הרכבה וכימות של תרביות משותפות המשלבות שמרים הטרוטרופיים עם ציאנובקטריה מפרישת סוכר פוטוטרופית

סיכום

פרוטוקול זה מספק הנחיה מקיפה להגדרה ולניטור כמותי של תרביות משותפות, כולל ציאנובקטריה מפרישת סוכר פוטו-אוטוטרופיים ושמרים הטרוטרופיים.

תקציר

עם הביקוש הגובר לביוטכנולוגיות בנות קיימא, קונסורציום מעורב המכיל חיידק פוטוטרופי ומינים שותפים הטרוטרופיים נחקרים כשיטה לייצור ביולוגי מונע שמש. גישה אחת כוללת שימוש בציאנובקטריה מקבעת_CO2 המפרישה פחמן אורגני כדי לתמוך בחילוף החומרים של הטרוטרוף מעובד במשותף, אשר בתורו הופך את הפחמן לסחורות או שירותים בעלי ערך גבוה יותר. בפרוטוקול זה, מסופק תיאור טכני שיסייע לניסוי בהקמת תרבית משותפת המשלבת זן ציאנובקטריאלי המפריש סוכרוז עם שותפ/ים פטרייתיים, כפי שמיוצגים על ידי מיני שמרים מודלים. הפרוטוקול מתאר את התנאים המוקדמים העיקריים להקמת תרבות משותפת: הגדרת הרכב המדיה, ניטור מאפייני הגידול של שותפים בודדים וניתוח תרבויות מעורבות עם מינים מרובים המשולבים באותו כלי גידול. טכניקות מעבדה בסיסיות לניטור תרבית משותפת, כולל מיקרוסקופיה, מונה תאים וציטומטריית זרימה של תא בודד, מסוכמות, ומסופקות דוגמאות לתוכנות לא קנייניות לשימוש לניתוח נתונים של קבצי תקן ציטומטריית זרימה גולמית (FCS) בהתאם לעקרונות FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable). לבסוף, כלולה פרשנות על צווארי הבקבוק והמלכודות שנתקלים בהם לעתים קרובות כאשר מנסים להקים תרבית משותפת עם ציאנובקטריה מפרישת סוכר ושותף הטרוטרופי חדש. פרוטוקול זה מספק משאב לחוקרים המנסים להקים זוג חדש של חיידקים בתרבית משותפת הכוללים ציאנובקטריום ומיקרוב הטרוטרופי.

מבוא

עם ההתרחבות המהירה של כלים גנומיים וטכנולוגיות DNA בשנים האחרונות, מאמצי הביו-הנדסה מסוגלים יותר ויותר להתייחס לקהילות מעורבות של חיידקים כברות קיימא לאסטרטגיות ייצור ביולוגי במקום להתמקד אך ורק בתרביות אקסניות. לקונסורציום מיקרוביאלי יתרונות פוטנציאליים מרובים ביחס לתרביות של מין יחיד, כולל התמחות וחלוקת עבודה, יכולת הסתגלות וחוסן, ויעילות ניצול המצע¹. עם זאת, ההנדסה הצפויה של קונסורציום רב-מינים מסובכת על ידי אי ודאות הנגרמת על ידי התנהגויות מסדר גבוה יותר הנובעות מאינטראקציות בין מינים². איתות בין מינים וחילופי מטבוליטים הם לב העיקרון של חלוקת העבודה אך גם מובילים לסינרגיה ואנטגוניזם בלתי צפויים בין משתתפי הקונסורציום³. התפתחות ניכרת בתחום נחוצה אם ניתן לממש את מלוא הפוטנציאל של קונסורציום מיקרוביאלי מעורב, כולל שימוש בפלטפורמות גמישות של תרבית משותפת של 2 ו-3 שותפים, שניתן להשתמש בהן כדי לאפיין ולהבין טוב יותר אינטראקטיביות מיקרוביאלית "מלמטה למעלה".

כמה סוגים דומיננטיים של פלטפורמות תרבית משותפת נמצאים כיום בשימוש בתחום, כולל שותפים אוקסוטרופיים משלימים וחיידקים המפרישים מטבוליטים המועילים בדרך כלל למגוון רחב של מינים מיקרוביאליים. בקטגוריה האחרונה, ציאנובקטריה הונדסו להפוך ליצרנים ראשוניים משופרים באמצעות הכנסת מסלולים המובילים להפרשת פחמימות העושות חילוף חומרים בקלות ונחקרו כעת במגוון קונסורציום שתוכנן באופן רציונלי. בקצרה, בקהילות מיקרוביאליות מהונדסות כאלה, השותף הציאנובקטריאלי מסוגל להשתמש באור וב-CO₂ כקלטים העיקריים, ובאמצעות תהליך הפוטוסינתזה החמצנית, זנים אלה יכולים להפריש סוכרי פחמן מרכזיים כמוצר ציבורי. סוג אחד של זנים ציאנובקטריאליים מהונדסים כאלה הם אלה שתוכננו להפריש סוכרוז^{דו-סוכר 4}. זנים כאלה נהנו ככל הנראה מהצלחתם מכיוון שסוכרוז הוא מטבוליט שקרוב למטבוליזם הפחמן המרכזי עבור מינים רבים וגם מצטבר לעתים קרובות כ"מומס תואם" כדי להסתגל למגוון לחצים אביוטיים סביבתיים⁵. מספר מינימלי של התערבויות גנטיות יכול להוביל להפרשת סוכרוז יעילה במגוון אורגניזמים מודל ציאנובקטריאלי⁴.

ציאנובקטריה המפרישה סוכרוז היא פלטפורמה שימושית לחקר קונסורציום מיקרוביאלי שתוכנן באופן רציונלי מכיוון שמגוון רחב של מינים הטרוטרופיים יכולים לבצע חילוף חומרים של סוכרוז כמקור הדומיננטי שלהם לפחמן ואנרגיה. ואכן, תוך שימוש בכמה ציאנובקטריה מודלים עם יכולות הפרשת סוכרוז, מעבדות רבות תכננו באופן רציונלי תרביות מינים מעורבים וקונסורציום המכילים חיידק הטרוטרופי אחד או יותר ואשר נתמכים בסופו של דבר על ידי התשומות העיקריות של אור ו-CO₂ ללא תוספת של חומרי גלם אורגניים⁴. הזנים ההטרוטרופיים עשויים פשוט להתקיים על פחמימות שמקורן בציאנובקטריה, או שהם עשויים לשמש להמרת חומרי הזנה של סוכרוז למוצרים ביולוגיים בעלי ערך גבוה יותר (למשל, דלקים, פולימרים, פיגמנטים וכו'). בנוסף להיותן אסטרטגיה פוטנציאלית לייצור ביולוגי בר קיימא, תרבויות משותפות פשטניות כאלה עשויות להיות שימושיות גם כפלטפורמה לחקירת אינטראקציות מתעוררות בין מינים מיקרוביאליים שאינם קשורים.

מאמר וידאו זה מתמקד במתודולוגיות ובתנאים מוקדמים לשימוש בציאנובקטריה המייצרת סוכר כפלטפורמה גמישה לתכנון קונסורציום מיקרוביאלי פשוט שיכול להיות יציב על ידי השלמת תשומות פחמן אור ואנאורגניות בלבד. בעוד שההגדרה והניטור של תרביות המכילות מיקרואורגניזמים מבוססים בודדים הם לרוב פשוטים וניתן להשיג אותם בקלות באמצעות מתודולוגיית צפיפות אופטית (OD) או פיזור אחורי, זה לא אפשרי ברגע ששני אורגניזמים או יותר משולבים בכלי אחד. הסיבה העיקרית היא ששיטות אלו אינן מבחינות בין המיקרואורגניזמים השונים, ולכן הן רק מספקות תמונה כוללת של התרבות ואינן פותרות את הצמיחה של האורגניזמים הבודדים. יתר על כן, לציאנובקטריה יש ספקטרום ספיגה רחב בטווח של 400-750 ננומטר, כך שמדידת OD₆₀₀ של הטרוטרופ תוביל לתוצאות שגויות עקב פיקוציאנין (שנספג ב-620 ננומטר). לכן, ניתנים פרוטוקולים ספציפיים להקמת קהילות מעורבות של ציאנובקטריה-הטרוטרופ בתוך המעבדה, כמו גם פרוטוקולים גנריים שימושיים לניתוח הביצועים של מאגדים אלה לאורך זמן. בעוד שהפרוטוקולים מתמקדים בזיווג ספציפי של מודל, מינים ציאנובקטריאליים המפרישים סוכרוז עם מיקרוב הטרוטרופי מודל אחד או יותר, כוונת עבודה זו היא לספק משאב לחוקרים שעשויים לרצות לעצב זיווגים של מינים חדשים ולהאיץ את שלב האופטימיזציה להקמת תרביות כאלה. לכן, בנוסף לפרוטוקולים ספציפיים למין, כלולים מידע ואסטרטגיות שניתן להשתמש בהם כדי להתאים ולהכליל פרוטוקולים אלה עבור קהילות מותאמות אישית, כפי שהוגדרו על ידי צרכי הקורא.

בגלל הגמישות של פלטפורמת התרבות המשותפת המתוארת כאן, מתוארים פרוטוקולים למספר מינים הטרוטרופיים שונים שדווחו בעבר בגידול משותף עם ציאנובקטריה מפרישת סוכר. לדוגמה, מסופק פרוטוקול שלב אחר שלב לתרבית משותפת של Synechococcus elongatus PCC 7942 עם שמרי המעבדה הנפוצים Saccharomyces cerevisiae . עם זאת, המאמר כולל גם פרוטוקולים המתאימים לבדיקת הביצועים של תרביות משותפות המכילות מיני מודל אחרים, כולל צורת השמרים של Ustilago maydis.

המאמר מתמקד במערך ליבה של פרוטוקולים הנחוצים להקמת קו-תרבית ציאנובקטריה/הטרוטרופית וביצוע אפיון בסיסי של הביצועים של מאגדים מעורבים אלה לאורך זמן. באופן ספציפי, מודגשות שיטות ציטומטריית זרימה של תא בודד וספירת חלקיקים המתאימות לביצוע מפקד מדויק של מינים שונים, כמו גם גישות מיקרוסקופיה להערכת מורפולוגיה של תאים. פרוטוקולים אלה נועדו לשמש בסיס להתאמה לצרכים ולציוד הזמין. חשוב לציין, הערות טכניות ושיקולים אחרים החשובים להקמה ולניטור של תרביות משותפות בתוך המעבדה מסופקות. לבסוף, כלולות דוגמאות לחלופות לא קנייניות לניתוח נתונים של קבצי FCS⁶ גולמיים באמצעות חבילות Python. לסיכום, המטרה היא להפוך טכניקות תרבית משותפת מבוססות ציאנובקטריה לנגישות יותר לקהל מדעי רחב יותר.

פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה מכיל הוראות מפורטות כיצד להגדיר ולכמת תרביות משותפות של מיני שמרים מפרישי סוכר ומודל הטרוטרופי של S . elongatus . באופן כללי, הפרוטוקול חל על כל מיני שמרים הניתנים למניפולציה גנטית.

1. הקמת תרביות משותפות המשלבות ציאנובקטריה פוטוטרופית ושמרים הטרוטרופיים

1. הכנות לגידול משותף: מדיה וטיפוח מקדים
   הערה: הכן את כל תמיסות המדיה והמלאי באמצעות מים מסוננים טהורים במיוחד. יש לנקות את כל כלי הזכוכית (כוסות מדידה, צילינדרים מדורגים, בקבוקי אחסון וצלוחיות גידול) ולבצע חיטוי. ניתן לאחסן מדיה סטרילית בטמפרטורת החדר (RT). מכשיר התואם לדרישות הגידול הפוטו-אוטוטרופי צריך להיות זמין.
   1. הכן את מדיום התרבות המשותפת לפחות 3-4 ימים לפני ההתחלה המיועדת של תרבית משותפת. רוב מתכוני המדיה של תרבית משותפת הם וריאציות על מדיום⁷ הנפוץ BG-11 המשמש לגידול שגרתי של מינים רבים של מודל ציאנובקטריאלי. פרוטוקול זה משתמש במדיום CoYBG-11 שדווח בעבר כדוגמה (⁸; ראה טבלה 1). חיטוי (121 מעלות צלזיוס, 20 דקות) או פילטר מעקרים (גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר) את המדיום המוכן, לפי הצורך.
      הערה: עיין בסעיף הדיון לקבלת הצעות להתאמת מדיום המתאים לזוגות מינים אחרים.
   2. הכן ריאגנטים מולקולריים: לאינדוקציה של ביטוי cscB וייצוא סוכרוז ^9,10,11, הכינו מלאי של 1 M של איזופרופיל-β-תיוגלקטוסיד (IPTG).
      הערה: השימוש באנטיביוטיקה במהלך התרבית המשותפת הוא תת-אופטימלי, אך אם כל הזנים נושאים קלטות עמידות, ניתן להשתמש בהם. במקרה כזה, הכינו מלאי אנטיביוטיקה בהתאם לצרכי הזנים המשמשים.
   3. הכינו תרבית מוקדמת של ציאנובקטריום: לפחות 3 ימים לפני תחילת התרבות המשותפת, העבירו תאים מתרבית מוקדמת של זן מפריש סוכר של ציאנובקטריה הגדל במדיום BG-11 לתוך בקבוק מבולבל טרי המכיל מדיום CoY^BG-11 (טבלה 1).
      הערה: מינים וזנים רבים של ציאנובקטריה שונו כעת כדי להפריש סוכרים. לסקירה מקיפה של הזנים הזמינים בזמן כתיבת שורות אלה, ראה⁴. הפניה זו מפרטת גם מינים הטרוטרופיים (ראה 1.1.4) שלגביהם דווח בעבר על תרבית משותפת ציאנובקטריאלית.
      1. מדוד את ה-OD₇₅₀ של קדם-התרבות. חשב את הנפח הנדרש של קדם-התרבית כדי להשיג יעד OD₇₅₀ של 0.3 (C₁) באמצעות המשוואה V₁ = C₂ x V₂/C₁ כאשר C₂ = OD מטרה, V₂ = נפח יעד ו-V₁ = נפח נדרש של קדם-תרבית. לדוגמה, בעת חיסון תרבית של 30 מ"ל (V₂) כמות x של תרבית נוזלית לשימוש היא V₁ (מ"ל) = (0.3 x 30)/(נמדד OD₇₅₀).
         הערה: צפיפות אופטית היא קירוב של צפיפות התא ותלויה בתנאי הגידול ובמורפולוגיה של התא; לכן, יש צורך לחוקרים להשתמש בשיטות למתאם צפיפות אופטית למספרי תאים מוחלטים (ראה סעיפים 2.1, 2.2 ו-2.3) להערכה נכונה של ביצועי תרבית משותפת. עבור ציאנובקטריה, אין להשתמש באורכי גל של אור בתוך הספקטרום הפעיל פוטוסינתטית (כלומר, 400-700 ננומטר) לקביעת צפיפות אופטית מכיוון שהם נספגים על ידי כלורופיל ופיגמנטים אחרים; לכן, אורכי גל אדומים רחוקים משמשים באופן שגרתי (למשל, 750 ננומטר).
      2. דגרו את התרבות המדוללת בפוטואינקובטור מתאים. דגירה אופיינית
         התנאים לדגם ציאנובקטריה הם כדלקמן: 30 מעלות צלזיוס, 150 סל"ד (זריקת 25 מ"מ), מרווח ראש של 2% CO₂ , ~200 מיקרומול פוטונים ^m-2·^s-1 תאורת LED, 75% לחות.
         הערה: מומלץ מאוד ליטול תוסף CO₂ כדי למטב את כמות הסוכרוז המשוחרר.
      3. חזור על תהליך דילול זה בכל יום לפחות 3 ימים לפני הקמת התרבית המשותפת כדי להבטיח שהציאנובקטריה נמצאים בצמיחה אקספוננציאלית. זה יעזור לשפר את העקביות בביצועי התרבות המשותפת בין ניסויים בימים שונים.
   4. לפחות יומיים לפני תחילת התרבות המשותפת, הכינו קדם-תרבות הטרוטרופית. כפי שצוין, מספר מיני שמרים ותת-זנים גודלו בעבר בתרבית משותפת עם ציאנובקטריה ^8,12,13.
      1. העבירו תאים בדילול של 1:100 (250 מיקרוליטר) מתרבית נוזלית של המינים ההטרוטרופים הגדלים במרק גידול עשיר (ראה טבלה 1) ל-50 מ"ל של מדיום CoY^BG-11 בתוספת 20 גרם/ליטר סוכרוז בבקבוק מבולבל של 250 מ"ל.
      2. דגירה למשך הלילה באותה טמפרטורה כמו תנאי הגידול המשמשים לשותף הציאנובקטריאלי.
   5. בדוק את OD₆₀₀ לפחות 24 שעות לפני הזמן המיועד לחיסון של תרבית משותפת כדי לוודא שהזן ההטרוטרופי גדל מספיק לצרכי ניסוי (ראה 1.2): לדלל במדיום טרי כדי לשמור על צמיחה אקספוננציאלית במידת הצורך.
2. חיסון ותחזוקה של תרבית משותפת
   הערה: עיין בסעיף הדיון לשיקולים על יחס החיסון בין המיקרואורגניזמים הפוטוטרופיים וההטרוטרופיים.
   1. לחיסון התרבות המשותפת, העשירו את שתי התרבויות הקדם-תרבויות על ידי צנטריפוגה.
      1. חשב את נפח תרחיף התאים המרוכז כדי להשיג את צפיפות ההתחלה הרצויה עבור שני המינים באמצעות המשוואה הסטנדרטית C₁ x V₁ = C₂ x V₂ , כאשר C₁ = OD של תרבית מועשרת. לדוגמה, כדי ליצור תרבית של 25 מ"ל של S. elongatus עם OD_{התחלתי של 750} של 0.5 (מתרבית אקסנית של 1.5 OD) ו-S. cerevisiae עם OD₆₀₀ התחלתי של 0.05 (מתרבית אקסנית של 0.7 OD), בהתבסס על המשוואה לעיל, יש צורך ב-8.33 מ"ל של תרבית התחלתית של S. elongatus , 1.79 מ"ל של תרבית הטרוטרופית מועשרת, ו-14.88 מ"ל של מדיום CoY^BG-11 .
      2. צנטריפוגה התרביות באמצעות 13,000 x גרם למשך 10 דקות ב-RT. בתנאים סטריליים, יש לשפוך ולהשליך את הסופרנטנט.
         הערה: ניתן להשתמש בפחות כוח צנטריפוגלי יחסי (RCF; xg) כדי להטיל את S. cerevisiae מכיוון שהם תאים גדולים יותר (פי 2-3) בהשוואה ל-S. elongatus, אך הקפידו שהסופרנטנט יהפוך לשקוף. לאיסוף הביומסה הציאנובקטריאלית, ניתן להשתמש גם בפחות מ-13,000 x g , אך זה ידרוש זמן ארוך יותר לצנטריפוגה (למשל, ניתן להשתמש ב-4,000 x g למשך 20 דקות).
      3. השעו מחדש את גלולת הציאנובקטריה ב-25 מ"ל של מדיום CoY^BG-11 סטרילי. השתמש באותם תנאי צנטריפוגה כמו קודם, לאחר מכן, השליך והוציא סופרנטנט.
      4. חזור על תהליך זה פעמיים עבור S. elongatus ו-4 פעמים נוספות עבור S. cerevisiae.
         הערה: חשוב לשטוף את כדורי הציאנובקטריה וההטרוטרוף (S. cerevisiae) כדי להסיר שאריות של רכיבים בינוניים. מכיוון ש-S. cerevisiae גדל בנוכחות סוכרוז בעבר, הכמות המוגברת של שלבי הכביסה תבטיח הסרת שאריות סוכר אפשריות.
      5. לאחר אימות ה-OD, שלב את הנפחים של S. elongatus ו-S. cerevisiae בבקבוק מבולבל של 250 מ"ל בתנאים סטריליים והוסף CoY^BG-11 לנפח סופי של 50 מ"ל. יש לדלל ממלאי ה-1M שהוכן קודם לכן של IPTG לריכוז סופי של 1 מ"מ (זאת כדי לגרום לציאנובקטריה לייצא סוכרוז למדיה). לתרבית של 50 מ"ל, השתמש ב-50 מיקרוליטר ממלאי 1 M IPTG.
         הערה: צלוחיות מבולבלות בדרך כלל טובות יותר מכיוון שהן מספקות אוורור וערבוב טובים יותר עבור ציאנובקטריה.
      6. הנח את הבקבוק מהשלב הקודם לתאורת LED של 200 מיקרומול פוטונים·^m-2·^s-1 בתוספת 2% CO₂ ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול מסלולי ב-150 סל"ד (זריקת 25 מ"מ) ו-75% לחות.
         הערה: התנאים שהוזכרו לעיל יכולים להשתנות ויש לייעל אותם על סמך תוצאת הניסוי.
      7. עקוב אחר צמיחת התרבית על ידי דגימה סטרילית (1 מ"ל) כל 12 שעות או 24 שעות (ראה סעיף 2). לחלופין, השתמש בדגימות לביצוע מיקרוסקופיה סטנדרטית של תאים חיים וכדי לקבוע יחידות יוצרות מושבה (CFU¹⁴) של תאי שמרים על מדיום מתאים כדי לעקוב אחר מורפולוגיה וכושר תאים ולניטור כמות התאים ההטרוטרופיים החיים כמו גם זיהום.
         הערה: CFUs אינם מומלצים כשיטה לניטור צפיפות התאים המדויקת של מיני הציאנובקטריה, שעלולים לחוות לחץ משמעותי במעבר מגידול במדיום הנוזלי למוצק. לכן, יש לבחור צלחות אגר עם מדיום עשיר מתאים לגידול מיני השמרים, כגון תמצית שמרים פפטון דקסטרוז (YEPD)¹⁵.

תרכובת כימית	BG-11 (ריכוז מ"ג/ליטר)	CoY BG-11 (ריכוז מ"ג/ליטר)
ננו3	1500	1500
K2HPO4	40	40
MgSO4·7H2O	75	75
CaCl2 · 2H2O	36	36
חומצת לימון	6	6
אמוניום ציטראט ברזל	6	6
EDTA (מלח דיסודיום)	1	1
Na2CO3	20	20
עקבות הרכב מתכת
ח3בו3	2.86	2.86
ZnSO4·7H2O	0.222	0.222
Co(NO3)2 · 6 שעות2או	0.0494	0.0494
MnCl2·4H2O	1.81	1.81
CuSO4 · 5 שעותו-2או	0.079	0.079
NaMoO4·2H2O	0.39	0.39
נוספים
הפסו	7160	7160
בסיס חנקן שמרים (YNB), ללא חומצות אמינו, ללא אמוניום גופרתי	–	3608, 120013
חומר טיטרציה pH 8.3	KOH	KOH
KPO3	–	118
סוכרוז (להטרוטרופים בלבד)	–	13690

טבלה 1: הרכב המדיה של BG-11 ו-CoY^BG-11. בהינתן ריכוזים של בסיס שמרים-חנקן ב-CoY^BG-11 נגזרים ממשאבים שפורסמו ^8,12,13.

2. כלים ומתודולוגיה לניטור צמיחת תרבויות משותפות

הערה: פרוטוקול זה הוא קו מנחה לניתוח וניטור של תרבית משותפת, החל מטכניקות פשוטות אך עתירות עבודה כמו מיקרוסקופיה ותאי ספירה ועד ליישומים בעלי תפוקה גבוהה כמו מוני חלקיקים וציטומטריית זרימה של תא יחיד. מלבד התרבות המשותפת בפועל, רצוי לכלול תרביות אקסניות של המיקרואורגניזמים הבודדים כדי לאפשר ניתוח מקיף. כנקודת התחלה כללית לניתוח, קבע את ה-OD של התרבויות. בחלק זה, מפורטות מתודולוגיות שונות שניתן להשתמש בהן כדי להמיר מדדים יחסיים של צפיפות תאים (כלומר, OD) לערכים מוחלטים של מספר תאים לנפח. מדידת OD₇₅₀ משמשת לעתים קרובות לקביעת צפיפות התאים של תרביות ציאנובקטריה (עקב ספיגה של אורכי גל של 400-700 ננומטר), בעוד ש-OD₆₀₀ משמש לאורגניזמים הטרוטרופיים. שתי המדידות מספקות ערכי מנחה משוערים עם יחידות שרירותיות. שים לב שערכים יכולים להיות שונים מאוד בין מכשירים.

1. כימות מיקרוסקופי עם תאי ספירה
   הערה: תאי ספירה (כלומר, נויבאואר (משופר)/המוציטומטרים) הם אמצעי פשוט וזול לקביעת הרכב תרביות משותפות המורכבות מתאים שניתן להבחין בקלות מבחינה מורפולוגית, i.e.לפי צורות התאים שלהם (איור 1א). הוא מורכב משקופית מיקרוסקופ זכוכית עבה וזכוכית כיסוי. אם זכוכית הכיסוי ממוקמת כהלכה על גבי השקופית, היא יוצרת שני תאי נפח מדויקים עם רשתות חרוטות (איור 1ב-ד). על ידי ספירת שטח מוגדר ברשת, ניתן לחשב את ריכוז התאים של מתלה. תאי ספירה זמינים בעומקים שונים. בהתאם לעובי התא, יש לבחור עומק תא מתאים. לתאים פטרייתיים כגון U. maydis או S. cerevisiae, עומק של 0.1 מ"מ עובד היטב. עומק החדר הזה גדול מדי עבור תאים קטנים יותר כמו ציאנובקטריה, והתאים צפים בתא. תא בעומק 0.02 מ"מ מתאים הן לציאנובקטריה והן לתרבויות משותפות של ציאנובקטריה ופטריות.
   1. ודא שתא הספירה וזכוכית הכיסוי נקיים מאבק ותאים.
      הערה: מומלץ לנקות עם 70% אתנול (v/v) וטישו נטול מוך ישירות לפני השימוש.
   2. כדי למקם את זכוכית הכיסוי בצורה נכונה, החלק אותה על שני מוטות התמיכה במעט לחץ, אך היזהר כדי למנוע שבירה.
      הערה: נדרשת זכוכית כיסוי ספציפית ועבה ליישום זה (עיין במדריך החדר). מכיוון שזכוכית הכיסוי נשברת לפעמים במהלך ההרכבה, טוב שיהיו תחליפים בהישג יד.
   3. כאשר זכוכית הכיסוי ממוקמת כראוי, שימו לב למה שנקרא טבעות ניוטון (איור 1B) בין שני משטחי הזכוכית, ושזכוכית הכיסוי לא תחליק יותר.
      הערה: נשימה עדינה על זכוכית הכיסוי לפני ההרכבה משפרת לעתים קרובות את התוצאה.
   4. מערבבים היטב את מתלה התא ומורחים כמה מיקרוליטרים (~2-10 מיקרוליטר תלוי בעומק החדר) של מתלה התא על קצה החדר ומאפשרים לו להתמלא לחלוטין באמצעות כוח נימי. השתמש בדילול מתאים של תרחיף התא כדי לאפשר ספירה אמינה, למשל, וכתוצאה מכך 20 עד 200 תאים לריבוע גדול (איור 1D, מלבן אדום).
   5. השתמש במטרה מתאימה (למשל, פי 10) של מיקרוסקופ אור (מצב שדה בהיר או ניגודיות פאזה) והתמקד בקווי הרשת של תא הספירה. הכיוון מסופק על ידי הרשת. התחל לספור את התאים בריבועים המתאימים לגודל התא הנתון.
      הערה: השתמש בכלי עזר טכני כגון מונה כף יד או אפליקציית סמארטפון מתאימה לספירה (למשל, "מונה דברים" כללי או אפליקציות המוציטומטר מיוחדות המספקות תכונות מועילות ביותר). הגדר כלל לספירת תאים הממוקמים בגבולות הרשת כדי למנוע ספירה כפולה. לדוגמה, ניתן לספור תאים הממוקמים בגבול העליון והשמאלי של כל ריבוע מבלי לכלול את אלה שבגבול הימני והתחתון. קיימים כללים חלופיים¹⁶. אם משתמשים במיקרוסקופ פלואורסצנטי, ניתן להבחין בין התאים גם על סמך האוטו-פלואורסצנציה או הסמנים הפלואורסצנטיים שלהם.
   6. לאחר ספירה, למשל, של כל ארבעת הריבועים הגדולים בפינות, קבע את הערך הממוצע עבור כל סוג תא. עם ערכים ממוצעים אלה, שטח הריבוע המנוצל ועומק התא הנתון (התייעץ עם מידע היצרנים), מחשבים את ריכוזי התאים (ראה תוצאות מייצגות).
      הערה: בהתאם לגודל התא, ניתן להשתמש בריבועים שונים לספירה. עבור תאי שמרים וציאנובקטריה, ארבעת הריבועים הגדולים בפינות פועלים היטב (איור 1D, מלבן אדום).
   7. לאחר השימוש, נקו את החדר בהתחשב בדרישות הדגימות (למשל, השביתו אורגניזמים מהונדסים גנטית כראוי).
2. כימות באמצעות מוני חלקיקים
   הערה: בהתאם למאפייני התאים בתרבית משותפת, ניתן ליישם מונה חלקיקים כדי לקבוע את מספרי התאים של השותפים. לצורך היישום של שיטה זו, התאים צריכים להיות שונים מאוד בגודלם; למשל, ניתן להשיג אפליה של תאי חיידקים ושמרים. יש לכלול תרביות אקסניות של המיקרואורגניזמים הבודדים של הקונסורציום כדי לאפשר פרשנות של התוצאות. יש לנתח תרביות משותפות המכילות תאים בגדלים דומים או יותר מ-2 שותפים במתודולוגיה המתוארת בסעיפים 2.1 או 2.3.
   1. ההכנות
      1. כוונן את ה-OD של התרבית ל-0.1 ודלל את הדגימה פי 1,000 עם מאגר מדידה איזוטוני (עיין במדריך המכשיר) בנפח כולל של 10 מ"ל. הכן משולשים טכניים של כל הדגימות.
      2. בחר גודל נקבוביות מתאים של הנימים לניסוי.
         הערה: גודל הנקבוביות צריך להיות בטווח התאים הקטנים ביותר בתרבית המשותפת, אך עליו לכלול גם את התאים הגדולים יותר. אל תלך קטן מדי מכיוון שהנקבוביות עלולות להיסתם עקב צבירת תאים, שעלולה להתרחש עקב חלוקת תאים. גדלי הנקבוביות הזמינים שונים. נימים של 45 מיקרומטר, למשל, מתחילים לזהות תאים בקוטר של 0.7 מיקרומטר (U. maydis ו-S. cerevisiae 3.5 מיקרומטר-5.5 מיקרומטר, S. elongatus/Synechocystis sp. ~1-2.5 מיקרומטר).
   2. כימות תאים במונה חלקיקים
      1. הפעל את המכשיר. בסופו של דבר, בצע בדיקה עצמית לבקרת איכות (עיין במדריך של המכשיר הספציפי).
      2. טען את הדגימות לכוסות הדגימה, אבטח את המכסה וערבב את הדגימה על ידי הטיה קלה של הכוס.
         הערה: נסה להימנע מקצף ובועות. השתמש תמיד בכוס אחת לכל מדידה. ניתן לנקות את הכוסות ולעשות בהן שימוש חוזר מספר פעמים. השליכו כוסות אם יש שאריות שלא ניתן להסיר. אם הדגימה נשארת בכוס לתקופות ארוכות יותר, ערבבו אותה שוב לפני המדידה.
      3. רשום בטווח של 0-30 מיקרומטר עקב צבירי תאים שעלולים להיות גדולים יותר מהתאים הבודדים.
         הערה: ראשית, השתמש בכל אחת מהתרביות האקסניות של שותפי התרבות המשותפת כדי לקבל מושג על גודל התאים ולקבוע אם ניתן להבחין ביניהם לפי גודלם.
      4. לאחר ההערכה, קבע את הרכב התרבות המשותפת באותו אופן.
3. כימות קונסורציום באמצעות ציטומטריית זרימה חד-תאית
   הערה: ציטומטריית זרימה של תא בודד היא שיטה בעלת תפוקה גבוהה שניתן להשתמש בה כדי לקבוע את מספר התאים של שותפים בודדים בתרבית המשותפת, בהתחשב בכך שניתן להבחין בין השותפים לפי גודל/תכונות פיזור האור שלהם ו/או הקרינה. חשוב לציין, לצורך הקמת השיטה יש צורך בתרביות אקסניות של שותפי התרבות המשותפת כדי לנתח את תכונותיהם בציטומטר ולהתאים את שערי האוכלוסייה בהתאם. עבור זנים הנושאים מדווח פלואורסצנטי, יש צורך בזנים ללא מדווח פלואורסצנטי כבקרות שליליות. היכרות בסיסית עם יישומי ציטומטר תקל על יישום מוצלח של הפרוטוקול להלן^{17,18,19,20,21}. בדוגמה זו, תערובת מלאכותית של 3 מיקרואורגניזמים מנותחת (ראה תוצאות מייצגות): Synechocystis (מבטא מדווח ציטוזולי פלואורופור, mVenus) ושני השמרים S. cerevisiae ו U. maydis. להבחנה מדויקת של S. cerevisiae ו U. maydisסמני פלואורסצנטיות הוכנסו בצורה של חלבון פלואורסצנטי ירוק ציטופלזמי (GFP) (U. maydis eGFP) וחלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) mKate2 (S. cerevisiae mKate2) תוך שימוש בטכניקות שיבוט מולקולאריות בסיסיות. במידת האפשר, יש להעדיף זנים עם אינטגרציה גנומית של מדווחים כדי להימנע מהדרישה ללחצי ברירה מתמשכים.
   1. הכנת מדגם
      1. מדוד את ה-OD של התרבויות בשלב גידול נתון לניתוח.
      2. התאם את ה-OD של הדגימות לטווח המתאים למדידה. השתמש ב-OD₇₅₀ משוער של 0.05-0.5 עבור הציאנובקטריה וב-OD₆₀₀ של 0.2-1.5 עבור השמרים באמצעות מדיום תרבית טרי (נפח סופי: לפחות 500 מיקרוליטר). עבור תרבויות משותפות, שאפו ל-OD₇₅₀ בין ~0.1 ל-0.5 ורשמו את גורם הדילול. לחישוב, החל את הנוסחה המופיעה בשלב 1.1.3.1. זה יבטיח שספירת התאים תישאר בטווח של 1,000 - 10,000 תאים לשנייה בקצב זרימה של 10 מיקרוליטר לדקה (שווה ערך ל-6,000 - 60,000 תאים למיקרוליטר).
         הערה: לצורך דילול, ניתן להשתמש במדיה או במאגר ללא אוטופלואורסצנטיות וחלקיקים (למשל, BG-11). היזהר עם מדיה המכילה מרכיבים מורכבים כגון תמצית שמרים שעלולים להופיע כחלקיקים במדידה.
      3. העבירו 300 מיקרוליטר מכל תרחיף תא דגימה לבאר בודדת בצלחת של 96 בארות (באר עגולה סטנדרטית, תחתית שקופה ושטוחה).
         הערה: לחלופין, העבר 0.5-2 מ"ל לצינור מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) אם נעשה שימוש במצב הדגימה החצי אוטומטי במקום במצב קורא הצלחות.
   2. מדידת ציטומטריה
      1. הפעל את הציטומטר ובצע את תוכנית ההפעלה ובקרת האיכות (QC) בהתאם להוראות היצרן.
      2. טען (מעמיס צלחות או דגימה חצי אוטומטית) והפעל את הדגימות. התחילו עם דגימות הבקרה תוך שימוש בתרביות האקסניות של כל שותף לתרבות משותפת כדי לזהות כל מין על סמך תכונותיו לפני שמטרתם להפריד אותם בדגימת תרבית משותפת.
      3. עלילות נקודות פתוחות ו/או היסטוגרמות עבור ערוצי הקרינה והפיזור (למשל, פיזור קדימה [FSC] או גובה פיזור צדדי [SSC] [-H] או שטח [-A]) הרלוונטיים לדגימות.
      4. חפש את אוכלוסיות התאים הנדרשות והתאם את הסף כדי לא לכלול את הרעש הטכני והחלקיקים הקטנים מהמדיום.
         הערה: מומלץ לחפש את אוכלוסיית התאים ב-FSC-H ברוחב FSC או FSC-H בתרשים נקודות SSC-H ולהתאים את קנה המידה מלינארי ללוגריתמי עבור תאים קטנים כמו חיידקים (בדרך כלל 1-3 מיקרומטר). הגדר את הסף בערוץ FSC-H או SSC-H. עבור תאים בקוטר של פחות מ-1 מיקרומטר, השתמש ב-SSC הסגול (VSSC) בלייזר הסגול ב-405 ננומטר לרזולוציה טובה יותר.
      5. התאם את הרווח עבור כל ערוץ עניין באופן ידני לטווח של 25-2,500. התאם את הרווחים כך שהבקרה השלילית (למשל, ללא סמן הפלורסנט) תהיה בטווח של 1 x 10^2-1 x 10³ והבקרה החיובית (למשל, עם סמן הפלורסנט) תהיה בטווח של 1 x 10^5-1 x 10⁶ כדי לקבל את ההפרדה הטובה ביותר ולהישאר בטווח של 1 x 10^1-1 x 10⁷.
         הערה: ניתן לשמור את הרווחים הסטנדרטיים מ-QC גם כהתייחסות טובה.
      6. כדי לקבוע את ריכוז התאים בדגימה, רשום נפח דגימה מוגדר באמצעות פונקציית הרשומה (למשל, 10 מיקרוליטר בקצב זרימה של 10 מיקרוליטר לדקה). מאוחר יותר, חלקו את ספירת התאים הבודדים שנמדדו עבור נפח זה בנפח המוקלט כדי לקבל ספירת תאים למיקרוליטר עבור כל אוכלוסייה.
         הערה: זכור את גורם הדילול הראשוני בעת חישוב ריכוז התאים בתרבית/דגימה.
   3. שער/בחירה של אוכלוסיות תאים
      הערה: ללא תלות במכשיר המשמש להפעלת המדידות, ניתן לבצע את הניתוח והשער בתוכנת ההפעלה של הציטומטר או בתוכנת הניתוח המסחרית כפי שמודגם להלן²². בנוסף, ניתוח נתוני זרימה ציטומטרית באמצעות תוכנה לא קניינית יכול להיעשות ביעילות עם כלי קוד פתוח שונים כגון FlowCytometryTools²³ או FlowKit, תוך שימוש ב-FlowUtils²⁴ חבילות ב-Python. ברוח המדע הפתוח, פרוטוקול זה חולק JupyterNotebook לדוגמה המציג את השימוש בחבילות אלה לחקר נתונים בסיסיים. כמובן, תוכנה חלופית יכולה להתאים באותה מידה לביצוע ביואינפורמטיקה של זרימה ציטומטרית²⁵.
      1. בחר אוכלוסיות תאים מסוימות על ידי ציור שערים סביבן בתרשים נקודות או הגדרת מפריד או מקטעי קו סביב פסגות בהיסטוגרמה (איור 4).
         הערה: פונקציית השער האוטומטי של התוכנית יכולה לשמש כהפניה.
      2. הפרד את האותות עבור אורגניזמים פוטוטרופיים והטרוטרופיים על סמך האוטופלואורסצנציה של האורגניזם הפוטוטרופי (הנגרם בעיקר על ידי כלורופיל) באזור האדום של הספקטרום. דוגמה: השתמשו בהיסטוגרמה של ערוץ APC-H (עירור (לדוגמה) ב-638 ננומטר, פליטה (em.) ב-660/10 ננומטר) והגדירו מפריד אנכי בין השיא הימני (פוטוטרופי = אוכלוסייה חיובית לאוטופלואורסצנציה של כלורופיל) לבין הפסגה/s השמאלית (אוכלוסייה הטרוטרופית = אוכלוסייה שלילית אוטופלואורסצנטית של כלורופיל) (איור 4A).
         הערה: ניתן להשתמש בסמנים פלואורסצנטיים גם כדי להבחין בין שני שותפים פוטוטרופיים (או יותר) באותה תרבית (למשל, mVenus עבור Synechocystis).
      3. הפרד את שני האורגניזמים ההטרוטרופיים על סמך הסמנים הפלואורסצנטיים או תכונות הפיזור שלהם (FSC, SSC, אם אפשר).
         הערה: הפרדה המבוססת על תכונות פיזור ישימה רק אם לתאים יש, למשלample, גודל תא או מורפולוגיה שונים המביאים לשינויים גלויים בפיזור (למשל, Synechocystis: תאים כדוריים בקוטר ~1.5-3 מיקרומטר לעומת U. maydis תאים מוארכים באורך של 10 מיקרומטר וקוטר של כ-1-2 מיקרומטר²⁶).
      4. דוגמה: השתמש בהיסטוגרמה של ערוץ FITC-H (לדוגמה: 488 ננומטר, em.: 525/40 ננומטר) המציג רק את האוכלוסייה ה"הטרוטרופית" כדי להבחין בין התאים ההטרוטרופיים המכילים GFP (למשל, U. maydis eGFP) לבין אלה ללא GFP (למשל, S. cerevisiae RFP/mKate2) (איור 4B). לחלופין, השתמש בהיסטוגרמה של ערוץ PC5.5-H (לדוגמה: 561 ננומטר, em.: 710/50 ננומטר) המציג רק את האוכלוסייה ה"הטרוטרופית" כדי להבחין בין התאים ההטרוטרופיים המכילים RFP (למשל, S. cerevisiae RFP/mKate2) לבין אלה ללא RFP (למשל, U. maydis GFP) (איור 4C).
         הערה: זכור ששני סוגי תאים שונים (או יותר) יכולים "להיצמד" זה לזה במהלך המדידה. ניתן לזהות בקלות את ה"כפולות" או ה"מרובות" הללו בתרשים נקודות של שני הסמנים הפלואורסצנטיים (למשל, APC-H מעל FITC-H לזיהוי כפולות של פוטוטרופ ושותף הטרוטרופי מתויג GFP).
      5. לניתוח נתונים בסיסי ב-Python, עקוב אחר ההוראות ב-Jupyter זה (https://git.rwth-aachen.de/computational-life-science/cytoflow).
         הערה: מחברת זו תומכת בשלושה שלבים של ניתוח נתונים. i) ייבוא נתונים: ייבוא קבצי FCS. ii) בצע בקרת איכות: בדוק את תקינות הנתונים ומספר האירועים. iii) הדמיית נתונים: השתמש בעלילות כמו היסטוגרמות, עלילות פיזור ותרשימי צפיפות כדי לדמיין נתונים. בנוסף, מוצג הנוהל כיצד לבצע שער כדי לבודד אוכלוסיות מעניינות המתרבות איור 4 .
         כדי להקל על ניתוח תרבויות משותפות בפרויקטים ארוכי טווח, מומלץ לחוקר להשתמש בשיטות לעיל כדי לספור מספרי תאים וליצור עקומות סטנדרטיות להשוואת ערכי OD לספירת תאים מוחלטת. צפיפות אופטית היא מדידה יחסית שיכולה להשתנות בהתאם למין, זן, תנאי גידול וספקטרומטר. לכן, יצירת עקומות סטנדרטיות "פנימיות" נחוצה להמרה מדויקת של ערכי OD למספרי תאים.

איור 1: כימות מיקרוסקופי של תאים הניתנים להבחנה מורפולוגית. (A) תא ספירה של נויבאואר. (B) הטבעות של ניוטון מציינות את המיקום הנכון של החלקת הכיסוי המיוחדת. (C) תיאור סכמטי של ארכיטקטורת החדר עם החלל המרכזי בנפח מוגדר לספירת תאים. (D) הרשת של תא הספירה של נויבאואר המתוארת מורכבת מתשעה ריבועים גדולים בגודל של 1 מ"מ² (אדום). ארבעת הריבועים הגדולים בפינות מחולקים עוד יותר ל-16 ריבועים (כחול). הריבוע הגדול המרכזי מחולק ל -25 ריבועי קבוצה בגודל 0.04 מ"מ² (כתום). כל ריבוע קבוצתי מורכב מ-16 הריבועים הקטנים ביותר (ירוק). הנתון נוצר על סמך מידע היצרנים הזמין לציבור. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

הקמת תרבויות משותפות של S. elongatus פוטוטרופיים ושמרים הטרוטרופיים
דיווחנו בעבר על תוצאות מפורטות מגידול משותף של Synechococcus elongatus PCC 7942 עם מגוון תת-זנים של S. cerevisiae. לתיאור מקיף של תוצאות תרבית משותפת עם זוג ציאנובקטריה/שמרים זה, ראה⁸. למען הקיצור והדיוק, תוצאות אלה אינן משוחזרות כאן. בקצרה, תוצאות קודמות מצביעות על מספר שיקולים החשובים להקמת תרביות משותפות ארוכות טווח של ציאנובקטריאליות-שמרים. הדאגה העיקרית, יכולתם של שמרים לשרוד בתנאים שבהם ציאנובקטריה מספקת את הצורות היחידות של פחמן קבוע תלויה מאוד ביעילות שבה זן השמרים יכול לנצל סוכרוז. זני S. cerevisiae שפותחו או הונדסו לחילוף חומרים יעיל יותר של סוכרוז^27,28 היו בעלי סיכוי גבוה יותר לשרוד את המעבר למצב גידול תרבית משותפת, השיגו צפיפות תאים גבוהה יותר והפגינו חוסן גבוה יותר בניסויים ארוכי טווח (ימים עד שבועות) בתרבית משותפת ציאנובקטריאלית⁸. השלב הראשוני של חיסון תרבית משותפת היה חשוב במיוחד לכדאיות השמרים, ככל הנראה עקב לחצים של דילול תרבית, החלפת הרכב המדיה ו/או נסיגה של מקור פחמן מרוכז יותר. לכן, מאמצים להקל על המעבר ממדיום גידול עשיר יותר לזמינות פחמן מינימלית בהתחלת תרבית משותפת יכולים לשפר את ביצועי הניסוי והעקביות (ראה שלב 1.2.1.1). בנוסף, S. cerevisiae הפגין תגובות עקה העולות בקנה אחד עם היפראוקסיה כאשר חוסנו לתרביות צפופות של S. elongatus, העקביות עם היווצרות O₂ כתוצר לוואי עיקרי של פוטוסינתזה חמצנית. לכן, מאמצים למנוע צמיחת יתר של השותף הציאנובקטריאלי ו/או מחזורי אור "יום/לילה" לסירוגין יכולים להאריך באופן משמעותי את הכדאיות של S. cerevisiae בתרביות משותפות ארוכות טווח. עיין בסעיף הדיון לסיכום נוסף של תופעות נפוצות בתרבויות משותפות ביחס לדגימות ביקורת אקסניות.

מעקב אחר צמיחת תרבויות משותפות באמצעות מתודולוגיות שונות
בחלק הבא מתואר הכימות המופתי של קונסורציום משולש מעורב באופן מלאכותי של Synechocystis ושני השמרים S. cerevisiae ו-U. maydis בשלוש שיטות שונות. עבור התערובת, OD₇₅₀ (עבור ציאנובקטריה) ו-OD₆₀₀ (עבור ההטרוטרופים) של תרביות בודדות נקבעו והותאמו ל-OD 0.1. תרביות בודדות עורבבו ביחס של 1:1:1 באמצעות צפיפות אופטית (הנבדלת מספירת תאים, ראה לעיל). כדי להקל על הבחנת השמרים בציטומטר, זנים מדווחים של S. cerevisiae מהונדס גנטית FY1679-O1B²⁹ מייצרים באופן מכונן mKate2 ציטופלזמי (גנוטיפ: URA3Δ/pTDH3::mKate2; זן: S. cerevisiae mKate2³⁰) וזן U. maydis AB33³¹ המייצר באופן מכונן eGFP (גנוטיפ: pep4Δ/pRpl40::egfp; זן: U. maydis eGFP³²) שימשו. יש לציין כי הזן הציאנובקטריאלי צויד בפלסמיד משוכפל המקדם את הביטוי המכונן והחזק של גרסת החלבון הפלואורסצנטי הצהוב mVenus (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus, זן Synechocystis mVenus, דומה^ל-33) ובנוסף, מציג את האוטופלואורסצנציה החזקה האופיינית עקב נוכחות המכונות הפוטוסינתטיות.

כימות מיקרוסקופי באמצעות חדרי ספירה: כל סוגי התאים בתערובת המלאכותית המשומשת של שלושה מיקרואורגניזמים ניתנים להבחנה מיקרוסקופית בקלות (איור 2A): Synechocystis ו-S. cerevisiae מיוצגים על ידי תאים כדוריים שעם זאת שונים מאוד בקוטר שלהם (Synechocystis: קוטר משוער של 1.5-3 מיקרומטר, S. cerevisiae: קוטר משוער של 3-6 מיקרומטר), בעוד שלתאי U. maydis יש מורפולוגיה מוארכת בצורת סיגר ואורך של לפחות 10 מיקרומטר (איור 2A). תכונות מורפולוגיות ברורות אלה מאפשרות כימות מדויק של כל שותף בתערובת. כדוגמה להמחשה, 37, 18, 36 ו-21 תאי S. cerevisiae נספרים בארבעת הריבועים הגדולים, בהתאמה (איור 2B). הערך הממוצע הוא 28 תאים. מכיוון שלריבוע גדול של המוציטומטר המשומש יש שטח של 1 מ"מ² ועומק החדר היה 0.02 מ"מ, התוצאה היא 28 תאים לכל 0.02 מיקרוליטר. זה מתאים ל-1,400 תאים/מיקרוליטר, שהם שווי ערך ל-1.4 x 10⁶ תאים/מ"ל. סוגי התאים האחרים נספרו, והריכוזים נקבעו בהתאם (איור 2C, טבלה 2).

איור 2: כימות מיקרוסקופי של קונסורציום משולש המורכב מ-Synechocystis והשמרים S. cerevisiae ו-U. maydis. (A) תמונת ניגודיות דיפרנציאלית מיקרוסקופית (DIC) של תערובת משולבת באופן מלאכותי של המיקרואורגניזמים המצוינים. ניתן להבחין בקלות בין כל המינים על ידי המורפולוגיה שלהם. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (B) תוצאות ספירה לדוגמה עבור תערובת מורכבת מלאכותית של הזנים המצוינים על סמך תרביות אקסניות עם OD של 0.1. ארבעת הריבועים הגדולים בקצוות הרשת נותחו (סימון אדום באיור 1D). (C) הערך הממוצע של התאים השונים שנספרו בארבעת הריבועים שימש לחישוב ריכוז התאים בתרחיף באמצעות המשוואה הבאה: ערך ממוצע/(עומק תא [0.02 מ"מ] x גודל הריבוע שנספר [1 מ"מ²] x 1,000). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

כימות באמצעות מוני חלקיקים: מוני חלקיקים קובעים את מספר החלקיקים בתרחיף בהתאם לגודלם. במערך הנתונים לדוגמה, נעשה שימוש במונה חלקיקים עם נימי 45 מיקרומטר. מכיוון שתאי S. cerevisiae ו-U. maydis מראים ממדים דומים, לא ניתן להבחין ביניהם במונה החלקיקים, בעוד שתאי Synechocystis הקטנים יותר ניתנים להפרדה ברורה. הניתוח של תרביות בודדות מראה אפוא שיאים במיקומים זהים המתייחסים ל-3 עד 6 מיקרומטר עבור שני השמרים (איור 3A). במהלך המדידה מופעל לחץ שלילי הגורם לתאים להיכנס לנימים. זה משנה לזמן קצר את ההתנגדות החשמלית כך שהמכשיר יכול לקבוע את גודל החלקיקים על סמך השינוי. בתרבית המעורבת אפשר לזהות שתי פסגות נפרדות, אחת קשורה לתאים ציאנובקטריאליים קטנים יותר, והשנייה מייצגת חלק משותף של שני מיני השמרים (איור 3B). חשוב לציין שבנוסף לפסגות שמשקפות את התאים החיים, זוהו שיאים נוספים בסביבות 1 מיקרומטר (איור 3), שמתאימים לפסולת תאים ולחלקיקים קטנים יותר. אותות שיופיעו בקטרים גדולים מהצפוי יכולים להיגרם על ידי הצטברות תאים. יש לציין כי צורת הפסגות משקפת את ההומוגניות של התאים: שיא חד מראה תאים הומוגניים מאוד, דבר שאינו סביר עבור תרבית משותפת. בתרבות משותפת, היא צפויה לראות שיא רחב מאוד או אפילו שתי פסגות אם השותפים של התרבות המשותפת שונים בבירור בגודלם. עבור תרביות אקסניות של פטריות הטרוטרופיות, השיא עשוי להיות שיא בינוני רחב.

איור 3: כימות של קונסורציום משולש המורכב מ-Synechocystis mVenus והשמרים S. cerevisiae mKate2 ו-U. maydis eGFP באמצעות מונה חלקיקים. (A) פלט חזותי של ניתוחים של תרביות אקסניות של שלושת הזנים כפי שמצוין בגרפים (מונה תאים עם נימי 45 מיקרומטר). (ב) קובץ פלט חזותי לדוגמה לניתוח הקונסורציום המלאכותי המשולש בתנאים זהים. מונה החלקיקים אינו תומך בהבחנה של שני מיני השמרים ששניהם מיוצגים על ידי הפסגה השנייה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

כימות באמצעות ציטומטריה חד-תאית: באמצעות ציטומטר הזרימה של תא יחיד ניתן להבחין בקלות בין אוכלוסיות התאים השונות על סמך תכונות הקרינה (האוטומטית) ופיזור האור שלהן. תאים פוטוטרופיים (Synechocystis) יכולים להיות מובחנים מתאים הטרוטרופיים (U. maydis ו-S. cerevisiae) בהתבסס על האוטופלואורסצנציה האדומה של הפיגמנטים הפוטוסינתטיים הנמדדת בתעלת APC-H (איור 4A). בהתבסס על ההפרדה הראשונית הזו של תאים פוטוטרופיים והטרוטרופיים, ניתן להבחין בין שתי האוכלוסיות ההטרוטרופיות על סמך הסמנים הפלואורסצנטיים שלהן eGFP בערוץ FITC-H ו-mKate2 בערוץ PC5.5 (איור 4B,C). בתרשים נקודות המציג את תכונות הפיזור של כל שלוש האוכלוסיות (FSC-H ו-FSC-Width), ניתן גם להבחין בין האוכלוסיות עם כמה חפיפות קלות בלבד של האוכלוסיות (איור 4D).

בשיטה זו נותחו 10 מיקרוליטר מהדגימות המדוללות בקצב זרימה של 10 מיקרוליטר לדקה, מה שמאפשר כימות של כ-70,000 תאים בדקה אחת. כ-60% מהתאים הללו היו יכולים להיות מוקצים ל-Synechocystis (4.23 x 10⁶ תאים/מ"ל), בעוד ש-40% הנותרים היו מפוזרים באופן שווה בין U. maydis (1.35 x 10⁶ תאים/מ"ל) ו-S. cerevisiae (1.36 x 10⁶ תאים/מ"ל, איור 4E, טבלה 2).

איור 4: כימות של קונסורציום משולש המורכב מהציאנובקטריום Synechocystis mVenus והשמרים U. maydis eGFP ו- S. cerevisiae mKate2 באמצעות ציטומטריית זרימה חד-תאית. תרשימים לדוגמה שהתקבלו לאחר מדידה של תרבית מעורבת של Synechocystis mVenus (ירוק כהה), U. maydis eGFP (ירוק בהיר) ו- S. cerevisiae mKate2 (אדום) ביחס של 1/3 OD₇₅₀ / 1/3 OD₆₀₀ / 1/3 OD₆₀₀ על ציטומטר (A) המציג היסטוגרמה של ספירת האירועים והפלואורסצנציה בערוץ APC-H (לדוגמה: 638 ננומטר, EM.: 660/10 ננומטר) של כל התאים המשמשים להבדיל תאים פוטוטרופיים והטרוטרופיים על סמך האוטופלואורסצנטיות שלהם. (B) היסטוגרמה של ספירת האירועים והפלואורסצנטיות בתעלת FITC-H (לדוגמה: 488 ננומטר, בערך: 525/40 ננומטר) של כל התאים ההטרוטרופיים המשמשים להתמיינות תאי U. maydis eGFP ו-S. cerevisiae mKate2 בהתבסס על תכונות הקרינה הירוקה שלהם. (C) היסטוגרמה של ספירת האירועים והפלואורסצנציה בערוץ PC5.5-H (לדוגמה: 561 ננומטר, בדק: 710/50 ננומטר) של כל התאים ההטרוטרופים המשמשים להבדיל בין תאי U. maydis eGFP ו-S. cerevisiae mKate2 בהתבסס על תכונות הקרינה האדומה שלהם. (D) תרשים נקודות של אותות הפיזור ברוחב FSC על פני ערוץ FSC-H המשמש לזיהוי אוכלוסיות התאים ללא תכונות פלואורסצנטיות. (ה) סטטיסטיקת האוכלוסייה כולל ספירת האירועים, האחוזים והממוצע האריתמטי וסטיות התקן (SD) של ערוצי הקרינה הרלוונטיים. הכמות הכוללת של התאים, יחד עם גודלם והפלואורסצנטיות שלהם, נקבעה בנפח של 10 מיקרוליטר עם קצב זרימה של 10 מיקרוליטר לדקה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

כדי להמחיש באופן השוואתי את הפלט של שיטות הכימות השונות, מספרי התאים שנקבעו מוצגים בשתי הטבלאות הבאות (טבלה 2 וטבלה 3). הריכוזים הסופיים של תאים שנקבעו בשלוש השיטות שתוארו קודם לכן הם בטווח דומה עבור כל השיטות. הציטומטר מספק את גודל המדגם הגבוה ביותר, ואחריו מונה החלקיקים והכימות המיקרוסקופי, עם ירידה של כסדר גודל אחד בין השיטות.

תרבות משותפת 1:1:1		פוטומטר	ציטומטר		מונה חלקיקים		תא ספירת מיקרוסקופיה
אורגניזם		OD750/600	ספירת תאים	תאים/מ"ל	ספירת תאים	תאים/מ"ל	ספירת תאים	תאים/מ"ל
Saccharomyces cerevisiae mKate2		0.0333	13,618	1.36 על 106	1,546*	2.58 x 106*	112	1.40 על 106
Ustilago maydis eGFP		0.0333	13,541	1.35 על 106			89	1.11 על 106
Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus		0.0333	42,330	4.23 על 106	3,094	5.16 על 106	271	3.39 על 106

טבלה 2: השוואה בין שיטות הכימות השונות: תרבות מעורבת מלאכותית. שימו לב שלא ניתן להבחין בין U. maydis ו-S. cerevisiae באמצעות מונה חלקיקים (*).

תרבות יחידה		פוטומטר	ציטומטר		מונה חלקיקים		תא ספירת מיקרוסקופיה
אורגניזם		OD750/600	ספירת תאים	תאים/מ"ל	ספירת תאים	תאים/מ"ל	ספירת תאים	תאים/מ"ל
Saccharomyces cerevisiae mKate2		0.1	38,936	3.89 על 106	1,928	3.21 על 106	403	4.03 על 106
Ustilago maydis eGFP		0.1	36,927	3.69 על 106	2,465	4.11 על 106	307	3.07 על 106
Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus		0.1	127,864	1.28 על 107	8,186	1.36 על 107	428	1.07 על 107

טבלה 3: השוואה בין שיטות הכימות השונות: כיול עם תרביות חד-אקסניות.

דיון

הטיפול במיקרואורגניזמים בתרביות חד-אקסניות בהקשר מעבדתי הוקם במשך עשרות שנים עבור מודלים מיקרוביאליים רבים. עם זאת, למרות שצורת החיים הרווחת בטבע היא קהילות מיקרוביאליות, השילוב של שני שותפים או יותר בכלי גידול אחד פחות מבוסס, והאתגרים מציבים פערים בידע ובמתודולוגיה הקיימים. כמו כן, קשה יותר לחזות את התנהגות התאים בקהילה, שכן אינטראקציות מתעוררות וחילופי מטבוליטים מתעוררים בין התאים, ומשפיעים מאוד על גורל התרבות המשותפת^34,35. לפיכך, הקמת תרבות משותפת אינה טריוויאלית, כולל ברמת הגדרת מצע הגידול, זיהוי תנאי גידול נפוצים, חילופי מינים של מטבוליטים/אותות עקבות, והרכב התרבות המשותפת המתקבל לאורך זמן. ההתקדמות של השנים האחרונות בהרכבה של ציאנובקטריה פוטוטרופית ומפרישת סוכר עם שותפים הטרוטרופיים מאפשרת כעת להסיק כללים ומתודולוגיה ראשונים שיכולים לספק קו מנחה מועיל לתכנון זוגות גידול משותף חדשים. בהתבסס על ידע זה, בחלק הראשון של פרוטוקול זה ניתנת הנחיה שלב אחר שלב להרכבת תרביות משותפות המכילות ציאנובקטריום הפרשת סוכרוז ושמרים אחד או יותר.

שיקול קריטי אחד כאשר מנסים לראשונה לבסס תרבית משותפת בין חיידקים לא קשורים הוא ההרכב של מצע גידול משותף העונה על כל דרישות התזונה עבור שני המינים או יותר. בשל מגבלות מקום, לא ניתן לספק פרוטוקול מפורט לחלוטין לתהליך זה כאן, שעשוי לדרוש גם רמה גבוהה של התאמה אישית במקרים מסוימים, אך במקום זאת מתאר להלן שיקולים חשובים שיש לזכור. גישה ראשונית פשוטה אחת כוללת השוואה של מצע הגידול הציאנובקטריאלי הטיפוסי (למשל, BG11; ראה טבלה 1) עם כל מדיה מינימלית מבוססת שהורכבה עבור המינים ההטרוטרופים המעניינים. השלמת המדיום הציאנובקטריאלי הסטנדרטי עם כל הרכיבים החסרים הכלולים בתווך המינימלי ההטרוטרופי היא נקודת התחלה טובה לבדיקה ראשונית ^8,36. זכור כי מכיוון שלעתים קרובות מתווסף למדיה מינימלית מקור פחמן אורגני משמעותי לצמיחה הטרוטרופית (למשל, 1%-4% גלוקוז), הם נועדו לעתים קרובות לתמוך בצפיפות תאים הטרוטרופית גבוהה יותר ממה שסביר שיושג בניסויים ראשוניים של תרבית משותפת. כמו כן, כמה רכיבי מדיום נפוצים יכולים גם לשמש כמקור פחמן אורגני ללא תלות בפוטוסינתזה המסופקת על ידי השותף הציאנובקטריאלי (למשל, ציטראט), מה שיכול לסבך ניתוח מאוחר יותר של תרביות משותפות של ציאנובקטריה/הטרוטרוף. לכן, ייתכן שלא יהיה צורך להשלים את המדיום הציאנובקטריאלי המינימלי עם הריכוז המלא של האלמנטים החסרים בעת תכנון מדיום תרבית משותפת. לדוגמה, אורגניזמים רבים שונים ביעילות השימוש שלהם בצורות שונות של חנקן סביבתי (למשל, N₂, חנקה, ניטריט, אוריאה) וייתכן שלא יוכלו לנצל חלק ממקורות החנקן המחומצנים יותר. באופן דומה, חיידקים רבים עשויים להזדקק לתוספי ויטמינים חיוניים (למשל, ויטמין B₁₂), קו-פקטורים או חומצות אמינו חיוניות מכיוון שהם חסרים מסלולים ביוסינתטיים מלאים לסינתזה ישירה של תרכובות אלה. מסיבות אלה, ייתכן שיהיה זה מעשי ביותר להתחיל פשוט ב"מיזוג" המדיום המינימלי המבוסס של השותף הציאנובקטריאלי (למשל, BG11) יחד עם תווך מינימלי מוגדר היטב של ההטרוטרוף (למשל, מוגדר סינתטי [SD]). ניתן להשתמש במחזורים מאוחרים יותר של הסרה/הפחתה חוזרת של רכיבים מיותרים כדי לייעל את המדיום ולהפחית את השפע של כל התרכובות שעלולות לעכב את הצמיחה של אחד מבני הזוג. נקודת התחלה שימושית היא לחצץ את המדיום ב-pH ניטרלי או מעט בסיסי, מכיוון שאלו נוטים להיות תנאים מועדפים על ידי רוב מיני המודל הציאנובקטריאליים.

בשלב זה, לעתים קרובות מועיל לערוך בדיקות מקדימות של צמיחת ההטרוטרוף הנתמך במדיום החדש של קו-תרבית כאשר מסופק עודף סוכרוז. כמובן שכאשר בוחרים הטרוטרוף פוטנציאלי, חשוב לבחור אחד שמסוגל לקטבוליזציה של המקור העיקרי של פחמן אורגני שיסופק על ידי השותף הציאנובקטריאלי. כדאי לציין כאן שסוכרוז, כפחמימה הדומיננטית המסופקת בתרביות ציאנובקטריאליות/הטרוטרופיות מהונדסות רבות⁴, אינו פחמימה המנוצלת באופן אוניברסלי על ידי חיידקים הטרוטרופיים כמו גלוקוז: מובילי סוכרוז ייעודיים חייבים להיות מקודדים על ידי המינים ההטרוטרופיים או שיהיה צורך באינברטאזים חוץ-תאיים כדי להמיר סוכרוז לפרוקטוז וגלוקוז המוכרים לעתים קרובות על ידי טרנספורטרים בעלי זיקה גבוהה יותר⁸. תצפית חשובה המדווחת בדרך כלל על ידי מעבדות מרובות החוקרות קהילות מיקרוביאליות מעורבות היא שנוצרות סינרגיות וניגודים מסדר גבוה יותר בין השותפים הפוטוטרופיים וההטרוטרופיים ^4,8,13. לדוגמה, מטבוליטים אחרים המופרשים באופן טבעי (למשל, חומצות אורגניות, צורות מופחתות של חנקן) או גורמים משלימים (למשל, סידרופורים) עשויים לאפשר שיעורי גדילה גבוהים יותר של אחד מבני הזוג או שניהם כאשר הם מעובדים באותו מדיום ביחס לבקרות אקסניות. לעומת זאת, תוצרי לוואי מטבוליים שעלולים להזיק, כגון היפר-חמצון של המדיום על ידי פיצול מים פוטוסינתטיים, דווחו כגורמים לעיכוב צמיחה בין מינים עבור אחד^מבני הזוג או שניהם. לכן, בקרות אקסניות יכולות לספק אמת מידה שימושית, אך ביצועי התרבות המשותפת עשויים להשתנות מהציפיות בשל מאפיינים מתעוררים אלה.

בהתאם לבן הזוג ההטרוטרופי וליכולותיו של S. elongatus להפריש סוכרוז (בהתבסס על רמת האינדוקציה, ריכוז ה-IPTG המשומש), יש לבדוק יחסים שונים של שני האורגניזמים. הצלחת התרביות תלויה בעיקר ביכולתו של S. elongatus לשמור על הצמיחה של השותף ההטרוטרופי (כלומר, האם הוא יכול לייצר מספיק מקור פחמן). בעוד שצמיחת יתר של הזן ההטרוטרופי מוגבלת בדרך כלל על ידי היעדר פחמן אורגני המסופק בהרכב המדיום של התרבות המשותפת, ציאנובקטריה יכולה לעלות על ההטרוטרוף, מה שעלול להוביל לאינטראקציות מעכבות מתעוררות (למשל, מצבים היפראוקסיים ^8,13). כאשר מנסים לקבוע תחילה יחסים מתאימים של צפיפות תאים עבור הציאנובקטריום: שמרים, כלל משוער טוב הוא שהשותף הציאנובקטריאלי יכול לתמוך בנפח תאים שווה של התאים ההטרוטרופיים הנלווים. מכיוון ששמרים אוקריוטיים נוטים להיות בעלי נפחי תאים גדולים בהרבה מציאנובקטריה המפרישה סוכרוז מודל, סביר להניח שמשמעות הדבר היא שצפיפות התאים הציאנובקטריאליים תהיה גבוהה משמעותית (למשל, פי 50-100 עבור S. cerevisiae) במצב יציב. לכן, נקודת התחלה טובה בעת הקמת תרבית משותפת חדשה עם תנאי המעבדה והמינים הספציפיים לחוקר תהיה לחשב את נפח התא הממוצע הן עבור הציאנובקטריום והן עבור השמרים (בהתבסס על ערכים שפורסמו; למשל, ראה B10NUMB3R5³⁷) כדי להעריך את היחס הנפחי. ניתן לזרוע צלוחיות ראשוניות עם יחס תאים זה. כדי לחקור את מרחב התמיסה, החוקר עשוי לרצות לשמור על ריכוז הציאנובקטריה קבוע (למשל, OD₇₅₀ = 0.3) תוך שינוי ריכוז תאי השמרים למעלה או למטה בערך בסדר גודל במרווחים בהתבסס על התפוקה המותרת על ידי שטח הגידול הפוטוטרופי הזמין של החוקר. כמובן, "כלל האצבע" הנפחי הזה תלוי בקצב שבו בן הזוג הפוטוטרופי מסוגל להפריש פוטוסינתטים אורגניים (למשל, סוכרוז) שיכולים לשמש את בן הזוג ההטרוטרופי. לאחר שנקבעו תנאי גידול משותף, ניטור קפדני של ביצועי הגידול של שני בני הזוג לאורך זמן יספק נתונים חשובים לגבי יחסי המינים האידיאליים, במיוחד אם ניתן לשמור על תרביות משותפות מוקדמות במשך ימים עד שבועות, ובכך לאפשר לחוקר לזהות את יחס המצב היציב שהושג לקראת סוף התרבית המשותפת. ניתן להשתמש במידע זה בעת בחירת צפיפות החיסון הראשונית עבור כל מין שותף בניסויים הבאים כדי לעזור לתרבית להגיע מהר יותר ליחס המינים האידיאלי שנקבע בעצמה.

בחלק השני של הפרוטוקול ניתנות הוראות מפורטות לניתוח תרבות משותפת. כימות אמין של התרבויות המשותפות הוא המפתח ליישומם המוצלח: צמיחה (או לפחות פעילות מטבולית) של השותף הפוטוטרופי המפריש פחמן חיונית לשמירה על ההטרוטרופים. בעוד שהיחס בין ציאנובקטריה:הטרוטרופה המשמש לחיסון התרבית עשוי לא תמיד להיות קריטי לאופטימיזציה, מכיוון שתרבויות משותפות ארוכות טווח נוטות להתכנס לפרופורציות יציבות, ייתכן שחשוב לשלב שיטות לבדיקת צמיחה בלתי מרוסנת של כל אחד מבני הזוג באמצעות דילול תרבית או אנקפסולציה של מין אחד או יותר 36,38,39,40. כפי שהוזכר לעיל, תוצרי לוואי של השותף הציאנובקטריאלי עשויים להיות מעכבים להטרוטרוף בריכוזים גבוהים (למשל, O₂), ותוצרים מסוימים של מטבוליזם הטרוטרופי עלולים גם הם להזיק לבריאות הציאנובקטריאלית. רוב התרבויות המשותפות שפורסמו משתמשות בהטרוטרופים בעלי קצב גדילה מהיר יותר מרוב מיני הציאנובקטריה; לכן, קצב הגידול ההטרוטרופי נוטה להיות מוגבל על ידי אספקת הפחמן האורגני המיוצר על ידי הציאנובקטריום. עם זאת, קביעת דינמיקת שפע המינים לאורך זמן היא ערך קריטי להבהרת כשלים ביציבות ואופטימיזציה עבור תרבויות משותפות חזקות בגידול ארוך טווח.

ניתנים פרוטוקולים לכימות באמצעות תאי ספירה, מוני חלקיקים וציטומטריית זרימה של תא בודד. עם זאת, כל הטכניקות הן כלים בעלי ערך לאפיון תרבויות משותפות, עם תנאים מוקדמים, יתרונות ומגבלות שונות. תאי ספירה ישימים באופן נרחב מאוד לכימות תרבית משותפת, בתנאי שניתן להבחין חזותית בין כל השותפים בתרבית על ידי צורות התאים שלהם או תכונות אחרות. היתרון הגדול הוא המחיר הנמוך של מכשיר זה, כך שהוא בעצם בר השגה לכל מעבדה. מלבד מידע על הרכב התרבות המשותפת והיחס בין השותפים השונים, ניתן להתרשם מהמורפולוגיה והכושר של התא לצד זה, ולזהות מזהמים פוטנציאליים. עם זאת, היישום של תא הספירה גם גוזל זמן רב, מגיע עם עומס עבודה גבוה ויכול לתמוך רק בתפוקה נמוכה.

גם מוני חלקיקים וגם ציטומטריית זרימה של תא יחיד מספקים את היתרונות העצומים של תפוקה גבוהה וטיפול נוח וחוסך זמן. בעוד שמונה התאים מסתמך על הבדלים ברורים בגודל התאים של השותפים בתרבית המשותפת, ציטומטריה של תא בודד יכולה גם להבחין בתוויות פלואורסצנטיות, וכתוצאה מכך היכולת לכמת תרביות משותפות עם יותר משני חברים באותו גודל או אפילו שני מוטציות שונות של אותו אורגניזם על סמך סמנים פלואורסצנטיים שונים. בדוגמה שסופקה של הרכבה מלאכותית של Synechocystis עם S. cerevisiae ו-U. maydis, נעשה שימוש במדווחי הקרינה התוך-תאיים mKate2 ו-eGFP כדי להבחין בין שני השמרים. אותם מדווחים פלואורסצנטיים יכולים לשמש גם כדי להבחין בין שני זנים מהונדסים גנטית של אותו אורגניזם (למשל S. cerevisiae) שלא ניתן להפריד על סמך תכונות פיזור האור שלהם בלבד. אסטרטגיות דומות יושמו למעקב אחר קונסורציום חיידקים סינתטיים⁴¹. בהתאם לסוג התא, מספר השותפים בקונסורציום והטווח הפוטנציאלי של האוטו-פלואורסצנציה שלהם, בחירת הסמנים הפלואורסצנטיים זקוקה לתשומת לב נוספת כדי למנוע חפיפה של איכויות ספקטרליות, במיוחד בהתחשב בתכונות האוטו-פלואורסצנטיות של ציאנובקטריה. ⁴²

אנו תומכים כאן כיצד לדבוק בעקרונות המנחים של FAIR במונחים של אחסון, ניהול ושיתוף של נתונים מדעיים. FAIR הוא ראשי תיבות של Findable, Accessible, Interoperable and Reusable⁴³. ככל שעקרונות אלה זוכים לקבלה רחבה יותר, הם מבטיחים לשנות את נוף המחקר הביולוגי, ולקדם גישה פתוחה, שיתופית ויעילה יותר לניהול נתונים ושימוש בהם. בעוד שניתן להבטיח רכיבים קריטיים של נגישות על ידי הפקדת נתונים בהקשר מחקר מבואר (ARC)⁴⁴, חשוב לאפשר שכפול של שלבי עיבוד הנתונים באמצעות תוכנת גישה פתוחה. קבצי FCS גולמיים מאחסנים גם נתונים וגם מטא נתונים (מידע על לייזרים וגלאים, כולל אורכי גל, מסננים וכו') על ניסויי זרימה ציטומטרית⁴⁵. ניתן לטעון ולקרוא אותם מחוץ לתוכנה קניינית המאפשרת ניתוח נתונים מתוחכם, למשל, מספר חבילות זמינות לעבודה עם נתונים גולמיים בתוך סביבת Python. החבילה שפותחה מדגימה כיצד לטעון, לקרוא ולדמיין קבצי .fcs גולמיים המכילים נתוני ציטומטריה מחוץ לתוכנה הקניינית באמצעות אחת מהחבילות הרבות הזמינות ב-Python²³. שימוש בתוכנה פתוחה כמו שתוארה לעיל מבטל את הצורך בדמי רישוי יקרים הקשורים לתוכנה קניינית, מספק שליטה מלאה על עיבוד הנתונים (למשל, טרנספורמציה, פיצוי, שער) ובנוסף מאפשר שילוב של כלים רבים במקום אחד.

יתרון נוסף יקר ערך של שימוש בציטומטריה של תא בודד בשילוב עם סדרן תאים הוא ההזדמנות לאסוף גם תאים מסוג מובחן על ידי FACS. זה יכול להיות בעל ערך רב ליישום כל טכנולוגיות -omics לתובנות מפורטות לגבי האינטראקציה בין המינים בתוך התרבות המשותפת, כמו RNASeq או מטבולומיקה. החיסרון הברור של מכשירים אלה הוא המחירים הגבוהים שלהם, כך שהמחיר הסביר והזמינות של מכונות כאלה עשוי להוות מגבלה לכאורה במעבדות מסוימות.

מעניין לציין כי השוואה ישירה של השיטות המוצגות לכימות שלושת השותפים בקונסורציום חשפה התאמה טובה מאוד בין הטכניקות השונות, מה שמצביע על כך שהתערובת שהורכבה על סמך מדידות OD מכומתת באופן מהימן על ידי כל השיטות המתוארות. באופן מעניין, המספר הכולל של ציאנובקטריה היה גבוה פי 3-4 ממספר שני מיני השמרים, תופעה שככל הנראה נובעת מגודל התאים הקטן שלהם. תצפית זו תואמת היטב את הידע הרווח ש-ODs אינם מספקים מידע על מספרי תאים בפועל ללא כיול⁴⁶. השמרים, לעומת זאת, הראו ספירה ברמה דומה (טבלה 2 וטבלה 3). בנוסף, ההשוואה לכימות התרביות הבודדות מראה כי כל שלוש השיטות הן כלים אמינים להבחנה בין סוגי התאים, למעט מונה החלקיקים שלא הפריד בין שני מיני השמרים.

בעיקרו של דבר, יישומי ציטומטריה של תא בודד הם ללא ספק הכלי החזק ביותר לניטור הרכב התרבויות המשותפות, המאפשר ספירה של 1,000-10,000 תאים בשנייה. הדבר נכון במיוחד אם מספר בני הזוג גדל ליותר משניים או אם בני הזוג דומים בצורתם ו/או בקוטרם. יש לציין שישנן חלופות רבות המאפשרות ניטור של תרבויות משותפות. גידול של חיידקים המסומנים פלואורסצנטית בתרבויות משותפות יכול, למשל, להיות במעקב רציף על ידי פלואורימטריה או מיקרוביו-ריאקטורים⁴⁷. עם זאת, אלה מוגבלים לרוב לתרבית משותפת של שני שותפים ודורשים תכנון ניסיוני זהיר, למשל, בבחירת סמני הקרינה. ריצוף אמפליקון (ריצוף 16S rRNA) וטכניקות ריצוף אחרות מהדור הבא בשילוב עם ביואינפורמטיקה מתוחכמת היא אפשרות נוספת לאפיון קהילות סינתטיות 48,49,50. טכניקות אלו מתאימות לגישות תפוקה גבוהות ויכולות לטפל באינטראקציות מבוססות בגידולים ארוכי טווח, שאלות אבולוציוניות או מעקב אחר מוטציות עם שותפים מיקרוביאליים מרובים.

יחד, תרבויות מיקרוביאליות פשטניות שתוכננו באופן רציונלי מספקות גישה רבת עוצמה "מלמטה למעלה" לחקירת דינמיקה בין מינים שיכולה להיות קשה יותר לגישה בתוך קהילות מרובות מינים השולטות בעולם הטבע 51,52,53. כאן, מסופק פרוטוקול יעיל שעשוי להיות מותאם בקלות על ידי הקהילה המדעית להקמה וניתוח של זוגות חדשים של ציאנובקטריה ושותפים הטרוטרופיים. ניכר כי יש צורך במחקר רב הן כדי לנצל את התובנות הבסיסיות הפוטנציאליות שניתן להפיק מתרבויות משותפות מיקרוביאליות מלאכותיות והן כדי לקבוע אם קונסורציום מיקרוביאלי מתוכנן סינתטי יכול להתאים לפוטנציאל המיוחס להם לעתים קרובות בספרות ליישומים ביוטכנולוגיים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10x Ph1 אובייקטיביות	Carl Zeiss AG	46 04 01-9904
525/40 ננומטר מסנן פס פס	בקמן קולטר, בע"מ.	A01-1-0051	מסנן FITC (בלייזר 488 ננומטר)
מסנן פס פס 660/10 ננומטר	בקמן קולטר, בע"	A01-1-0055	ערוץ APC (בלייזר 638 ננומטר)
מסנן פס פס 710/50 ננומטר	בקמן קולטר, בע"	B71092	PC5.5 ערוץ (בלייזר 561 ננומטר)
Accuvettes עבור Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	A35473	כוסות לדוגמא עם מכסים
צמצם 30 μ M עבור Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	C92760	Capillary
Autoclave	Lab Associates	EQM-ARBP	לעיקור חומר
צלוחיות מבולבל ROTILABO®, צוואר ישר, 250 מ"ל	Carl Roth GmbH + Co. KG	LY95.1
BG11 / CoYBG11 רכיבים	ספקים		ראה טבלה 1
מסנן סטרילי על הבקבוק	Sigmaaldrich	Z222593	למדיה סטרילית אם אינך רוצה להשתמש בחיטוי
נימי 45 ומיקרו; m	Omni Life Science	OLS 5651738
CASY Cell Counter דגם TTC	Schaerfe Systems
כוסות CASY	Omni Life Science	OLS 5651794
CASYclean	Omni Life Science	OLS 5651786	פתרון ניקוי
CASYton Omni	Life Science	OLS 5651808	פתרון איזוטוני
צינורות צנטריפוגה (50 מ"ל)	Sigmaaldrich	CLS430828
CO2	BOC	270182-L	לאספקת ציאנובקטריה תרביות אקסניות ותרביות משותפות
CONTRAD® 70	Beckman Coulter, Inc.	81911	תמיסה לניקוי עמוק
כיסוי זכוכית 20 ופעמים; 26 x 0.4 מ"מ	VWR International GmbH	631-1190	כיסוי זכוכית לתא ספירה
Cuvettes	Sarstedt	67.742
Cyanobacteria BG-11 Freshwater Solution	Merck KGaA	C3061
CytExpert Software v. 2.6	Beckman Coulter, Inc.		תוכנת יישום ציטומטר
CytoFLEX נדן נוזל	בקמן קולטר, בע"מ	B51503	ציטומטר נוזל שיט
CytoFLEX S	בקמן קולטר, בע"מ		מנקה
BE51180 DxH עבור Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	628022	תמיסת ניקוי
צנטריפוגה צינור אפנדורף (קטנה)	Labstac	CEN16-15	לצנטריפוגה פחות מ-2 מ"ל תרבית
אתנול	Carl Roth GmbH + Co. KG	K928.1
צינורות FACS	בקמן קולטר, בע"	2523749	צינורות למצב חצי אוטומטי
FlowClean Cleaning Agent, 500 מ"ל	בקמן קולטר, בע"	C48093	פתרון נקי יומיומי
צילינדרים מדורגים	Sigmaaldrich	Z131121	להכנת מדיה
HEPPSO	Merck KGaA	R426725
Infors MultiTron פוטואינקובטור	Infors AG		אור LED לבן
IPTG	Merck KGaA	I6758	הכן אליקוטות, אחסן ב-20° C, להפשיר ולשמור על קרח
Isoton II עבור Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	8448011	תמיסה איזוטונית
קלוזה נ' 2.2	בקמן קולטר, בע"מ	B16406	תוכנת ניתוח נתוני ציטומטריה
KimWipes	VWR International GmbH	115-2221	רקמות נטולות מוך
KOH	Merck KGaA	221473
KPO3	Noah Chemicals	7790-53-6
כוסות מדידה	VWR	213-3747
לוחית בדיקה מיקרו, 96 באר, מכסה החלקה, בסיס שטוח, PS, שקוף	SARSTEDT AG & Co. KG	82.1581.001
בסיס מיקרוסקופ	Carl Zeiss AG	47 09 18-9902/16
ראש מיקרוסופ	Carl Zeiss AG	47 30 14
Milli-Q מערכת טיהור מים	Merck Millipore	C85358
Mulitisizer 4e מונה חלקיקים	בקמן קולטר, בע"מ.	B23005	אלטרנטיבה למונה התאים CASY
נויבאואר משופר, עומק 0.02 מ"מ	תא ספירה	גרמני מסייע
נויבאואר משופר, עומק 0.1 מ"מ	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	640010	תא ספירה
מוכן לשימוש יומי QC פלואורוספירות	בקמן קולטר, בע"	C65719	התייחסות לבקבוקי QC
SCHOTT	Dutscher	90347	לאחסון
Specord® 200 פלוס ספקטרופוטומטר	אנליטי Jena GmbH		OD600/750
סוכרוז	Merck KGaA	84100
צנטריפוגה שולחנית (גדולה)	Labstac	CEN18-06R	לאסוף תרבית ביומסה
שמרים בסיס חנקן, ללא חומצות אמינו, ללא אמוניום גופרתי	Thermo Fisher Scientific Inc.