a systematic review and meta-analysis. Human Reprod Update. 28 (4), 548-582 (2022).
  8. Manaster, I., et al. Endometrial NK cells are special immature cells that await pregnancy. J Immunol. 181 (3), 1869-1876 (2008).
  9. Lai, Z. Z., et al. Single-cell transcriptome profiling of the human endometrium of patients with recurrent implantation failure. Theranostics. 12 (15), 6527-6547 (2022).
  10. Coughlan, C., et al. Recurrent implantation failure: definition and management. Reprod BioMed Onl. 28 (1), 14-38 (2014).
  11. Chen, X., et al. Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range. Am J Obst Gyneco. 217 (6), 680.e1-680.e6 (2017).
  12. Yang, W. J., et al. A comparison of uterine natural killer cell density in the peri-implantation period between natural cycles and hormone replacement therapy cycles. Am J Reprod Immunol. 82 (3), e13156(2019).
  13. Syed, J., et al. Multiplex immunohistochemistry: The importance of staining order when producing a validated protocol. Immunother. 5 (2), 1-9 (2019).
  14. Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. J Reprod Immunol. 116, 50-59 (2016).
  15. Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in vivo fluorescence imaging. J Biomed Optics. 10 (4), 41207(2005).
  16. Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: Forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Front Mol Biosci. 8, 674747(2021).
  17. Von Woon, E., et al. Number and function of uterine natural killer cells in recurrent miscarriage and implantation failure: a systematic review and meta-analysis. Human Reprod Update. 28 (4), 548-582 (2022).
  18. Lee, J. Y., Lee, M., Lee, S. K. Role of endometrial immune cells in implantation. Clin Exp Reprod Med. 38 (3), 119-125 (2011).
  19. Gothe, J. P., de Mattos, A. C., Silveira, C. F., Malavazi, K. C. Exploring natural killer cell testing in embryo implantation and reproductive failure: An overview of techniques and controversies. Reprod Sci. 31 (3), 603-632 (2024).
  20. Russell, P., et al. The distribution of immune cells and macrophages in the endometrium of women with recurrent reproductive failure: I: Techniques. J Reprod Immunol. 91 (1), 90-102 (2011).
  21. Wang, W., Sung, N., Gilman-Sachs, A., Kwak-Kim, J. T. Helper (Th) cell profiles in pregnancy and recurrent pregnancy losses: Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Tfh cells. Front Immunol. 11, 2025(2020).
  22. Nagamatsu, T., Schust, D. J. The contribution of macrophages to normal and pathological pregnancies. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 460-471 (2010).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NKCD49aCXCR4

מאמרים קשורים