הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

העשרת חלבונים תת-תאיים בלפטוספירה באמצעות גישת פיצול מבוססת Triton X-114

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67298

⸱

8 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, ICMR - Regional Medical Research Centre, 2Department of Chemistry & Molecular Biology, University of Gothenburg

במאמר זה

סיכום

למרות שלפרוקריוטים אין מערכת אורגנית, ישנם אזורים תת-תאיים עם חלבונים מקומיים. ניתוח כמותי ואיכותי של האנזימים והחלבונים באזורים התת-תאיים חשוב לפיתוח מטרות תרופות וחיסונים. כאן, אנו מדגימים את הפיצול התת-תאי של חלבונים לפטוספירליים באמצעות Triton X-114 וניתוחו.

תקציר

לפרוקריוטים חסרים אברונים תת-תאיים מדויקים אך מציגים אזורים מובהקים כגון ציטופלזמה, קרום פנימי, פריפלזמה וממברנה חיצונית, שם מאורגנים רוב הפונקציות הביוכימיות והפיזיולוגיות. לפיכך, הבנת המאפיינים הפונקציונליים של חלבונים מחייבת להבהיר את הלוקליזציה התת-תאית שלהם. עם זאת, מיצוי חלבונים תת-תאיים מחיידקים גרם שליליים מציב אתגרים בשל שכבת הפוספוליפידים המורכבת שלהם. למרות שטריטון X-114 הראה הבטחה במיצוי חלבון הממברנה החיצונית (OMP), פרוטוקול תמציתי נותר חמקמק. פרוטוקול זה מדגים זרימת עבודה שלב אחר שלב לחילוץ חלבונים תת-תאיים באמצעות הספירוכטה לפטוספירה כמודל. טכניקה זו, הכוללת פיצול תת-תאי והפרדת פאזה, מניבה שברים מובהקים עבור חלבוני ממברנה ציטופלזמית, חיצונית ופנימית. חומר הניקוי Triton X-114 מתאים היטב להפרדת פאזות בשל טמפרטורת נקודת הענן האופטימלית שלו (~22 מעלות צלזיוס) וריכוז המיצלה הקריטי הנמוך (CMC), המאפשר מיצוי וטיהור יעילים של חלבונים מקומיים עם דנטורציה מינימלית. יש לציין כי הניתוח חושף את היעילות בהבחנה בין חלבונים מהממברנות הפנימיות והחיצוניות הנבדלות מהציטופלזמה.

מבוא

ניתוחים פרוטאומיים תת-תאיים (SCP) ממלאים תפקיד מרכזי בהבהרת פתוגנזה חיידקית על ידי ניתוח הפרוטאום בתוך תאים תת-תאיים ספציפיים של תאי חיידקים. גישה פרוטאומיקה תת-תאית זו מאפיינת חלבוני חיידקים בתוך תאים נפרדים, מפחיתה את המורכבות על ידי אי הכללת חלבונים בשפע רב ומספקת תובנות לגבי ארגונם ושפעם היחסי 1,2. לדוגמה, תוך שימוש בטכניקות פיצול תת-תאי ו-LC-MS/MS, מחקר על Shewanella oneidensis חשף חלק ניכר מהפרוטאום שלו, וסיפק פרטים חיוניים לגבי ארכיטקטורת התאים של שפע התאים והחלבונים. מחקר זה משמש כמסגרת בסיסית לחקירות עוקבות של ארגון תת-תאי בתוך חיידקים גראם-שליליים3. בתחום הפתוגנזה החיידקית, תיחום הפרוטאום החיידקי במהלך זיהום in vivo הוא הכרחי להבנת המנגנונים המניעים פתוגניות4. חקירת הפרוטאום של סלמונלה תוך-תאית בתוך תאי אפיתל בשלבי זיהום שונים הייתה חיונית בחשיפת אסטרטגיות ההסתגלות המופעלות על ידי פתוגנים חיידקיים בסביבה התוך-תאית שלהם 4,5. אסטרטגיות SCP מספקות תובנות מקיפות לגבי הדינמיקה התאית על ידי הערכת שפע חלבונים וטרנסלוקציה בתוך תאים תאיים שונים. שיטה זו מאפשרת זיהוי נרחב של חלבונים מתאי חיידקים מגוונים, ומשפרת את הניתוח היסודי של פרוטאומים חיידקיים 6,7.

ההתפלגות התת-תאית של חלבונים לא רק מכתיבה את פעילותם התפקודית אלא גם משפרת את המגוון התפקודי שלהם8. לדוגמה, אנזימים מציגים מנגנוני ויסות ורמות פעילות מגוונים בהתאם ללוקליזציה התת-תאית שלהם. טרנסגלוטמינאזות (TGases), למשל, מציגות תפקידים מובהקים או מנגנוני ויסות על פני תאים תת-תאיים שונים בצינורות אבקה: TGases ציטופלזמיים משלבים אמינים ראשוניים בחלבונים ציטוזוליים (למשל, אקטין וטובולין) באופן תלוי Ca (2+), באינטראקציה עם השלד הציטולוגי; TGases ממברנה קשורים לגולגי ולממברנות פלזמה, מה שמרמז על תפקיד באספקה אקסוציטוטית; ו-TGases הקשורים לדופן התא מווסתים את הצמיחה האפיקלית על ידי מיקום עם סמני דופן התא. הבחנות פונקציונליות אלה מתווכות על ידי תפקידים ספציפיים לתא9. יתר על כן, תיקון חלבונים מחומצנים במעטפת החיידקים מדגיש את התפקיד הקריטי של מערכות אנזימים בתוך תאים ספציפיים החשופים למיני חמצן תגובתיים10. קחו למשל סינתאז תחמוצת החנקן האנדותל (eNOS), שהלוקליזציה התת-תאית שלו מווסתת על ידי שינויים בשומנים, ומשפיעה על האינטראקציה שלו עם ממברנות תאיות מגוונות11. מידור אנזימים שומר על סביבות מובחנות התורמות לאינטראקציות בין אנזימים וסובסטרטים, ובכך מקל על תהליכים מטבוליים ספציפיים לתא12.

לחיידקים ולפרוקריוטים אחרים אין אברונים תת-תאיים ברורים; ישנם אזורים נפרדים, כולל ציטופלזמה, קרום פנימי, פריפלזמה וממברנה חיצונית. רוב הפונקציות הביוכימיות והפיזיולוגיות באורגניזם מאורגנות בתאים תת-תאיים שונים13. לכן, לוקליזציה תת-תאית של חלבונים חשובה כדי לחזות את המאפיינים התפקודיים שלהם. עם זאת, מיצוי חלבונים תת-תאיים מחיידקים גרם שליליים מציב אתגרים בשל שכבת הפוספוליפידים המורכבת שלהם בעלת הממברנה הכפולה. שיטות מיצוי קונבנציונליות, המשתמשות בחומרי ניקוי כמו נתרן דודציל סולפט (SDS) ותוספים כגון אוריאה, פוגעות לעתים קרובות בשלמות חלבון הממברנה, ומשפיעות על ניתוחים במורד הזרם14,15. יתר על כן, הרכב השומנים ממלא תפקיד משמעותי בעיצוב השינויים הקונפורמטיביים של חלבוני הממברנה. הצלחת המסיסות תלויה בגורמים כמו יחס דטרגנטים-שומנים-חלבון, שכן התהליך כולל החדרת חומר ניקוי לשכבת השומנים הדו-שכבתית ואחריה מסיסות חלבון16. בחירת חומר הניקוי היא קריטית להמסת חלבוני הממברנה ביעילות, בהתחשב בגורמים כמו טמפרטורת נקודת ענן וזמן הדגירה17. סביבת השומנים יכולה להשפיע על השינויים הקונפורמטיביים של חלבוני הממברנה18,19.

חומרי ניקוי חיוניים למיצוי חלבוני ממברנה מממברנות ביולוגיות ולהבטחת מסיסותם בתמיסות מימיות, תנאי מוקדם לטיהור חלבון לאחר מכן. עם זאת, טיהור חלבוני הממברנה הוא לעתים קרובות מאתגר מכיוון שהם מוסרים מסביבת קרום השומנים המקורית שלהם ומונחים במאגר דטרגנטים, המשכפל רק חלקית את התכונות הפיזיקליות והכימיות של הממברנה20. לאחר המיצוי, חלבוני הממברנה מטוהרים בדרך כלל בתהליכים הבאים באמצעות דיאליזה, משקעי חלבון וכמה שיטות כרומטוגרפיה כחלבונים מסיסים20,21. הפרדת פאזות מציעה אלטרנטיבה רבת עוצמה או השלמה לפרוטוקולי טיהור מבוססי כרומטוגרפיה וניתן ליישם אותה ישירות על חלבונים מסיסים. בעיקרון, הפרדת פאזה מאפשרת לחלבוני ממברנה אינטגרליים להתחלק לפאזה מעשירה בחומר ניקוי וחלבונים ציטוזוליים בשלב המימי המדולדל בחומר הניקוי20,22. מספר חומרי ניקוי תוארו כמשמשים למסיסות של חלבוני ממברנה במחקרים קודמים20. אלה כוללים את משפחת טריטון (Triton X-100 ו-Triton X-114), משפחת Tween (Tween-20, & -80), חומרי ניקוי אניוניים, חומרי ניקוי קטיוניים, חומרי ניקוי פוליאוקסיאתילן גליקול מונואתר וכו', אך יש להם יתרונות וחסרונות מבחינת מבנה ותפקוד החלבונים20. התכונות הפיזיקוכימיות של חומרי ניקוי אלה משפיעות מאוד על חלוקת הפאזה והמסת חלבוני הממברנה20. חומרי ניקוי הם מולקולות אמפיפתיות עם קבוצת ראש קוטבית ושרשרת פחמימנים הידרופובית. בריכוזים נמוכים, הם קיימים כמונומרים במים. מעל ריכוז המיצלה הקריטי (CMC), הם יוצרים מיצלות שגודלן תלוי בסוג חומר הניקוי, כאשר מספר הצבירה מציין את מספר המולקולות למיצלה (נקרא גם משקל מולקולרי של מיצלה). גורם חשוב נוסף הוא "נקודת ענן" אליה ניתן להגיע על ידי שינוי הטמפרטורה של תמיסת ניקוי מיסלרית מימית שהופכת לעכורה ובסופו של דבר יוצרת שני שלבים נפרדים. תהליך זה ידוע בשם הפרדת פאזה או חילוץ נקודת ענן. CMC גבוה יכול להניב יותר חלבוני ממברנה המתאימים לריכוזים גבוהים של חומר ניקוי עם קשירה חלשה יותר, אותם ניתן לבצע דיאליזה כנגד מאגר עם ריכוז חומר ניקוי מוגדר20. עם זאת, הגעה ל-CMC גבוה ברוב חומרי הניקוי דורשת טמפרטורת נקודת ענן גבוהה, מה שיכול להשפיע על מבנה ותפקוד החלבון המופק ולהשפיע על תהליכים במורד הזרם. אפילו הריכוז הגבוה של חומר הניקוי בשלב זה עלול להזיק לחלבון וליצור בעיות בטיפול בנוזלים לפיפטינג בנפח מדויק עקב צמיגות גבוהה. לדוגמה, לטריטון X-100 יש תפוקה גבוהה של חלבוני ממברנה במיצלת חומר הניקוי מעל טמפרטורת נקודת הענן של 64-65 מעלות צלזיוס. כדי לשמור על טמפרטורת העבודה, 9%-23% (NH4)2כל כך4 או ניתן להפחית תוספת NaCl של 16%-25% לטמפרטורת החדר (RT), וכתוצאה מכך ריכוז גבוה של חומר ניקוי, מה שככל הנראה משפיע על יציבות החלבון. באופן דומה, מיצוי מבוסס טווין משתמש בטמפרטורת נקודת ענן גבוהה (76 מעלות צלזיוס עבור טווין 20 ו-93 מעלות צלזיוס עבור טווין 80). חומר ניקוי אניוני SDS משמש לעתים קרובות ביישומי חלבון, אך בדרך כלל מנטרל חלבונים20. החוקרים, שמטרתם לחלץ ביעילות חלבוני ממברנה, זיהו את Triton X-114 כחומר ניקוי קלאסי בשל טמפרטורת נקודת הענן האופטימלית שלו של כ-22 מעלות צלזיוס, אידיאלית למחקרי חלבון ממברנה. Triton X-114 הוצג לראשונה על ידי Bordier בשנת 1981, ומאז נעשה בו שימוש נרחב למיצוי וטיהור חלבון ממברנה במקורות מגוונים, כולל רקמות של בעלי חיים וצמחים כמו גם מיקרואורגניזמים20,22. ה-CMC הנמוך של Triton X-114 מונע את הסרתו בדיאליזה; עם זאת, אופיו המתון ממזער את הדנטורציה של חלבוני הממברנה בשלב המועשר בחומרי ניקוי. בנוסף, טריטון X-114 יוצר מיצלות קטנות יותר (n = 7-8) בהשוואה לטריטון X-10020. פרוטוקול המחקר של ג'יימס ג'י פרייד השתמש בטריטון X-114 למיצוי חלבון ממברנה מתאי יונקים מתורבתים. על ידי שימוש בטמפרטורת נקודת ענן מעל 20 מעלות צלזיוס (דגירה ב-30 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות), חלבוני ממברנה אינטגרליים מחולקים לשלב המועשר בחומר ניקוי, בעוד שחלבונים היקפיים וציטוזוליים התאוששו מהפאזה המימית המדולדלת בחומר הניקוי22. יתר על כן, David A. Haake et al. השתמשו ב-Triton X-114 כדי לחלץ חלבוני ממברנה חיצונית (OMPs) מ Leptospira interrogansעם ובלי CaCl,2 כתוסף23,24. מחקרים מאוחרים יותר אישרו כי Triton X-114 מחלץ ביעילות OMPs מתאים תת-תאיים ללא תוספים כמו גליצרול או CaCl225,26. עם זאת, הכללת מלחים יכולה להגדיל את ריכוז חומרי הניקוי, מה שעשוי להשפיע על מחקרי פרוטאום בקנה מידה גדול באמצעות ספקטרומטריית מסה בתפוקה גבוהה20. בעבודתנו על ניתוח פרוטאום תת-תאי, השתמשנו בטריטון X-114 בשילוב עם ספקטרומטריית מסה טנדם, והשגנו העשרה משמעותית בכל התאים התת-תאיים, כולל חלבוני ציטופלזמה, ממברנה פנימית וממברנה חיצונית25,26. המטרה העיקרית של הפרוטוקול הנוכחי היא להעשיר ביעילות תאים תת-תאיים של תא חיידקי גרם שלילי טיפוסי תוך מזעור בעיות בתהליכים במורד הזרם. בנוסף, הפרוטוקול נועד להיות חסכוני וחסכוני בזמן. כאן, אנו מרחיבים על הפרוטוקול האופטימלי שפותח במעבדה לבידוד חלבון תת-תאי ודנים בכל צוואר בקבוק שנתקל בו במהלך תהליך המיצוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה משתמש ב-Leptospira interrogans לניסוי מיצוי החלבון התת-תאי. בעוד שניתן להתאים פרוטוקול זה לשימוש עם חיידקים גראם שליליים אחרים, ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה בהתאם למטרות המחקר הספציפיות. טבלת החומרים וטבלה 1 מספקות את רשימת הכימיקלים והציוד, יחד עם הרכבי המאגרים ותמיסות הריאגנטים, בהתאמה, בעוד שטבלה 2 מתארת את מתקני המעבדה.

1. זן לפטוספירה ותנאי תרבית

  1. השיגו את קבוצת הסרו L. interrogans Icterohaemorrhagiae serovar Copenhageni זן Fiocruz L1-130.
    הערה: זן זה הושג מהמועצה ההודית למחקר רפואי - מרכז מחקר רפואי אזורי בפורט בלייר, הודו, מרכז המשתף פעולה עם ארגון הבריאות העולמי המתמחה באבחון, התייחסות, מחקר והכשרה של לפטוספירוזיס.
  2. גדל לפטוספירה (חיסון המכיל ~1 × 106 תאים/מ"ל) ב-50 מ"ל של מדיום Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) בתוספת אלבומין סרום בקר 1% (BSA).
  3. דגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עד שהתרבית מגיעה לשלב הגידול הבינוני (3.5 × 108 תאים/מ"ל). בדוק את הכמות של המדיום המתורבת על צלחות אגר מזינים כדי להבטיח שהמדיום יישאר לא מזוהם.
    הערה: השתמש במיקרוסקופ שדה כהה ובתא ספירה של פטרוף-האוסר כדי לספור את התאים. לפרטים, עיין במאמר27 שפורסם בעבר.

2. קצירת תאים

  1. לאחר תקופת דגירה של 7 ימים, העבירו שלושה שכפולים ביולוגיים של תרבית L. interrogans לצינורות צנטריפוגות בנפחים שווים (25 מ"ל כל אחד).
    הערה: תרבית לפטוספירה טופלה בתוך מכסה מנוע זרימת אוויר למינארי במתקן מעבדה BSL-2 במהלך ההעברה.
  2. צנטריפוגה כל הצינורות ב-2500 × גרם למשך 45 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שפכו בזהירות את הסופרנטנט לכוס המכילה חומר חיטוי והשליכו אותו. השתמש בגלולת התא לשלב הבא.
  3. שטפו את כדורי התא שלוש פעמים עם מי מלח עם פוספט (1 מ"ל בכל פעם) בתוספת 5 מ"מ MgCl2, צנטריפוגה ב-10,000 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס לאחר כל שטיפה.
    הערה: שלב זה יסיר את ה-BSA הלא רצוי הקיים במדיום EMJH מפני השטח של גלולת התא.

3. מיצוי חלבון תת תאי

  1. מיצוי טריטון X-114
    1. טפל בכדור תאי הלפטוספירה , המתקבל לאחר הקטיף, עם מאגר מיצוי המכיל 10 מ"מ Tris-Cl (pH 8), 1% טריטון X-114 ו-150 מ"מ NaCl בקצב של 1 מ"ל לכל גלולה שנקטפה (טבלה 1) (אופציונלי - קוקטייל מעכב פרוטאז יכול להוסיף בהתאם למטרת הניסוי).
      הערה: ההליך כולל פשוט חשיפת חיידקים לתמיסת דטרגנט על ידי הוספת מאגר המיצוי למיצוי חלבוני הממברנה.
    2. מערבבים בעדינות את מאגר החילוץ עם הגלולה באמצעות מיקרופיפטה מתחת ל-25 מעלות צלזיוס עד שהתמיסה הופכת לעכורה מבחינה ויזואלית.
    3. דוגרים את התערובת למשך הלילה בחום של 4 מעלות צלזיוס.
    4. מערבבים שוב את התמצית המתקבלת עם מיקרופיפטה וצנטריפוגה בחום של 15,000 × גרם למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    5. שפכו את הסופרנטנט לבקבוקון אחר ושמרו את כדור התא לתהליכי מיצוי הבאים.
      הערה: סופרנטנט זה מכיל תערובת של חלבונים הידרופיליים והידרופוביים בשפע מהציטופלזמה והממברנה החיצונית, והוא משמש להפרדת פאזות.
    6. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר המכיל 10 מ"מ Tris-Cl (pH 8), 8 M אוריאה, קוקטייל מעכב פרוטאז ו-1% נתרן דודציל סולפט (SDS) לגלולת התא.
    7. מערבל את התערובת ברציפות במשך 5 דקות לאחר הוספת מאגר המיצוי, ולאחר מכן דוגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות נוספות.
    8. צנטריפוגה את התערובת שוב ב-15,000 × גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ומייעדים את הסופרנטנט המתקבל כחלק הגלולה (P).
      הערה: נמצא כי חלק הגלולה מכיל שפע גבוה של חלבוני ממברנה פנימית בלפטוספירה25,26.
  2. מחיצת פאזה
    1. התאם את ריכוז הטריטון X-114 של הסופרנטנט המתקבל מהמיצוי ל-2%. לדוגמה, אם נפח ה-supernatant הוא 900 מיקרוליטר, הוסיפו 9 מיקרוליטר של חומר ניקוי Triton X-114 כדי להשיג את הריכוז הרצוי.
    2. דוגרים את התערובת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה, ואז צנטריפוגה בחום של 2000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה במהירות נמוכה זו יכולה להאיץ את הפרדת השלבים.
    3. אפשר לתערובת להיפרד לשני שלבים נפרדים: מימי וחומר ניקוי. הקפידו על צנטריפוגה נכונה במהירות נמוכה כדי להשיג הפרדה גלויה. במידת הצורך, הניחו לו לשבת דקה אחת לפני הבידוד. אם לא מתרחשת הפרדה, חזור על שלב 3.2.2 לפי הצורך.
      הערה: ניתן לצפות בהפרדת פאזה באופן חזותי, על ידי מדידות עכירות באמצעות ספקטרופוטומטר, או באמצעות פיזור אור סטטי. כדי להגביר את הדיוק של בדיקת נקודת הענן, הוסף לתמיסה צבע הידרופובי (5-Hexadecanoyl-aminoeosin) בריכוז של 500 ננומטר ונתח אותו באמצעות ספקטרוסקופיה אולטרה סגולה (UV-VIS).
    4. בודד את השלב המימי העליון על ידי ניקוב הממשק עם מזרק סטרילי והעברתו לבקבוקון נפרד. בודד את שלב חומר הניקוי התחתון באמצעות מיקרופיפטה ואחסן אותו בבקבוקון נפרד.
      הערה: טפל בזהירות בבקבוקון המכיל את שני השלבים במהלך תהליך ההפרדה. לפני ניקוב הבקבוקון עם מזרק, פתח את המכסה שלו כדי למנוע שבירת מחט או קושי בחילוץ השלב המימי העליון. שימוש במזרק מבטיח מדידת נפח מדויקת יותר של כל שלב לאחר ההפרדה וממזער זיהום צולב של חלבון בין השלבים.
    5. סמן את השלבים כמימיים (A) וחומר ניקוי (D) ואחסן אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

4. הערכת חלבון

  1. העריכו את ריכוזי החלבון של כל שבר טריטון X-114 (מימי, חומר ניקוי וגלולה) באמצעות מבחן ביסינצ'וניני28 או כל שיטה מתאימה אחרת.

5. אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) אלקטרופורזה של ג'ל

הערה: יש לטפל בחלבונים מכל חלק (מימי, חומר ניקוי, גלולה) עם בטא-מרקפטואתנול כדי להפחית אותם, ולאחר מכן להפריד אותם באמצעות 10% SDS-PAGE (שלושה שכפולים ביולוגיים). את המתכון ל-10% SDS-PAGE ניתן למצוא בטבלה 1. לצורך מיקוד דגימות חלבון, כל ניתוח פעילות אנזימים צריך להיעשות בצורה מקורית שניתן לפתור ב-PAGE מקורי.

  1. השעו מחדש את דגימת החלבון באצטון קר כקרח באמצעות פי ארבעה מנפח הדגימה. דגרו את התערובת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות, ולאחר מכן צנטריפוגה בחום של 14,000 × גרם למשך 10 דקות. בנוסף, השעו מחדש את חלק הגלולה ב-80% אצטון קר כקרח, ולאחר מכן דגרו למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה בחום של 14,000 × גרם למשך 10 דקות להסרת גבישי מלח אוריאה מוגזמים.
  2. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנט והניח את כדור החלבון באמבטיה יבשה עד שכל שאריות האצטון יתאדו מהבקבוקונים.
  3. דגרו את דגימות החלבון במאגר דגימה של 20 מיקרוליטר המכיל בטא-מרקפטואתנול, ולאחר מכן חממו אותן בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות באמבט מים או באמבטיה יבשה.
    הערה: כאן, דגימות החלבון מייצגות את השבר המימי (A) המכיל חלבונים ציטופלזמיים, את שבר חומר הניקוי (D) המכיל חלבוני ממברנה חיצונית, ואת שבר הגלולה (P) המכיל חלבוני ממברנה פנימית.
  4. טען את הדגימות המכילות A, D ו-P לכל באר של ג'ל 10% SDS-PAGE לצד סמן חלבון צבוע מראש (M) וחלבון כולל (T).
    הערה: ניתן להכין את החלבון הכולל על ידי משיכת כל שלושת השברים יחד לבקבוקון יחיד באמצעות 20 מיקרוליטר של מאגר דגימה.
  5. השתמש במאגר אלקטרודות 1x במנגנון האלקטרופורזה (טבלה 1). הגדר את פרמטרי ריצת הג'ל ל-6 mA עבור ג'ל הערימה ו-12 mA עבור הג'ל הפתרון. הפעל את האלקטרופורזה ב-RT.
  6. צבעו את הג'ל עם Coomassie Brilliant Blue G או כתמי חלבון אחרים הזמינים במעבדה.

6. אימונובלוטינג

  1. לאחר הפרדת הג'ל, דגרו את הג'ל הלא מוכתם במאגר ההעברה (25 מ"מ בסיס טריס, 190 מ"מ גליצין, 20% מתנול) למשך 5 דקות.
  2. דגרו ניירות ספיגה בגודל מתאים במאגר העברת אימונובלוט למשך 5 דקות, ולאחר מכן הרכיבו אותם כשכבה התחתונה של הכריך.
  3. השתמש בממברנות פלואוריד פוליווינילידן (PVDF) או ממברנות ניטרוצלולוזה כדי להעביר חלבונים מהג'לים הלא מוכתמים. התחל בטבילת קרום ה-PVDF במתנול מוחלט למשך 30 שניות, ולאחר מכן השרייה של 5 דקות במאגר העברת ה-Immunoblot. לאחר מכן, שלבו אותו בכריך הספיגה.
  4. כעת, הניחו את הג'ל הלא מוכתם שהוסר ממאגר ההעברה והשתמשו בו בכריך ספיגת ההעברה.
  5. לבסוף, כסו את הכריך על ידי הנחתו על נייר סופג אחר מעליו, שחררו את בועות האוויר הכלואות בעזרת גלגלת כתמים, והפעילו את ההעברה בשיטת העברה חצי יבשה.
    הערה: ניתן להשתמש בגישות אחרות, כולל העברה יבשה ורטובה, בהתאם למתקני המעבדה.
  6. טבלו את הממברנה במאגר חוסם (8% חלב ללא שומן ב-TBS-0.1% Tween 20 [TBS-T]) למשך שעתיים, ולאחר מכן דגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם נוגד חד-ספציפי* המכוון לליפופרוטאין Leptospira LipL41 (1:5000), או חלבון ליבה 35 kDa (FlaB) (1:4000) (*נוגדן מותאם אישית). שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם TBS-T, ואפשרו לכל שטיפה להמשיך במשך 5 דקות.
    הערה: יש להשתמש בכל נוגדן מעניין. גורם הדילול של הנוגדנים עשוי להשתנות.
  7. דגרו את הממברנה עם נוגדן משני נגד ארנב עכבר מצומד עם חזרת פרוקסידאז (HRP) IgG (דילול 1:20000) למשך שעתיים ב-RT.
  8. חשוף את הממברנה למגיב האלקטרוכימילומינסנציה (ECL) כדי לדמיין רצועות חלבון.
  9. הנח את הממברנה מתחת לסרט רנטגן רגיש לכחול בתוך חדר חשוך.
    הערה: ניתן להשתמש גם בכל שיטות פיתוח אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בניסוי זה, השתמשנו בספירוכטה לפטוספירה כאורגניזם מודל לחילוץ תאים תת-תאיים. השתמשנו במתודולוגיה אסטרטגית המעוגנת בנקודת ענן ובריכוז תפטיר קריטי (CMC), תוך רתימת היעילות של Triton X-114, חומר ניקוי לא-יוני (איור 1). לפני שנמשיך הלאה, נערכה הערכת חלבון כדי להעריך את הריכוז בכל שבר עבור שכפול ביולוגי יחיד. צפינו ביחס ריכוז של 3:1:1.3 בשברי מימיים (A): חומר ניקוי (D): גלולה (P), שנצפו באופן עקבי בכל אצווה של שכפולים ביולוגיים. דגימות החלבון שחולצו מכל שבר של Triton X-114 עברו ניתוח SDS-...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

טכניקות פיצול תת-תאיות ממלאות תפקיד מרכזי בבידוד של מרכיבים תאיים נפרדים לניתוח שלאחר מכן. Triton X-114, חומר ניקוי לא יוני, נמצא בשימוש נפוץ בטכניקות אלה בגלל יכולתו לחלק דגימות לשלבים נפרדים, מה שמאפשר הפרדה של רכיבים סלולריים שונים32. Triton X-114 היה שימושי במיוחד במיצוי חלבוני ממברנה (בצורה מקורית) ממגוון מקורות, כולל שלפוחיות חוץ-תאיות בשתן, ממברנות גולגי, ממברנות חיידקים וחלבוני הממברנה החיצונית של פתוגנים כמו Borrelia burgdorferi ו-Leptospira ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים הצהירו שאין להם אינטרסים פיננסיים מנוגדים.

תודות

המחברים מביעים את תודתם הכנה למועצה ההודית למחקר רפואי, ניו דלהי, הודו, על התמיכה הכספית הניתנת באמצעות מענק מס. Leptos/22/2013-ECD-I-2012-2400 והמחלקה למדע וטכנולוגיה, מועצת המחקר למדע והנדסה, ניו דלהי, הודו, על תמיכתם במימון באמצעות מענק מס. SR/SO/HS/0108/2012 ל-M.G.M. בנוסף, המחברים מביעים את הערכתם למועצה ההודית למחקר רפואי, ניו דלהי, הודו, על הענקת מלגת מחקר בכירה באמצעות מענק מס. ICMR-SRF 2020-0756/PROTEOMICS- BMS, מלגה/131/2022-ECD-II-2021-8230 ל-H.P ו-AS בהתאמה ולמחלקה למדע וטכנולוגיה, מועצת המחקר למדע והנדסה, ניו דלהי, הודו, מענק מס'. PDF/2017/000343 ל-S.A.D.C.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אצטית  סיגמא  695092
אצטון    סיגמא  32201
אקרילאמיד    סיגמא  א-3553
אמוניום פרסולפט    סיגמא  א-3678
מאזניים  שימדוז  Z741079
ביס אקרילאמיד    סיגמא  M7279
אלבומין בסרום בקר שבר V (BSA)  סיגמא  א-8022
ברומופנול כחול    סיגמא  ב-8026
צינור צנטריפוגה (50 מ"ל)טרסונס500020
בקבוק חרוטי עם מכסה (150 מ"ל)טרסונס431030
צנטריפוגה לקירור  אפנדורף  5355316200
Coomassie כחול מבריק    סיגמא1.12553
מיקרוסקופ שדה אפל  צייס  גמב"ה37081
מגבונים עדינים למשימותמדע קימטק34155
אמבטיה יבשה  אפנדורף  535531620
Ellinghausen– מק'קאלו– ג'ונסון– האריס (EMJH) בינוני, דיפקו  דיפקו  279410
מגשי ג'ל: מגשי ג'ל חייבים להיות רחבים יותר ב-2 ס"מ לפחות ובעל משטח חלק ושטוח עם מכסה.   הופר  לא ישים
זכוכית (150 מ"ל)טרסונס421030
גליצין G8790    סיגמא  G-8898
נייר סינון אימובילוןמיליפורIBFP0813C
התקנה חצי יבשה של Immunoblot  אטא  AE-6675
אינקובטור - לדגירה של מגשי הג'ל למשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.  איילה  SLI-700
זרימת אוויר למינרית  לא ישים  לא ישים
לומינול  סיגמא  09253
מגנזיום כלוריד M8266  סיגמא  M8266
בוחש מגנטי  טרסונס  6040
מתנול    סיגמא  17995-7
קצות מיקרופיפטה (10 ומיקרו; L– 10 מ"ל)אקסיג'ןT-10, T-200-C, T-1000-C, T-10ML-C
מיקרופיפטות  אפנדורף  EP2231300010
מיקרו-צינורות (נעילה בטוחה של 1.5 מ"ל)אפנדורףEP022363212
מיני ספין  ג'נקסי  דור מיני-6K
קורא רב-מצביב.מ.ג. לאבטק  S/N 413-3877
חלב ללא שומן, בקרסיגמא-אולדריץ'M7409
חומצה P-קומרית    סיגמא  C9008
מי מלח חוצץ פוספט    סיגמאעמ' 4417 
מקרר  LG  GC-B217BLJ2
נדנדה - נדנדה או שייקר סיבובי במהירות נמוכה להכתמת הג'ל.  טרסונס  4080
הגדרת SDS-PAGE- מכשיר אלקטרופורזה  הופר בע"מ  SE300-10A-1.0  דגם הופר ' miniVE' שיכול ליצוק ג'ל בגודל 10 ס"מ על 8 ס"מ בעובי 1 מ"מ.
נתרן כלורי      סיגמא  5886
נתרן דודציל סולפט (SDS)    סיגמא  ל-4396
תמד    סיגמא  טי-9281
טריטון X-114    סיגמא648468
בסיס Trizma (TRIS) T6066    סיגמא  T6066
מערבולת  טרסונס  3020

מקורות

  1. Curreem, S. O. T., Watt, R. M., Lau, S. K. P., Woo, P. C. Y. Two-dimensional gel electrophoresis in bacterial proteomics. Protein Cell. 3 (5), 346-363 (2012).
  2. King, B. R., Latham, L., Guda, C. Estimation of subcellular proteomes in bacterial species. Open Appl Informatics J. 3 (1), 1-11 (2009).
  3. Brown, R. N., Romine, M. F., Schepmoes, A. A., Smith, R. D., Lipton, M. S. Mapping the subcellular proteome of Shewanella oneidensis MR-1 using Sarkosyl-based fractionation and LC−MS/MS protein identification. J Proteome Res. 9 (9), 4454-4463 (2010).
  4. Cash, P. Investigating pathogen biology at the level of the proteome. Proteomics. 11 (15), 3190-3202 (2011).
  5. Liu, Y., et al. Temporal regulation of a Salmonella Typhimurium virulence factor by the transcriptional regulator YdcR. Mol Cell Proteomics. 16 (9), 1683-1693 (2017).
  6. Rey, S., Gardy, J. L., Brinkman, F. S. Assessing the precision of high-throughput computational and laboratory approaches for the genome-wide identification of protein subcellular localization in bacteria. BMC Genomics. 6 (1), 162(2005).
  7. Lietzén, N., et al. Quantitative subcellular proteome and secretome profiling of influenza A virus-infected human primary macrophages. PLoS Pathog. 7 (5), e1001340(2011).
  8. Arioka, Y., Watanabe, A., Saito, K., Yamada, Y. Activation-induced cytidine deaminase alters the subcellular localization of Tet family proteins. PLoS One. 7 (9), e45031(2012).
  9. Del Duca, S., Faleri, C., Iorio, R. A., Cresti, M., Serafini-Fracassini, D., Cai, G. Distribution of transglutaminase in pear pollen tubes in relation to cytoskeleton and membrane dynamics. Plant Physiol. 161 (4), 1706-1721 (2013).
  10. Gennaris, A., et al. Repairing oxidized proteins in the bacterial envelope using respiratory chain electrons. Nature. 528 (7582), 409-412 (2015).
  11. Schilling, K., et al. Translocation of endothelial nitric-oxide synthase involves a ternary complex with caveolin-1 and NOSTRIN. Mol Biol Cell. 17 (9), 3870-3880 (2006).
  12. Mintz-Oron, S., Aharoni, A., Ruppin, E., Shlomi, T. Network-based prediction of metabolic enzymes' subcellular localization. Bioinformatics. 25 (12), i247-i252 (2009).
  13. Phukan, H., Sarma, A., Rex, D. A. B., Rai, A. B., Prasad, T. S. K., Madanan, M. G. Unique posttranslational modification sites of acetylation, citrullination, glutarylation, and phosphorylation are found to be specific to the proteins partitioned in the Triton X-114 fractions of Leptospira. ACS Omega. 7 (22), 18569-18576 (2022).
  14. Tinrat, S. Preliminary phytochemical analysis, antibacterial and anti-biofilm activities of Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe extracts. Malaysian J Microbiol. 18 (4), 344-353 (2022).
  15. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), a000414-a000414 (2010).
  16. Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Curr Protoc Protein Sci. 53 (1), ps0408s53(2008).
  17. Santos, H. deL., Ciancaglini, P. A practical approach to the choice of a suitable detergent and optimal conditions for solubilizing a membrane protein. Biochem Educ. 28 (3), 178-182 (2000).
  18. Picard, M., Duval-Terrié, C., Dé, E., Champeil, P. Stabilization of membranes upon interaction of amphipathic polymers with membrane proteins. Protein Sci. 13 (11), 3056-3058 (2004).
  19. Rice, A. J., Alvarez, F. J., Davidson, A. L., Pinkett, H. W. Effects of lipid environment on the conformational changes of an ABC importer. Channels. 8 (4), 327-333 (2014).
  20. Arnold, T., Linke, D. Phase separation in the isolation and purification of membrane proteins. BioTechniques. 43 (4), 427-440 (2007).
  21. Fricke, B. Phase separation of nonionic detergents by salt addition and its application to membrane proteins. Anal Biochem. 212 (1), 154-159 (1993).
  22. Pryde, J. G. Partitioning of proteins in Triton X-114. In: Methods in Molecular Biology. , Humana Press. Totowa. (2000).
  23. Haake, D. A., Walker, E. M., Blanco, D. R., Bolin, C. A., Miller, J. N., Lovett, M. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59 (3), 1131-1140 (1991).
  24. Haake, D. A., et al. The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection. Infect Immun. 68 (4), 2276-2285 (2000).
  25. Thoduvayil, S., et al. Triton X-114 fractionated subcellular proteome of Leptospira interrogans shows selective enrichment of pathogenic and outer membrane proteins in the detergent fraction. Proteomics. 20 (19-20), (2020).
  26. Phukan, H., et al. Physiological temperature and osmotic changes drive dynamic proteome alterations in the leptospiral outer membrane and enhance protein export systems. J Proteome Res. 22 (11), 3447-3463 (2023).
  27. Murray, G. L., King, A. M., Srikram, A., Sermswan, R. W., Adler, B. Use of luminescent Leptospira interrogans for enumeration in biological assays. J Clin Microbiol. 48 (6), 2037-2042 (2010).
  28. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  29. Shang, E. S., Summers, T. A., Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding LipL41, a surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 64 (6), 2322-2330 (1996).
  30. Evangelista, K. V., Hahn, B., Wunder, E. A. Jr, Ko, A. I., Haake, D. A., Coburn, J. Identification of cell-binding adhesins of Leptospira interrogans. PLoS Negl Trop Dis. 8 (10), e0003215(2014).
  31. Picardeau, M. Virulence of the zoonotic agent of leptospirosis: still terra incognita. Nat Rev Microbiol. 15 (5), 297-307 (2017).
  32. Hu, S., et al. Purification and identification of membrane proteins from urinary extracellular vesicles using Triton X-114 phase partitioning. J Proteome Res. 17 (1), 86-96 (2018).
  33. Radolf, J. D., Chamberlain, N. R., Clausell, A., Norgard, M. V. Identification and localization of integral membrane proteins of virulent Treponema pallidum subsp. pallidum by phase partitioning with the nonionic detergent Triton X-114. Infect Immun. 56 (2), 490-498 (1988).
  34. Nally, J. E., Whitelegge, J. P., Bassilian, S., Blanco, D. R., Lovett, M. A. Characterization of the outer membrane proteome of Leptospira interrogans expressed during acute lethal infection. Infect Immun. 75 (2), 766-773 (2007).
  35. Crother, T. R., Nally, J. E. Analysis of bacterial membrane proteins produced during mammalian infection using hydrophobic antigen tissue Triton extraction (HATTREX). Curr Protoc Microbiol. 9 (1), mc1201s9(2008).
  36. Casey, T. M., Meade, J. L., Hewitt, E. W. Organelle proteomics. Mol Cell Proteomics. 6 (5), 767-780 (2007).
  37. Bell, A. W., et al. Proteomics characterization of abundant Golgi membrane proteins. J Biol Chem. 276 (7), 5152-5165 (2001).
  38. Boonciew, P., et al. Improved antibody detection for canine leptospirosis: ELISAs modified using local leptospiral serovar isolates from asymptomatic dogs. Animals. 14 (6), (2024).
  39. Nogueira, S. V., et al. Leptospira interrogans enolase is secreted extracellularly and interacts with plasminogen. PLoS One. 8 (10), e0078150(2013).
  40. Riazi, M., Zainul, F. Z., Bahaman, A. R., Amran, F., Khalilpour, A. Role of 72 kDa protein of Leptospira interrogans. as a diagnostic marker in acute leptospirosis. Indian J Med Res. 139 (2), 308-313 (2014).
  41. Domingos, R. F., et al. Features of two proteins of Leptospira interrogans with potential role in host-pathogen interactions. BMC Microbiol. 12, 50(2012).
  42. Dhandapani, G., et al. Proteomic approach and expression analysis revealed the differential expression of predicted leptospiral proteases capable of ECM degradation. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1866 (5-6), 712-721 (2018).
  43. Matsunaga, J., Werneid, K., Zuerner, R. L., Frank, A., Haake, D. A. LipL46 is a novel surface-exposed lipoprotein expressed during leptospiral dissemination in the mammalian host. Microbiology. 152 (12), 3777-3786 (2006).
  44. Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4 (6), e6071(2009).
  45. Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira. Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

FractionationTriton X 114LeptospiraSDS PAGE
העשרת חלבונים תת-תאיים בלפטוספירה באמצעות גישת פיצול מבוססת Triton X-114
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.