הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חשיפת היסטון פרוטאופורמים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל 2D-TAU

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67321

⸱

18 באוקטובר 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center on Advanced Biochemistry and Molecular Biology, Department of Experimental and Clinical Medicine, Magna Græcia University of Catanzaro, 2Department of Pharmacy, Health and Nutritional Sciences, University of Calabria

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

שיטה זו מתארת אסטרטגיה פשוטה ומהירה לאפיון וחקירה של פרוטאופורמים של היסטון.

תקציר

היסטונים עוברים שינויים שונים לאחר התרגום (PTMs) כגון מתילציה, אצטילציה, זרחון, אצילציה ו-ubiquitination, השולטים בדינמיקת הנוקלאוזומים וקובעים את גורל התא. הנוקלאוזום, שהוא היחידה התפקודית של הכרומטין, מורכב מ-DNA, ארבעה זוגות היסטונים (H3, H4, H2A ו-H2B) המרכיבים את הליבה הכדורית, והיסטון המקשר H1, המייצב את מבנה הכרומטין. זנבות האמינו (N) הסופיים של ההיסטונים בולטים מתחומי הליבה הכדוריים ועוברים PTMs מובהקים המשפיעים על נוף הכרומטין. כמה עדויות מצביעות על כך שהומאוסטזיס PTM של היסטון הוא חיוני לשימור כל הפעילויות הפיזיולוגיות. דה-רגולציה של PTMs היסטון היא הגורם העיקרי לשגשוג תאים חריג, פלישה וגרורות. לכן, פיתוח שיטות לאפיון PTMs של היסטון הוא קריטי. כאן, אנו מתארים טכניקה יעילה לבידוד וניתוח איזופורמים של היסטון. השיטה, המבוססת על שילוב של שתי הפרדות אורתוגונליות, מאפשרת העשרה של איזופורמים של היסטון וזיהוי ספקטרומטריית המסה הבאה. הטכניקה, שתוארה במקור על ידי שכטר ועמיתיו, משלבת ג'לים פוליאקרילאמיד חומצה-אוריאה (TAU-GEL), שיכולים להפריד בין חלבוני היסטון בסיסיים על בסיס גודל ומטען, וג'לים של נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE), שיכולים להפריד חלבונים לפי משקל מולקולרי. התוצאה היא מפה דו-ממדית של איזופורמים של היסטון, המתאימה לעיכול בתוך הג'ל ואחריה זיהוי ספקטרומטריית מסה וניתוח כתמים מערביים. התוצאה היא מפה דו מימדית של איזופורמים של היסטון, המתאימה הן לעיכול בתוך הג'ל ואחריו זיהוי ספקטרומטריית מסה וניתוח כתמים מערביים. גישה פרוטאומית זו היא שיטה חזקה המאפשרת העשרה של איזופורם היסטון יחיד ואפיון של PTMs היסטונים חדשים.

מבוא

הופעת סרטן, התקדמותו ועמידות לכימותרפיה קשורים לאירועים גנטיים ואפיגנטיים, כולל PTMs של היסטון. היסטונים עוברים מגוון PTMs המווסתים את דינמיקת הכרומטין ומכתיבים את גורל התא1.

הנוקלאוזום הוא היחידה הפונקציונלית של הכרומטין והוא קומפלקס מולקולרי של DNA וחלבונים המאפשר לארוז DNA בגרעין. הוא מורכב מארבעה זוגות היסטונים (H3, H4, H2A ו-H2B) המהווים את ליבת הנוקלאוזום, כמו גם את היסטון המקשר H1, המסייע לייצב את מבנה הכרומטין. זנבות ההיסטונים אמינו (N) בולטים מתחומי הליבה הכדוריים שלהם ועוברים שינויים ספציפיים לאחר התרגום המשפיעים על נוף הכרומטין2.

עד כה, ידועים לפחות 23 סוגים של PTMs היסטונים. PTMs אלה הם שינויים קוולנטיים המורכבים בעיקר ממתילציה, אצטילציה, זרחון, גליקוזילציה, ubiquitylation, SUMOylation ו-ADP-ribosylation3. בנוסף, לאחרונה הוצע מתאם הדוק בין הומאוסטזיס אפיגנום לחיווט מחדש מטבולי, מה שמסביר את הגידול האקספוננציאלי של המספר האפשרי של היסטונים PTMs 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . PTMs של היסטון, מופקדים, נמחקים ומומרים על ידי אנזימים משנים, נקראים בהתאמה ככותבים, מוחקים וקוראים. הם משפיעים על התכונות הפיזיקליות והכימיות של מבנה הכרומטין, ומשפיעים על פרופיל ביטוי הגנים, כולל ביטוי גנים מדכאי גידול ואונקוגנים 14,15,16.

מספר היסטונים פרוטאופורמים גדל כאשר הם משולבים בנוקלאוזום כגרסאות היסטון. גרסאות אלה הן איזופורמים לא אלליים של היסטונים קנוניים, והן מוסיפות מורכבות על ידי שינוי התכונות הכימיות והפיזיקליות של כרומטין. בהשוואה להיסטונים קנוניים, לגרסאות היסטון יש תחומים פונקציונליים העוברים שינויים ייחודיים לאחר התרגום או מקיימים אינטראקציה עם רכיבי כרומטין ספציפיים, המשפיעים על הדינמיקה והיציבות של נוקלאוזום17.

בתאי סרטן, דה-רגולציה של PTMs וגרסאות היסטון משפיעה על פרופיל ביטוי הגנים, מה שמוביל לשגשוג תאים חריג, פלישה, גרורות והפעלת מסלולי עמידות לתרופות 3,18,19,20. מוטציות בתוך מתחמי שיפוץ היסטונים או כרומטין יכולות לשנות את הפנוטיפ של התא, ולתרום לטרנספורמציה ניאופלסטית. הצטברות של שינויים אפיגנטיים, כגון מתילציה של היסטון, היא גורם מפתח בהפעלת מסלולי עמידות לתרופות 21,22,23. מוטציות בתוך קומפלקס SWI/SNF, המורכב מ-15 תת-יחידות המקודדות על ידי 29 גנים, משפיעות על למעלה מ-20% ממקרי הסרטן האנושיים על פני סוגי גידולים רבים. בעשור האחרון פותחו אסטרטגיות תרופות מבוססות אפיגנטיקה (epi-drugs), ותרופות רבות המכוונות לסרטן עם דפוסי שינוי היסטון חריגים אושרו על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקני (FDA)23.

הניתוח של חלבוני היסטון הוא מאתגר למדי, מה שהופך אותו לתחום מחקר תובעני. לאחרונה, שיטות ספקטרומטריית מסה הפכו לדרך המועדפת לאפיון ולימוד פרוטאופורמים של היסטון. עם זאת, תנאי המיצוי הדרסטיים, בשילוב עם המסיסות הירודה של גרסאות מסוימות והומולוגיה של רצף גבוה, הופכים את הניתוח שלהם למאתגר.

בעשור האחרון פותחו מספר שיטות מבוססות ספקטרומטריית מסה לפרופיל וחקירה של היסטון 24,25,26,27. במחקר זה, אנו מציגים שיטה חסכונית ואמינה ליצירת מפה דו-ממדית של פרוטאופורמים היסטונים, שיכולה לשפר את הסיכוי לגילוי שינויים חדשים לאחר התרגום.

אלקטרופורזה דו-ממדית של אוניברסיטת תל אביב משלבת הפרדה בתנאים חומציים עם SDS PAGE. בממד הראשון, מצבו החומצי של המדיום נותן מטען חיובי נטו לחלבונים בסיסיים. מכיוון שהיסטונים הם חלבונים בסיסיים מאוד ובעלי נקודה איזואלקטרית גבוהה יותר (pH) בהשוואה לתווך, הם הופכים טעונים חיובית ונודדים תחת שדה חשמלי. בממד השני, היסטונים עוברים דנטורציה על ידי SDS ומופרדים על סמך משקלם המולקולרי. המפה הדו-ממדית המתקבלת יכולה לשמש ככלי להעשרת פרוטאופורמים ספציפיים ברזולוציה נקודתית אחת לניתוח ספקטרומטריית מסה ומחקרים אימונולוגיים28,29. לאחר אלקטרופורזה, ניתן לעכב כתמי TAU דו-ממדיים, לעכל טריפסין ולנתח אותם על ידי ספקטרומטריית מסה. לחלופין, ניתן למחוק את המפה הדו-ממדית של אוניברסיטת תל אביב על מסנן ניטרוצלולוז/PVDF ולחקור אותה על ידי צביעה חיסונית27.

בהקשר זה, השיטות עשויות להיות אסטרטגיות לשיפור הזיהוי והניתוח של שינויים חדשים לאחר התרגום הקשורים לחיווט מחדש מטבולי30,31.

שיפרנו עוד יותר את השיטה המקורית על ידי שילוב שלב סוניקציה, המסייע לפירוק DNA ושיפור מסיסות החלבון. בנוסף, הארכנו את שלב הדגירה למיצוי היסטון, על מנת לקבל דגימת חלבון בטוהר גבוה. יתר על כן, בפרוטוקול שלנו, הרצנו את הממד הראשון במתח נמוך למשך זמן ארוך יותר כדי להשיג רזולוציה טובה יותר. הג'ל שהתקבל שימש לחקירת PTMs היסטונים קנוניים ולאפיון שינויים חדשים כגון גליקציה10,32.

בסך הכל, פיתחנו שיטה לחילוץ וטיהור היסטונים, ואחריה רזולוציה של פרוטאופורמים של היסטונים באמצעות מפה דו מימדית. העבודה כוללת גם נוהל לעיכול בתוך הג'ל לניתוח ספקטרומטריית מסה והשלבים לניתוח כתמים מערביים דו מימדיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מיצוי היסטון

  1. בצע מיצוי היסטון מלפחות 1 x 106 תאים, שהם 80% מתלכדים. עבור הניסוי הזה, השתמשנו בשורות תאים MCF-10A מ-ATCC. לאחר הציפוי, יש לשטוף תאים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) 1x. בצע את כל השלבים על הקרח.
  2. הכן מאגר ליזה של תאים המכיל 10 מ"מ Tris-HCl pH 8.0, 1 מ"מ KCl ו-1.5 מ"מ MgCl2. יש להוסיף 1 מ"מ דיתיאוריתריטול ומעכבי פרוטאז ופוספטאז ממש לפני השימוש.
  3. הוסף 800 מיקרוליטר של מאגר ליזה תאים לצלחת הפטרי המכילה תאים, גרד ואסוף את התאים בצינור של 1.5 מ"ל, ולאחר מכן דגר על מסובב ב-300 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס למשך שעה.
  4. צנטריפוגטה בטמפרטורה של 10,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות במיקרו-צנטריפוגה מקוררת מראש עם מסובב לצינורות של 1.5 מ"ל.
  5. שטפו את הגלולה עם 400 מיקרוליטר של מאגר ליזה תאים וצנטריפוגה בטמפרטורה של 10,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט. חזור על שלב הכביסה 3x.
    הערה: השתמש במיקרו-צנטריפוגה מקוררת מראש (4 מעלות צלזיוס) עם מסובב לצינורות של 1.5 מ"ל עבור כל השלבים. טפל בגלולה בזהירות כדי למנוע אובדן חומר.
  6. השעו מחדש את הגלולה ב-640 מיקרוליטר של 0.2 מ"ש2SO4 ודגרו על מסובב ב-300 סל"ד, ב-4 מעלות צלזיוס, למשך 16 שעות.
    זהירות: חומצה גופרתית היא כימיקל מסוכן; אנא השתמש בו מתחת למכסה אדים כימי.
  7. צנטריפוגה בטמפרטורה של 16,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות. העבירו את הסופרנטנט לשפופרת טרייה ואחסנו אותו עד לשלבים הבאים. השליכו את הפסולת הגרעינית.
  8. לזרז היסטונים על ידי הוספת 212 מיקרוליטר של חומצה טריכלורואצטית, טיפה אחר טיפה (הריכוז הסופי של TCA הוא 33%). מערבבים את התמיסה על ידי היפוך הצינור פי 10. דגירה על קרח, בחושך, למשך 16 שעות.
    זהירות: TCA הוא כימיקל מסוכן; השתמש מתחת למכסה אדים כימי.
  9. גלולה היסטונים על ידי סיבוב בצנטריפוגה מקוררת מראש ב-16,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את הסופרנטנט ושטוף את הגלולה פי 3 עם 200 מיקרוליטר אצטון קר.
  10. השעו מחדש את הגלולה עם אצטון קר, ולאחר מכן סוניקט בעוצמה גבוהה פי 2 עם 3 מחזורים של 30 שניות הפעלה/כיבוי, לסירוגין עם הפסקה של 10 דקות על הקרח.
    הערה: ההליך נעשה באמצעות אולטרסאונד. שלב זה חיוני לחיסול DNA עטוף היסטון.
  11. צנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 10 דקות, השליכו אצטון והשעו מחדש את הדגימה ב-100 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפולים. קבע את ריכוז החלבון בשיטת בדיקת ברדפורד, על פי הוראות היצרן33.
    הערה: לאחר צנטריפוגה, הכדור נראה לפעמים לבן או שקוף. משקע לבן ואטום יכול להצביע על נוכחות של מזהמי מלח שעלולים לפגוע בהפרדה הדו-ממדית. אם כן, חזור על שלבי שטיפת האצטון עד שהגלולה הופכת לשקופה.
  12. ליופיליזציה של 70 מיקרוגרם היסטונים, על פי הוראות היצרן. כוונו את הליופילייזר ל-30 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. בדוק את נפח הצינור וחזור על הצעד ב-30 מעלות צלזיוס עד שהדגימה עוברת ליופיליזציה מלאה (בדרך כלל, יש צורך ב-90 דקות כדי ליופיליזציה מלאה של הדגימה). לאחר 60 דקות, בדוק את עוצמת הקול כל 10 דקות מכיוון שהתהליך תלוי במדגם.
    הערה: אם כמות חלבוני ההיסטון נמוכה, התחל מ -2 x 106 תאים. במקרה זה, השתמש באותו נפח של ריאגנטים המשמשים ל -1 x 106 תאים. בדוק את טוהר כל הכימיקלים המשמשים במהלך ההליך; כל הריאגנטים חייבים להיות בדרגת HPLC.

2. אלקטרופורזה מיני דו-ממדית ג'ל טריטון-חומצה-אוריאה (TAU)

  1. הכן ג'ל מיני TAU למערכת אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד אנכית כמתואר להלן.
    1. הכנת ג'ל הפרדה: 6 M אוריאה, 15% אקרילאמיד/ביסקרילאמיד (29:1), 5% חומצה קרחונית אצטית, 0.25% טריטון X-100 (v/v), 0.4% TEMED (v/v), 0.1% APS (p/v). להכנת התמיסה, ממיסים אוריאה באקרילאמיד/ביס ו-1 מ"ל מים טהורים במיוחד עם תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר; הוסף את שאר הרכיבים והתאם את עוצמת הקול. עבור ג'ל מיני TAU, הכינו 10 מ"ל תמיסה. מלאו את צלחות הג'ל המוגדרות מראש בתמיסה, והימנעו מהיווצרות בועות אוויר במרחק של 1.5 ס"מ בלבד מלמעלה. מכסים את התמיסה ב -1 מ"ל איזופרופנול כדי ליישר את הג'ל.
    2. הכן ג'ל ערימה: 6 M אוריאה, 6% אקרילאמיד/ביסקרילאמיד (29:1), 5% חומצה קרחונית אצטית, 0.25% טריטון X-100 (v/v), 0.4% TEMED (v/v), 0.1% APS (p/v). להכנת התמיסה, ממיסים אוריאה באקרילאמיד/ביס ו-1 מ"ל מים טהורים במיוחד; הוסף את שאר הרכיבים והתאם לנפח. מלאו צלחות ג'ל בתמיסת ערימה, הניחו מסרק ג'ל 10 בארות בין הצלחות והכניסו אותו עד שתמיסת הג'ל מגיעה באמצע שיני המסרק. הניחו לג'ל להתפלמר 16 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: הכנס בזהירות את המסרק כדי להבטיח היווצרות קבועה של בארות.
  2. הכן 100 מיקרוליטר של מאגר דגימת TAU על ידי המסת 6 M אוריאה, 5% חומצה קרחונית אצטית ומים מזוקקים כפולים. ממיסים את הדגימה הליופילית שהוכנה ב-30 מיקרוליטר של מאגר דגימת TAU.
  3. מלאו את המיני קסטה במאגר ריצה של אוניברסיטת תל אביב, ריכוז סופי של 5% חומצה אצטית. שוטפים את בארות ה- TAU-gel עם מזרק מלא במאגר רץ וטוענים את הדגימה בבאר באמצעות מיקרופיפטה.
  4. חבר את התא האלקטרופורטי לאספקת החשמל, כאשר האלקטרודה החיובית (האדומה) מונחת בתחתית. שימו לב, כאשר IP > pH, חלבונים טעונים חיובית, כך שהנדידה היא מאלקטרודה חיובית לשלילית. הפעל את הג'ל תחילה ב -30 וולט למשך 70 דקות, ואז במתח קבוע של 25 וולט למשך 17 שעות.
    הערה: במהלך תקופה זו, כבה מדי פעם את אספקת החשמל ושטוף את בארות הג'ל באמצעות מזרק חד פעמי. שימו לב להסרת בועות מהמשטח התחתון של הג'ל באמצעות מזרק כדי למנוע אובדן דגימה ונוכחות של מריחה בחלבונים שנפתרו.
  5. מוציאים את הג'ל מצלחות הג'ל וחותכים את קו העניין בעזרת אזמל נקי. טפל בזהירות בג'ל כדי למנוע שבירת ג'ל. מכיוון שקו העניין הוא חסר צבע, טען את הדגימה בבאר מספר 1 כדי לזהות ולחתוך במדויק את נתיב העניין.
    הערה: כדי לבדוק את ההפרדה על ג'ל mini-TAU, הכן והפעל את הדגימה בשכפול. ניתן לצבוע את אחד הג'לים הללו באמצעות Coomassie Brilliant Blue. דפוס ההפרדה מדווח באיור 1A.
  6. שטפו את הנתיב עם 15 מ"ל של 0.5 מ' Tris-HCl pH 8.8 למשך 15 דקות.
  7. הכן 15 מ"ל של מאגר שיווי משקל 1 באמצעות 6 M אוריאה, 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, 30% גליצרול, 20% SDS ו-2% דיתיאוריתריטול. הכן 15 מ"ל של מאגר שיווי משקל 2, תוך שימוש ב-6 M אוריאה, 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, 30% גליצרול, 20% SDS ו-2% יודואצטמיד. הכן את מאגר שיווי המשקל 1 ו -2 ממש לפני השימוש; אחסן את מאגר שיווי המשקל 2 בחושך.
  8. דגרו את נתיב הג'ל, תחת תסיסה עדינה, ב-10 מ"ל של מאגר שיווי משקל 1 למשך 15 דקות, ואז שפכו. דגרו את נתיב הג'ל, תחת תסיסה עדינה, עם 10 מ"ל של מאגר שיווי משקל 2 למשך 15 דקות בחושך, ואז שפכו.
  9. הכן ג'ל אקרילאמיד SDS 15% נמסר על ידי ביצוע טבלה 1. הגדר את צלחת הג'ל ומלא אותה בתמיסת הג'ל הפתרון. מלאו את התמיסה עד שהיא נמצאת במרחק של 1.5 ס"מ מקצה צלחת הג'ל הארוכה. שים 1 מ"ל איזופרופנול על פני השטח כדי ליישר את הג'ל ולאפשר לו להתפלמר.
  10. לאחר פילמור ג'ל, יש לשפוך את האיזופרופנול ולייבש את הבאר עם נייר כרומטוגרפיה תאית 3 מ"מ Chr. הכנס את הנתיב שנוצר משלב 8 לבאר הג'ל.
  11. אטום את הנתיב לג'ל הממיס עם תמיסת איטום של 0.5% נקודת התכה נמוכה אגרוז במאגר 1x Tris/glycine/SDS ו-5 מיקרוליטר של 0.003% ברומופנול כחול. אפשר פילמור ג'ל אגרוז למשך 30 דקות.
    הערה: הימנע מהיווצרות בועות אוויר במהלך איטום אגרוז כדי למנוע מריחת ג'ל.
  12. הכניסו את צלחות הג'ל לקסטה ומלאו במאגר 1x Tris/glycine/SDS. יש למרוח את הג'ל על 120 וולט עד שהצבע הכחול ברומופנול מגיע לתחתית. הסר בעדינות את הג'ל מהצלחות, השליך את עודפי האגרוז והכתים את הג'ל בכסף באמצעות הליך התואם לספקטרומטריית מסה או כתם לבדיקה אימונולוגית.

3. מכתים כסף 32

  1. הכן את הריאגנטים הבאים - מקבע: 50% מתנול, 5% חומצה אצטית, 45% מים נטולי יונים; תמיסת שטיפה: 50% מתנול, 50% מים נטולי יונים; רגיש: 0.02% Na2S2O3 5H2O במים נטולי יונים; מגיב כסף: 0.1% כסף חנקתי במים קרים (4 מעלות צלזיוס) נטולי יונים; מפתח: 0.04% פורמלין ו-2% Na2CO3, פורמלדהיד (37%) (הוסף ממש לפני השימוש) 0.4 מ"ל מים נטולי יונים ומילוי עד 1000 מ"ל; עצור-מגיב : 5% חומצה אצטית; תמיסת אחסון ג'ל: 1% חומצה אצטית.
    הערה: מכיוון שכימיקלים המשמשים לצביעה מסוכנים, בצע את כל השלבים מתחת למכסה אדים כימי.
  2. בצע את ההליך בטבלה 2 תוך התחשבות בדברים הבאים. בצע את כל הדגירות בתסיסה עדינה. הכן את מגיב העצירה לפני תחילת שלב הפיתוח; זה יבטיח התפתחות ג'ל בעוצמה המתאימה. במהלך שלב ההתפתחות, כתמים יופיעו כאותות צהובים שיהפכו לחומים בהירים בסוף הדגירה. עוצמת הכתמים השונים תהיה תלויה בכמות פרוטאופורמים של היסטון. הג'ל מוכן לכריתה נקודתית ולעיכול בתוך הג'ל (איור 1B)

4. עיכול בתוך ג'ל

  1. הכן את התמיסות הבאות: 50 מ"מ אמוניום ביקרבונט (NH4HCO3)/50% (v/v) אצטוניטריל; 10 מ"מ דיתיותרייטול (DTT) ב-50 מ"מ NH4HCO3; 55 מ"מ יודואצטמיד (IAA) ב-50 מ"מ NH4HCO3; 0.1% TFA; 50 מ"מ NH4HCO3, pH 8; אצטוניטריל בדרגת HPLC; צינורות סיליקון 1 מ"ל.
    הערה: כדי לעקוף זיהום קרטין אנושי, משיער או עור, השתמש בכפפות נקיות ועבוד באזור נקי.
  2. הסר כתמי היסטון מעניינים מהג'ל המוכתם באמצעות אזמל נקי והנח אותם בשפופרת סיליקון טרייה (1.5 מ"ל). הקפד לכרות נקודה אחת ולהכניס אותה לצינור יחיד כדי למנוע זיהום צולב איזופורמי.
  3. הוסף לכל נקודת ג'ל 250 מיקרוליטר של 50 מ"מ NH4HCO3/50% אצטוניטריל ודגירה תחת ערבוב עדין בתרמו-מיקסר בטמפרטורת החדר. שפכו את התמיסה וחזרו על שלב זה 3x. חתיכות ג'ל ייראו שקופות.
  4. ייבש כתמי ג'ל על ידי הוספת אצטוניטריל (200 מיקרוליטר). בשלב זה חתיכות הג'ל יקבלו צבע אטום-לבן.
  5. מזלפים אצטוניטריל ומניחים לייבוש באוויר למשך 10 דקות. חתיכת הג'ל תיראה מיובשת בצינור. הפחתה ואלקילציה אינם חיוניים מכיוון שחלבוני היסטון הופחתו ועברו אלקילציה במהלך שלב שיווי המשקל.
  6. לחות כתמי ג'ל ב -20 מיקרוליטר של תמיסת טריפסין (0.1 מ"מ HCl) או נפח מספיק כדי לכסות את חתיכות הג'ל. מניחים את הצינורות בתרמו-מיקסר ומדגרים, תחת תסיסה עדינה, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות עד 16 שעות.
  7. העבירו את הסופרנטנט המכיל את הפפטידים הטריפטיים לשפופרת חדשה. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת מיצוי (60% אצטוניטריל, 1% TFA) לחתיכות הג'ל וסוניקט 2x באמבט מים קולי למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  8. העבירו את הסופרנטנט, המכיל פפטידים טריפטיים נוספים, לצינור הטרי. השתמש בליופילייזר כדי לייבש את הפפטידים שחולצו באגרוף. הגדר את הליופילייזר ל-30 מעלות צלזיוס וייבש את התמיסה; גלולה ליופילית תופיע בצינור.
    הערה: שלב זה תלוי באמצעי אחסון; בדרך כלל, שעה אחת מספיקה, אך בדוק את עוצמת הקול כל 10 דקות עד שהדגימה מתייבשת לחלוטין.
  9. מוסיפים 15 מיקרוליטר של 0.1% TFA לכל צינור ודוגרים בעדינות בתרמו-מיקסר ב-25 מעלות צלזיוס. העבר את הסופרנטנט לבקבוקון לניתוח LC-MS/MS.

5. כתם מערבי 2DTAU

  1. הכן את מאגר ההעברה, בסיס טריס 250 מ"מ, גליצין 92 מ"מ ומתנול 10% באמצעות מים מזוקקים כפולים.
  2. חותכים את קרום הניטרוצלולוזה ואת נייר הסינון למידות הג'ל.
  3. מאזנים את הג'ל ומשרים את הממברנה, נייר הסינון וניירות הסינון במאגר ההעברה למשך 15 דקות. השתמש בממברנות ניטרוצלולוזה או PVDF. אם אתה משתמש בממברנות PVDF (פוליווינילידן דיפלואוריד), הפעל אותן על ידי השרייה ב-100% MetOH.
  4. הכן את כריך הג'ל בקסטה להעברה חצי יבשה באופן הבא: אלקטרודה שלילית/נייר פילטר/ג'ל/קרום ניטרוצלולוז/נייר פילטר/אלקטרודה חיובית. הסר את כל בועות האוויר בין הג'ל לממברנה כדי להבטיח תוצאות טובות.
  5. הנח את הקסטה ביחידה חצי יבשה והפעל את הכתם ב-25 וולט למשך 30 דקות. בסוף, פרק את כריך הספיגה ואחסן את הממברנה לבדיקה האימונולוגית. בדוק את יעילות ההעברה עם צביעת פונסו. סמן את הממברנה עם שלט בפינה השמאלית העליונה כדי לשמור על כיוון המסנן הנכון.
  6. דגירה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים כתלות בניסוי (איור 2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באיור 1A, אפשר לראות כיצד חלבוני היסטון נודדים בג'ל חד-ממדי. זהו צעד מקדים חשוב להבנת זמן הריצה של הממד הראשון. לאחר שנקבע זמן ההפרדה הנכון, הפעל את הממד השני. המפה הדו-ממדית של פרוטאופורמים היסטונים מציגה דפוס טופוגרפי ייחודי (איור 1B). כל נקודה באיור 1B מייצגת סוג היסטון ספציפי. שימו לב לאזור המדויק של הג'ל שבו ניתן למצוא כל פרוטאופורם היסטון. זיהוי ספקטרומטריית המסה עבור כל פרוטאופורם היסטון מדווח ב-Perri et al....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעשור האחרון, הטיפול בחולי סרטן עבר מהפכה על ידי זיהוי שינויים מולקולריים שונים המניעים את התפתחות הסרטן והתקדמותו. ההתקדמות המשמעותית ביותר באונקולוגיה המודרנית היא פיתוח טיפול המבוסס על ניתוח מולקולרי מקיף. ההתקדמות הטכנולוגית בגנומיקה ובפרוטאומיקה מילאה תפקיד מכריע באפיון סמנים ביולוגיים ספציפיים לגילוי מוקדם, מעקב, פרוגנוזה וניטור תרופות. פרוטאומיקה מוגדרת כניתוח של השלמת החלבון השלמה של תא, רקמה או אורגניזם בתנאי מסוים, והיא כוללת גם חקר אינטראקציות חלבון, שינויים לאחר תרגום ולוקליז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

העבודה נתמכה על ידי PRIN2022, DS, CF ו-AC נתמכו על ידי PRIN2022, ו-MLC נתמכה על ידי תוכנית הדוקטורט באונקולוגיה מולקולרית, בית הספר לתוכנית הדוקטורט של UMG. העבודה נתמכה גם על ידי פרויקט PNRR INSIDE CUP: B83C22003920001

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,4-דיתיאוריתריטולSIGMA- אולדריץ'D8255 מגיב לתחזוקה ומינוס; קבוצות SH במדינה המצומצמת; מפחית כמותית דיסולפידים.
1,5 M Tris-HCL buffer, pH 8.8BIO-RAD161-0798מאגר ג'ל פותר
10x Tris/Glycine/SDS ביו-רד 1610772השתמשו במאגר הריצה 10x Tris/glycine/SDS המעורבב מראש כדי להפריד דגימות חלבון על ידי SDS-PAGE.
2-פרופנולSIGMA-ALDRICH335392-פרופנול (איזופרופנול) הוא אלכוהול משני. הוא נבדק כתחליף לדלק לשימוש בתאי דלק שונים. אבקת CuO מומסת ב-2-פרופנול שימשה לסינתזה בסיוע אבלציה בלייזר של קולואידים Cu. השעיה של 2-פרופנול עם Zn (NO3) 2 שימשה לייצור פוטואנודה של נירוסטה מצופה טיטניום דו חמצני (P25-TiO2 / SS) המצופה בשכבה עבה אחידה של P25-TiO2. פוטואנודה זו שימשה לתהליך הפירוק האלקטרוכימי הפוטו-קטליטי (ECPC).
30% אקרילאמיד/תמיסת BIS BIO-RAD16101582.6% Crosslinker. מגיב טוהר אלקטרופורזה 
חומצה אצטית קרחוןקרלו ארבה ריגנטס401392חומצה אצטית היא מגיב כימי חשוב עם יישומים תעשייתיים רבים.
אצטוןPanreac Applichem211007.1214אצטון  הוא ממס, הידוע בזכות הרבגוניות שלו ביישומי מעבדה, ייצור וניקוי שונים.
83640320VWR אצטוניטילעבור HPLC    אגרוז
Invitrogen15510-027אגרוז  הוא a  הטרופוליסכריד  משמש לעתים קרובות בביולוגיה מולקולרית.
אמוניום ביקרבונטSIGMA-ALDRICHA6141מינימום 99,0%
אמוניום פרסולפטSIGMA-ALDRICHA3678לביולוגיה מולקולרית, לאלקטרופורזה, ≥ 98% 
Bioruptor plusDiagenodeB01020001 - B01020002- B01020003סוניקטור
DithiothreitolSIGMA- ALDRICHD9163-5Gחומר מפחית המשמש להפחתת קשרי דיסולפיד בחלבונים.
ערכת כתמי כסף Dodeca BIO-RAD161-0480ערכת כתמי הכסף של Dodeca קלה לשימוש לאיתור רמות נוןגרם של חלבונים בג'לים פוליאקרילאמיד.
גליצרולGE - Healthcare Life Sciences171325010Lגליצרול הוא תרכובת טריול פשוטה, הוא מעורב כדי לסייע ביציקת ג'ל שיפוע, מייצב חלבון ורכיב חיץ אחסון.
מעכב פוספטאז עצור Thermo SCIENTIFIC78428קוקטייל מעכב פוספטאז Thermo Scientific Halt משמר את מצב הזרחן של חלבונים במהלך ואחרי ליזיס תאים או מיצוי חלבון רקמות  קוקטייל חד פעמי (100X).   
מעכב פרוטאז עצור Thermo SCIENTIFIC78430קוקטייל מעכב פרוטאז Thermo Scientific Halt (100X) הם תמיסות מלאי מרוכזות מוכנות לשימוש של מעכבי פרוטאז לתוספת לדגימות למניעת פירוק פרוטאוליטי במהלך ליזיס תאים ומיצוי חלבון. קוקטייל חד פעמי (100X).   
חומצה הידרוכלוריתSIGMA-ALDRICHH1758BioReagent, לביולוגיה מולקולרית
יודואצטמידSIGMA-ALDRICHI6125≥ 99% (NMR), גבישי
KClSIGMA-ALDRICHP9541אשלגן כלורי, KCl, IS  משמש בדרך כלל בשגרת מעבדה. השימוש בו כמאגר אחסון לאלקטרודות pH וכפתרון ייחוס למדידות מוליכות מבוסס היטב.
קו תאים MCF10atccCRL-10317 קו תאי אפיתל שבודד בשנת 1984 מבלוטת החלב של אישה לבנה בת 36 עם שדיים פיברוציסטיים. קו תאים זה הופקד על ידי קרן הסרטן של מישיגן.
MgCl2SIGMA-ALDRICH208337מגנזיום כלוריד הוא מוצק גבישי חסר צבע.
N,N,N',N'-Tetramethylethylene-diamineSIGMA-ALDRICHT9281לאלקטרופורזה, כ. 99%
מאגר מי מלח פוספט 1XCorning153736311 X PBS (מי מלח חוצץ פוספט) is  חוצץ  תמיסת מלח מאוזנת  משמש למגוון יישומים ביולוגיים ותרביות תאים, כגון שטיפת תאים לפני דיסוציאציה, הובלת תאים או רקמות, דילול תאים לספירה והכנת ריאגנטים.
אשלגן הקסציאנופראטSIGMA-ALDRICH60299מקבל אלקטרונים, המשמש במערכות הכוללות הובלת אלקטרונים,
תמיסת SDS 20% (w/v) BIO-RAD161-0418נתרן דודציל סולפט. מגיב טוהר אלקטרופורזה 
נתרן תיוסולפט, ריאגנט פלוס 99%SIGMA-ALDRICH21,726-3נתרן תיוסולפט, ריאגנט פלוס 99%
חומצה גופרתיתSIGMA-ALDRICH339741חומצה גופרתית, ריאגנט, IS  חומצה קורוזיבית במיוחד שמגיעה כנוזל צהבהב מעט צמיג. הוא מסיס במים והוא חומצה דיפרוטית. יש לו תכונות מאכלות, מייבשות ומחמצנות חזקות מאוד, כמו גם היותו היגרוסקופי.
חומצה טריכלורואצטיתSIGMA-ALDRICHT6399-5Gחומצה טריכלורואצטית (TCA) היא  משמש כמגיב למשקעים של חלבונים1,2 וחומצות גרעין3. 
חומצה טריפלואורואצטיתRiedel-de Haë n34957חומצה טריפלואורואצטית
טריטון X-100SIGMA- ALDRICHT9284-1Lטריטון X-100 הוא חומר פעילי שטח פוליאוקסיאתילן לא יוני המשמש לרוב למיצוי והמסת חלבונים.
טריפסין מלבלב חזירSIGMA-ALDRICHT6567Proteomics Grade, BioReagent, דימתילציה
UREASIGMA-ALDRICH33247אוריאה הוא חומר כאוטרופי ומשמש לדנטורציה של חלבונים. זה מפריע לקשרי המימן במבנה המשני, השלישוני והרבעוני של חלבונים. זה יכול גם להפריע לקשרי מימן הקיימים במבנה המשני של ה-DNA
בדרגת LC-MS

מקורות

  1. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  2. Cutter, A. R., Hayes, J. J. A brief review of nucleosome structure. FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).
  3. Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  4. Sun, L., et al. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
  5. Kinnaird, A., et al. Metabolic control of epigenetics in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (11), 694-707 (2016).
  6. Díaz-Hirashi, Z., et al. Metabolic reprogramming and signaling to chromatin modifications in tumorigenesis. Adv Exp Med Biol. 1219, 225-241 (2020).
  7. Panatta, E., et al. Metabolic regulation by p53 prevents R-loop-associated genomic instability. Cell Rep. 41 (5), 111568(2022).
  8. Scumaci, D., Zheng, Q. Epigenetic meets metabolism: novel vulnerabilities to fight cancer. Cell Commun Signal. 21 (1), 249(2023).
  9. Chiaradonna, F., Scumaci, D. Cancer metabolism as a new real target in tumor therapy. Cells. 10 (6), 1393(2021).
  10. Scumaci, D., et al. DJ-1 proteoforms in breast cancer cells: The escape of metabolic epigenetic misregulation. Cells. 9 (9), 1968(2020).
  11. Olivo, E., et al. Moving beyond the tip of the iceberg: DJ-1 implications in cancer metabolism. Cells. 11 (9), 1432(2022).
  12. Zheng, Q., Maksimovic, I., Upad, A., David, Y. Non-enzymatic covalent modifications: a new link between metabolism and epigenetics. Protein Cell. 11 (6), 401-416 (2020).
  13. Maksimovic, I., David, Y. Non-enzymatic covalent modifications as a new chapter in the histone code. Trends Biochem Sci. 46 (9), 718-730 (2021).
  14. Lowe, B. R., et al. Histone H3 mutations: an updated view of their role in chromatin deregulation and cancer. Cancers. 11 (5), 660(2019).
  15. Karsli-Ceppioglu, S. The epigenetic landscape of promoter genome-wide analysis in breast cancer. Sci Rep. 7 (1), 6597(2017).
  16. Yang, C., et al. Histone methyltransferase and drug resistance in cancers. J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 173(2020).
  17. Vardabasso, C., et al. Histone variants: emerging players in cancer biology. Cell Mol Life Sci. 71 (3), 379-404 (2014).
  18. Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. Epigenetic alterations in cancer. Front Biosci. 25 (6), 1058-1109 (2020).
  19. Liu, Y., et al. Histone H2AX promotes metastatic progression by preserving glycolysis via hexokinase-2. Sci Rep. 12 (1), 3758(2022).
  20. Nowsheen, S., et al. ZNF506-dependent positive feedback loop regulates H2AX signaling after DNA damage. Nat Commun. 9 (1), 2736(2018).
  21. Ribeiro-Silva, C., Vermeulen, W., Lans, H. SWI/SNF: Complex complexes in genome stability and cancer. DNA Repair. 77, 87-95 (2019).
  22. Yang, Y., Wang, Y. Role of epigenetic regulation in plasticity of tumor immune microenvironment. Front Immunol. 12, 640369(2021).
  23. Miranda Furtado, C. L., et al. Epidrugs: targeting epigenetic marks in cancer treatment. Epigenetics. 14 (12), 1164-1176 (2019).
  24. Thomas, S. P., et al. A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: best practices and pitfalls. Methods. 184, 53-60 (2020).
  25. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  26. Kwak, H. G., Dohmae, N. Proteomic characterization of histone variants in the mouse testis by mass spectrometry-based top-down analysis. Biosci Trends. 10, 357-364 (2016).
  27. Sidoli, S., Simithy, J., Karch, K. R., Kulej, K., Garcia, B. A. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-Orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Anal Chem. 87, 11448-11454 (2015).
  28. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
  29. Basak, S. K., Ladisch, M. R. Correlation of electrophoretic mobilities of proteins and peptides with their physicochemical properties. Anal Biochem. 226 (1), 51-58 (1995).
  30. Nuccio, A. G., Bui, M., Dalal, Y., Nita-Lazar, A. Mass spectrometry-based methodology for identification of native histone variant modifications from mammalian tissues and solid tumors. Methods Enzymol. 586, 275-290 (2017).
  31. Zhang, S., Roche, K., Nasheuer, H. P., Lowndes, N. F. Modification of histones by sugar β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) occurs on multiple residues, including histone H3 serine 10, and is cell cycle-regulated. J Biol Chem. 286 (43), 37483-37495 (2011).
  32. Perri, A. M., et al. Histone proteomics reveals novel post-translational modifications in breast cancer. Aging. 11, 11722-11755 (2019).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  34. Omenn, G. S., et al. Research on the human proteome reaches a major milestone: >90% of predicted human proteins now credibly detected, according to the HUPO human proteome project. J Proteome Res. 19 (12), 4735-4746 (2020).
  35. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  36. Starkova, T. Y., et al. The profile of post-translational modifications of histone H1 in chromatin of mouse embryonic stem cells. Acta Naturae. 11 (2), 82-91 (2019).
  37. García-Giménez, J. L., et al. Histone carbonylation occurs in proliferating cells. Free Radic Biol Med. 52 (8), 1453-1464 (2012).
  38. García-Saura, A. G., Schüler, H. PARP10 multi-site auto- and histone MARylation visualized by acid-urea gel electrophoresis. Cells. 10, 654(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדיPTMs של היסטוניםספקטרומטריית מסותמבנה הכרומטיןSDS-PAGEעיכול בתוך הג'לצביעה בכסףמודיפיקציות אפיגנטיות
חשיפת היסטון פרוטאופורמים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל 2D-TAU
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.