פרוטוקול זה חוקר את התפלגות ההטרוכרומטין בשמונה אוכלוסיות של עשב Lycoris aurea (L′Her), תוך שימוש בצביעה משולבת של כרומוזום PI ו-DAPI, הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) עם אזורי גן 18S-5.8-26S rRNA (אזורי 45S rDNA), ובדיקות DNA ריבוזומלי 5S.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פרוטוקול זה חוקר את התפלגות ההטרוכרומטין בשמונה אוכלוסיות של עשב Lycoris aurea (L′Her), תוך שימוש בצביעה משולבת של כרומוזום PI ו-DAPI, הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) עם אזורי גן 18S-5.8-26S rRNA (אזורי 45S rDNA), ובדיקות DNA ריבוזומלי 5S.
כדי להבין את השונות בקריוטיפ בשמונה אוכלוסיות, קריוטיפים מפורטים נקבעו בקפידה באמצעות מדידות כרומוזומליות, רצועות פלואורסצנטיות ואותות rDNA FISH. מספר אתרי 45S rDNA נע בין זוג אחד לחמישה זוגות לאוכלוסייה, כאשר המספר הנפוץ ביותר לכל קריוטיפ הוא ארבעה זוגות. לוקוס 45S rDNA ממוקם בעיקר בזרועות הקצרות ובאזורים הסופיים של הכרומוזומים, בעוד שלוקוס 5S rDNA נמצא בעיקר בזרוע הקצרה ובאזורים הסופיים או הפרוקסימליים. אוכלוסיות HBWF, HNXN, HBBD ו-HNZX הראו התפלגות דומה של אתרי 45S rDNA, וכך גם GXTL, HBFC ו-SCLS, מה שמצביע על קשר הדוק בין אוכלוסיות עם התפלגות דומה של אתרי 45S rDNA. הקריוטיפים של כל האוכלוסיות שנחקרו הם סימטריים, הכוללים צנטרומרים יציבים ויציבים או צנטרומרים יציבים בלבד. עלילות פיזור של MCA ו-CVCL מבחינות ביעילות את המבנים הקריוטיפיים שלהם. הניתוח כולל שישה פרמטרים כמותיים (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). בנוסף, התוצאות מצביעות על כך ש-PCoA המבוסס על ששת הפרמטרים הללו הוא שיטה חזקה לקביעת קשרי קריוטיפ ביולוגיים בין שמונה האוכלוסיות. מספר הכרומוזומים באוכלוסיות ליקוריס הוא x = 6-8. בהתבסס על המחקר והספרות הנוכחיים, התמיינות גנומית של אוכלוסיות אלה נדונה במונחים של גודל הגנום, הטרוכרומטין, אתרי 45S ו-5S rDNA ואסימטריה של קריוטיפ.
ליקוריס היא משפחה הכוללת מספר צמחי גננות חשובים1. Lycoris aurea (L'Hér.) עשב. הוא צמח מרפא סיני מסורתי עם היסטוריה ארוכה. ניתוח פיטוכימי הראה כי Lycoris aurea (L′Her.) הצמח מכיל גלנטמין ואלקלואידים אחרים, שיכולים להגביר את הרגישות לאצטילכולין ויש להם פוטנציאל לטפל במחלת אלצהיימר כמעכבי כולינאסטראז2.
בצמחים גבוהים יותר, ניתוח קריוטיפ חיוני לשילוב מפות גנטיות ופיזיות, עם השלכות מעשיות משמעותיות על הביולוגיה של הצמח. ניתוח זה מאפשר אפיון גנום ברמה כרומוזומלית , הבהרת קשרים טקסונומיים תאיים בין אוכלוסיות, זיהוי סטיו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים, בעוד שהבדיקות ששימשו מסופקות בתיק משלים 1.
1. הכנת כרומוזומים אפיקליים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
על ידי שימוש בשיטת טבילת אנזימים וייבוש להבה (EMF) קפדנית, כרומוזומי מטפאזה מפוזרים ומובחנים היטב של Lycoris aurea (L'Hér.) הושגו עשבים, ונבנה הקריוטיפ הכרומוזומי הציטוגנטי של Lycoris aurea (איור 1). כרומוזומי המטפאזה עם דרגת העיבוי הגבוהה ביותר אינם מתאימים לניתוח קריוטיפ בשל ההבדלים המורפולוגיים המופחתים. עם זאת, מכיוון שהאורך הכולל של כרומוזומים הפלואידים (TCL) ניתן להשוואה בין אוכלוסיות, ניתן להבחין בין הקריוטיפים של אוכלוסיות שונות של Lycoris aurea על ידי השוו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הכנת Lycoris aurea (L'Hér.) כרומוזומי שורש עשבים כוללים מספר שלבים קריטיים: (1) טיפוח שורשים באמצעות הידרופוניקה, (2) טיפול בקצות השורשים עם α-ברומונפתלין רווי, (3) קיבוע שורשים באמצעות תמיסת אלכוהול-חומצה אצטית, (4) ביצוע הידרוליזה אנזימטית בקצות השורשים עם תמיסת אנזים, ו-(5) ריסוק יסודי של השורשים המעוכלים וייבוש המגלשות על להבת מנורת אלכוהול.
מדידת כרומוזומים מדויקת חיונית לניתוח קריוטיפ במחקרים ציטוגנטיים. כרומוזומים צריכים להפגין עיבוי ניכר וגבול.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים הצהירו כי לא קיימים אינטרסים מתחרים.
העבודה הזו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של סין (32070367).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אלכוהול | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | A500737-0005 | (70%, 90%, 100%) |
| 1 פעמים; TNT | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | B548108 | 1&פעמים;, 10&פעמים; |
| פעמיים; SSC | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | B548109 | 2&, 20&; |
| 45ש rDNA | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | TAMRA מתווספת לשני הקצוות (5 'ו-3' קצוות) | |
| 4'6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E607303 | 20 מ"ל |
| 5S rDNA | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | 5 'end plus 6-FAM(FITC) | |
| Adobe Photoshop software | Adobe Systems Incorporated | CS6 | |
| Alpha bromo-naphthalene | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A602718 | סוכן רוויה |
| נגד שחיקה | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | Vectashield H-1000 | 10 מ"ל |
| חממה ביוכימית | שנחאי Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | LRH-70 | |
| Cellulase | Sangon Biotech (שנחאי) ושות', בע"מ | A426068 | 10 גרם |
| חומצת לימון | Sangon Biotech (שנחאי) ושות', בע"מ | A501702 | 10 גרם |
| פורממיד דה-יונים (FAD) | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | A600211-0500 | 0.7 |
| דקסטרן סולפט | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | A428229 | 10 מ"ל |
| פלואורסצנטי מכשיר הכלאה באתרו | ארה"ב/אבוט ThermoBrite | S500-24 | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | אולימפוס סין Co.ltd | BX60 | |
| חומצה אצטית קרחונית | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | A501931 | 500 מ"ל |
| HCl | Aladdin Reagent Co. Ltd. (שנחאי) | H399657 | 500 מ"ל |
| מכונת קרח | דן דינג שנחאי סחר בינלאומי ושות', בע"מ | ST-70 | |
| מיקרוסקופ ביולוגי Leica | גרמניה Leica Instrument Co., LTD | DM6000B | |
| מתיל אלכוהול | Sangon Biotech (שנחאי) ושות', בע"מ | A601617 | 500 מ"ל |
| תוכנת MetMorph | מכשירים מולקולריים | גרסה 7.35 | |
| תנור | תרמו מדעי ומסחרי; Heratherm&Trade; | THM#51028152 | |
| פקטינאז | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | A004297 | 10 גרם |
| פפסין | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | 1.07185 | 100 גרם |
| פרופידיום יודיד (PI) | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | A425259 | 1 גרם |
| RNaseA | סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ | R4642 | 10 מ"ג |
| DNA זרע סלמון (ssDNA) | מגיב אלאדין ושות' בע"מ (שנחאי) | D119871 | 1 גרם |
| נתרן | ציטראט מגיב אלאדין ושות' בע"מ (שנחאי) | S189183 | 10 גרם |
| סטטיסטיקה עבור Windows 10.0 | לניתוח סטטיסטי |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב