מאמר שיטה

ניתוח קריוטיפ השוואתי של אוכלוסיות עשב Lycoris aurea באמצעות רצועות פלואורוכרום ו-45S ו-5S rDNA-FISH

DOI:

10.3791/67363

⸱

29 בנובמבר 2024

 ,  , 
1Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province, Huaihua University, 2College of Biological and Food Engineering, Hunan University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה חוקר את התפלגות ההטרוכרומטין בשמונה אוכלוסיות של עשב Lycoris aurea (L′Her), תוך שימוש בצביעה משולבת של כרומוזום PI ו-DAPI, הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) עם אזורי גן 18S-5.8-26S rRNA (אזורי 45S rDNA), ובדיקות DNA ריבוזומלי 5S.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להבין את השונות בקריוטיפ בשמונה אוכלוסיות, קריוטיפים מפורטים נקבעו בקפידה באמצעות מדידות כרומוזומליות, רצועות פלואורסצנטיות ואותות rDNA FISH. מספר אתרי 45S rDNA נע בין זוג אחד לחמישה זוגות לאוכלוסייה, כאשר המספר הנפוץ ביותר לכל קריוטיפ הוא ארבעה זוגות. לוקוס 45S rDNA ממוקם בעיקר בזרועות הקצרות ובאזורים הסופיים של הכרומוזומים, בעוד שלוקוס 5S rDNA נמצא בעיקר בזרוע הקצרה ובאזורים הסופיים או הפרוקסימליים. אוכלוסיות HBWF, HNXN, HBBD ו-HNZX הראו התפלגות דומה של אתרי 45S rDNA, וכך גם GXTL, HBFC ו-SCLS, מה שמצביע על קשר הדוק בין אוכלוסיות עם התפלגות דומה של אתרי 45S rDNA. הקריוטיפים של כל האוכלוסיות שנחקרו הם סימטריים, הכוללים צנטרומרים יציבים ויציבים או צנטרומרים יציבים בלבד. עלילות פיזור של MCA ו-CVCL מבחינות ביעילות את המבנים הקריוטיפיים שלהם. הניתוח כולל שישה פרמטרים כמותיים (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI). בנוסף, התוצאות מצביעות על כך ש-PCoA המבוסס על ששת הפרמטרים הללו הוא שיטה חזקה לקביעת קשרי קריוטיפ ביולוגיים בין שמונה האוכלוסיות. מספר הכרומוזומים באוכלוסיות ליקוריס הוא x = 6-8. בהתבסס על המחקר והספרות הנוכחיים, התמיינות גנומית של אוכלוסיות אלה נדונה במונחים של גודל הגנום, הטרוכרומטין, אתרי 45S ו-5S rDNA ואסימטריה של קריוטיפ.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ליקוריס היא משפחה הכוללת מספר צמחי גננות חשובים1. Lycoris aurea (L'Hér.) עשב. הוא צמח מרפא סיני מסורתי עם היסטוריה ארוכה. ניתוח פיטוכימי הראה כי Lycoris aurea (L′Her.) הצמח מכיל גלנטמין ואלקלואידים אחרים, שיכולים להגביר את הרגישות לאצטילכולין ויש להם פוטנציאל לטפל במחלת אלצהיימר כמעכבי כולינאסטראז2.

בצמחים גבוהים יותר, ניתוח קריוטיפ חיוני לשילוב מפות גנטיות ופיזיות, עם השלכות מעשיות משמעותיות על הביולוגיה של הצמח. ניתוח זה מאפשר אפיון גנום ברמה כרומוזומלית , הבהרת קשרים טקסונומיים תאיים בין אוכלוסיות, זיהוי סטיות גנטיות והבנת מגמות האבולוציה הכרומוזומלית 3,4,5. בדרך כלל, תיאור קריוטיפ כולל מספר כרומוזומים, אורכי כרומוזומים מוחלטים ויחסיים, מיקומי התכווצות ראשוניים ומשניים, התפלגות שברים הטרוכרומטיים, מספרים ומיקומים של אתרי rDNA ומאפיינים אחרים של רצף DNA, כמו גם אסימטריה של קריוטיפ 6,7,8. בין הפרמטרים הקריוטיפיים, אסימטריה נקבעת על ידי וריאציות באורך הכרומוזום (אסימטריה בין-כרומוזומלית) ומיקום הצנטרומר (אסימטריה תוך-כרומוזומלית). אסימטריית קריוטיפ היא תכונה משמעותית המשקפת מורפולוגיה של כרומוזומים ונמצאת בשימוש נרחב בטקסונומיה של תאי צמחים 9,10,11,12.

לעתים קרובות, היעדר סמני כרומוזומים מגביל את ניתוח הקריוטיפ ומעכב את הזיהוי של כרומוזומים בודדים. בשנים האחרונות, צביעת גימסה, רצועות פלואורסצנטיות והכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) הפכו פופולריים בניתוח כרומוזומי צמחים. שיטות צביעה פלואורסצנטיות כפולות, כגון צביעת CMA (כרומיצין A3) / DAPI (4, 6-diamino-2-phenylindole) וצביעה PI (פרופיל יודיד) / DAPI (המכונה צביעת CPD), חושפות אזורים הטרוכרומטיים עשירים ב- GC ו- AT, על כרומוזומים 4,13. במהלך מטפאזה או פצ'יטן של מיטוזה של צמחים, רצפי DNA חוזרים או מקטעי DNA ארוכים יכולים ליצור אותות ספציפיים באוכלוסיות צמחים באמצעות הכלאה של FISH 14,15,16.

רצועות פלואורסצנטיות ואותות FISH מספקים סמנים שימושיים לזיהוי כרומוזומים. על ידי מדידת אורך הכרומוזום, ניתוח מאפייני רצועות פלואורסצנטיות והשוואת הבדלי אותות FISH, ניתן לבנות קריוטיפים ציטוגנטיים מולקולריים מפורטים של נבטפלזמות או אוכלוסיות צמחים שונות. קריוטיפים אלה מציגים ביעילות מורפולוגיה של כרומוזומים בג'רמפלזמות או אוכלוסיות שונות, מה שמאפשר השוואות של התפלגות הטרוכרומטין ולוקליזציה של רצף ה-DNA ומעודד מחקר נוסף 4,8,17. השוואות קריוטיפ ציטוגנטיות מולקולריות יכולות להציע תובנות חשובות לגבי הקשרים הפילוגנטיים והאבולוציה הכרומוזומלית של אוכלוסיות קשורות 8,14,18,19.

הסוג Lycoris , קבוצה מגוונת ומסקרנת במשפחת האמריליס, ידוע בפקעות הרב שנתיות שלו. הוא כולל כ-20 מינים, 15 מהם אנדמיים לסין, ומציג מגוון ביולוגי עשיר. סוג זה נמצא אך ורק באזורים ממוזגים וסובטרופיים חמים של מזרח אסיה, כולל דרום מערב סין, דרום קוריאה ויפן, עם אוכלוסיות מעטות המשתרעות עד צפון הודו ונפאל. מחקרים ציטוגנטיים מוקדמים כללו בעיקר ספירת כרומוזומים כדי לקבוע את מספר הכרומוזומים הבסיסי של הסוג ולתיאור מורפולוגיה של כרומוזומים באוכלוסיות ספציפיות, תוך התמקדות בעיקר ב-Lycoris radiata21. מספרי הכרומוזומים הכוללים שנצפו בסוג זה נעים בין 12 ל-33 או 44, המייצגים רמות דיפלואידיות, דיפלואידיות חריגות, טריפלואידים, טטרפלואידים ואנופלואידים, בהתאמה. מספרי הכרומוזומים הבסיסיים, x, הם 6, 7, 8 ו-11.

Lycoris aurea (L'Hér.) עשב, מין בולט בסוג Lycoris , נפוץ ברחבי סין22. הוא משגשג בסביבות רגועות ולחות ומתרבה באמצעות נורות קטנות. פקעות אלה, המכילות ליקורין וגלנטמין - שתי תרכובות רפואיות מרכזיות - שימשו ברפואה הסינית המסורתית במשך מאות שנים. Lycoris aurea שובה את לב הגננים עם הפרחים האדומים הבולטים שלו בסתיו והעלים ירוקי עד בחורף. עם זאת, הדמיון המורפולוגי בין כל ה-Lycoris aurea (L'Hér.) שנחקר אוכלוסיות צמחים מהוות אתגר משמעותי לזיהוי כרומוזומלי בשיטות ציטולוגיות קונבנציונליות.

שיבוט של FISH, פוסמיד או BAC (כרומוזומים מלאכותיים חיידקיים) עם רצפי DNA חוזרים ובדיקות אוליגונוקלאוטידים על כרומוזומים מטפאזיים או פצ'ידרמטיים שימש לניתוח קריוטיפ23,24,25, ניתוח ציטוגנטי השוואתי26,27, בניית מפה ציטוגנטית28,29 ובדיקות ספציפיות לכרומוזום30. לאחרונה, טכניקת FISH יושמה לניתוח כרומוזומים של אוכלוסיות ליקוריס 31. למרות שמספר הכרומוזומים והקריוטיפ משתנים באוכלוסיות ליקוריס, מספר הכרומוזומים הכולל נשאר קבוע, עם שלושה סוגים בסיסיים שנצפו: כרומוזום הצנטרומר המרכזי (M-), כרומוזום הצנטרומר הדיסטלי (T-) וכרומוזום הצנטרומר הפרוקסימלי (A-). בנוסף, צורות וגדלים מגוונים של כרומוזומים נצפים באוכלוסיות טבעיות32.

פלואורסצנטיות RNA בהכלאה באתרה (FISH) שימושית לאיתור שינויים כרומוזומליים, כגון היתוך צנטרומר, היפוך, הגברת גנים ומחיקת שבר. טכנולוגיית Fluorescence In Situ Hybridization (RNA-FISH) מאפשרת ניתוח חזותי ברזולוציה גבוהה של כרומוזומים כדי לזהות ולזהות שינויים מורכבים מרובים, כולל היתוך של אזורים מרכזיים של כרומוזומים, היווצרות מבני כרומוזומים חדשים, היפוך אזורים כרומוזומליים, הגברה של גנים או שברי גנים ואובדן רצף גנים באזורי כרומוזומים ספציפיים33. חמישה מתוך 500 השיבוטים הראו אותות FISH חזקים באזור הצנטרומר של כרומוזום הצנטרומר המרכזי (M-) אך לא על כרומוזום הצנטרומר הדיסטלי (T-)34. דפוס התפלגות אותות ה-FISH הייחודי על כל כרומוזום איפשר זיהוי של כרומוזומים בודדים, מה שבעבר היה מאתגר באוכלוסיות ליקוריס באמצעות שיטות צביעה מסורתיות31. נכון לעכשיו, ישנם מעט מחקרים על הציטוגנטיקה המולקולרית של Lycoris aurea (L'Hér.) Herb, תוך הדגשת הצורך הדחוף במחקר נוסף בתחום זה.

במחקר זה, שמונה כרומוזומי מטפאזה מובחנים היטב של Lycoris aurea (L'Hér.) אוכלוסיות הצמחים הוכנו בשיטות טבילה באנזים וייבוש להבה (EMF). צביעת CPD ובדיקות 45S ו-5S rDNA שימשו לזיהוי FISH. קריוטיפים ציטוגנטיים מולקולריים מפורטים של אוכלוסיות אלה נבנו באמצעות נתונים משולבים ממדידות כרומוזומליות, רצועות פלואורסצנטיות ואותות 45S ו-5S rDNA FISH. שישה מדדי אסימטריה קריוטיפיים שונים חושבו עבור כל אוכלוסייה כדי לזהות קשרים קריוטיפיים ביניהם. הערכת נתוני הקריוטיפ הציטוגנטי המולקולרי סיפקה תובנות משמעותיות לגבי ההתמיינות הגנומית והיחסים האבולוציוניים של שמונה האוכלוסיות, מה שעשוי לעצב מחדש את ההבנה של כרומוזומי ליקוריס .

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים, בעוד שהבדיקות ששימשו מסופקות בתיק משלים 1.

1. הכנת כרומוזומים אפיקליים

  1. השתרש על ידי הידרופוניקה. לאחר הסרת החלק מעל הקרקע של הנורה, הניחו אותה בבקבוק מחודד מלא במים, והחליפו את המים כל 3 ימים, לפי השיטה שתוארה על ידי סונג ואחרים.35.
  2. כרתו את קצות השורשים הגדלים באופן פעיל כאשר הם מגיעים לאורך של כ-1.0-2.0 ס"מ וטפלו בהם ב-α-ברומונפתלין רווי בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 1.0 שעות.
  3. חותכים את קצות השורש לכ -1 ס"מ ומניחים אותם בתערובת טרייה שהוכנה של מתנול וחומצה אצטית קרחונית ביחס נפח של 3: 1 בטמפרטורת החדר (כ 20-25 מעלות צלזיוס) למשך 2-3 שעות. לאחר מכן, אחסן אותם במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, כפי שמתואר על ידי She et al.36.
  4. שוטפים היטב את קצות השורש הקבועים (2-3 מ"מ) במים מזוקקים כפולים.
  5. הכינו תערובת של צלולאז ופקטין הידרולאז במאגר חומצת לימון-נתרן ציטראט של 0.01 מ"מ ב-pH 4.5, עם צלולאז ופקטין הידרולאז כל אחד ב-1%. מניחים את קצות השורש שטופלו מראש בתערובת ומעכלים בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך 1.0-1.5 שעות.
  6. שוטפים את קצות השורש המעוכלים במים מזוקקים כפולים, מעבירים אותם על שקופית זכוכית ומועכים היטב עם הקיבוע בעזרת מלקחיים מחודדים.
  7. יבש את המגלשות מעל להבת מנורת אלכוהול עד שערפל המים פשוט נעלם. תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, בחר שקופיות עם יותר מחמישה שלבים מפוצלים וללא כרומוזומים חופפים. אחסן את השקופיות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.

2. מכתים CPD

  1. הכן תמיסת CPD על ידי הוספת PI ו-DAPI למנחת אנטי-פלואורסצנטי של 30% (v/v), כאשר ריכוז ה-PI הוא 0.6 מיקרוגרם·מ"ל-1 וריכוז ה-DAPI הוא 3 מיקרוגרם·מ"ל-1.
  2. יבש את שקופית הכרומוזום ב-65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. הוסף 100 מיקרוליטר של מדלל RNase A (תמיסת האחסון RNase A מדוללת 100 פעמים עם 2x SSC (נתרן ציטראט מלוח), וכתוצאה מכך ריכוז סופי של 100 מיקרוגרם/מ"ל) לכל שקופית כרומוזום. מכסים את השקופית ומחממים אותה בתא לח של 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
  4. שטפו את שקופית הכרומוזום עם 2x SSC בטמפרטורת החדר למשך שלושה מרווחים של 5 דקות כל אחד.
  5. שטפו את שקופית הכרומוזום בטמפרטורת החדר למשך 1-2 דקות.
  6. הוסף 200 מיקרוליטר של מדלל פפסין (תמיסת אחסון הפפסין מדוללת 100 פעמים עם 0.01 N HCl כדי להשיג ריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל) לכל שקופית כרומוזום. מכסים את השקופית ומדגרים אותה בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5-20 דקות.
  7. שטפו את חלקי הכרומוזום במים טהורים במיוחד בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות, ולאחר מכן שטפו עם 2 xSSC בטמפרטורת החדר למשך שני מרווחים של 5 דקות כל אחד.
  8. תקן את השקופיות עם מתנול: תמיסת חומצה אצטית קרחונית (3: 1) למשך 10 דקות.
  9. יש לשטוף עם 2x SSC בטמפרטורת החדר למשך שלושה מרווחים של 5 דקות כל אחד.
  10. טפל ב-70%, 95% ו-100% אתנול ב-20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן יבש בטמפרטורת החדר.
  11. קח את שקופיות הכרומוזום המטופלות והמיובשות, הוסף 30 מיקרוליטר של תמיסת צביעה CPD לכל שקופית, כסה בכיסוי 24 מ"מ על 50 מ"מ והכתים בחושך במשך יותר מ-30 דקות. יש להכתים חומר כרומוזומי נרחב בן לילה.
  12. התבונן בשקופיות הכרומוזום תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, באמצעות מסנן עירור ירוק (WG) לצביעה PI ומסנן אולטרה סגול (UV) לצביעה DAPI. צלם תמונות עם התוכנה התואמת.
    1. כוונן את זמן החשיפה דרך שני המסננים כדי להשיג עוצמות פלואורסצנטיות דומות של אדום וכחול במהלך לכידת תמונה. תמונת ה-CPD מתקבלת מהתמונות בגווני אפור המוכתמות ב-PI ו-DAPI. מדידות כרומוזומים ועיבוד תמונה בוצעו באמצעות תוכנת Adobe Photoshop.

3. פלואורסצנציה בהכלאה באתרה

  1. הכן את התמיסה ההיברידית: FAD (10 μL), ssDNA (2 μL), 20× SSC (2 μL), 5S rDNA (1 μL), 45S rDNA (1 μL) ו-50% גלוקן סולפט (4 μL). לאחר ההכנה, צנטריפוגה את התמיסה ההיברידית (2500 x גרם, 5-10 דקות, בטמפרטורת החדר) והניחו אותה על קרח.
  2. מכניסים את השקופיות הסרוקות לתנור בחום של 65 מעלות למשך 30-60 דקות.
  3. מסירים את השקופיות האפויות, מוסיפים 100 מיקרוליטר של תמיסת דנטורציה של 70% FAD, מכסים בכוס כיסוי ומנטרלים בתנור הכלאה מולקולרי של 85 מעלות צלזיוס למשך 2.5 דקות.
  4. הסר את זכוכית הכיסוי וטבל מיד את השקופיות באתנול קר של 70%, 90% ו-100%, תוך התייבשות ברציפות למשך 5 דקות כל אחת.
  5. הסר את השקופיות ואפשר להן להתייבש בטמפרטורת החדר במשך יותר מ-30 דקות.
  6. הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסה היברידית לשקופית, הניח בעדינות את זכוכית הכיסוי מעל עד שהנוזל מתפזר לחלוטין, והשאיר אותו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי להרטיב את האזור המכוסה של השקופית.
  7. מניחים את השקופיות בכלי היברידי ספוג ב-2× SSC (המנה ההיברידית צריכה להיות צלחת פטרי גדולה עם מכסה עטוף בנייר כסף כדי להקל על הפעולה הרחק מאור) ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (למשך 6 שעות לפחות).
  8. כתם את הכרומוזומים על ידי הרכבתם עם 3 μg·mL-1 DAPI בתמיסה של 30% (v/v) של Vectashield H-100. צלם את התמונה באמצעות תוכנה תואמת, כאשר הקרינה הכחולה של DAPI נרגשת על ידי האור הסגול של המסנן והפלואורסצנטיות האדומה של PI נרגשת על ידי האור הירוק, בהתאמה.
    הערה: הכלאת FISH בוצעה באמצעות בדיקות 45S ו-5S rDNA בשקופיות מוכתמות בעבר ב-CPD, בהתאם לשיטה שתוארה על ידי She et al.36.

4. ניתוח קריוטיפ

  1. בחר חמישה תאים מיטוטיים מטפאזיים עבור כל אוכלוסייה שבה הכרומוזומים מפוזרים היטב (ללא חפיפה) ומעובים בצורה בינונית (אין לצבור את הכרומוזומים בצורה מקסימלית, אך אין להצמיד את הקצוות יחד), בהתאם למתודולוגיה המתוארת על ידי She et al.4.
  2. קבע את האורך המוחלט של כל כרומוזום על ידי בחירת חמישה כרומוזומים עם הריכוז הגבוה ביותר במהלך חלוקת התא.
  3. יש למדוד בקפדנות ובדייקנות את אורך הזרוע הארוכה (L) והזרוע הקצרה (S) של כל כרומוזום, כמו גם את הגודל של כל רצועת פיגמנט פלואורסצנטי על הכרומוזום.
  4. חשב את הפרמטרים הבאים: (1) אורך כרומוזום יחסי (RL, אחוז הפלואיד); (2) יחס זרועות (AR = L/S, זרוע ארוכה/זרוע קצרה); (3) אורך כרומוזום הפלואיד כולל (TCL; אורך קריוטיפ); (4) אורך כרומוזום ממוצע (C); (5) גודל פס הקרינה (אחוז פס הקרינה ביחס לאורך הכרומוזום); (6) מרחק מהצנטרומר לאתר ה-rDNA; (7) אינדקס צנטרומר ממוצע (CI, מחושב כאורך הזרוע הקצר של כל כרומוזום חלקי האורך הכולל של אותו כרומוזום, ואז ממוצע ערכים אלה); (8) ארבעה אינדיקטורים שונים לאסימטריה של קריוטיפ, כולל אינדקס הצנטרומר (CVCI), מקדם השונות (CV), מקדם השונות של אורך הכרומוזום (CVCL), מקדם אסימטריה צנטרומר ממוצע (MCA) וקטגוריית אסימטריית סטבינס.
    הערה: עיין בשיטות של Paszko10 ו-Peruzzi et al.11 כדי לחשב את מדד האסימטריה. סווג כרומוזומים עם יחסי זרוע שונים לפי חמש שיטות הסיווג של לבן. סדר את הכרומוזומים של Lycoris aurea (L'Hér.) עשב בסדר אורך יורד כמתואר בפרוטוקולהאן ואחרים 37.
  5. ודא את הדיוק והדיוק של המתודולוגיה על ידי ציור דפוסי קריוטיפ כרומוזומים המבוססים על נתוני מדידת כרומוזומים בשילוב עם מידע על פס הקרינה והמיקום והגודל של ה-rDNA-FISH.
  6. המחשת היחסים הא-סימטריים של הקריוטיפ בין שמונה האוכלוסיות היא צעד מפתח המספק תובנות ברורות. זה מושג באמצעות עלילות פיזור דו מימדיות, המשמשות להשגת ה-MCA וה-CVCL שלהם.
  7. בצע ניתוח קואורדינטות ראשי (PCoA) באמצעות מקדם הדמיון של גאוור, מרכיב מכריע, בהתאם לשיטות של She et al.38.
  8. חשב שישה פרמטרים כמותיים (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI) כדי לקבוע את הקריוטיפים הציטוגנטיים של שמונה האוכלוסיות.
  9. ביצוע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנית ניתוח נתונים והדמיה ליצירת דנדרוגרמה מבוססת UPGMA ותרשים פיזור PCoA.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על ידי שימוש בשיטת טבילת אנזימים וייבוש להבה (EMF) קפדנית, כרומוזומי מטפאזה מפוזרים ומובחנים היטב של Lycoris aurea (L'Hér.) הושגו עשבים, ונבנה הקריוטיפ הכרומוזומי הציטוגנטי של Lycoris aurea (איור 1). כרומוזומי המטפאזה עם דרגת העיבוי הגבוהה ביותר אינם מתאימים לניתוח קריוטיפ בשל ההבדלים המורפולוגיים המופחתים. עם זאת, מכיוון שהאורך הכולל של כרומוזומים הפלואידים (TCL) ניתן להשוואה בין אוכלוסיות, ניתן להבחין בין הקריוטיפים של אוכלוסיות שונות של Lycoris aurea על ידי השוואת הבדלים בערכי TCL. מאפייני הקריוטיפ ותכולת ה-DNA הגרעיני של שמונה אוכלוסיות של Lycoris aurea מוצגים בטבלה 1. התפלגות רצועות הקרינה והמיקומים של אתרי 45S ו-5S rDNA מוצגים בטבלה 2. איור 2 מציג את מדידות הכרומוזומים יחד עם מאפייני פס פלואורסצנטי ואת המיקום והגודל של אותות 45S ו-5S rDNA FISH.

מספרי הכרומוזומים הדיפלואידים הם כדלקמן: 2n = 16 = 8m + 8t עבור GXTL, 2n = 14 = 8m + 6t עבור HBFC, 2n = 14 = 8m + 6t עבור GZDS, 2n = 16 = 6m + 10t עבור HNZX, 2n = 14 = 8m + 6t עבור HBBD, 2n = 14 = 8m + 6t עבור HNXN, 2n = 16 = 6m + 10t עבור HBWF, ו- 2n + 1 = 15 = 7m + 8t עבור SCLS (טבלה 1). כפי שמתואר בפרוטוקול על ידי She et al.4, כרומוזומי המטאפאזה של שמונה אוכלוסיות L. aurea הם קטנים, עם אורכי כרומוזומים ממוצעים הנעים בין 1.01 מיקרומטר (HNZX) ל-2.08 מיקרומטר (GZDS) ו-TCL נע בין 16.14 מיקרומטר (HNZX) ל-29.13 מיקרומטר (GZDS). ה-TCL של שמונה האוכלוסיות נמצא בקורלציה עם תכולת ה-DNA הגרעיני המדווח (טבלה 1). טווח האורך היחסי הקטן ביותר (RRL) נצפה ב-HNXN (1.52-3.81), בעוד שהגדול ביותר נראה ב-GZDS (2.73-5.86). אוכלוסיות HNXN ו-GZDS הראו את השונות הקטנה והגדולה ביותר באורך הכרומוזומים, בהתאמה. מדד הצנטרומר הממוצע (CI) של הגנום נע בין 61.02 ±-5.63 (אוכלוסיית HBFC) ל-70.70 ±-4.63 (אוכלוסיית HBWF). אוכלוסיית HBFC הראתה את השינוי הקטן ביותר במדד הצנטרומר, בעוד שאוכלוסיית HBWF הציגה את השינויים הנרחבים ביותר.

הקריוטיפים מורכבים מכרומוזומים מטצנטריים (m) וטלוצנטרים (t) (טבלה 1; איור 2), המייצג את צורות הכרומוזומים הנפוצות ביותר מבין שמונה האוכלוסיות שנחקרו. שמונת מדדי האסימטריה השונים של קריוטיפ מסופקים בטבלה 1. בין מדדים אלה, מקדם השונות של אינדקס הצנטרומר (CVCI) ואסימטריית הצנטרומר הממוצעת (MCA) מאפיינים אסימטריה תוך-כרומוזומלית, בעוד שמקדם השונות של אורך הכרומוזום (CVCL) מודד אסימטריה בין-כרומוזומלית. הטווחים עבור CVCI ו-MCA הם כדלקמן: CVCI = 10.97 (HBBD) עד 18.25 (HBWF), ו-MCA = 28.85 (HNZX) עד 39.30 (HBWF). ערכים אלה מצביעים באופן עקבי על כך של-HBBD יש את הנמוך ביותר ול-HBWF יש את האסימטריה התוך-כרומוזומלית הגבוהה ביותר. הטווח של CVCL הוא 14.98 (GZDS) עד 23.32 (HBWF), מה שמצביע על כך ש-GZDS מציג את הקריוטיפ הכי פחות אסימטרי, בעוד ש-HBWF מציג את הקריוטיפ הא-סימטרי ביותר מבין שמונה האוכלוסיות. על פי עקרונות הסיווג של סטבינס9, קריוטיפים אלה שייכים למחלקה 1B, מה שמצביע על כך שלכל האוכלוסיות שנחקרו יש קריוטיפים סימטריים יחסית.

יחסי אסימטריה קריוטיפיים בין שמונת הליקוריס הזהוב (L'Hérit.) אוכלוסיות עשבי תיבול מודגמות באמצעות תרשימי פיזור דו-ממדיים של CVCI לעומת CVCL ו-MCA לעומת CVCL (איור 3). למבנה הקריוטיפ של אוכלוסיות אלה, כפי שנחשף על ידי שלושת זוגות הפרמטרים - CVCI, CVCL ו- MCA - יש השלכות משמעותיות. פרמטרים אלה מדגימים אסימטריות קריוטיפיות דומות. הממצאים מתרשימי הפיזור מדגישים את ההשפעה הפוטנציאלית של המחקר, ומראים כי לאוכלוסיית HNXN יש את הקריוטיפ הסימטרי ביותר, בעוד שאוכלוסיות HBFC ו-HBWF מציגות את האסימטריות התוך-כרומוזומליות והבין-כרומוזומליות ביותר, בהתאמה (איור 3).

מחקר זה סיווג בקפידה את שמונה אוכלוסיות Lycoris aurea לשלוש קבוצות עיקריות בהתבסס על דיאגרמת עץ UPGMA עם חמישה פרמטרים קריוטיפיים (איור 4). האשכול הראשון, המיוצג על ידי אוכלוסיית SCLS, יוצר קבוצה עצמאית. הקבוצה השנייה מורכבת מ-HNXN ו-HBWF. האשכול השלישי מחולק לשתי תת-קבוצות: האחת מכילה רק את האוכלוסייה HBFC, ואילו השנייה כוללת את האוכלוסיות HBWF, GZDS ו-GXTL, כאשר האוכלוסייה HBBD ו-GZDS מקובצות בענף קטן יותר. הקשרים הקריולוגיים בין האוכלוסיות הנחקרות, כפי שנחשפו על ידי ניתוח קואורדינטות ראשי (PCoA), מודגמים באיור 5. תרשים פיזור ה-PCoA מצביע על כך שניתן לחלק את שמונה האוכלוסיות לשתי קבוצות ברמת ביטחון של 68.36%. הקבוצה הראשונה כוללת HBWF, HBBD ו-GXTL, כאשר שלוש האוכלוסיות הראשונות מקובצות יחד. הקבוצה השנייה מורכבת מ-HBFC, HNXN, HNZX ו-SCLS, כאשר HBFC תופס את המיקום האמצעי בין שתי הקבוצות, ו-SCLS ממוקם הכי מבודד (איור 5).

CPD (שילוב של פרופידיום יודיד ו-DAPI) ו-DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) צביעה הפוכה הן טכניקות סטנדרטיות המשמשות לצפייה במבנה הגרעיני ובהתפלגות הכרומטין. תוצאות מחקר זה חשפו תופעות הטרוכרומטין לכאורה בקרב שמונה אוכלוסיות של Lycoris aurea (L'Hérit.) עשב (איור 1 ואיור 2; טבלה 2). תוצאות הכלאה של FISH עבור כל אוכלוסייה הצביעו על כך שכל האזורים הכרומוזומליים תואמים למיקומי 45S ו-5S rDNA. המאפיינים של רצועות ה-CPD מומחשים באיור 1A,C,E,G,I,K,M,O.

באוכלוסיות HBFC ו-HBBD, רצועות CPD נצפו באזורים הצנטרומריים והפרי-צנטרומריים (איור 1G,K; איור 2D,F). עם זאת, כרומוזומים מסוימים לא הציגו רצועות CPD: הכרומוזומים השלישי והשמיני ב-SCLS, הכרומוזום הראשון ב-HNXN, הכרומוזום הראשון ב-HNZX, הכרומוזום הראשון ב-HBWF, הכרומוזום השני ב-GZDS והכרומוזום השני ב-GXTL (איור 1A,C,E,I,J,M,O; איור 2A-C,E,G,H). יש לציין כי רצועות CPD נמצאו גם על הטרמינלים של הזרועות הקצרות של זוגות כרומוזומים 5, 6 ו-7 ב-SCLS ו-HNXN, בזוגות 4, 5, 6, 7 ו-8 ב-HNZX, ובזוגות 5, 6 ו-7 ב-HBFC. נוסף על כך, רצועות CPD היו נוכחות בקצות הזרוע הקצרה של כרומוזומים 4, 5, 6, 7 ו-8 ב-HBWF, בקצות הזרוע הקצרה של כרומוזומים 5, 6 ו-7 ב-HBBD, ובקצות הזרוע הקצרה של כרומוזומים 5, 6, 7 ו-8 ב-GXTL (איור 1A ואיור 2A).

לאחר הכלאת FISH, צביעה הפוכה של DAPI יצרה רצועות פלואורסצנטיות בהירות סביב החלקיקים המרכזיים של כרומוזומים 5, 6 ו-7 ב-GZDS. רצועות אלה, הנקראות רצועות DAPI+ פוסט-FISH, מצביעות על כך שאזורי הטרוכרומטין אלה מכילים מספר גבוה של זוגות בסיסי A-T (איור 2G). טווח רצועות ה-CPD (פרי)צנטרומרי שנצפו בשמונה האוכלוסיות היה 25.00% עד 57.14% (טבלה 2), בעוד שהכמות הכוללת של רצועות CPD סופיות נעה בין 40.00% ל-71.43% (טבלה 2). באוכלוסיית GZDS, רצועות DAPI+ לאחר FISH היו בקורלציה עם אורך הקריוטיפ, והיוו 42.86% מהסך הכל. הגדלים של רצועות rDNA CPD, רצועות CPD שאינן rDNA ורצועות DAPI+ לאחר FISH היו שונים באופן משמעותי בין זוגות הכרומוזומים השונים של Lycoris aurea (L'Hérit.) עשב (איור 2; טבלה 2).

טכניקת FISH שימשה להחדרת בדיקות 45S ו-5S rDNA לכרומוזומים מוכתמים ב-CPD, כפי שמוצג באיור 1. סיכום המספר והמיקום של אתרי 45S ו-5S rDNA בשמונה האוכלוסיות של Lycoris aurea (L'Hérit.) עשב מוצג בטבלה 2 ומתואר באיור 2. יש לציין כי הבדלים משמעותיים במספר, בגודל ובמיקום של מיקומי rDNA בין שמונה האוכלוסיות מדגישים את חשיבות הממצאים הללו. בסך הכל, היו 30 מיקומי 45S rDNA בשמונה האוכלוסיות. מתוכם, 4 לוקוסים (13.33%) היו ממוקמים באזור הצנטרומר המרכזי, 9 (30.00%) באזור הצנטרומר הקרוב למרכז ו-17 (56.67%) באזורים הסופיים של זרועות הכרומוזום שלהם (איור 2; טבלה 2).

באוכלוסיית GXTL, אות לוקוס 45S rDNA אחד נמצא באזור הצנטרומר של הזרוע הקצרה של כרומוזום 4, בעוד שארבעה אותות נוספים אותרו באזור הצנטרומר של הזרועות הארוכות של כרומוזומים 5, 6, 7 ו-8 (איור 1P; איור 2G). באוכלוסיית HBFC, לוקוס 45S rDNA אחד הוצב באזור הצנטרומר על הזרוע הקצרה של כרומוזום 4, עם שלושה לוקוסים שנמצאו באזורים הטרוכרומטין פרי-צנטרומריים על הזרועות הקצרות של כרומוזומים 5, 6 ו-8 (איור 1H; איור 2D). באוכלוסיית GZDS, לוקוס 45S היה ממוקם באזור הצנטרומר של הזרוע הקצרה של כרומוזום 4 מטצנטרי (איור 1N; איור 2G). ב-HNZX, נצפו חמישה מיקומי 45S rDNA באזורים הסופיים של הזרועות הקצרות של זוגות כרומוזומים 4, 5, 6, 7 ו-8 (איור 1H; איור 2D). התפלגות אתרי 45S ב-HBBD (איור 1J; איור 2E) ו-HNXN (איור 1L; איור 2F) היה דומה, עם לוקוס אחד באזור הצנטרומר של הזרוע הקצרה של כרומוזום 4 ושלושה לוקוסים באזור הצנטרומר של הזרועות הקצרות של כרומוזומים 5, 6 ו-7.

ב-HBWF, חמישה אותות של 45S rDNA הופיעו באזורי הצנטרומר של הזרוע הקצרה של זוגות כרומוזומים 4, 5, 6, 7 ו-8 (איור 1N; איור 2G). ב-SCLS, אות לוקוס 45S rDNA אחד נמצא באזורי הצנטרומר של הזרוע הקצרה של זוגות כרומוזומים 1 ו-2, כמו גם באזורים הפרי-צנטרומריים של הזרועות הקצרות של זוגות כרומוזומים 5 ו-6 (איור 1P; איור 2H). עבור מיקומי 5S rDNA, זוהו בסך הכל תשעה על פני שמונת הטקסונים, כאשר 3 (33.33%) ממוקמים באזורים הפרוקסימליים, 3 (33.33%) באזורים הפרי-צנטרומריים, ו-3 (33.33%) באזורים הסופיים של זרועות הכרומוזום המתאימות (איור 2; טבלה 2). ב-GXTL, אות לוקוס 5S rDNA אחד הופיע ליד הקצה הסופי של הזרוע הארוכה של זוג כרומוזומים 6 (איור 1P; איור 2G). התפלגות אתרי 5S הייתה דומה ב-HBFC (איור 1H; איור 2D) ו-GZDS (איור 1N; איור 2G), שניהם מכילים לוקוס 5S rDNA אחד באזור הפרוקסימלי של הזרוע הקצרה של כרומוזום 7. ב-HNZX, לוקוס 5S rDNA נמצא ליד הקצה הסופי של הזרוע הארוכה של כרומוזום 8 (איור 1H; איור 2D), בעוד שב-HBBD, לוקוס 5S rDNA זוהה בכרומוזום 7 (איור 1J; איור 2E). ב-HBWF, שני לוקוסים של 5S rDNA הופיעו ליד הקצה הסופי של הזרועות הארוכות של כרומוזומים 4 ו-8, שניים נוספים בזרוע הארוכה של כרומוזום 7, אחד באזור הצנטרומר ואחד לקראת הסוף (איור 1N; איור 2G).

השילוב של אותות 45S ו-5S rDNA FISH, יחד עם מאפייני מקטע CPD טרמינלי, הבחין למעשה בין כל הכרומוזומים המיטוטיים מאוכלוסיות שונות של Lycoris aurea (L'Hérit.) עשב. באוכלוסיות SCLS, HBFC, HBBD, GZDS ו-GXTL, כרומוזום 1 הפגין אותות CPD חזקים באזור הצנטרומרי. כרומוזום 2 הציג אותות CPD חזקים באזור הצנטרומרי, למעט GZDS ו-GXTL. כרומוזום 3 הראה אות CPD חזק באזור הצנטרומרי, למעט SCLS. כרומוזום 4 הפגין באופן עקבי אותות CPD חזקים באזור הצנטרומרי. עבור כרומוזומים 5, 6 ו-7, אותות CPD חזקים נצפו בקצות הזרועות הקצרות. כרומוזום 4 הראה גם אותות 45S rDNA חזקים בקצה הזרוע הקצרה, בעוד שלכרומוזומים 5 ו-6 היו אותות 45S חזקים באזורים הסופיים שלהם, למעט ב-GZDS. יש לציין כי אות DAPI חזק היה קיים באוכלוסיית GZDS. בנוסף, אות 5S rDNA חלש הופיע באזור הפרוקסימלי של כרומוזום 7 באוכלוסיות HBFC, HBWF, HBBD ו-GZDS.

figure-results-1
איור 1: כרומוזומים מיטוטיים של שמונה Lycoris aurea (L' Hér.) אוכלוסיות עשבי תיבול. בדיקת כרומוזומי מטפאזה מיטוטיים משמונה ליקוריס אוריאה שונים (L' Herit.) אוכלוסיות עשבי תיבול מוצגות, כולל אוכלוסיית SCLS (A,B), אוכלוסיית HNXN (C,D), אוכלוסיית HNZX (E,F), אוכלוסיית HBFC (G,H), אוכלוסיית HBWF (I,J) ואוכלוסיית HBBD (K,L). הכלאה של GZDS (M,N) ו-GXTL (O,P) בוצעה באמצעות FISH עם בדיקות 45S עם תווית ביוטין ו-5S rDNA עם תווית דיגוקסין לאחר צביעת CPD. התמונות המתקבלות של כרומוזומים לאחר צביעת CPD מציגות אותות rDNA של 45S (ירוק) ו-5S (אדום). ה-DNA הכולל נצבע הפוך בצבע DAPI, וכתוצאה מכך צבע כחול. פסי קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: דיאגרמות קריוטיפ כרומוזום של שמונה Lycoris aurea (L' Hér.) אוכלוסיות עשבי תיבול. דיאגרמת דפוס הכרומוזומים עבור שמונה אוכלוסיות של Lycoris aurea (L' Herit.) הרב חושף את מאפייני פס הקרינה, יחד עם המיקום והגודל של אותות 45S ו-5S rDNA FISH. אוכלוסיות SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS ו-GXTL מיוצגות על ידי (A-H), בהתאמה. סולם הקואורדינטות מציין את האורך היחסי של הכרומוזום (האחוז של אותו כרומוזום בגנום הפלואידי), והמספר בחלק העליון מציין את המספר הסידורי של הכרומוזום. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תרשימי פיזור עבור שמונה Lycoris aurea (L' Hér.) אוכלוסיות עשבים המבוססות על שלושה פרמטרים קריוטיפיים. (A) מדד CVCI משורטט כנגד מדד CVCL. (ב) מדד MCA משורטט כנגד מדד CVCL. אוכלוסיות SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS ו-GXTL מסומנות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: דנדרוגרמה UPGMA של שמונה Lycoris aurea (L' Hér.) אוכלוסיות עשבי תיבול. הדנדרוגרמה של UPGMA מבוססת על הפרמטרים x, 2n, TCL, MCA, CVCL ו-CVCI עבור שמונת Lycoris aurea (L' Hér.) אוכלוסיות עשבי תיבול: SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS ו-GXTL. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: PCoA של שמונה Lycoris aurea (L' Hér.) זני עשבי תיבול המבוססים על שישה פרמטרים של קריוטיפ. ה-PCoA מבוסס על הפרמטרים x, 2n, TCL, MCA, CVCL ו-CVCI, המייצגים SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS ו-GXTL. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: שמותיהם של שמונה Lycoris aurea (L' Hér.) אוכלוסיות עשבי תיבול. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: התפלגות רצועות פלואורוכרום ואתרי rDNA בשמונת Lycoris aurea (L' Hér.) אוכלוסיות עשבי תיבול. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

תיק משלים 1: הבדיקות ששימשו במחקר זה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנת Lycoris aurea (L'Hér.) כרומוזומי שורש עשבים כוללים מספר שלבים קריטיים: (1) טיפוח שורשים באמצעות הידרופוניקה, (2) טיפול בקצות השורשים עם α-ברומונפתלין רווי, (3) קיבוע שורשים באמצעות תמיסת אלכוהול-חומצה אצטית, (4) ביצוע הידרוליזה אנזימטית בקצות השורשים עם תמיסת אנזים, ו-(5) ריסוק יסודי של השורשים המעוכלים וייבוש המגלשות על להבת מנורת אלכוהול.

מדידת כרומוזומים מדויקת חיונית לניתוח קריוטיפ במחקרים ציטוגנטיים. כרומוזומים צריכים להפגין עיבוי ניכר וגבולות מוגדרים בבירור; אחרת, חישוב מדויק של פרמטרים כרומוזומיים הופך למאתגר5. מחקרים ציטוגנטיים קודמים הראו כי ההתמיינות המורפולוגית של כרומוזומים מיטוטיים תלויה במידת העיבוי 4,36. כאשר העיבוי אינו מספיק, קצות זרועות הכרומוזום עדיין עשויים להיות מפוקפקים, מה שמוביל לגבולות כרומוזומים לא ברורים. עם זאת, כאשר הכרומוזומים מגיעים לעיבוי מקסימלי, ההבדלים המורפולוגיים בין הכרומוזומים פוחתים. לכן, בחירת כרומוזומים עם עיבוי בינוני היא קריטית לזיהוי ומדידה של כרומוזומים, במיוחד באוכלוסיות עם פחות כרומוזומים.

תיוג בדיקה הוא חיוני להכלאה מוצלחת של FISH באתר, במיוחד עבור פתרון בדיקת 5S rDNA. בשל הרצף הקצר של 5S rDNA, ריכוז רצפי המטרה המסומנים על ידי PCR הוא בדרך כלל נמוך, מה שמוביל לאותות הכלאה חלשים. עם זאת, סינתזה ישירה של בדיקות המסומנות בפלואורסצאין מייצרת אותות הכלאה חזקים יותר ומפשטת את התהליך. עבור תמיסת בדיקת 45S rDNA, רצפים חלקיים מאזורי קידוד 5.8S, 18S ו-25S rRNA של Arabidopsis thaliana סומנו בקצוות 5' ו-3' עם 6-קרבוקסיל-טטרמתיל רודמין (TAMRA) ולאחר מכן עורבבו. תמיסת הבדיקה פלואורסצאין 5S rDNA הושגה באמצעות רצפי נוקלאוטידים 1-59 ו-60-118 מאזור קידוד הגן Arabidopsis 5S rRNA, כאשר כל רצף מסומן בקצה 5' עם 6-קרבוקסיל פלואורסצאין (6-FAM), ואז מעורבב.

במחקר זה, מינפנו את ההבדלים בין צבעי DAPI ו-PI בקשירת DNA ושילבנו אותם כדי להשיג רצועות פלואורסצנטיות ברורות. צבעי PI (פרופידיום יודיד) יכולים לחדור לקרומי התאים ולהיקשר למולקולות DNA בתוך התאים. לעומת זאת, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) נקשר באופן מועדף לאזורי DNA עשירים ב-AT, ומספק צביעה ברורה ובעלת ניגודיות גבוהה. בשל תכונות משלימות אלה, DAPI ו-PI משמשים לעתים קרובות יחד, המכונה צביעת CPD, כדי לאסוף מידע הן על הגרעין והן על הציטופלזמה בו זמנית. הבדלים בנוכחות, במיקום ובגודל של רצועות CPD ו-DAPI+ חשפו בידול משמעותי של הטרוכרומטין על פני שמונה האוכלוסיות של Lycoris aurea. צביעת CPD הראתה אזורים הטרוכרומטין עשירים בתכולת GC הן באזורים צנטרומריים ופרי-צנטרומריים והן בתוך כרומוזומים טלוצנטריים.

חקר אסימטריית קריוטיפ הוא גישה טקסונומית ציטוגנטית פופולרית, משתלמת ונפוצה המשלבת מגוון פרמטרים ואינדיקטורים, כולל מדדים איכותיים וכמותיים, פרמטרי סיווג סטבינס ומדדים כמותיים שונים (למשל, Paszko10; Peruzzi et al.11). בין אלה, יחס R ו-CVCL משמשים למדידת אסימטריה כרומוזומלית, בעוד ש-CVCI ו-MCA מייצגים אינדיקטורים מרכזיים לאסימטריה כרומוזומלית. יש לציין כי CVCL נחשב לפרמטר סטטיסטי חזק להערכת אסימטריה בין-כרומוזומלית10, והמדד לאסימטריה כרומוזומלית (MCA) מוכר כמדד יעיל להערכת אסימטריה תוך כרומוזומלית11. כדי לייצג בצורה הטובה ביותר אסימטריות קריוטיפ בין אוכלוסיות, מומלצת תרשים פיזור דו-ממדי, עם שני אומדני אסימטריה הממוקמים על ציר ה-x וה-y, בהתאמה, כאשר כל דגימה מיוצגת כנקודה11,12. התוצאות הראו כי תרשימי פיזור דו-ממדיים של CVCL לעומת CVCI, כמו גם MCA vs. CVCL, מדגים ביעילות קשרי אסימטריה של קריוטיפ בין שמונה האוכלוסיות הנפרדות של Lycoris aurea (L′Herit.) Herb, התומך במהימנות המדדים הללו בהערכת אסימטריה כרומוזומלית.

כדי להשוות קריוטיפים ולשחזר קשרים קריולוגיים בין שמונה האוכלוסיות, מחקר זה יישם את המתודולוגיה שהוצעה על ידי Peruzzi et al.11, תוך שימוש בפרמטרים x, 2n, TCL, MCA, CVCL ו-CVCI. הממצאים חשפו כי אוכלוסיות HBWF, GZDS, HBBD ו-GXTL היו קשורות קשר הדוק, כאשר HBFC ממוקם בין הקבוצות הללו. כתוצאה מכך, PCoA המבוסס על ששת הפרמטרים הללו הוכיח את עצמו כשיטה יעילה ביותר להבחנה בין שמונה האוכלוסיות. עם זאת, דפוסים מורכבים מסוימים הופיעו גם מהעץ האבולוציוני המולקולרי המובנה. לדוגמה, בעוד ש-HNZX נראה קשור קשר הדוק ל-HBWF בעץ הפילוגנטי המולקולרי, הוא היה קשור רחוק יותר בתרשים הפיזור PCoA. מורכבות זו מדגישה את החשיבות של שימוש בגישות כמותיות מרובות כדי לחזות מגמות באבולוציה של קריוטיפ בתוך ליקוריס, תוך השלמת מאפייני הסיווג המולקולרי.

הצמחים למחקר זה נדגמו ממרכז ומערב סין, כולל מחוז טיאנלין, מחוז גואנגשי (GXTL), מחוז פאנג, מחוז חוביי (HBFC), מחוז דושאן, מחוז גוויג'ואו (GZDS), מחוז זישינג, מחוז הונאן (HNZX), מחוז באדונג, מחוז חוביי (HBBD), מחוז שינינג, מחוז הונאן (HNXN), מחוז וופנג, מחוז חוביי (HBWF) ומחוז לושאן, מחוז סצ'ואן (SCLS). דגימת שובר נשמרה בעשבייה של אוניברסיטת הואיהואה. מחקר זה מצא כי השילוב של אותות 45S ו-5S rDNA FISH ומאפייני מקטע CPD סופי הבדיל למעשה את כל הכרומוזומים המיטוטיים מאוכלוסיות שונות של Lycoris aurea (L′Herit.) עשב. הפרוטוקול המוצג כאן נועד לחקור את התפלגות ההטרוכרומטין בין אוכלוסיות שונות של Lycoris aurea (L′Herit). עשב. CPD (שילוב של PI ו-DAPI) וצביעה הפוכה של DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) הן טכניקות מבוססות להתבוננות במבנה הגרעיני ובהתפלגות הכרומטין. התיוג הפלואורסצנטי הישיר של אזורי גן 18S-5.8-26S rRNA (אזורי 45S rDNA) ו-5S ריבוזומלי להכלאת FISH של כרומוזומים הוא פשוט ומספק אותות הכלאה חזקים. הבחנה איכותית זו תהיה בעלת ערך הולך וגובר בניתוח אוכלוסיות שונות.

שיטה זו מתאימה ביותר למיני צמחים המסוגלים לגידול מהיר של קצה השורש, מכיוון שיש צורך בתרבית קצה שורש במהלך מיטוזה פעילה. בשל רצף 5S הקצר, המחקר השתמש ברצף הנוקלאוטידים 1-118bp של אזור קידוד הגן 5S rRNA של Arabidopsis thaliana כבדיקת 5S rDNA. בגלל הרצף הקצר והאות החלש שלה, שיטה זו יעילה רק לזיהוי מינים עם בסיסים שמורים יחסית באזור 1-118bp של הגן 5S rRNA. בחירת כרומוזומים מטפאזיים עם עיבוי בינוני היא קריטית להצלחת השיטה. עיבוי כרומוזומים קשור קשר הדוק לעיתוי קצירת השורשים, משך הטיפול המקדים ואפיית הלהבה. לכן, הטכניקה דורשת שליטה מדויקת על כל שלב כדי להבטיח את הצלחת הניסוי.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים הצהירו כי לא קיימים אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה הזו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של סין (32070367).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אלכוהולסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מA500737-0005(70%,  90%,  100%)
1 פעמים; TNTסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מB5481081&פעמים;, 10&פעמים;
פעמיים; SSCסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מB5481092&, 20&;
45ש  rDNAסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מTAMRA מתווספת לשני הקצוות (5 'ו-3' קצוות)
4'6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320 מ"ל
5S  rDNAסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ5 'end plus 6-FAM(FITC)
Adobe Photoshop softwareAdobe Systems IncorporatedCS6
Alpha bromo-naphthaleneSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A602718סוכן רוויה
נגד שחיקהסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מVectashield H-100010 מ"ל
חממה ביוכימיתשנחאי Yiheng Scientific Instrument Co., LTDLRH-70
CellulaseSangon Biotech (שנחאי) ושות', בע"מA42606810 גרם
חומצת לימוןSangon Biotech (שנחאי) ושות', בע"מA50170210 גרם
פורממיד דה-יונים (FAD)סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מA600211-05000.7
דקסטרן סולפטסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מA42822910 מ"ל
פלואורסצנטי מכשיר הכלאה באתרוארה"ב/אבוט ThermoBriteS500-24
מיקרוסקופ פלואורסצנטיאולימפוס  סין  Co.ltdBX60
חומצה אצטית קרחוניתסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מA501931500 מ"ל
HClAladdin Reagent Co. Ltd. (שנחאי)H399657500 מ"ל
מכונת קרחדן דינג שנחאי סחר בינלאומי ושות', בע"מST-70
מיקרוסקופ ביולוגי Leicaגרמניה Leica Instrument Co., LTDDM6000B
מתיל אלכוהולSangon Biotech (שנחאי) ושות', בע"מA601617500 מ"ל
תוכנת MetMorphמכשירים מולקולרייםגרסה 7.35
תנורתרמו מדעי ומסחרי; Heratherm&Trade;THM#51028152
פקטינאזסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מA00429710 גרם
פפסיןסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ1.07185100 גרם
פרופידיום יודיד (PI)סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מA4252591 גרם
RNaseAסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מR464210 מ"ג
DNA זרע סלמון (ssDNA)מגיב אלאדין ושות' בע"מ (שנחאי)D1198711 גרם
נתרןציטראט מגיב אלאדין ושות' בע"מ (שנחאי)S18918310 גרם
סטטיסטיקה עבור Windows 10.0 לניתוח סטטיסטי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heywood, V., Casas, A., Ford-Lloyd, B., Kell, S., Maxted, N. Conservation and sustainable use of crop wild relatives. Agric Ecosyst Environ. 121 (3), 245-255 (2007).
  2. Rong, W., Sun, J., Zhang, H., Wang, H., Liu, H. Cloning and characterization of a tyrosine decarboxylase involved in the biosynthesis of galanthamine in Lycoris aurea. PeerJ. 7, e6729(2019).
  3. Guerra, M. Cytotaxonomy: The end of childhood. Plant Biosyst. 146 (3), 703-710 (2012).
  4. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Karyotype analysis of Lablab purpureus (L.) Sweet using fluorochrome banding and fluorescence in situ hybridization with rDNA probes. Czech J Genet Plant Breed. 51 (3), 110-116 (2015).
  5. Kadluczka, D., Grzebelus, E. Using carrot centromeric repeats to study karyotype relationships in the genus Daucus (Apiaceae). BMC Genomics. 22 (1), 508(2021).
  6. Levin, D. A. The role of chromosomal change in plant evolution. , Oxford Univ Press. 49-52 (2002).
  7. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Molecular cytogenetic characterization and comparison of the two cultivated Canavalia varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 11 (4), 579-600 (2017).
  8. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Comparative molecular cytogenetic characterization of five wild Vigna varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 14 (2), 243-264 (2020).
  9. Stebbins, G. L. Chromosomal evolution in higher plants. , Addison-Wesley. London. (1971).
  10. Paszko, B. A critical review and a new proposal of karyotype asymmetry indices. Plant Syst Evol. 258 (1-2), 39-48 (2006).
  11. Peruzzi, L., Eroglu, H. Karyotype asymmetry: Again, how to measure and what to measure. Comp Cytogenet. 7 (1), 1-9 (2013).
  12. Dehery, S. K., Tavakkoli, A., Jafari, M. Karyotype and chromosome pairing analysis in some Iranian upland cotton (Gossypium hirsutum). Nucleus. 64 (2), 167-179 (2021).
  13. Schweizer, D. Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI. Chromosoma. 58 (4), 307-324 (1976).
  14. Moscone, E. A., Debat, H. J., Salguero, N. Quantitative karyotyping and dual color FISH mapping of 5S and 18S-25S rDNA probes in the cultivated Phaseolus varieties (Leguminosae). Genome. 42 (6), 1224-1233 (1999).
  15. Hasterok, R., Sliwinska, E., Kwasniewski, M. Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes. Theor Appl Genet. 103 (4), 486-490 (2001).
  16. Koo, D. H., Han, Y., Lee, H. Molecular cytogenetic mapping of GXTL and C. melo using highly repetitive DNA sequences. Chromosome Res. 18 (3), 325-336 (2010).
  17. De Moraes, A. P., Ferreira, J. P., Marques, R. Karyotype diversity and the origin of grapefruit. Chromosome Res. 15 (1), 115-121 (2007).
  18. Weiss-Schneeweiss, H., Kiefer, C., Schneider, H. Karyotype diversification and evolution in diploid and polyploid South American Hypochaeris (Asteraceae) inferred from rDNA localization and genetic fingerprint data. Ann Bot. 101 (7), 909-918 (2008).
  19. Siljak-Yakovlev, S., Peruzzi, L. Cytogenetic characterization of endemics: Past and future. Plant Biosyst. 146 (3), 694-702 (2012).
  20. Miaohua, Q., Wang, Y., Zheng, Y. Reciprocal natural hybridization between Lycoris aurea and Lycoris radiata (Amaryllidaceae) identified by morphological, karyotypic, and chloroplast genomic data. BMC Plant Biol. 24 (1), 14-27 (2024).
  21. Shi, S., Wang, Y., Yu, J. Phylogenetic relationships and possible hybrid origin of Lycoris varieties (Amaryllidaceae) revealed by its sequences. Biochem Genet. 44, 198-208 (2006).
  22. Yumai, J., Wang, Y., Zheng, H. Characterization, validation, and cross-species transferability of EST-SSR markers developed from Lycoris aurea and their application in genetic evaluation of Lycoris species. BMC Plant Biol. 20 (1), 522-528 (2020).
  23. Koo, D. H., Shin, D., Lee, J. Karyotype analysis of a Korean cucumber cultivar (Cucumis sativus L. cv. Winter Long) using C-banding and bicolor fluorescence in situ hybridization. Molecules Cells. 13 (3), 413-418 (2002).
  24. Waminal, N. E., Kim, H. H. Dual-color FISH karyotype and rDNA distribution analyses on four Cucurbitaceae species. Hortic Environ Biotechnol. 53 (1), 49-56 (2012).
  25. Xie, W. J., Yang, X., Wang, F. Localization of 45S and 5S rDNA sequences on chromosomes of 20 varieties of Cucurbitaceous plants. J South China Agric Univ. 40 (6), 74-81 (2019).
  26. Han, Y., Zhang, H., Zhu, C. Centromere repositioning in cucurbit varieties: Implication of the genomic impact from centromere activation and inactivation. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (35), 14938-14941 (2009).
  27. Li, K. P., Yao, S., Li, Y. Cytogenetic relationships among Citrullus varieties in comparison with some genera of the tribe Benincaseae (Lycoris aurea (L' Hér.) Herb) as inferred from rDNA distribution patterns. BMC Evol Biol. 16, 85(2016).
  28. Ren, Y., Huang, H., Zhang, Z. An integrated genetic and cytogenetic map of the cucumber genome. PLoS One. 4 (6), e5795(2009).
  29. Han, Y., Wang, H., Liu, B. An integrated molecular cytogenetic map of Cucumis sativus L. chromosome. BMC Genet. 12, 18(2011).
  30. Han, Y., Zhang, H., Yu, C. Chromosome-specific painting in Cucumis varieties using bulked oligonucleotides. Genetics. 200 (3), 771-779 (2015).
  31. Liu, M. S., Zhang, S., Liu, Q. Chromosomal variations of Lycoris varieties revealed by FISH with rDNAs and centromeric histone H3 variant associated DNAs. PLoS One. 16 (9), e0258028(2021).
  32. Hayashi, A., Murota, K., Murata, J. Genetic variations in Lycoris radiate var. radiate in Japan. Genes Genet Syst. 80, 199-221 (2005).
  33. Nima, R. Fluorescence in situ hybridization: Methods and application in cancer diagnosis. Cancer Immunol. 2, 711-728 (2020).
  34. Liu, K., Yang, X., Wang, J. Cytogeography and chromosomal variation of the endemic East Asian herb Lycoris radiate. Ecol Evol. 9, 6849-6859 (2019).
  35. Song, Y. C., Zhang, L., Yan, B. Comparisons of G-banding patterns in six species of the Poaceae. Hereditas. 121, 31-38 (1994).
  36. She, C. W., Zhou, M., Zhang, L. CPD staining: An effective technique for detection of NORs and other GC-rich chromosomal regions in plants. Biotechnic Histochem. 81 (1), 13-21 (2006).
  37. Han, Y. H., Kim, J., Yoon, M. Distribution of the tandem repeat sequences and karyotyping in cucumber (Cucumis sativus L.) by fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 122 (1), 90-98 (2008).
  38. Chao-Wen, S., Chen, Z., Wang, S. Comparative karyotype analysis of eight Cucurbitaceae crops using fluorochrome banding and 45S rDNA-FISH. Comp Cytogenet. 17, 31-58 (2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

45S rDNA5S rDNA
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים