התקפים משפיעים לרעה על תפקודים שונים ועל איכות החיים. תולעי פלנריה נחשפו לריכוזים משתנים של פרכוסים כימיים כדי להעריך את פנוטיפים ההתקפים ואת התנועתיות המשבשת שלהן. מחקר זה מציע להשתמש בתולעי פלנריה כמודל להתקפים חריפים בבני אדם ויש לו משמעות בפיתוח תרופות לאפילפסיה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
אפילפסיה היא בין ההפרעות הנוירולוגיות השכיחות ביותר המאופיינות בהתקפים ספונטניים חוזרים ונשנים. התקפים מייצגים ביטוי קליני של פעילות תאים עצביים בלתי מבוקרת ומסונכרנת יתר על המידה. מידת הנזק המוחי מהתקפים תלויה במשך הזמן ובעוצמה שלהם. למרבה הצער, אין תרופה יעילה לאפילפסיה. מטרת מחקר זה היא להעריך האם תולעת הפלנריה Dugesia dorotocephala יכולה לשמש כמודל לסיוע בזיהוי ופיתוח טיפולים לאפילפסיה שיכולים להתמקד בהתקפים חריפים. כיום, מודלים שונים, כמו מודלים ימיים, משמשים להערכת תרופות נגד פרכוסים (ASM). עם זאת, הם יקרים מאוד, ויש חששות אתיים. לחלופין, מודלים של חסרי חוליות מציעים הזדמנות מחקר חסכונית בתהליך גילוי התרופות עבור ASM. Planaria שייכים למשפחת התולעים השטוחות ומאכלסים מים מתוקים ימיים וסביבות יבשתיות. Dugesia dorotocephala הוא המין הדומיננטי של פלנריה מימית ברחבי צפון אמריקה. D. dorotocephala מוצג כמודל חסרי חוליות בר-קיימא למחקרי אפילפסיה בשל עלות-תועלת, נוירונים דמויי חוליות והתנהגויות הניתנות לכימות, בניגוד לחסרי חוליות אחרים או בעלי חיים גדולים יותר. הם שימשו במחקרי פרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה סביבתית שונים הקשורים לגיל, זיכרון והתחדשות. במחקר זה, פלנריה נחשפו לריכוזים שונים של פילוקרפין, תרופה כימותרפית נפוצה כדי לחקור את התנהגותם בעת החשיפה. לאחר התצפית, הפלנריה הורדמה ונשמרה בתמיסת פורמלדהיד או גולגי להערכה נוירו-היסטולוגית. שישה פנוטיפים התנהגותיים מובהקים נצפו במישור: תנודות גב, תנודות ראש, הרחבת גב הזנב, צורת C, תנועת ראש ותנועת זנב. תדירות התנודות הגביות גדלה באופן משמעותי בקרב קבוצות הניסוי בהשוואה לקבוצת הביקורת והפגינו תלות במינון. בנוסף, פילוקרפין שיבש את התנועתיות של הפלנריה. התקפים הנגרמים על ידי פילוקרפין בפלנריה יכולים לשמש מודל להערכת התקפים חריפים ותרופות נגד פרכוסים, החיוניים לפיתוח התערבויות טיפוליות לחולים אנושיים הסובלים מאפילפסיה.
מבוא
אפילפסיה, המאופיינת בשני התקפים או יותר תוך 24 שעות ללא סיבה נראית לעין, משפיעה על ~50 מיליון אנשים ברחבי העולם1. ביניהם, 10-15 מיליון אנשים מדווחים על אפילפסיה עמידה לתרופות2. לכן, חקירת תרופות לאפילפסיה היא קריטית. המצב כרוך באפיזודות קצרות של תנועה בלתי רצונית חלקית או כללית, החל מבהייה ריקה ועד התקשות ורעד של הגוף, והוא קשור לנחשול של פעילות חשמלית במוח3.
מבחינה היסטורית, מחקר האפילפסיה הסתמך על מכרסמים ויונקים אחרים בשל הדמיון האבולוציוני שלהם לבני אדם. עם זאת, שיטות אלו עלולות לגזול זמן ויקר, מה שמחייב גישה חלופית 4,5. יצורים שאינם יונקים כמו זבובי פירות, עלוקות, ראשנים, דגי זברה ותולעים עגולות שימשו במחקרים והראו תוצאות מבטיחות6. יתר על כן, הוכח כי פלנריה יכולה לספק מודל מחקר גנומי השוואתי בין גנום חסר חוליות לגנום אנושי לצד היכולת לבדוק תרופות פרו-פרכוסים, תרופות נגד פרכוסים (ASM) ודפוסי התנהגות6. Planaria (Phylum Platyhelminthes), הידועים כתולעים שטוחות וחברים במחלקת הטורבלריה, ידועים בעיקר ביכולות ההתחדשות שלהם; עם זאת, חקירה זו מתמקדת בתגובתם לחומרים מעוררי התקפים.
פלנריה חולקת מנגנונים נוירולוגיים בסיסיים עם בני אדם, כגון היענות לסרוטונין ודופמין, מראה דמיון של 95% לגנים הקשורים למערכת העצבים במוח היונקים ובעלת מבנה מוח מוכר7. בנוסף, הם מציגים תנועות הניתנות לצפייה בתנאי מעבדה והם חסכוניים, חסכוניים בזמן ואתיים בהשוואה למכרסמים או יונקים אחרים. התנהגויות נצפות אלה, כגון תנועות דמויות בורג, דמויות C וצורת אגוז, תועדו בהרחבה במשך עשרות שנים וקשורות לחומרים כמו קוקאין, ניקוטין, דופמין ופילוקרפין 7,8,9,10,11,12,13,14. לפיכך, פלנריה מתגלה כמודל בר-קיימא למחקר תרופות לאפילפסיה בבני אדם.
שיטה זו נועדה לאפיין נוירונים של פלנריה שנחשפו לפילוקרפין באמצעות כתם גולגי. כתם גולגי משמש להדמיית נוירונים במיקרוסקופ אור ושימש לחקירה אם שינוי במורפולוגיה קשור להתקפים 15,16,17. בספרות הנוכחית אין עדויות לכך שצביעת גולגי בוצעה על מוחות פלנריים. למרות שמחקרים קודמים תיעדו השפעות פרמקולוגיות על ידי התבוננות בפנוטיפים התנהגותיים, כתב יד זה הוא הראשון לאפיין את הנוירונים של פלנריה שנחשפו לפילוקרפין באמצעות צביעת גולגי11,18. טכניקה זו מוכיחה את עצמה כבעלת ערך בהדמיה והבנה של השינויים המורפולוגיים הקשורים להתקפים. מחקר זה ציין עלייה משמעותית בתדירות התנהגות התנודות הגביות המתנודדות בתולעים מישוריות ככל שריכוז הפילוקרפין גדל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: תכנון הניסוי הכולל מתואר באיור 1.
1. בדיקת פנוטיפ התנהגות
- יש להכין ריכוזים של 1 מ"מ ו-2 מ"מ פילוקרפין מומס במי מעיין וכן בקרה במי מעיינות בלבד.
- פיפטה 3 מ"ל מכל תמיסה לצלחת באר בגודל 4X3, כאשר כל שורה מייצגת ריכוז שונה של פילוקרפין.
- הנח Dugesia dorotocephala אחד שגדל במעבדה בן כשבועיים בכל אחת מ-12 הבארות באמצעות פיפטת העברה עם קצה חתוך.
הערה: חותכים את הקצה כך שהקצה יהיה גדול מספיק כדי להתאים למישור מבלי לפגוע בו. - רשום את התנהגות הפלנריה למשך שעה אחת באמצעות כל מצלמה המתעדת היטב את ההתנהגויות וניתנת לצפייה בעין האנושית, הממוקמת מעל צלחת הבאר בגודל 4X3 בתנאי תאורה פנימיים רגילים.
- חזור על שלבים 1.1-1.4 עם ריכוזים של 3 מ"מ, 4 מ"מ ו-6 מ"מ פילוקרפין מומס במי מעיין.
2. ניתוח תנועתיות
הערה: התנהגויות מישוריות תועדו בבארות בקוטר 2.5 ס"מ. הקלטות הווידיאו באורך שעה פוצלו לחלקים של 30 דקות ונחתכו באמצעות תוכנה מסחרית לניתוח פלנריה בנפרד.
- התחל ניסוי חדש באמצעות תוכנה אוטומטית לניתוח התנהגות. פתח את מערכת מעקב ההתנהגות האוטומטית המשופרת. לחץ על חדש תחת ניסוי חדש. תן שם לניסוי.
- הגדר את הגדרות הניסוי כמתואר להלן.
- לחץ על הגדרות ניסוי בהנחיית התפריט. ודא שההגדרות הן ברירת מחדל: מקור וידאו (מקובץ וידאו), מספר זירות (1), תכונות במעקב (זיהוי נקודת מרכז), טכניקת זיהוי נקודת גוף (מבוססת קווי מתאר), אפשרויות ניתוח (ללא), יחידות (ס"מ, שניות, מעלות).
- הגדר את הגדרות הזירה כמתואר להלן.
- לחץ על הגדרות זירה תחת הכרטיסייה הגדרות זירה בחלונית ההתקנה השמאלית העליונה. כאשר תתבקש להעלות סרטון, בחר צילומים מוקלטים של פלנריה ממיקום הקובץ המאוחסן. לאחר בחירת הסרטון, לחץ על תפוס
- עקוב אחר ההנחיות בחלונית השמאלית העליונה של המסך. לחץ על 1. צייר קנה מידה כדי לכייל. בתמונת הווידיאו של הבאר, גרור קו קנה מידה מקצה לקצה של באר הדגימה. הזן את המרחק בעולם האמיתי של הבאר (2.5 ס"מ).
- לחץ על 2. בחר צורה וצייר זירה. ודא ש-Arena 1 נבחר בחלונית הימנית. הזז את סמן העכבר לאמצע העליון של המסך ולחץ על סמל העיגול.
- צור מעגל בתמונת הווידאו שהועלתה על ידי גרירה מהיקף אחד של הזירה למשנהו. ודא שהזירה נמצאת באזור הכתום. התאם את הצורה כך שתתאים לזירה. ודא שתווית Arena 1 נמצאת בגבולות הזירה.
- בתחתית החלונית הימנית, שנה את הצורה, הגודל והמיקום (רוחב: 2.75, גובה: 2.75, X: 0, Y: 0) למידות הרצויות.
- לחץ על 3. בחר אזורי צורה וצייר (אופציונלי). קבוצת אזור 1 בחלונית הימנית תיבחר כעת. הזז את סמן העכבר לאמצע העליון של המסך ובחר את סמל העיגול. צור עיגול קטן יותר בתמונת הזירה על ידי גרירתו פנימה.
- בחלונית הימנית התחתונה, שנה צורה, גודל ומיקום למידות הרצויות (רוחב: 1.75, גובה: 1.75, X:0, Y: 0).
- לחץ/י על הכפתור ״הוסף תווית אזור ״ באותה שורת תפריטים כמו העיגול. לחץ במרכז העיגול הקטן יותר. לחץ לחיצה ימנית על התג Zone 1 בחלונית הימנית כדי לשנות את שם Zone Center.
- לחץ שוב על הלחצן Add Zone Label . לחץ על היקף הזירה, מחוץ לאזור המרכז. לחץ לחיצה ימנית על אזור 2 בחלונית הימנית כדי לשנות את שם האזור להיקף.
- לחץ על 4. אמת את ההגדרה כדי להבטיח הגדרות זירה חוקיות.
- הגדר את הגדרות בקרת הניסיון כמתואר להלן.
- לחץ על הגדרות בקרת ניסיון תחת הכרטיסייה הגדרות בקרת ניסיון בחלונית ההתקנה השמאלית העליונה. יופיעו שש תיבות רכיבים. לחץ על הגדרות בתוך התיבה הרביעית הנושאת את התווית תנאי, הכוללת זמן (1) וזמן אינסופי (התנאי מעולם לא התקיים).
- לחץ/י על הבועה לצד ״אחרי״ והזן/י את משך הזמן (30 דקות) בתיבת המלל הימנית. יהיה גם תפריט נפתח מימין לתיבת טקסט הזמן כדי לבחור בין h, min ו-s.
הערה: הגדרות הזיהוי של קטעי וידאו מוקלטים תלויות באיכות הצילומים. ניתן לתפעל את השיטות הבאות כדי לראות את התוצאות הטובות ביותר, ספציפיות לצילומים בודדים.
- הגדר את הגדרות הזיהוי כמתואר להלן.
- לחץ על הגדרות זיהוי תחת הכרטיסייה הגדרות זיהוי בחלונית ההגדרות השמאלית העליונה. לחץ על בחר וידאו כפתור בחלונית השמאלית העליונה. העלה את הסרטון הרצוי להגדרות הזיהוי הבסיסיות.
- לחץ על הכרטיסייה מתקדם באותה חלונית ימנית. כעת, תחת הכרטיסייה שיטה, ודא שהיא מוגדרת לקנה מידה אפור. שנה את הטווח (0 - 100).
- תחת הכרטיסייה החלקה של החלונית הימנית, ודא שהחלקת פיקסלים של וידאו היא ללא, תיקון פריימים שהושמטו כבוי והפחתת רעש מסלול כבויה.
- תחת הכרטיסייה קווי מתאר נושא בחלונית הימנית, התאם את הגדרת הרצף ושנה את השחיקה, ההתרחבות והשחיקה ל-1, 1 ו-0, בהתאמה.
- תחת הכרטיסיה גודל נושא, שנה מינימום (0) ומקסימום (125000). לחץ על שמור בפינה השמאלית התחתונה.
- הגדר רצף של ניסויי וידאו לתצפית כמתואר להלן.
- לחץ על Trial List בחלונית ההתקנה השמאלית העליונה. העלה קטעי וידאו של דגימות ברצף הרצוי על ידי לחיצה על שלוש הנקודות תחת העמודה קובץ וידאו מערכת. כדי להוסיף גרסאות ניסיון נוספות, לחץ על Add Trials בסמוך לפינה השמאלית העליונה של לוח Trial List.
- הגדר הגדרות רכישה.
- לחץ על השגת משתמשים בלשונית השגת משתמשים בפינה הימנית העליונה. תחת הגדרות רכישה בחלונית הימנית, לחץ על עקוב אחר כל גירסאות הניסיון המתוכננות.
- כדי להתחיל ברכישה, לחץ על הכפתור האדום באמצע התחתון של המסך לצד מוכן להתחלה. רכישת סרטונים תתחיל כעת ותארך פרק זמן מסוים, בהתאם לכמות ואורך ניסויי הווידאו שהועלו.
- הגדר את הגדרות הניתוח כמתואר להלן.
- לחץ על פרופיל ניתוח תחת הכרטיסייה ניתוח בחלונית השמאלית. לחץ על המשתנים התלויים שנבחרו כברירת מחדל, מהירות ומרחק נע, ומחק אותם.
- בחלונית המשתנים התלויים, תחת הכרטיסייה Location, לחץ על In Zone. לחץ על התיבות מרכז ואזור היקפי כך שהן יסומנו בסמן ביקורת.
- לחץ על הכרטיסיה סטטיסטיקת גירסת ניסיון בתיבה In Zone. לחץ כדי לבטל את הסימון של השהיה לראשונה. לחץ על הוסף.
- תחת הכרטיסיה גוף, לחץ על לחצן סיבוב. לחץ על בכיוון השעון והשאר את הסף (50.00 מעלות) והמרחק המינימלי (2.00 ס"מ) כברירת מחדל. לחץ על הוסף.
- לחץ שוב על לחצן סיבוב ולחץ נגד כיוון השעון. לחץ על הוסף.
- נתח מסלולים כמתואר להלן.
- תחת הכרטיסיה תוצאות, לחץ על עקוב אחר תצוגה חזותית. בחלונית הימנית, תחת מסנן, בטל את הסימון של אחרון. סרגל בקרת ההשמעה בפאנל האמצעי התחתון של המסך יתאר הדמיית מסלול של דגימות בזמנים ספציפיים של תצפית.
- נתח וייצא תוצאות. ניתן למצוא את התוצאות בשאר כרטיסיות החלונית השמאלית התחתונה. כדי לייצא נתונים, לחץ על נתונים גולמיים או סטטיסטיקה תחת ייצוא בחלונית השמאלית.
3. המתת חסד
- הכינו תמיסה של 22 מ"מ של אאוגנול במי מעיין. מניחים פלנריה בצלחות פטרי עם 9 מ"ל של תמיסת אאוגנול של 22 מ"מ באמצעות פיפטת ההעברה החתוכה, תוך שמירה על כל ריכוז בנפרד. המתת חסד למשך 3 דקות או עד להפסקת כל התנועה.
- מניחים את הפלנריה בצלחת פטרי טרייה מלאה ב-9 מ"ל מי מעיין לשטיפה 1x-2x, ומניחים בתמיסת גולגי המתוארת להלן (כתם גולגי) או 4% פרפורמלדהיד (כתם אימונופלואורסצנטי).
4. ניתוח היסטולוגי
- מכתים גולגי
- לאחר המתת חסד של פלנריה, הניחו אותם בכוס או בצלחת פטרי מלאה בתערובת 1:1 של תמיסות A ו-B מערכת הכתמים של גולגי. החלף את פתרונות A ו-B למחרת על ידי הנחת פלנריה בכוס חדשה מלאה בתערובת של תמיסות A ו-B.
- אפשר לפלנריה לשבת במשך שבוע בפתרונות A ו-B.
- הסר את הפלנריה מתמיסות A ו-B והנח אותה בתמיסה C בכוס אחרת. החלף את תמיסה C למחרת. אפשר לפלנריה לשבת לפחות 72 שעות ועד שבוע בתמיסה C.
- הסר את הפלנריה מתמיסה C עם פיפטת העברה והטמיע על ידי הנחת כמות קטנה של תרכובת OCT על צ'אק, הוספת הפלנריה ולאחר מכן הקפת הפלנריה בתרכובת OCT. חותכים לרוחב את המישור למקטעים של 5 מיקרומטר עם מכונת הקריוסטט ב-24 מעלות צלזיוס.
- הרכיבו את הפלנריה על שקופיות מצופות ג'לטין באמצעות פיפטת העברה ותמיסה C והניחו לה להתייבש בחושך ב-RT עד 3 ימים.
- מכתים שקופיות באמצעות תמיסת הצביעה (1 חלק תמיסה D, 1 חלק תמיסה E, 2 חלקים מי מעיינות) על ידי טבילת השקופיות בכוסות עם התמיסות כדלקמן: תמיסת מכתים למשך 10 דקות, ואז במי מעיין 2x למשך 4 דקות כל אחד, ואז 50% אתנול למשך 4 דקות, ואז 75% אתנול למשך 4 דקות, ואז 95% אתנול למשך 4 דקות, לאחר מכן ב-100% אתנול פי 4 למשך 4 דקות, ולבסוף בקסילן פי 3 למשך 4 דקות.
- Coverslip מחליק עם אמצעי הרכבה היסטולוגיים וצפה ברקמה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.
- צביעה אימונופלואורסצנטית
- לאחר המתת חסד של פלנריה, יש להניח ב-4% פרפורמלדהיד למשך 24 שעות לפחות. ניתן לאחסן אותו גם במקרר לאחר שלב זה.
- העבירו את הפלנריה ל -20% סוכרוז מ -4% PFA והשאירו בה למשך יום אחד. מוציאים את הפלנריה מהסוכרוז ומניחים אותה במאגר PBS למשך 5 דקות.
- שוטפים עם 3-4 כביסות של מאגר PBS ומעבירים ל-20% סוכרוז לאחסון עד שמוכן להכתמה.
- מניחים בתמיסות אלכוהול של 70%, 95% ו-100% למשך דקה אחת כל אחת. מניחים בקסילן למשך דקה.
- מניחים 95% ו -70% אלכוהול למשך דקה אחת כל אחד. מניחים במאגר PBS 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחד. מניחים בתמיסת מתנול ומי חמצן 60:40 למשך 10-15 דקות.
- יש לשטוף ב-PBS 3x למשך 5 דקות כל אחד. הוסף את הנפח של 4% פרפורמלדהיד ששימש בעבר ב-4.2.1 למאגר PBS זה.
- יש לשטוף ב-PBS 3x למשך 5 דקות כל אחד. חוסמים למשך שעה באבקת חלב, על ידי כיסוי הפלנריה איתו.
- יש לדלל את הנוגדן הראשוני (1H6) ל-5 מיקרוגרם/מ"ל עם PBS ולדגור את השקופיות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בתמיסת הנוגדנים. למחרת יש לשטוף את הפלנריה ב-PBS למשך 10 דקות.
- לדלל נוגדן משני (IgG נגד עכברים עזים) ל-1 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS ולדגור את השקופיות למשך הלילה ב-RT בתמיסת הנוגדנים. למחרת יש לשטוף את הפלנריה ב-PBS למשך 15 דקות.
הערה: לנוגדנים שונים יש ריכוזים אופטימליים שונים; קבע זאת לפני תחילת הניסוי. - הרכיבו פלנריה שלמה על השקופית, כסו בכיסוי, אטמו באמצעי הרכבה מימיים והתבוננו ברקמה תחת מיקרוסקופ פלורסנט.
5. ניתוח תמונות
- פתח את יישום התוכנה לניתוח תמונות בקוד פתוח. התקן את התוסף colour_deconvolution2.jar ביישום התוכנה לניתוח תמונות בקוד פתוח על ידי גרירת התוסף ליישום.
- בחר את התמונה לניתוח וגרור אותה ליישום התוכנה לניתוח תמונות בקוד פתוח. עבור ללשונית תמונה. לחץ על צבע. לחץ על Colour Deconvolution2 v2.1.
- באפשרות הווקטורים, לחץ על H DAB. באפשרות הפלט לחץ על 8bit_Transmittance. ודא ש-LUTs מדומים, מוצר צולב עבור צבע 3, הצג מטריצות והסתר נבחרו כולם. לחץ על OK.
- בחר את התמונה בשחור-לבן כדי להבטיח שיישום התוכנה לניתוח תמונות בקוד פתוח יוכל לנתח את התמונה ביעילות.
- עבור ללשונית תמונה. לחץ על התאם. לחץ על סף. כוונן את הסף כך שצביעת ה-DAB או החזית יהיו בצבע אדום עם רקע לבן. ודא שהסף זהה לכל תמונה אם מכמתים מספר תמונות.
- לחץ על נתח. לחצו על 'קביעת מידות'. בחר ערך אפור אזור, ערך אפור מינימלי ומקסימלי, הגבל לסף, תווית תצוגה, חציון וערך אפור ממוצע. לחץ על OK. לחץ על נתח. לחץ על מדידה. השג את התוצאה.
- חזור על שלבים 1.2 עד 1. כל התמונות מכומתות. לחץ על תמונת התוצאות. לחץ על קובץ. לחץ על שמירה בשם. שמור את הקובץ כגיליון אלקטרוני והצג את הנתונים בתוכנת הגיליון האלקטרוני.
6. ניתוח סטטיסטי
- חשב את הממוצע ואת שגיאות התקן של הממוצע (SEM) עבור התנהגות הפלנריה באמצעות ניתוח שונות (ANOVA) ומבחן t של סטודנט למובהקות סטטיסטית (עמ' < 0.05).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ההתנהגות הבאה נצפתה על ידי הפלנריה שנחשפה לריכוזים משתנים של פילוקרפין:
תנודות גביות: תצורה דמוית בועה העוברת מקצה הגולגולת של גוף המישור לקצה הזנב.
תנודות ראש: היווצרות דמוית בועה על ידי ראש המישור היוצרת מראה דמוי ראשן.
צורת C: הראש נע עם כיוון השעון והזנב נע נגד כיוון השעון ליצירת C.
תנועת ראש: ראשו של הפלנרי מטלטל בפתאומיות שמאלה או ימינה.
תנודת גב זנב: היווצרות דמוית בועה על ידי זנב המישור היוצרת מראה דמוי ראשן.
תנועת זנב: הזנב של המישור מטלטל בפתאומיות שמאלה או ימ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקר זה הדגים התנהגות הנגרמת על ידי פילוקרפין בפלנריה בריכוזים שונים. ההתנהגות הרלוונטית ביותר הייתה התרחבות גבית מתנודדת, מכיוון שהתנהגות זו לא תועדה במחקרים אחרים לגבי התנהגות דמוית התקףב-planaria 9,10,11,12. המנגנון שבאמצעותו פילוקרפין גורם להתנהגויות דמויות התקפים בפלנריה עדיין לא ידוע. עם זאת, מחקר זה מדגים כי התנהגויות שונות עשויות להתאים לדרגות שונות של ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה להצהיר.
תודות
אנו רוצים להודות לקרן תמריצי המחקר של EVMS (PI: A.E. Musto) ולד"ר חורחה ז'אקוט על הצעותיו המועילות לאופטימיזציה של פרוטוקול האימונופלואורסצנטי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינורות צנטריפוגה | |||
| % תמיסת פרפורמלדהיד | Himedia | TCL119 | |
| מדיה הרכבה מימית | Clini Sciences | NB-47-02240-30ML | |
| כוסות (אחת לכל ריכוז שנבדק) | |||
| קרולינה ספרינגווטר | קרולינה 132450 | ||
| קריוסטט | |||
| ראשוניים ומשניים מדוללים | |||
| אתנול (100%) | sigma Aldrich | ||
| EthosVision XT 16 | noldus | ||
| Fiji Version 2.9.0 | |||
| שקופיות מצופות ג'לטין | סיגמא Aldrich | 643203 | |
| Golgi נוגדן 1H6 | DSHB | AB_2619608 | |
| כתם גולגי kit_ | עמית למדעי המוח | PK 401/401A | |
| מי חמצן | |||
| מתנול | |||
| אמצעי הרכבה | תרמו פישר מדעי | ||
| תרכובת | |||
| PBS מאגר | סיגמא Aldrich | P4417 | |
| אבקת חלב | |||
| רדיד | |||
| העברת פיפטות | |||
| קסילן |
מקורות
- World Health Organization. Epilepsy. , (2024).
- Dalic, L., Cook, M. J. Managing drug-resistant epilepsy: challenges and solutions. Neuropsychiatr Dis Treat. 12, 2605-2616 (2016).
- Mayo Clinic. Seizures - Symptoms and causes. , (2023).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. J Exp Biol. 216 (20), 3799-3810 (2013).
- Moreira-Lobo, D. C., et al. Eugenol modifies the excitability of rat sciatic nerve and superior cervical ganglion neurons. Neurosci Lett. 472 (3), 220-224 (2010).
- Johan Arief, M. F., Choo, B. K. M., Yap, J. L., Kumari, Y., Shaikh, M. F. A systematic review on non-mammalian models in epilepsy research. Front Pharmacol. 9, 655(2018).
- Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7666-7671 (2003).
- Wu, J. P., Lee, H. L., Li, M. H. Cadmium neurotoxicity to a freshwater planarian. Arch Environ Contam Toxicol. 67 (4), 639-650 (2014).
- Kim, A., Rawls, S. M. Nicotine-induced C-shape movements in planarians are reduced by antinociceptive drugs: Implications for pain in planarian paroxysm etiology. Brain Res. 1778, 147770(2022).
- Reho, G., Lelièvre, V., Cadiou, H. Planarian nociception: Lessons from a scrunching flatworm. Front Mol Neurosci. 15, 935918(2022).
- Pagán, O. R., et al. Planarians require an intact brain to behaviorally react to cocaine, but not to react to nicotine. Neuroscience. 246, 265-270 (2013).
- Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. J Pharmacol Toxicol Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
- Bhatt, P., Reitz, A. B., Tallarida, C. Mephedrone ("bath salt") pharmacology: insights from invertebrates. Neuroscience. 208, 79-84 (2012).
- Neufeld, T., Carniello, T., Dotta, B. A single hypoxic event ameliorates pilocarpine-induced hyperkinetic movements in Planaria. Nat Sci. 14, 149-156 (2022).
- Rossini, L., et al. Dendritic pathology, spine loss, and synaptic reorganization in human cortex from epilepsy patients. Brain. 144 (1), 251-265 (2021).
- Owuor, K., et al. LGI1-associated epilepsy through altered ADAM23-dependent neuronal morphology. Mol Cell Neurosci. 42 (4), 448-457 (2009).
- Dubey, V., et al. Dendritic reorganization in the hippocampus, anterior temporal lobe, and frontal neocortex of lithium-pilocarpine induced Status Epilepticus (SE). J Chem Neuroanat. 133, 102329(2023).
- Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Musto, A. E., Walker, C. P., Petasis, N. A., Bazan, N. G. Hippocampal neuro-networks and dendritic spine perturbations in epileptogenesis are attenuated by neuroprotectin D1. PLoS One. 10 (1), e0116543(2015).
- Omuro, K. G., et al. Novel monoclonal antibodies to study tissue regeneration in planarians. BMC Dev Biol. 15 (2), (2015).
- Keenan, C. L., et al. Cytoarchitecture of primitive brains: Golgi studies in flatworms. J Comp Neurol. 195, 4(1981).
- Pronin, A. N., Wang, Q., Slepak, V. Z. Teaching an old drug new trick: Agonism, antagonism, and biased signaling of pilocarpine through M3 muscarinic acetylcholine receptor. Mol Pharmacol. 92 (5), 601-612 (2017).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods Mol Biol. 1897, 299-311 (2019).
- Vogt, R. V., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J Immunol Meth. 101 (1), 43-50 (1987).
- Duhamel, R. C., Johnson, D. A. Use of nonfat dry milk to block nonspecific nuclear and membrane staining by avidin conjugates. J Histochem Cytochem. 33 (7), 711-714 (1985).
- Chen, T. S., Huang, T. H., Lai, M. C., Huang, C. W. The role of glutamate receptors in epilepsy. Biomedicines. 11 (3), 783(2023).
- Kreshchenko, N. Immunocytochemical identification of serotoninergic neurons in Planaria Girardia tigrina. Biochem. Moscow Suppl Ser A. 11, 68-76 (2017).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
