חלבונים חיוניים לפתוגנזה של חיידקים, ומאפשרים פלישה והתחמקות חיסונית. מיצוי חד-שלבי של חלבונים ציטופלזמיים וממברנה של חיידקים בצורתם הפעילה הוא מטריד. מאמר וידאו זה מדגים מיצוי של חלבונים תאיים שלמים של לפטוספירה לניתוח זימוגרפיה לאיתור ואפיון ג'לטינאזות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מיצוי חד-שלבי וניתוח זימוגרפי של ג'לטינזות חיידקיות
במאמר זה
סיכום
תקציר
חלבונים של חיידקים פתוגניים תורמים לפלישה ופתוגנזה על ידי פירוק פעיל של רכיבי המטריצה החוץ-תאית (ECM) של המארח ומחסומים תאיים, שינוי התגובה החיסונית של המארח ופגיעה במערכת ההגנה של המארח. זה הופך את הפרוטאינאזות לאחת המולקולות האלימות ביותר וזיהוין ואפיונם חיוניים למניעה ובקרה של מחלות. לחיידקים רבים יש גם חלבונים הקשורים לממברנה החיצונית. בידוד ואפיון של חלבוני הממברנה החיצונית בצורתם הפעילה מציבים אתגרים משמעותיים בשל מיקומם בתוך הממברנה החיצונית. במחקר זה, אנו מדגימים שיטה חד-שלבית לחילוץ ג'לטינזות ציטופלזמיות וחיצוניות הקשורות לממברנה החיצונית מלפטוספירה ומדגימים את פעילותם האנזימטית באמצעות זימוגרפיה. בשיטה זו, אנו משתמשים בנתרן דאוקסיכולאט כדי לשבש את קרום התא ולשחרר את החלבונים הקשורים וחומצה 6-אמינוקפרואית כדי להמיס את חלבון הממברנה המשוחרר בצורתו המקורית. יתר על כן, אנו מראים ניתוח זימוגרפי של הג'לטינאזות הלפטוספירליות. גישה זו מספקת מסגרת רב-תכליתית לבידוד, טיהור ואפיון מטאלופרוטיזות, קולגנאזות וג'לטינזות מפתוגנים חיידקיים שונים.
מבוא
רוב הפתוגנים החיידקיים חייבים להיתקל במטריצה החוץ-תאית (ECM) של המארח במהלך פלישה והתפשטות לאיברי מטרה במהלך פתוגנזה. קולגן מהווה את המרכיב העיקרי ב-ECM של רקמות בעלי חיים1. ג'לטינזות הן קבוצה של פרוטאזות הפועלות על קולגן וצורתו ההידרוליזה, ג'לטין. פירוק ה-ECM מבוצע בעיקר על ידי קבוצה של פרוטאזות, הכוללת קולגנאזות וג'לטינאזות 2,3. פתוגנים חיידקיים משתמשים בקולגנאזות וג'לטינאזות כדי לעצב מחדש או לפרק את ה-ECM המארח לנוחיותם בפלישה ופתוגנזה 4,5. אנזימים מפרקי ECM חיידקיים הם מועמדים פוטנציאליים למיקוד חיסונים ותרופות5.
פרוטאזות חיידקיות נמצאות בצורות הפרשה וקשורות לממברנה 6,7,8,9. שיטות רבות למיצוי אנזימים תאיים אינן יעילות לבידוד ג'לטינזות חיידקיות וקולגנאזות הקשורות לממברנה, מכיוון שתהליכים אלה עשויים שלא לשמר ביעילות את הצורה המקורית של חלבונים הקשורים לממברנה. באופן דומה, ישנן שיטות ספציפיות לממברנה שמחלצות רק פרוטאזות וג'לטינאזות קשורות לממברנה. שיטות מיצוי קונבנציונליות עבור חלבונים כוללים, כולל חלבוני ממברנה, כוללות לרוב חומרי ניקוי ויונים כאוטרופיים, שיכולים להשפיע על הפעילות האנזימטית. הליך מיצוי השומר על פעילות האנזים ומסיסותו חיוני להפרדה אלקטרופורטית ומאפשר פיתוח זימוגרפיה לאיתור פעילות פרוטאז.
נתרן דאוקסיכולאט, חומר ניקוי יוני שיכול ליזוק תאים על ידי שיבוש קרום התא, מאפשר שחרור של תכולת התא וחלבון הממברנה. החומצה 6-אמינוקפרואית יכולה להמיס את חלבון הממברנה המשוחרר בצורתו המקורית. למסיסות על ידי חומצה 6-אמינוקפרואית יש יתרון בכך שהיא אינה משפיעה על אלקטרופורזה. כאן, אנו מדגימים מיצוי של חלבונים חיידקיים תאיים וממברנים באמצעות נתרן דאוקסיכולט וחומצה 6-אמינוקפרואית, ומייצבים אותם בצורתם המסיסה המקורית 10,11,12. שיטה זו מסיסה ביעילות חלבונים מהתא ומהממברנה שניתן להשתמש בהם ישירות מבלי להפריע לאלקטרופורזה13,14. ניתן לבצע אפיונים אנזימטיים שונים על ידי החלפת מעכבי הפרוטאז ויוני המתכת המשמשים במאגר ההפעלה, בהתאם ליישום.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. מיצוי ג'לטינאזות חיידקיות
הערה: ראה טבלה 1 להכנת ריאגנטים וחומרים.
- גדל את האורגניזם במדיום Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) המכיל 10 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר ב-30 מעלות צלזיוס. קח 10 מ"ל של תרבית לפטוספירה בשלב האמצע של הגידול המכיל 3.5 × 108 תאים/מ"ל עבור חלבוני המיצוי13,14. השתמש בספירה המיקרוסקופית הישירה עם תא ספירה של פטרוף-האוסר תחת מיקרוסקופ שדה כהה כדי לצפות בשלב אמצע העץ של הצמיחה.
- קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה ב-6,000 × גרם למשך 10 דקות, והשליכו את הסופרנטנט במיכל לטיהור על ידי חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
- העבירו את הגלולה על ידי תלייתה ב-1 מ"ל של מאגר כביסה לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב-6,000 × גרם למשך 5 דקות. חזור על שטיפה זו.
- חלץ את החלבון מהגלולה על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מאגר מיצוי לכדור לפטוספירה מ-10 מ"ל תרבית ומערבולת למשך 5 דקות. המשך במיצוי על ידי דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה. אוספים את החלבון המופק על ידי צנטריפוגה ב-15,000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, וזורקים את הגלולה למיכל לטיהור על ידי חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
- השתמש בתמצית החלבון ישירות לזימוגרפיה על ידי הוספת נפח שווה של מאגר דגימה פי 2.
- השתמש במבחן הערכת ברדפורד כדי לקבוע את ריכוז החלבון.
- אם ריכוז החלבון נמוך, זרז אותו באצטון על ידי ערבוב החלבון בנפח פי 4 של אצטון למשקעים ודגירה אותו למשך הלילה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. למחרת, צנטריפוגה את הדגימה ב-10,000 × גרם למשך 10 דקות, יבש את הגלולה המתקבלת באוויר והשהה אותה מחדש ב-PBS או ממיס אותה במאגר הרצוי ואחסן אותה ב-20 מעלות צלזיוס עד חודש. השתמש בליופיליזציה לאחסון או הובלה לטווח ארוך.
הערה: עקב פרוטאזות פעילות בתמצית והיעדר מעכבי פרוטאזות, חלבונים עלולים להתפרק בדגימה.
2. צימוגרפיה של ג'לטינזות
- הכנת ג'ל SDS PAGE עם קו-פולימר ג'לטין
- ג'ל מפנק
- הכינו את תערובת הג'ל הממיס על ידי הוספת הרכיבים בכמויות הנדרשות ליציקת הג'ל. ל-3.86 מ"ל מים בכוס של 50 מ"ל, הוסיפו 2.5 מ"ל של Tris-HCl (pH 8.8), 0.1 מ"ל מתמיסת מלאי הג'לטין 10%, 3.34 מ"ל של תמיסת אקרילאמיד-ביס (ABA), 0.1 מ"ל של 10% SDS, 0.006 מ"ל של TEMED ו-0.1 מ"ל של 10% אמוניום פרסולפט וערבבו היטב ללא קצף ובועות. המערכת שהוזכרה (לוחות זכוכית רגילים; 18X8 ס"מ) דורשת 10 מ"ל של תערובת ג'ל מתפרקת.
הערה: אם הג'לטין הוא מאליקוט קפוא, הפשירו אותו עד שהוא נמס כדי לנקות את התמיסה ללא גושים. הוסף אמוניום פרסולפט ממש לפני היציקה מכיוון שהפילמור יתחיל מיד לאחר הוספת אמוניום פרסולפט. - יוצקים את תערובת הג'ל הממיס לתא היציקה עד ~3-5 מ"מ מתחת לסימון לתחתית הבארות. הימנע מבועות אוויר.
- יוצקים לאט מעט מים לקבלת שכבה אחידה של 1 מ"מ על החלק העליון של הג'ל ומסירים בועות. הניחו לג'ל להתייצב למשך שעה.
הערה: ניתן לאשר היווצרות ג'ל על ידי חיפוש הפרדת פאזה בין שכבת המים לג'ל; לא ניתן לשפוך את הג'ל גם אם קלטת הג'ל מוטה.
- הכינו את תערובת הג'ל הממיס על ידי הוספת הרכיבים בכמויות הנדרשות ליציקת הג'ל. ל-3.86 מ"ל מים בכוס של 50 מ"ל, הוסיפו 2.5 מ"ל של Tris-HCl (pH 8.8), 0.1 מ"ל מתמיסת מלאי הג'לטין 10%, 3.34 מ"ל של תמיסת אקרילאמיד-ביס (ABA), 0.1 מ"ל של 10% SDS, 0.006 מ"ל של TEMED ו-0.1 מ"ל של 10% אמוניום פרסולפט וערבבו היטב ללא קצף ובועות. המערכת שהוזכרה (לוחות זכוכית רגילים; 18X8 ס"מ) דורשת 10 מ"ל של תערובת ג'ל מתפרקת.
- ג'ל בערימה
- הכן את ג'ל הערימה על ידי ערבוב הרכיבים הבאים. ל-1.84 מ"ל מים בכוס של 10 מ"ל, הוסיפו 2.5 מ"ל של Tris-Cl (pH 6.6), 0.35 מ"ל של ABA, 0.03 מ"ל של 10% SDS ו-0.006 מ"ל של TEMED. המערכת בגודל 8X10 ס"מ בעובי 1 מ"מ דורשת 3 מ"ל של תערובת ג'ל מתפרקת.
- מקלטת הג'ל, שפכו את המים שנוצרו בחלק העליון של הג'ל על ידי הטיית מערך הג'ל לצד אחד וספיגת המים שנאספו מהפינה באמצעות רצועת נייר פילטר צרה.
- הוסף 0.03 מ"ל של 10% APS לתערובת שהוזכרה בשלב 2.1.2.1 וערבב מבלי ליצור בועות.
- יוצקים את ג'ל הערימה על הג'ל המפרסק ומניחים מיד את המסרק במקומו מבלי ליצור בועות אוויר מתחת לשיני המסרק, ומשאירים עובי של 3-5 מ"מ של ג'ל ערימה בין הג'ל המפרסק לתחתית שיני המסרק. המתן לפחות 3 שעות לפילמור מלא וקישור צולב של הג'לטין.
- הוצא את המרווח התחתון וקבע את הג'ל על מנגנון האלקטרופורזה.
- הנח לאט את הג'ל במיכל המכיל מאגר אלקטרודות 1x, וודא שאין אוויר כלוא בתחתית הג'ל.
- ג'ל מפנק
- הכנת מדגם
- הוסף נפח שווה של מאגר דגימה לתמצית ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר ל-SDS להיקשר לחלבון. השתמש בדגימה המכילה 2 מיקרוליטר של סרום אנושי עם נפח שווה של מאגר דגימה כבקרה חיובית.
- טוען את המדגם
- טען בזהירות את הדגימה לבארות בעזרת פיפטה צרה או מזרק המילטון (0.5-1 מ"ל). הוסף בהדרגה מאגר אלקטרודות כדי למלא את החלקים הנותרים של הבארות, את החלק העליון של הג'ל ואת המיכל העליון של יחידת האלקטרופורזה מבלי להפריע לדגימות הטעונות.
הערה: יש לשטוף היטב את מזרק המילטון בין הדגימות כדי למנוע זיהום צולב.
- טען בזהירות את הדגימה לבארות בעזרת פיפטה צרה או מזרק המילטון (0.5-1 מ"ל). הוסף בהדרגה מאגר אלקטרודות כדי למלא את החלקים הנותרים של הבארות, את החלק העליון של הג'ל ואת המיכל העליון של יחידת האלקטרופורזה מבלי להפריע לדגימות הטעונות.
- הפעלת אלקטרופורזה
- התחל את האלקטרופורזה ב-6 mA לכל ג'ל והפעל עד שחזית הצבע נכנסת לג'ל הפתרון. לאחר מכן, הגדילו את הזרם ל-12 mA לכל ג'ל והמשיכו עד שחזית הצבע מגיעה ל-1 ס"מ מעל תחתית הג'ל.
הערה: זמן הריצה עשוי להשתנות בהתאם לריכוז ה-ABA המשמש וגודל חלבון המטרה.
- התחל את האלקטרופורזה ב-6 mA לכל ג'ל והפעל עד שחזית הצבע נכנסת לג'ל הפתרון. לאחר מכן, הגדילו את הזרם ל-12 mA לכל ג'ל והמשיכו עד שחזית הצבע מגיעה ל-1 ס"מ מעל תחתית הג'ל.
- סימון כיוון להקות התקן
- לאחר השלמת האלקטרופורזה, יש לפרק בזהירות את לוחות הזכוכית באמצעות כלי להפרדת צלחות או מרית פלסטיק ולסמן את כיוון טעינת הדגימה על ידי חיתוך הפינה התחתונה הימנית של הג'ל ולסמן את רצועות הסמן המוכתמות מראש על ידי ניקוב חורים בקרבת מקום או סריקת הג'ל.
- רנטורציה של אנזימים שנפתרו
- טבלו את הג'ל בתמיסת חידוש המכילה Triton X-100 במגש ג'ל ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מבלי לנער.
הערה: Triton X-100 משנה את החלבונים, מכיוון שג'ל הזימוגרמה המכיל חלבונים שנפתרו עלול לעבור דנטורציה ולאבד פעילות בנוכחות SDS.
- טבלו את הג'ל בתמיסת חידוש המכילה Triton X-100 במגש ג'ל ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מבלי לנער.
- אינקובציה לפעילות פרוטאז
- החלף את תמיסת החידוש במאגר הפעלה שטובל לחלוטין את הג'ל ודוגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות בחממה.
הערה: שנה את מאגר ההפעלה על ידי הוספת מעכבים או מפעילים של חלבונים מעניינים כדי לאפיין את פעילות הפרוטאינאז לפי הצורך.
- החלף את תמיסת החידוש במאגר הפעלה שטובל לחלוטין את הג'ל ודוגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות בחממה.
- מכתים של הזימוגרמה
- לאחר הדגירה, הסר את מאגר ההפעלה ושטוף את הג'ל לזמן קצר במים למשך דקה אחת כדי להסיר את שאריות הטריטון X-100 וכדי למנוע קצף במהלך הטלטול.
- הוסף את תמיסת הצביעה למגש, וודא שהג'ל שקוע לחלוטין. יש לנער את הג'ל בעדינות במהירות נמוכה כדי למנוע נזק. המשיכו להכתים עד שהג'ל הופך לכחול לחלוטין.
- הסר כתם עודף משטח הג'ל על ידי שטיפתו במים למשך דקה. מוסיפים את תמיסת העיכוב למגש ומנערים בעדינות. החלף את תמיסת ההימנעות בתמיסה טרייה מספר פעמים עד להשגת ניגודיות הרצועה הרצויה על הרקע הכחול.
הערה: בזמן ביצוע ההימנעות, יש לעקוב באופן רציף אחר הג'ל כדי לוודא שהוא לא נמנע לחלוטין, מה שמאפשר תצפית ורישום של הרצועות הפרוטאוליטיות. - סרוק את הג'ל במערכת תיעוד ג'ל או סורק מסמכים, וקבע את המסה המולקולרית של רצועות החלבון על ידי השוואתם לתקני החלבון.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התוצאה מציגה את הזימוגרמה של חלבון לפטוספירלי וג'לטינאזות מסרום אנושי. התוצאות, שמוצגות באיור 1, מייצגות פרוטאזות כפסים לבנים שקופים על רקע כחול. הרצועות מייצגות אזורים בהם הג'לטין הקופולימרי מתפרק ולכן אינו מוכתם, בעוד שאזורים אחרים של הג'ל כולו מוכתמים בכחול בגלל נוכחות הג'לטין. יתר על כן, זה מראה שלמרות שג'לטין הוא גם חלבון, הוא אינו נפלט באלקטרופורזה עקב קופולימריזציה עם אקרילאמיד. זה מראה את החשיבות של קופולימריזציה ושל ההרכב הנכון וזמן מספיק לפילמור.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במהלך הכנת ג'ל האקרילאמיד, הג'לטין מתפלמר יחד עם מטריצת הפולימר האקרילאמיד. כתוצאה מכך, הג'לטין הקו-פולימריזציה נשאר מקובע בתוך הג'ל ואינו נודד במהלך אלקטרופורזה, למרות שמדובר בחלבון. לאחר האלקטרופורזה, החלבונים המקומיים המופקים באמצעות דאוקסיכולט וחומצה 6-אמינוקפרואית נפרדים בהתאם למסה ולמטען שלהם. לאחר הסרת ה-SDS, חלבונים אלה עוברים טבע מחדש בנוכחות Triton X-100 וחוזרים לפעילותם. בתנאים טבעיים, בהתאם לדרישות של ג'לטינזות שונות, האנזים מפרק את הג'לטין הקו-פולימר, ולא ניתן לצבוע את האזור...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.
תודות
המחברים מביעים את תודתם לחטיבת SERB, המחלקה למדע וטכנולוגיה, ניו דלהי, על תמיכתם באמצעות No.SR/S0/HS/0108/2012 מענקים, ל-MGM
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 6-אמינוקפרואיקס | מרק | א2504 | |
| חומצה אצטית | סיגמא | 695092 | |
| אצטון | סיגמא | 32201 | |
| אקרילאמיד | סיגמא | א-3553 | |
| אמוניום פרסולפט | סיגמא | א-3678 | |
| ביס אקרילאמיד | סיגמא | M7279 | |
| אלבומין בסרום בקר שבר V (BSA) | סיגמא | א-8022 | |
| ברומופנול כחול | סיגמא | ב-8026 | |
| CaCl<תת>2 | מרק | C4901 | |
| Coomassie כחול מבריק | סיגמא | 1.12553 | |
| דאוקסיכולאט | סיגמא-אולדריץ' | D6750 | |
| Ellinghausen– מק'קאלו– ג'ונסון– האריס (EMJH) בינוני, דיפקו | דיפקו | 279410 | |
| ג'לטין | מרק | G9382 | |
| גליצרול | מרק | G5516 | |
| גליצין G8790 | סיגמא | G-8898 | |
| Leptospira interrogans serovar Copenhageni זן Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198) , נשמר במאגר הביולוגי של ICMR-RMRC Portblair | מתוחזק במאגר הביולוגי של ICMR-RMRC פורט בלייר | טמפרטורת גידול אופטימלית 30 מעלות; C | |
| מגנזיום כלוריד M8266 | סיגמא | M8266 | |
| מתנול | סיגמא | 17995-7 | |
| מי מלח חוצץ פוספט | סיגמא | עמ' 4417 | |
| הכלי להפרדת לוחות | וונדר וודגל | ||
| רוטור | תרמו-מדעי | FIBERLite F15 8x50 cy | |
| נתרן דודציל סולפט (SDS) | סיגמא | ל-4396 | |
| תמד | סיגמא | טי-9281 | |
| טריטון X-100 | סיגמא-אולדריץ' | T8787 | |
| בסיס טריזמה (TRIS) | סיגמא | T6066 |
מקורות
- Yue, B. Biology of the extracellular matrix. J Glaucoma. 23 (8 Suppl 1), S20-S23 (2014).
- Cabral-Pacheco, G. A., et al. The roles of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human diseases. Int J Mol Sci. 21 (24), 1-53 (2020).
- Ambili, M., Jayasree, K., Sudhakaran, P. R. 60K gelatinase involved in mammary gland involution is regulated by β-oestradiol. Biochim Biophys Acta. 1403 (3), 219-231 (1998).
- Zhang, Y. -Z., Ran, L. -Y., Li, C. -Y., Chen, X. -L. Diversity, structures, and collagen-degrading mechanisms of bacterial collagenolytic proteases. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Crit Rev Microbiol. 42 (1), 106-126 (2016).
- Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira. Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).
- Kramer, R. A., Zandwijken, D., Egmond, M. R., Dekker, N. In vitro folding, purification and characterization of Escherichia coli outer membrane protease OmpT. Eur J Biochem. 267 (3), 885-893 (2000).
- Kum, S. L., Ho, J. C. S., Parikh, A. N., Liedberg, B. Amphiphilic membrane environments regulate enzymatic behaviors of Salmonella outer membrane protease. ACS Bio Med Chem Au. 2 (1), 73-83 (2022).
- Sarma, A., et al. Extracellular proteome analysis shows the abundance of histidine kinase sensor protein, DNA helicase, putative lipoprotein containing peptidase M75 domain and peptidase C39 domain protein in Leptospira interrogans grown in EMJH medium. Pathogens. 10 (7), 852(2021).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Levy, D., Gulik, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. Phospholipid vesicle solubilization and reconstitution by detergents. Symmetrical analysis of the two processes using octaethylene glycol mono-n-dodecyl ether. Biochemistry. 29 (40), 9480-9488 (1990).
- Lichtenberg, D., Ahyayauch, H., Alonso, A., Goñi, F. M. Detergent solubilization of lipid bilayers: a balance of driving forces. Trends Biochem Sci. 38 (2), 85-93 (2013).
- Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
- Zeug, A., et al. Current microscopic methods for the neural ECM analysis. Prog Brain Res. 214, 287-312 (2014).
- Madathiparambil, M. G., et al. A zymography analysis of proteinase activity present in Leptospira. Curr Microbiol. 62 (3), 917-922 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
