Method Article

כימות אפנון פעילות אנזים אלסטאז באמצעות אנליזה קולורימטרית

DOI:

10.3791/67331

⸱

January 17th, 2025

 ,  ,  , 
1Institute for Research, Development and Innovation in Health Biotechnology of Elche (IDiBE), Miguel Hernández University (UMH), 2CIBER, Pathophysiology of Obesity and Nutrition, CIBERobn, Carlos III Health Institute (CB12/03/30038)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של שיטת בדיקה קולורימטרית לקביעת היכולת של תרכובות לעכב או להפעיל פעילות אלסטאז.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלסטאז, פרוטאז סרין, ממלא תפקיד חיוני בפירוק אלסטין. אלסטין הוא חלבון חוץ-תאי המסייע בשמירה על גמישות רקמות בריאות, בעור ובכלי הדם. רגולציה הדוקה של פעילות האלסטאז חיונית להומאוסטזיס רקמות, שכן חוסר ויסות יכול לתרום לפתולוגיות כגון אמפיזמה, קמטים וטרשת עורקים. תרכובות מסוימות, כגון פיטוכימיקלים טבעיים, הראו פוטנציאל להתערבות טיפולית ומשכו עניין רב. הבהרת ההשפעות המודולריות של תרכובות שונות על אלסטאז, בין אם מעכבות או גירוי, חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות וקוסמטיות חדשניות המתמקדות בהפרעות הקשורות לאלסטאז. שיטה מקובלת למדידת פעילות האלסטאז היא בדיקת האלסטאז הקולורימטרי. בבדיקה זו, מצע מסוים משמש לפירוק אלסטאז, שחרור תרכובת צהובה ניתנת לזיהוי, p-nitroaniline (pNA). כמות ה-pNA המיוצרת משקפת את פעילות האלסטאז בדגימה וניתן למדוד אותה באמצעות קולורימטריה. בדיקה זו מציעה מספר יתרונות, כולל פשטות, רגישות גבוהה, תוצאות מהירות ויכולת הסתגלות לצרכי מחקר שונים. בדיקת האלסטאז הקולורימטרי נותרה כלי רב ערך לחקר האופן שבו תרכובות משפיעות על פעילות האלסטאז. בשל קלות השימוש והאפקטיביות שלה, בדיקה זו היא אבן פינה של מחקר בתחום זה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלסטאז הוא אנזים פרוטאז סרין הממלא תפקיד מכריע בפירוק אלסטין, חלבון המספק גמישות לרקמות שונות בגוף, כולל הריאות, העור וכלי הדם. פעילות האלסטאז מווסתת היטב כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמות, וחוסר ויסות יכול להוביל למצבים פתולוגיים ועוריים כגון אמפיזמה, טרשת עורקים וקמטיםבעור 1.

ישנם מספר סוגים של אלסטאזות, כל אחד עם מאפיינים ספציפיים ופונקציות. אלסטזות נויטרופילים, המיוצרות על ידי נויטרופילים, חשובות בתגובה החיסונית ובדלקת. אנזימים אלה יכולים לפרק מגוון רחב של חלבונים חוץ-תאיים ומעורבים במחלות דלקתיות כרוניות2. אלסטזות הלבלב, לעומת זאת, ממלאות תפקיד בעיכול חלבונים....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש למחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת חיץ תגובת בסיס 0.2 M Tris (RB)

  1. לשקול את בסיס Tris המתאים באמצעות איזון אנליטי.
  2. מעבירים את בסיס הטריס לכוס ומוסיפים מים נטולי יונים, באמצעות גליל מדורג.
  3. ערבבו את התמיסה עם מערבל מגנטי עד להמסה מוחלטת של בסיס הטריס.
  4. כוונן את ה- pH ל- 8.0 על ידי הוספת 4 N HCl טיפתית. השתמש במד pH כדי לפקח על ה- pH.
  5. לאחר שמגיעים ל- pH הרצוי, מעבירים את התמיסה לבקבוק נפחי וממלאים לסימן הנפח הרצוי במים נטולי יונים.
  6. העבירו את המאגר לבקבוק אחסון מסומן ואחסנו אותו בטמפרטו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר השלמת הפרוטוקול, ניתן לקבל את נתוני הספיגה הדרושים לביצוע החישובים הרלוונטיים ולכימות יכולת הדגימות לווסת את פעילות האלסטאז. איור 3 מדגיש את מיקום הבארות בעזרת הבקרות והדגימות השונות. במקרה של דגימות צבעוניות, כמו זו המשמשת בדוגמה זו, יש צורך להוסיף פקדי צבע כדי למזער הפרעות ספקטרופוטומטריות, מכיוון שצבע יכול להפריע למדידת הצבע הצהוב של pNA ב- 410 ננומטר.

לאחר קבלת תוצאות הבליעה, חושב אחוז העיכוב של כל דגימה, והתוצאות נורמלו בהתבסס על קבוצת הביקורת, יש ליצור .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשיטה הנוכחית נבדקות ההשפעות המודולריות של פיטוכימיקלים על אנזימי אלסטאז באמצעות בדיקה קולורימטרית. אלסטאז, פרוטאז סרין החיוני לפירוק אלסטין, ממלא תפקיד משמעותי בשמירה על גמישות הרקמה באיברים שונים. בדיקת האלסטאז הקולורימטרי המתוארת בעבודה זו מציעה שיטה פשוטה, רגישה ומהירה למדידת פעילות האלסטאז.

בהקשר זה, החוקרים התמקדו במודולטורים, כגון תמציות צמחים ופיטוכימיקלים טהורים, בשל הפוטנציאל שלהם לווסת את פעילות האלסטאז; מודולטורים אלה מראים פוטנציאל ליישומים בפיתוח.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי משרד המדע והחדשנות הספרדי (MCIN/AEI/10.13039/501100011033/FEDER, UE; פרויקטים: RTI2018-096724-B-C21, TED2021-129932B-C21 ו-PID2021-125188OB-C32) וה-Generalitat Valenciana (PROMETEO/2021/059). עבודה זו נתמכה גם על ידי סוכנות המימון הרשמית למחקר ביו-רפואי של ממשלת ספרד, מכון הבריאות קרלוס השלישי (ISCIII) באמצעות CIBEROBN (CB12/03/30038), Agencia Valenciana de la Innovación: INNEST/2022/103; אשר ממומן במשותף על ידי הקרן האירופית לפיתוח אזורי. א.ב.-ג ומ.ה.-ל. נתמכים על ידי Requalification של מערכת האוניברסיטה הספרדית עבור 2021/2023 מענק. פ.י.א.-מ. נתמך על ידי מרגריטה סאלאס מענקים להכשרת רופאים צעירים 2021/2023. ברצוננו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 באר צלחת תרבית תאיםקורנינג משולב3599תחתית שטוחה עם מכסה, פוליסטירן
הדמיית תאים קורא מולטי-מודAgilentBioTek Cytation 1בשימוש עם תוכנת Gen5
אלסטאז מחזיר לבלבסיגמא-אולדריץ'E7885CAS 39445-21-1; 25,9 kDa
איזופרופנול 99.5%פישר סיינטיפיקAC184130010CAS 67-63-0; C3H8O; 60.10 גרם/מול
N-Succinil-(Ala)3-nitroanilideSigma-AldrichS4760CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451.43 גרם/מול
מד pHHach LangesensION+ PH31עם מערבל מגנטי ומחזיק חיישן
פנילמתאן סולפוניל פלואורידסיגמא-אולדריץ'P7626CAS 329-98-6; C7H7FO2S; 174,19 גרם/מול
טריס לביולוגיה מולקולריתPanReac AppliChemA2264CAS 77-86-1; C4H11NO3; 121,14 גרם/מול

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Imokawa, G., Ishida, K. Biological mechanisms underlying the ultraviolet radiation-induced formation of skin wrinkling and sagging I: Reduced skin elasticity, highly associated with enhanced dermal elastase activity, triggers wrinkling and sagging. Int J Mol Sci. 16 (4), 7753-7775 (2015).
  2. Voynow, J. A., ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Elastase ActivityColorimetric AssayElastin DegradationEnzyme InhibitionSerine ProteasePlant ExtractsMicroplate ReaderTissue ElasticityAbsorbance MeasurementReaction Buffer

Related Articles