Method Article

גישת סינון בתפוקה גבוהה להערכת הזיקה המחייבת של מזהמים סביבתיים לקולטנים גרעיניים

DOI:

10.3791/67327

⸱

September 20th, 2024

 , 
1School of Public Health, Qingdao University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר מערכת סינון בעלת תפוקה גבוהה המשתמשת בקיטוב פלואורסצנטי של בדיקה פלואורסצנטית ספציפית הנקשרת לקולטן גרעיני כקריאה לסינון מזהמים סביבתיים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רמות הולכות וגדלות של תרכובות התגלו בסביבה, הגורמות לזיהום נרחב ומהוות סיכונים לבריאות האדם. עם זאת, למרות הופעתם הסביבתית הגבוהה, יש מידע מוגבל מאוד לגבי השפעותיהם הטוקסיקולוגיות. יש צורך דחוף לפתח שיטות סינון בתפוקה גבוהה (HTS) להנחיית מחקרים טוקסיקולוגיים. במחקר זה פותחה בדיקת קשירת קולטן-ליגנד באמצעות מערכת HTS כדי לקבוע את עוצמת הקישור של מזהמים סביבתיים על קולטנים גרעיניים. הבדיקה מתבצעת באמצעות קורא מיקרו-פלטות (כלומר, צלחת בת 96 בארות המכילה כימיקלים שונים) על ידי מדידת קיטוב הקרינה (FP) של בדיקה פלואורסצנטית ספציפית. בדיקה זו מורכבת מארבעה חלקים: בנייה וטרנספורמציה של וקטורים רקומביננטיים, ביטוי וטיהור של חלבון הקולטן (תחום קשירת ליגנד), קשירת קולטן-בדיקה וקשירה תחרותית של כימיקלים עם הקולטן. עוצמת הקישור של שני מזהמים סביבתיים, חומצה פרפלואורואוקטן-סולפונית (PFOS) וטריפניל פוספט (TPHP), עם גמא קולטן המופעל על ידי פרוקסיזום פרוליפרטיבטור (PPARγ) נקבעה כדי להמחיש את הליך הבדיקה. לבסוף, נדונו גם היתרונות והחסרונות של שיטה זו והיישומים הפוטנציאליים שלה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר רב של כימיקלים זוהו באופן נרחב בסביבה ובגוף האדם, מה שמעלה חששות משמעותיים לגבי השפעתם על הסביבה האקולוגית ובריאות האדם 1,2,3. למרות השכיחות הסביבתית הגבוהה שלהם, המידע לגבי השפעותיהם הטוקסיקולוגיות מועט. לכן, דחוף לפתח שיטות סינון בתפוקה גבוהה (HTS) כדי להקל על הערכת הרעילות הכימית.

מספר שיטות סינון בתפוקה גבוהה (HTS) דווחו להערכת רעילות כימית, כגון הבדיקות הביולוגיות של HTS המשמשות בתוכניות Tox21 ו-ToxCast 4,5. שיטות אלו יכולות לזהות במהירות חומרים רעילים פוטנציאליים ולספק מידע רב ערך על מנגנוני הרעילות הכימית. עם זאת, בדיקות ביולוגיות אלה של HTS מסתמכות בעיקר על מערכות מבוססות תאים, שעלולות להיות מורכבות ויקרות. בנוסף, שיטות ריצוף בתפוקה גבוהה שימשו גם להערכת רעילות כימית, אך השגת הערכה בתפוקה גבוהה של כימיקלים נותרה מאתגרת6. מחקרים קודמים פיתחו מבחני קשירה תחרותיים מבוססי קיטוב פלואורסצנטי (FP) כדי לקבוע את עוצמת הקישור של מספר מזהמים סביבתיים, כולל חומרים פר-ופוליפלואורואלקיל (PFAS)7,8,9, ביספנול A (BPA)10,11, וחומר חלקיקי (PM)12, עם קולטנים גרעיניים כגון קולטן המופעל על ידי פרוקסיזום (PPAR)7, 8,9,10,13, קולטן פרנזואיד X (FXR)11,12, וקולטן בלוטת התריס (TR)14,15. גישה זו יעילה, חסכונית ומספקת תובנות מכניסטיות.

במחקר זה, הפרוטוקול לבדיקת קשירת קולטן-ליגנד מתואר על סמך זיהוי הקיטוב הקרינה (FP) של בדיקה פלואורסצנטית קטנה. העיקרון של מבחן קשירת קולטן-ליגנד מבוסס FP מודגם באיור 1. כאשר מולקולה פלואורסצנטית קטנה נרגשת על ידי אור מקוטב מישורית, האור הנפלט הופך לדפולריזציה גבוהה עקב סיבוב מולקולרי מהיר. עם זאת, כאשר העוקב נקשר לקולטן גדול יותר, סיבובו מואט. ערך FP גבוה מתגלה כאשר העוקב קשור לקולטן הגדול, בעוד שערך FP נמוך נצפה כאשר העוקב חופשי. גמא קולטן המופעל על ידי פרוקסיזום (PPARγ) טוהר לצורך קשירת הגשושית לקולטן. רוזיגליטזון (רוזי), חומצה פרפלואורואוקטן-סולפונית (PFOS) וטריפניל פוספט (TPHP) שימשו כדי להתחרות על קשירת הגשושית לקולטן. רוזי, אגוניסט ספציפי של PPARγ, שימש כבקרה חיובית במבחני הקישור התחרותיים של הקולטן. בנוסף, PFOS ו-TPHP זוהו בעבר כאגוניסטים חלשים של PPARγ במחקרים קודמים 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. יתר על כן, הם שייכים לקטגוריות מבניות שונות של תרכובות הידועות בחשיפה סביבתית ובולטות בשיעורי הגילוי הגבוהים יחסית שלהן באוכלוסיות אנושיות. תרכובות אלה שימשו כדי לאמת עוד יותר את הישימות הרחבה של מבחן כריכת התחרות. ההליך מורכב מארבעה שלבים: בנייה וטרנספורמציה של וקטורים רקומביננטיים, ביטוי וטיהור של חלבון הקולטן (תחום קשירת ליגנד), קשירת קולטן-בדיקה וקשירה תחרותית של כימיקלים עם הקולטן.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרטי הריאגנטים והציוד מפורטים בטבלת החומרים.

1. בנייה וטרנספורמציה של וקטורים רקומביננטיים

הערה: PPARγ הוא גורם שעתוק תלוי ליגנד עם מבנה קולטן גרעיני קלאסי, המורכב מתחום קשירת DNA המווסת את גני המטרה ותחום קשירת ליגנד המופעל על ידי ליגנדים. עם הפעלת הליגנד, PPARγ יוצר הטרודימר עם קולטן גרעיני אחר, קולטן רטינואיד X (RXR), ונקשר לרכיבי תגובה של PPARγ, ובכך מווסת את השעתוק של גני המטרה במורד הזרם 9,16.

  1. תכנן פריימרים עבור PPARγ-LBD (ראה טבלה 1) והגביר את מקטע ה-DNA PPARγ-LBD (ראה טבלה 2 וטבלה 3).
  2. ליניאריזציה של וקטור pET28a המתויג His×6 על ידי עיכול שלו עם אנדונוקלאזות הגבלה XhoI וBamHI18.
  3. שכפל את מקטע ה-DNA PPARγ-LBD לתוך וקטור pET28a המתויג His×6 באמצעות ערכת השיבוט הזמינה מסחרית, וכתוצאה מכך הפלסמיד הרקומביננטי pET28a-PPARγ-LBD-6×His18.
  4. העבר את הביטוי הרקומביננטי של פלסמיד pET28a-PPARγ-LBD-6×שלו לתאי Escherichia coli של BL21 (DE3) לביטוי חלבון18.
  5. הוסף 5 מיקרוליטר של הווקטור הרקומביננטי לתאי BL21(DE3) מוכשרים, דגירה על קרח למשך 30 דקות, בצע הלם חום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, ואז חזור מיד לקרח.
  6. מוסיפים 900 מיקרוליטר של מדיום LB, מנערים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת (160-200 סל"ד), ולאחר מכן צנטריפוגה ב-~3000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את כדור החיידקים ב-100 מיקרוליטר של מדיום LB ומרחו על מדיום מוצק. הפוך את הצלחות והתרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12-16 שעות.
  8. בחר מושבות בודדות לזיהוי ריצוף וביטוי וטיהור חלבון לאחר מכן.

2. ביטוי וטיהור חלבון הקולטן

  1. דגרו את תאי ה-BL21 (DE3) שעברו טרנספורמציה במדיום LB של 200 מ"ל בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין על שייקר אורביטלי (230 סל"ד) למשך 1-2 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.
  2. השרה את התאים כאשר ה-OD600 מגיע ל-0.4-0.6 יחידות ספיגה על ידי הוספת איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) של 10 מיקרומטר ודגירה ב-16 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
  3. אוספים את תרחיף החיידקים והצנטריפוגה בטמפרטורה של 8000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות.
  4. ליזה את התאים במאגר ליזה מסיס של 20 מ"ל (50 מ"מ של NaH2PO4, 300 מ"מ של NaCl, 10 מ"מ של אימידזול, pH 8.0), הוספת 200 מיקרוליטר של פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) ו-200 מיקרוליטר של ליזוזים. השעו מחדש את גלולת החיידקים באמצעות פיפטה של 5 מ"ל, ולאחר מכן המשיכו בסוניקציה בעוצמה של 30% למשך 20 דקות.
  5. הוסף מאגר ליזה השווה פי 5 מנפח העמודה כדי לאזן את עמודת הניקל. חזור על תהליך זה פעמיים והניח בצד.
  6. צנטריפוגה את תרחיף החיידקים הסוניקטיבי ב-8000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להשיג את הליזאט החיידקי (CL).
  7. טען את ה-CL על עמוד הניקל (לספיגת חלבון) כדי להשיג את הזרימה (FT).
  8. שטפו את העמודה עם פי 5 מנפח העמודה של מאגר הכביסה (50 מ"מ של NaH2PO4, 300 מ"מ של NaCl, 20 מ"מ של אימידזול, pH 8.0) כדי להשיג את פליטת הכביסה (W1-W6).
  9. שטפו את העמודה עם 1 מ"ל של מאגר פליטה (50 מ"מ NaH2PO4, 300 מ"מ NaCl, 250 מ"מ אימידזול, pH 8.0) כדי לחסל את חלבון המטרה ולהשיג את שברי החלבון (E1-E5).
  10. קח מינון של 20 מיקרוליטר מכל שבר (CL, FT, W1-W6 ו-E1-E5) ונתח באמצעות SDS-PAGE18 עם צביעה כחולה מבריקה של Coomassie. PPARγ-LBD פועל כחלבון של 34.9 kDa על ג'ל דנטורציה.

3. בדיקת קשירת קולטנים

הערה: בבדיקה זו, C1-BODIPY-C12 שימש כבדיקה פלואורסצנטית ספציפית לאתר כדי לבסס את מערכת קשירת הקולטן-ליגנד. C1-BODIPY-C12, ליגנד ספציפי ל-PPARγ, הוא אנלוגי פלואורסצנטי של חומצת שומן עם קבוצת הפלואורסצנט BODIPY המשולבת בחומצת השומן במצב C1.

  1. יש לדלל את ה-PPARγ-LBD האנושי המטוהר במאגר Tris-HCl (20 מ"מ של Tris, 100 מ"מ של NaCl, pH 8.0) לטווח ריכוז של 1 ננומטר עד 6400 ננומטר. כמו כן, יש לדלל את הגשושית C1-BODIPY-C12 במאגר Tris-HCl לריכוז של 50 ננומטר.
  2. מערבבים את תמיסת PPARγ-LBD המדוללת (55 מיקרוליטר לבאר) ואת תמיסת הבדיקה C1-BODIPY-C12 (55 מיקרוליטר לבאר) בצלחת שחורה של 96 בארות. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  3. מדוד קיטוב פלואורסצנטי (FP) עם קורא המיקרו-פלטות.
  4. התווה את ערכי ה-FP כנגד ריכוז הקולטן, התאם את העקומה באמצעות הקישור הספציפי למשוואת שיפוע היל באמצעות תוכנה סטטיסטית וגרפית, וחשב את ערך ה-Kd .

4. מבחן מחייב תחרותי

הערה: בבדיקה זו, 800 ננומטר של בדיקת PPARγ-LBD אנושית ו-50 ננומטר C1-BODIPY-C12 שימשו לקשירת קולטנים. רוזיגליטזון (רוזי), טריפניל פוספט (TPHP) וחומצה פרפלואורואוקטן-סולפונית (PFOS) שימשו כדי להתחרות בקשירת הגשושית ל-PPARγ.

  1. לדלל את שלוש התרכובות במאגר Tris-HCl בטווח ריכוזים שבין 0-200 מיקרומטר.
  2. הכן את תמיסת קשירת הקולטן-בדיקה עם ריכוז סופי של 800 ננומטר של PPARγ-LBD אנושי ו-50 ננומטר של בדיקה C1-BODIPY-C12.
  3. מערבבים את תמיסת קשירת הקולטן-בדיקה (55 מיקרוליטר לבאר) ותמיסת התרכובת (55 מיקרוליטר לבאר) בצלחת שחורה של 96 בארות. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  4. מדוד קיטוב פלואורסצנטי (FP) עם קורא המיקרו-פלטות.
  5. שרטט את ערכי ה- FP כפונקציה של ריכוז הליגנד. השג את הריכוז המעכב החצי מקסימלי (IC50) של כל ליגנד מעקומת התחרות באמצעות המודל הסיגמואידלי המעובד על ידי תוכנת גרפים וניתוח.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביטוי וטיהור חלבונים של PPARγ-LBD
PPARγ-LBD התבטא באופן הטרולוגי ב-BL21 (DE3) כחלבון מתויג היסטידין. החלבון זוהה בשברים המסיסים, וה-PPARγ-LBD המטוהר הראה פס יחיד ב-SDS-PAGE עם משקל מולקולרי לכאורה של כ-34.9 kDa (איור 2), התואם את המשקל המולקולרי החזוי של החלבון.

הקישור של בדיקה C 1-BODIPY-C12 ל-PPARγ-LBD
במבחן קשירת הקולטן, C1-BODIPY-C12, חומצת שומן המסומנת על ידי BODIPY שיכולה להיקשר ל-PPARγ-LBD, שימשה כבדיקה פלואורסצנטית לחקר עוצמת הקישור של מזהמים סביבתיים עם hPPARγ-LBD. כפי שמוצג באיור 3A, ערכי הקיטוב הקרינה (FP) עלו מ-20 ל-250 עם הוספת PPARγ-LBD, מה שמעיד על קשירה של C1-BODIPY-C12 לקולטן. עקומת הקישור הגיעה לרוויה ב-800 ננומטר PPARγ-LBD, עם קבוע דיסוציאציה (Kd) של 253.5 ננומטר ±-10.05 ננומטר. לכן, 800 ננומטר PPARγ-LBD נבחר עבור מבחני הכריכה התחרותיים הבאים.

הקישור התחרותי של מזהמים סביבתיים ל-PPARγ-LBD
רוזיגליטזון (רוזי), אגוניסט ספציפי של PPARγ, שימש כבקרה חיובית להחלפת הגשושית הפלואורסצנטית במבחני קשירת הליגנד התחרותיים. כפי שמוצג באיור 3B, רוזי עיכבה את קשירת הגשושית C1-BODIPY-C12 ל-PPARγ-LBD באופן תלוי מינון, עם IC50 של 6.89 מיקרומטר, מה שמדגים את היתכנות הבדיקה. לאחר מכן, נקבעו זיקות הקישור של TPHP ו-PFOS ל-PPARγ-LBD. כפי שמוצג באיור 3C,D, TPHP ו-PFOS עיכבו גם את הקישור של בדיקת C1-BODIPY-C12 ל-PPARγ-LBD באופן תלוי מינון, עם ערכי IC50 של 60.45 מיקרומטר ו-37.27 מיקרומטר, בהתאמה.

figure-results-1
איור 1: איור סכמטי של מבחני קשירה תחרותיים של קולטנים מבוססי קיטוב פלואורסצנטי (FP). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ניתוח SDS-PAGE של ה-PPARγ-LBD המטוהר. M הוא סמן המשקל המולקולרי של החלבון. Cl הוא ליזאט התא, FT הוא שבר הזרימה, W1-W6 הם תמיסות הכביסה, E1 הוא ה-eluate ו-E2-E4 הם חלבוני PPARγ-LBD המטוהרים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: עקומת קשירת קולטנים מבוססת קיטוב פלואורסצנטי (FP) ועקומות קשירה תחרותיות. (A) עקומת קשירה מבוססת FP של C 1-BODIPY-C12 ל-PPARγ-LBD אנושי. (ב-ד) עקומות קשירה תחרותיות מבוססות FP של Rosi, TPHP ו-PFOS ל-PPARγ-LBD אנושי. קווי שגיאה מציינים את סטיית התקן (SD) עבור שלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מזהההמשך
pET28a-PPARG אנושי-P1CAAATGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCC
pET28a-PPARG אנושי-P2GTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTACAAGTCCTTGTAGATCTC
רצף נוקלאוטידים PPARγ-LBDAGACGACATTCCCTAGAATAATTTTTTTTTTTAACTTTAAGAAGGAGAT
ATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCAGCAGCGGCCTG
GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAA
TGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCCGCTGAC
CTCCGGGCCCTGGCAAAACATTTGTATGACTCATACATAAAGTCCTTCC
CGCTGACCAAAGCAAAGCAAAGCGAGGGCGATCTTGACAGGAAAGACAACACA
GACAAATCACCATTCGTTATTAGATGATGAATTCCTTAATGATGGGAGA
AGATAAAATCAAGTTCAAACACATCACCCCCCTGCAGGAGCAGAGCAA
AGAGGTGGCCATCCGCATCTCTCGGGCTGCCAGTTTCGCTCCGGGGGG
AGGCTGTGCAGGAGATCACAGAGTATGCCAAAAGCATTCCTGGTTG
TAAATCTTGACTTGAACGACCAAGTAACTCTCTCAAATGGAGTCCA
CGAGATCATTTACACAATGCTGGCCTCCTTGATGAATAAAGATGGGGT
TCTCATATCCGAGGGCCAAGGCTTCATGACAAGGGAGTTTCTAAAG
AGCCTGCGAAAGCCTTTTGGTGACTTTATGGAGCCCAAGTTTGAGT
TTGCTGTGAAGTTCAATGCACTGGAATTAGATGACAGCGACTTGGCAA
TATTTATTGCTGTCATTATTCTCAGTGGAGACCGCCCAGTTGCTGAA
TGTGAAGCCCATTGAAGACAACCTGCTACAAGCCCTGG
AGCTCCAGCTGAAGCTGAACCACCCTGAGTCCTCACAGCTGTGTT
CCAAGCTGCTCCAGAAAATGACAGACCCACAGATTGTCACGGA
ACACGTGCAGCTACTGCAGGTGATCAAGAAGACGGAAACCGACATG
AGTCTTCACCCCTCTCCTCAGGAGATCTACAAGGACTTGGGG
CTCGAGGCCACCCACCC

טבלה 1: רצף הפריימר והנוקלאוטידים של תחום קשירת ליגנד PPARγ.

שמות ריאגנטים ניסיונייםנפח/מינון
pET28a-PPARG אנושי-P11 מיקרוליטר
pET28a-PPARG אנושי-P21 מיקרוליטר
2×פנטה מקס מאסטר מיקס12.5 מיקרוליטר
cDNA2 מיקרוליטר
ddH2O8.5 מיקרוליטר

טבלה 2: מערכת ריאגנטים ניסיונית PCR.

שמות ניסוייםטמפרטורהזמן
טרום דנטורציה95 מעלות צלזיוס3 דק'
דנטורציה95 מעלות צלזיוס15 שניות
חישול65 מעלות צלזיוס15 שניות
סיומת72 מעלות צלזיוס6 דק'
חֲנוּת12 מעלות צלזיוס--

טבלה 3: תוכנית תגובה ניסויית PCR.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קיטוב פלואורסצנטי (FP), תהודה פלזמונית פני השטח (SPR) ותהודה מגנטית גרעינית (NMR) הן טכניקות נפוצות המשמשות להערכת אינטראקציות קשירה ישירות בין חלבונים ותרכובות19,20. FP נמצא בשימוש נרחב בחקירת אינטראקציות מולקולריות לגילוי תרופות וסינון כימי 21,22,23. לשם השוואה, בדיקות SPR ו-NMR הן יקרות וגוזלות זמן, מה שהופך אותן לפחות מתאימות ליישומי סינון בתפוקה גבוהה (HTS). פרוטוקול זה מתאר שיטת ניתוח קולטן-ליגנד המבוססת על FP עם מערכת גילוי לוחות מרובת בארות, המאפשרת HTS של כימיקלים.

בחירת הבדיקה המתאימה לבדיקת קשירת קולטן היא קריטית. הגשושית צריכה להיות מורכבת משני מרכיבים: ליגנד ספציפי לקולטן הגרעיני וקבוצה פלואורסצנטית. בדרך כלל, ניתן להשיג בדיקות כאלה באופן מסחרי, כפי שמודגם על ידי בדיקת C1-BODIPY-C12 ששימשה במחקר זה. C1-BODIPY-C12 הוא אנלוגי פלואורסצנטי של חומצת שומן, כאשר קבוצת הפלואורסצנט BODIPY משולבת במיקום C1, ומהווה ליגנד ספציפי ל-PPARγ. אם בדיקה פלואורסצנטית זמינה מסחרית אינה אופציה, יש לסנתז אותה כימית על ידי הצמדת קבוצה פלואורסצנטית לליגנד ספציפי ידוע.

המבנה הקלאסי של קולטן גרעיני כולל תחום קשירת DNA האחראי על ויסות ביטוי גן המטרה ותחום קשירת ליגנד (LBD), הממוקם בדרך כלל בקצה C24 של הקולטן. אתר הקישור של הקו-רגולטור נמצא בדרך כלל בתחום פונקציית ההפעלה השעתוק של הקולטן הגרעיני, שם הוא מקיים אינטראקציה עם גורמי קו-רגולציה גרעיניים25. קו-רגולטורים אלה יכולים לשפר או לדכא את פעילות השעתוק של הקולטן, ובכך לווסת את ביטוי הגנים. ה-LBD, הממוקם באזור ספציפי של חלבון הקולטן, מווסת את השינויים הקונפורמטיביים של הקולטן בעת קשירת ליגנד, אשר בתורו מפעיל או מעכב את פעילות השעתוק שלו. מכיוון שה-LBD הוא תחום מוגדר היטב החיוני לזיהוי וקשירה של ליגנדים ספציפיים של מולקולות קטנות24, רק הקולטן-LBD שימש במבחן הקישור התחרותי של הקולטן במחקר זה. גישה זו, שכללה ביטוי וטיהור תחום קשירת הליגנדים של PPARγ, הפחיתה את עלויות הבדיקה.

הריאגנטים המשמשים בשיטה זו, כולל חוצצים לטיהור חלבונים, בדיקה C1-BODIPY-C12 ו-Tris-HCl, זמינים מסחרית וזולים, וזה יתרון משמעותי לבדיקה. זיהוי קיטוב פלואורסצנטי (FP) מתבצע בצלחת מרובת בארות (96 בארות או 384 בארות), עם זמן קריאה מהיר של 3-5 דקות לצלחת, מה שמשפר את תפוקת הבדיקה והיעילות. גישת קשירת הקולטן-ליגנד גמישה מאוד וניתנת להתאמה בקלות לקולטנים שונים, בתנאי שחלבוני הקולטן זמינים. יכולת הסתגלות זו מרחיבה את היקף המחקר שניתן לבצע בשיטה זו. בסך הכל, השילוב של יתרונות אלה - קלות שימוש, יעילות עלות, יכולת תפוקה גבוהה, עיבוד מהיר וגמישות בהסתגלות הקולטנים - הופך שיטה זו לאופציה מבטיחה לסינון מזהמים סביבתיים רעילים.

התוצאות הנוכחיות מדגימות כי PFOS ו-TPHP יכולים להיקשר ל-PPARγ, מה שעולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים מעגינה מולקולרית ומבחני גנים מדווחים 9,26. בנוסף, השיטה המתוארת בכתב יד זה שימשה להערכת עוצמת הקישור של מספר מזהמים סביבתיים עם קולטנים גרעיניים. לדוגמה, באמצעות מבחן הקישור התחרותי של קולטן-ליגנד מבוסס FP, עוצמת הקישור של 19 חומרים פר-ופוליפלואורואלקיל (PFAS) ו-7 תרכובות ביספנול A (BPA) לקולטן המופעל על ידי פרוקסיזום β/δ (PPARβ/δ)7,10, 12 PFASs ל-PPARγ 9,13, 7 תרכובות BPA ו-3 רכיבי חומר חלקיקי (PM2.5) לקולטן X פרנזואיד (FXR)11, נקבעו 12 ו-8 אתרים דיפניל פוליברום (PBDEs) ו-6 ביפנילים פולי-כלוריים (PCBs) לקולטן בלוטת התריס (TR)14,15. ממצאים אלה מדגישים את הפוטנציאל של שיטה זו לסינון האינטראקציות המקשרות בין מזהמים סביבתיים לקולטנים גרעיניים.

מחקרים קודמים דיווחו על שיטות בדיקת קיטוב פלואורסצנטי (FP) עבור PPARγ הכוללות שימוש בסינון ג'ל למדידת קשירה, הדורשת לפחות 1.5 שעות כדי לזהות את הקישור של תרכובת בודדת23. לעומת זאת, שיטה זו מאפשרת זיהוי זיקות קשירה של לפחות 12 תרכובות עם PPARγ תוך 10 דקות. בנוסף, חלק מערכות הבדיקה הזמינות מסחרית (ראה טבלת חומרים) מתומחרות ביותר מ-3000 דולר עבור פורמט 800 × 20 מיקרוליטר. שיטות אלו יקרות במיוחד וגוזלות זמן. מחקר זה מציג שיפורים לעומת שיטות קיימות אלה.

מגבלה פוטנציאלית אחת של שיטה זו היא שבדיקת הקרינה חייבת להיות ליגנד לקולטן, ובדיקות פלואורסצנטיות אינן מקיימות אינטראקציה ישירה עם מזהמים סביבתיים. לכן, חיוני לוודא שהגשושית והמזהמים הסביבתיים נשמרים בנפרד בתמיסה. בנוסף, בדיקה זו משקפת מצב in vitro ואינה יכולה ללכוד באופן מלא אינטראקציות in vivo , מכיוון שהקולטנים הם הטרודימריים in vivo27. כתוצאה מכך, בעוד ששיטה זו משמשת ככלי סינון מהיר, יש צורך בחקירה נוספת של הפעלת הקולטן ומנגנונים טוקסיקולוגיים קשורים in vivo .

חסרון נוסף הוא תופעת "ההסטה ימינה" שנצפתה במבחני קיטוב פלואורסצנטי (FP) בעת הערכת זיקה מחייבת, מה שעלול להוביל להערכת חסר שיטתית של הזיקות הנמדדות. במחקרים קודמים, זיקת הקישור של רוזיגליטזון עם PPARγ הוערכה באמצעות בדיקת העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (TR-FRET)28, שהיא שיטה רגישה ביותר למדידת זיקה לקשירת ליגנד-קולטן. עם זאת, בדיקת TR-FRET גוזלת זמן ומסורבלת יחסית, ודורשת דגירה של 4 שעות של תמיסת התגובה בטמפרטורת החדר לפני הזיהוי. למרות שבדיקת FP מציגה רגישות נמוכה יותר בהשוואה לבדיקת TR-FRET, היא מתאימה יותר להקרנה בתפוקה גבוהה של ליגנדים סביבתיים הנקשרים לקולטנים גרעיניים. עם זאת, בדיקת FP עשויה לפספס כמה ליגנדים סביבתיים חלשים. בנוסף, במחקרים קודמים, זיקת הקישור של PFOS עם PPARγ נקבעה באמצעות דיאליזה בשיווי משקל (EqD)29, שיטה רגישה נוספת למדידת זיקה קשירת ליגנד-קולטן. עם זאת, EqD מסתמך על ציוד אנליטי יקר (LC-MS/MS), המגביל את היישום שלו ומונע יכולות סינון בתפוקה גבוהה.

למרות שבדיקת קיטוב פלואורסצנטי (FP) זו מציגה תופעת "הסטה ימינה", שעלולה לגרום לערכי IC50 מחושבים גבוהים יותר בדרך כלל, היא אינה משפיעה על דירוג הזיקה היחסית או על תחזיות הערכת הסיכונים העוקבות. יתר על כן, בדיקת FP היא חסכונית, חסכונית בזמן ומסוגלת לסנן מגוון רחב של תרכובות לזיקתן לקולטנים גרעיניים מרובים. בסך הכל, סינון תפוקה גבוהה מבוסס FP של ליגנדים סביבתיים מקל על זיהוי מהיר של מזהמים סביבתיים רעילים.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס' 82103875).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
C1-BODIPY-C12 ProbeThermo Fisher Scientific, China102209-82-3נקשר ל-PPARγ-LBD ופולט פלואורסצנטיות.
Coomassie Brilliant Blue R-250Solarbio, סין6104-59-2מכתים את רצועות החלבון.
GraphPad פריזמהDotmaticshttps://www.graphpad.com/features
imidazoleSolarbio, סיןI8090הכן מאגרים לתהליך טיהור החלבון.
איזופרופיל &בטא;-D-1-thiogalactopyranosideSolarbio, סין367-93-1לגרום לביטוי של PPARγ-LBD
Microplate readerBiotek, ארה"בסינרגיה H1 זיהוי ערך FP
NaClShanghai Reagent7647-15-5הכן מאגרים לתהליך טיהור החלבון.
NaH2PO4 · 2H2OShanghai Reagent13472-35-0הכן מאגרים לתהליך טיהור החלבון.
Ni NTA חרוזים 6FFSmart-Lifesciences, סיןSA005005טיהור חלבונים.
מקור 8.5 OriginLab, Northampton, MA, ארצות הברית
חומצה פרפלואורואוקטן-סולפונית (PFOS)J& K Scientific Ltd, סין1763-23-1המזהמים הסביבתיים שזוהו
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Solarbio, ChinaP0100מעכבים פירוק חלבונים.
PPARγ-ערכת בדיקת מתחרהThermo Fisher ScientificPV6136https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136-PPAR
γ-ערכת בדיקת סינון ליגנד LBDקיימן600616 https://www.caymanchem.com/product/600616
רוזיגליטזון (רוזי)אלאדין, סין122320-73-4האגוניסטים של PPARγ
שייקרZHICHENG, סיןZWY-211Cהרחבת תרבית חיידקים ואינדוקציה של ביטוי חלבון
טריפניל פוספט (TPHP)מקלין, סיןT819317המזהמים הסביבתיים שזוהו
טריססולארביו, סיןT8230הכן מאגרים לתהליך טיהור החלבון.
TryptoneOXOID Limited, סיןLP0042Bלהכין מרק ליזוגני (LB) בינוני.
מנקה אולטרסאונדקימברלי, סיןLHO-1לשבש את החיידקים כדי להשיג ליזה מלאה
אוריאהסולארביו, סיןU8020הכן מאגרים לתהליך טיהור החלבון.
תמצית שמריםOXOID Limited, סיןLP0021Bלהכין מרק ליזוגני (LB) בינוני.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maddela, N. R., Ramakrishnan, B., Dueñas-Rivadeneira, A. A., Venkateswarlu, K., Megharaj, M. Chemicals/materials of emerging concern in farmlands: sources, crop uptake, and potential human health risks. Environ Sci Process Impacts. 24 (12), 2217-2236 (2022).
  2. Naidu, R., et al. Chemical pollution: A growing peril and potential catastrophic risk to humanity. Environ Int. 156, 106616(2021).
  3. Ryu, H., Li, B., De Guise, S., McCutcheon, J., Lei, Y. Recent progress in the detection of emerging contaminants PFASs. J Hazard Mater. 408, 124437(2021).
  4. Alofe, O., et al. Determining the endocrine disruption potential of industrial chemicals using an integrative approach: Public databases, in vitro exposure, and modeling receptor interactions. Environ Int. 131, 104969(2019).
  5. Bajard, L., et al. Endocrine disrupting potential of replacement flame retardants - Review of current knowledge for nuclear receptors associated with reproductive outcomes. Environ Int. 153, 106550(2021).
  6. Chen, Q., Chou, W. C., Lin, Z. Integration of toxicogenomics and physiologically based pharmacokinetic modeling in human health risk assessment of perfluorooctane sulfonate. Environ Sci Technol. 56 (6), 3623-3633 (2022).
  7. Li, C. H., Ren, X. M., Cao, L. Y., Qin, W. P., Guo, L. H. Investigation of binding and activity of perfluoroalkyl substances to the human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Environ Sci Process Impacts. 21 (11), 1908-1914 (2019).
  8. Li, C. H., et al. Chlorinated polyfluorinated ether sulfonates exhibit higher activity toward peroxisome proliferator-activated receptors signaling pathways than perfluorooctanesulfonate. Environ Sci Technol. 52 (5), 3232-3239 (2018).
  9. Li, C. H., Shi, Y. L., Li, M., Guo, L. H., Cai, Y. Q. Receptor-bound perfluoroalkyl carboxylic acids dictate their activity on human and mouse peroxisome proliferator-activated receptor γ. Environ Sci Technol. 54 (15), 9529-9536 (2020).
  10. Li, C. H., Zhang, D. H., Jiang, L. D., Qi, Y., Guo, L. H. Binding and activity of bisphenol analogues to human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Ecotoxicol Environ Saf. 226, 112849(2021).
  11. Zhang, D., et al. Binding activity and risk assessment of bisphenols toward farnesoid X receptor pathway: In vitro and in silico study. Sci Total Environ. 869, 161701(2023).
  12. Zhang, D., et al. Fine particulate matter disrupts bile acid homeostasis in hepatocytes via binding to and activating farnesoid X receptor. Toxicology. 506, 153850(2024).
  13. Li, C. H., Ren, X. M., Guo, L. H. Adipogenic activity of oligomeric hexafluoropropylene oxide (perfluorooctanoic acid alternative) through peroxisome proliferator-activated receptor γ pathway. Environ Sci Technol. 53 (6), 3287-3295 (2019).
  14. Qin, W. P., Li, C. H., Guo, L. H., Ren, X. M., Zhang, J. Q. Binding and activity of polybrominated diphenyl ether sulfates to thyroid hormone transport proteins and nuclear receptors. Environ Sci Process Impacts. 21 (6), 950-956 (2019).
  15. Ren, X. M., Li, C. H., Zhang, J. Q., Guo, L. H. Binding and activity of sulfated metabolites of lower-chlorinated polychlorinated biphenyls towards thyroid hormone receptor alpha. Ecotoxicol Environ Saf. 180, 686-692 (2019).
  16. Evans, N., et al. In vitro activity of a panel of per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS), fatty acids, and pharmaceuticals in peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) alpha, PPAR gamma, and estrogen receptor assays. Toxicol Appl Pharmacol. 449, 116136(2022).
  17. Kim, S., et al. Triphenyl phosphate is a selective PPARγ modulator that does not induce brite adipogenesis in vitro and in vivo. Arch Toxicol. 94 (9), 3087-3103 (2020).
  18. Matsumoto, H., Haniu, H., Komori, N. Determination of protein molecular weights on SDS-PAGE. Methods Mol Biol. 1855, 101-105 (2019).
  19. Nguyen, H. H., Park, J., Kang, S., Kim, M. Surface plasmon resonance: A versatile technique for biosensor applications. Sensors (Basel). 15 (5), 10481-10510 (2015).
  20. Hu, J., Kim, J., Hilty, C. Detection of protein-ligand interactions by 19F nuclear magnetic resonance using hyperpolarized water. J Phys Chem Lett. 13 (17), 3819-3823 (2022).
  21. LeBlanc, E. V., Shekhar-Guturja, T., Whitesell, L., Cowen, L. E. Fluorescence polarization-based measurement of protein-ligand interaction in fungal cell lysates. Curr Protoc. 1 (1), e17(2021).
  22. Huang, X., Aulabaugh, A. Application of fluorescence polarization in HTS assays. Methods Mol Biol. 1439, 115-130 (2016).
  23. Seethala, R., et al. A rapid homogeneous fluorescence polarization binding assay for peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma using a fluorescein-tagged dual PPARalpha/gamma activator. Anal Biochem. 363 (2), 263-274 (2007).
  24. Hu, W., et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma and disruption of progesterone synthesis of 2-ethylhexyl diphenyl phosphate in human placental choriocarcinoma cells: Comparison with triphenyl phosphate. Environ Sci Technol. 51 (7), 4061-4068 (2017).
  25. Weatherman, R. V., Fletterick, R. J., Scanlan, T. S. Nuclear-receptor ligands and ligand-binding domains. Annu Rev Biochem. 68, 559-581 (1999).
  26. Khazaee, M., et al. Perfluoroalkyl acid binding with peroxisome proliferator-activated receptors α, γ, and δ and fatty acid binding proteins by equilibrium dialysis with a comparison of methods. Toxics. 9 (3), 45(2021).
  27. de Vera, I. M. S., et al. Synergistic regulation of coregulator/nuclear receptor interaction by ligand and DNA. Structure. 25 (10), 1506-1518.e4 (2017).
  28. Hendrickson, O. D., Taranova, N. A., Zherdev, A. V., Dzantiev, B. B., Eremin, S. A. Fluorescence polarization-based bioassays: New horizons. Sensors (Basel). 20 (24), 7132(2020).
  29. Liu, C., et al. Identification of a novel selective agonist of PPARγ with no promotion of adipogenesis and less inhibition of osteoblastogenesis. Sci Rep. 5, 9530(2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

High Throughput ScreeningNuclear ReceptorsBinding AffinityEnvironmental PollutantsReceptor Ligand BindingFluorescence PolarizationMicroplate ReaderProtein ExpressionCompetitive BindingPPAR Gamma
Video Coming Soon

Related Articles