מחקר זה קובע קבוצה של נהלי הפעלה סטנדרטיים (SOPs) לסינון ובידוד יעיל של חיידקי מעיים המסוגלים לבקע C-גליקוזידים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
* These authors contributed equally
מחקר זה קובע קבוצה של נהלי הפעלה סטנדרטיים (SOPs) לסינון ובידוד יעיל של חיידקי מעיים המסוגלים לבקע C-גליקוזידים.
גליקוזידים C נמצאים בדרך כלל בצמחי מרפא ומציגים מגוון מבני נרחב יחד עם פעילויות ביולוגיות שונות, כולל פעילויות אנטיבקטריאליות, אנטי דלקתיות, אנטי-ויראליות, נוגדות חמצון ואנטי-ניאופלסטיות. ב-C-glycosides, הפחמן האנומרי של חלק הסוכר מחובר ישירות לאגלקון באמצעות קשר פחמן-פחמן. בהשוואה ל-O-גליקוזידים, גליקוזידים C יציבים מבחינה מבנית ועמידים בפני חומצות ואנזימים. כתוצאה מכך, הם בדרך כלל בלתי שבירים, וכתוצאה מכך יכולת ספיגה ירודה וזמינות ביולוגית נמוכה. מעניין כי חיידקי מעיים מסוימים יכולים לבקע קשרים גליקוזידיים מסוג C-C, מה שמספק גישה ביולוגית ספציפית וידידותית לסביבה לפירוק C-גליקוזידים. במחקר זה, פותחה קבוצה של נהלי הפעלה סטנדרטיים (SOPs) לסינון חיידקי מעיים המסוגלים לבקע קשרים גליקוזידיים C-C בהתבסס על מודל הטרנספורמציה הביולוגית של תרכובות טבעיות. ה-SOPs כוללים הכנה והעשרה של חיידקי מעיים, סינון מוכוון פעילות ואימות פעילות במדיום מקור דל פחמן. מתודולוגיה זו מספקת התייחסות בסיסית לחוקרים שמטרתם לבודד ולחקור את החיידקים הפונקציונליים המיוחדים הללו.
C-glycosides הם קבוצה של תרכובות המאופיינות בקישור ישיר של קבוצות גליקוזיל לאגלקונים באמצעות קשרי C-C1. בטבע, אוריינטין, ויטקסין, פוארארין ונגזרותיהם מזוהים בדרך כלל כ-C-גליקוזידים2. תרכובות אלו נמצאות לעתים קרובות בצמחי מרפא כמו Trollius chinensis3 ובבעלי חיים כמו Styela plicata4. מחקרים הוכיחו כי תרכובות אלו מספקות יתרונות בריאותיים ומציגות פעילויות ביולוגיות שונות, כולל אנטיבקטריאלי 5,6,7, אנטי דלקתי 8,9,10,11,12, אנטי-ויראלי 3,12,13, נוגד חמצון 14,15,16, ו פעילויות אנטי-ניאופלסטיות17.
בשל הקישור של קבוצות גליקוזיל לשלד באמצעות קשרי C-C, תרכובות אלו מציגות יציבות גבוהה ועמידות להידרוליזה חומצית ואנזימטית18, מה שמוביל לספיגה ירודה וזמינות ביולוגית נמוכה19. מגבלה זו משפיעה על ההתפתחות והניצול של C-גליקוזידים. עם זאת, תרופות המכילות C-גליקוזידים, הניתנות לעתים קרובות דרך הפה, עוברות דה-גליקוזילציה על ידי אנזימים ספציפיים, ומייצרות אגיקונים ביו-אקטיביים חזקים יותר 20,21,22,23. בעוד שהאנזימים של המארח עצמו אינם מסוגלים לבצע דה-גליקוזילט C-גליקוזידים, דווח על חילוף חומרים של חיידקי מעיים מסוימים. לדוגמה, חלק מחיידקי המעיים ממירים מנגיפרין לנורתיריול, המפגין עוצמה רבה יותר כחומר אנטי-סוכרתי או אנטי-ניאופלסטי24. למרות ממצאים אלה, רק מספר מוגבל של חיידקים המסוגלים לבקע C-גליקוזידים אופיינו, והמנגנונים הבסיסיים נותרו לא מובנים היטב. סינון יעיל וסטנדרטי של חיידקים אלה ישפר את ההבנה של תפקידיהם ויאיץ את התפתחות C-גליקוזידים.
שיטת הסינון פותחה ושוכללה עם הזמן למערכת בוגרת. גישות הליבה כוללות העשרה, סינון מוכוון פעילות ואימות פעילות במדיה דלת פחמן. שיטה זו מאפשרת בידוד של זני מטרה טהורים, כמו גם זיהוי מינים, נתונים גנומיים ותכונות של מיקרואורגניזמי מטרה. באמצעות מערכת זו, ניתן לסנן ולבודד ביעילות חיידקי מעיים המסוגלים לבקע גליקוזידים C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הניסויים שנערכו עמדו בתקנות הבלימה המקומיות, הלאומיות והבינלאומיות של בטיחות ביולוגית המתאימות לסכנות הבטיחות הביולוגית הספציפיות הקשורות לכל זן. דגימות צואה נאספו ממתנדבים בריאים שלא נטלו תרופות במשך שבוע לפחות. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים מסופקים בטבלת החומרים.
1. בניית מודל טרנספורמציה של חיידקי המעי האנושי במבחנה
2. בידוד זנים בודדים מפלורת חיידקי המעי האנושית
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דגימות צואה מעשרה מתנדבים בריאים נבדקו באמצעות ניסויי טרנספורמציה, וכתוצאה מכך דגימה אחת הדגימה פעילות באוריינטין דה-גליקוזילציה. ממצא זה אישר את היתכנות הבדיקה לדגימות פעילות. הדגימה הפעילה בודדה בשיטת סימון הצלחת. בהתבסס על המורפולוגיה והמאפיינים של המושבות, נבחרו לניתוח נוסף כ-18 מושבות חיידקים בודדות בעלות צבע צהוב או לבן, צורות מגוונות וקצוות לא אחידים. מבין אלה, רק מושבה אחת הדגימה את היכולת לבקע אוריינטין לתוך האגלקון שלה, לוטאולין. המושבה טוהרה עוד יותר באמצעות חמש איטרציות של תהליך סימון הלוחות, בהתאם למתודולוגי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
נקבעו נוהל הפעלה סטנדרטי (SOP) לסינון חיידקי מעיים אנושיים המסוגלים לבקע C-גליקוזידים. באמצעות הליכים אלה, הושג בהצלחה זן פעיל טהור, ותכונת הדגליקוזילציה שלו אושרה באמצעות בדיקות טרנספורמציה. ה-SOP מורכב מהכנה והעשרה של חיידקי מעיים, סינון מוכוון פעילות ואימות פעילות במדיום מקור דל פחמן.
ההיבט החשוב ביותר בתהליך הסינון הוא השימוש במדיום מקור דל פחמן כדי לגרום לפעילות חיידקית ולהגדיל את אחוזי ההצלחה של ההקרנה. במהלך ניסויי טרנספורמציה, קשה לזהות חיידקים בעלי פע...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
העבודה נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין 82374134.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אצטוניטריל | תרמו פישר מדעי | F2408R205 | HPLC |
| אנאירובי חממה | שנחאי CIMO מכשור רפואי ייצור ושות', בע"מ | YQX- II | |
| תמצית בקר | בייג'ינג Abxing ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | 01-009 | BR |
| אבקת סרום עיכול | בייג'ינג Abxing ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | 01-087 | BR |
| דיפוטסיום מימן פוספט | בייג'ינג עבודות כימיות | M26298 | AR |
| צינור איסוף צואה סטרילי חד פעמי | Lang Fu Co., Ltd | 5 מ"ל | |
| מים מזוקקים | המחלקה לביו-פרמצבטיקה, אוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית מסורתית | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich Corporation | WXBD2861V | AR |
| EP Tube | Beijing Biodee Biotechnology Co., בע"מ | 10 מ"ל / 1.5 מ"ל | |
| אפנדורף צנטריפוגה | Eppendorf AG | 5418 | |
| גלוקוז | בייג'ינג עבודות כימיות | GC205003 | AR |
| כרומטוגרף נוזלי בעל ביצועים גבוהים | Shimadzu Corporation | LC-20 | |
| מעקר קיטור בלחץ גבוה | Sanyo Denki שנחאי ושות', בע"מ | MLS-3780 | |
| Innoval C18 < / sub>עמוד כרומטוגרפי | Agela טכנולוגיות ושות', בע"מ | 4.6 מ"מ ופעמים; 250 מ"מ, 5 ומיקרו; m | |
| L-cysteine הידרוכלוריד | בייג'ינג Abxing ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | BGASY01 | BR |
| אבקת תמצית כבד | בייג'ינג Abxing ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | 01-085 | BR |
| לוטאולין | המכונים הלאומיים לבקרת | >98% | |
| בוחש מגנטי | Ika Werke ושות', בע"מ | RCT בסיסי | |
| מתנול | תרמו פישר מדעי | 20240901312 | AR |
| Millipore מסנן ממברנה | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | 0.22 ומיקרו; L וזמנים; 50 מ"מ | |
| אוריינטין | Yishiming (בייג'ינג) ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | 19120601 | >98% |
| פפטון | בייג'ינג Abxing ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | 1685787 | BR |
| פטרי צלחת | בייג'ינג ביודי ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | 150 מ"מ | |
| נתרן כלוריד | בייג'ינג Abxing ביוטכנולוגיה ושות', בע" | BN20008 | AR |
| נתרן תיוגליקולט | שנחאי Jianglai ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | J031S219019 | AR |
| עמילן מסיס | בייג'ינג Abxing ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | S9765 | BR |
| סויה פפטון | בייג'ינג Abxing ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | 2147955 | BR |
| Tryptone | Agela טכנולוגיות ושות', בע"מ | 1685787 | BR |
| מנקה אולטרסאונד | Kun Shan אולטרסאונד מכשירים ושות', בע"מ | KQ-500DE | |
| תמצית שמרים | בייג'ינג Abxing ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ | 01-014 | BR |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.