מאמר שיטה

המעבדה הצפה: נוהל תפעולי סטנדרטי לאיסוף וסינון דגימות מי ים ממעבורות הפעלה לניתוח DNA סביבתי

DOI:

10.3791/67366

⸱

1 באוגוסט 2025

 , 
1Department of Earth and Environmental Sciences, University of Milano-Bicocca, 2Marine Research and Higher Education Center (MaRHE Center), 3National Biodiversity Future Centre (NBFC)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול חדשני לאחזור דנ"א סביבתי ימי באמצעות איסוף וסינון של דגימות מי ים ממעבורות תפעוליות וכלי שיט מסחריים אחרים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כלים גנטיים לאחזור מידע מעקבות DNA סביבתיים מבוססים היטב לאפיון מגוון ביולוגי ממוקד וטקסונומי כאחד. אולם בהקשר הימי, איסוף דגימות דנ"א סביבתי מאזורים לא נגישים, כמו למשל במים תהומיים או בים, עשוי עדיין להוות מגבלה. השימוש במעבורות מתוכננות או בספינות מסחריות החוצות מרחבים גדולים של ים פתוח יכול להוות פלטפורמות אופורטוניסטיות יקרות ערך לאיסוף דגימות סביבתיות. היתרונות הם אינספור, החל מהאפשרות לאסוף נתונים בכל תנאי מזג אוויר ובכל שעה ביום ועד לחזרתיות לאורך זמן, היותם קבועים במסלולים, ועם הפחתה מוחלטת בעלויות ובפליטת הדלק. עבודות קודמות הראו שהגישה אפשרית ומוצלחת. עם זאת, תהליך רכישת הדגימות מהבטן של כלי שיט גדולים אלה עשוי להיות לא מיידי. עבודה זו ממחישה בכל פרט כיצד ניתן להכין, לארגן ולבצע איסוף וסינון של מי ים מספינות גדולות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעשורים האחרונים, ניתוח הדנ"א הסביבתי (eDNA), כלומר זיהוי החומר הגנטי שהותירו אורגניזמים בסביבה, גדל במהירות ככלי ניטור מבטיח עבור קהילות מים מתוקים ובעלי חיים ימיים. טכניקה מולקולרית זו מציעה את האפשרות לזהות בו זמנית מספר טקסונים בתוך דגימה אחת (גישת מטא-ברקוד), המאפשרת זיהוי של הקהילות הביולוגיות המאכלסות או חוצות את האזור שנדגם 1,2,3,4,5.

נכון לעכשיו, האתגר האמיתי הוא להגיע לנקודות דגימה, מכיוון שלעתים קרובות זה לא אפשרי מבחינה כלכלית ו/או לוגיסטית לאסוף דגימות בקנה מידה גיאוגרפי גדול, וכתוצאה מכך אזורי הים בדרך כלל לא נדגמים בהשוואהלאזורי חוף נגישים יותר. שימוש במעבורות או כלי שיט מסחריים אחרים מאפשר מעברי דגימה בעלי יכולת שכפול גבוהה, מכיוון שהם עוקבים אחר נתיבי משלוח ספציפיים שהם בדרך כלל קבועים לאורך העונה ומכסים שטחים גדולים 7,8. יתר על כן, שימוש במסלולי מעבורות כאמצעי דגימה מאפשר איסוף דגימות בכל שעה ביום ובכל עונה, ללא קשר לתנאי מזג האוויר והים, בנוסף ליתרונות רבים אחרים (איור משלים 1). מחקרים ראשוניים הוכיחו הן את היתכנותו והן את דיוקו להערכת מדדי המגוון הביולוגי 9,10. ניתן לאסוף דגימות מים מחדר המנועים של המעבורת באמצעות צינור גזירה המיירט מי קירור ימיים במעלה הזרם של המנועים. LIFE-CONCEPTU MARIS (שימור של CEtaceans ו-Pelagic Sea TUrtles in Med: ניהול פעולות להתאוששותם בקיימות) הוא הפרויקט הראשון שבו הוכחת היתכנות זו מיושמת בקנה מידה גדול: הוא מכוון לאיסוף של 500 דגימות (במשך שנתיים), והוא כרוך במעורבות של לא אחת אלא כמה חברות מעבורות ומספר מובילים, המאפשר להדגיש סוגיות קריטיות ולחדד אסטרטגיות דגימה כדי להסתגל טוב יותר להקשרים המגוונים ביותר שעשויים להיתקל בהם על הסיפון. אנו מתארים להלן את מאפייני הפרויקט עבור מרכיבו הנוגע לאיסוף רחב היקף של דגימות DNA סביבתיות ימיות (לתיאור הפרויקט, בקרו באתר https://webgate.ec.europa.eu/life/publicWebsite/project/details/5707).

ההחלטה לבצע קמפיין דגימה באמצעות מעבורת מתוכננת מרמזת על כמה פעולות שיש לנקוט לפני הדגימה בפועל, וזה ההיבט שאליו מתייחסת ישירות עבודה זו. כאן, אנו מזכירים בקצרה את הפעולות שחייבות להקדים דגימה על הסיפון מכל כלי שיט מסחרי.

זהו היבט שאסור להתעלם ממנו והוא שקובע את הצלחת קמפיין הגבייה. חברות הספנות הן גופי מסחר ולא מחקר ולכן אינן מכירות, ואינן נדרשות להכיר, את המטרות והיעדים של המחקר המדעי המיועד להתבצע באונייה. זה מרמז על שלב ראשוני חשוב ועדין שבו מטרות הפרויקט המדעי המוצע, שיכול להיות רב תחומי, חייבות להיות מועברות ומונעות על ידי ההנהלה הבכירה של חברת הספנות עצמה. במקרה הספציפי של פרויקט CONCEPTU MARIS, הדבר התאפשר הודות למערכת יחסים בת עשרות שנים שבה חברות הספנות כבר היו מעורבות בפרויקטים של ניטור חזותי (למשל, Fixed Line Transects [FLT]7), שקבעו מערכת יחסים של הערכה הדדית הנחוצה כדי לקבל אור ירוק לגישה לחדרי המכונות החיוניים לגישת הדגימה המכוסה בעבודה זו.

סוג משטר הדגימה שאומץ בפרויקט CONCEPTU MARIS הוא כפול: הדגימות נלקחות הן בתחנות דגימה קבועות (FSS, ראה להלן) והן לרגל תצפיות של יונקים "נדירים". אלה מייצגים מינים שהכי פחות נראים במהלך FTLtransects 11, כלומר: דולפין מצוי (Delphinus delphis), לווייתן מקורו של קובייה (Ziphius cavirostris), לווייתן טייס (Globicephala melas), דולפין ריסו (Grampus griseus), לוויתן זרע (Physeter macrocephalus) ולוויתן סנפיר (Balaenoptera physalus). דגימת מים נוספת נאספת רק כאשר התצפית של המינים הנדירים המדווחים על ידי צוות המפקד החזותי (צוות FLT) מתרחשת יותר מחצי שעה לפני או אחרי אחד מ-FSSs. הדגימות שבוצעו בשילוב עם התצפיות יהיו בהכרח כולן יומיות.

תחנות דגימה קבועות (FSS), שמיקומן הגיאוגרפי נותר קבוע במהלך הפלגות, מזוהות מראש ומוסכמות עם כל צוות העבודה. המיקומים הגיאוגרפיים של FSS נבחרים על פי 1) נוכחות של אתר בעל עניין ביולוגי על סמך נתוני תצפית/ספרות קודמים; 2) עדיפות לנקודות המציינות שינויים בבתי גידול במפות בתימטריות (למשל, קצה המדף היבשתי); 3) כיסוי הומוגני של נתיבי השיט הייעודיים, ובכך בחירת אתרי דגימה שווים בערך (כ-35-45 מיילים ימיים זה מזה), על מנת לכסות את כל המסלול ולחזות גם את איסוף הדגימות בלילה.

על מנת להבטיח שדגימות סמוכות נלקחות בשעות שונות של היום ושיש מספיק זמן בין שתי דגימות רצופות להשלמת עיבוד הדגימה, רצוי לקחת דגימות מ-FSS סמוכים, אחת במסע החוצה ואחת בנסיעה חזרה. משמעות הדבר היא שאם ה-FSS ממוספרים לפי הסדר הכרונולוגי שבו הם נדגמים, הם לא יופיעו בסדר עוקב על המפה. לדוגמה, אם נבחרו 6 FSS, 3 ידגמו במסע החוצה ו- 3 במסע חזרה. "הסדר שלהם לאורך המסלול במפה יהיה PortAFSS1-FSS6-FSS2-FSS5-FSS3-FSS4-PortB, כאשר שלוש תחנות הדגימה בכתב נטוי (FSS4, FSS5 ו-FSS6) ייסקרו במסע חזרה (ראה איור 1).

לכל FSS בודד יש מספר זיהוי ייחודי (כלומר, אף אחד מה-FSS שזוהו במסלולים שונים אינו חולק את אותו מספר זיהוי). המספור מוקצה בפעם הראשונה שנדגמת FSS, ואחריו מספור עוקב. לכן, בסוף הפרויקט, FSS ממוספרים נמוכים יהיו אלה שנבדקו במשך מספר שנים או שעבורם הנתונים הישנים ביותר זמינים.

כל דגימה מורכבת מכ-13 ליטר מי ים שנאספו בכל תחנת דגימה. מי הים מוזרמים ישירות מצינור הגזירה של המעבורת למיכלי "שקית בקופסה" (BiB), כלומר שקיות ניילון למינציה סטריליות, עד לעיבוד הדגימה (ראה להלן). המאפיינים והיתרונות של מערכת הדגימה Bag-in-Box (BiBSS) מומחשים בפירוט על ידי Valsecchi et al. (2021)9 ומדווחים גם כאן באיור 2 מטעמי נוחות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. התארגנות במעבדה

  1. רשימת ציוד
    1. עיין ברשימת התיוג עבור הפריטים שיילקחו על הסיפון הן לאיסוף דגימות והן לסינון דגימות. הוא מוצג בקובץ משלים 1. כל פריט והשימוש בו יוסברו בסעיפים הבאים.
    2. הדפיסו עותק של קובץ משלים 1 ומלאו אותו לפני היציאה לקמפיין הדגימה.
  2. הכנת מערכת הדגימה של Bag-in-Box
    1. הכן את התיקים בקופסה במעבדה, מתחת למכסה האדים במידת האפשר, לפני העלייה למטוס. אטמו את שלושת הפתחים (זה שעל השקית, חלק מהמכסה שסוגר את השקית והיציאה מהברז) עם סרט איטום (איור 3, טבלת החומרים).
    2. גלגלו את השקיות, כשהמכסה מנותק ואטום בפנים, בחוזקה וסגרו אותו עם סרט דבק כדי למנוע פתיחה מחדש במהלך ההובלה (איור 3).
    3. בצע פעולה זו על ידי הקפדה לא להכניס אוויר לשקית במהלך תמרון האיטום הנ"ל, הן (i) כדי למנוע זיהום אפשרי הנישא על ידי אוויר הנכנס לשקית והן (ii) כדי למנוע מהשקית המקופלת להיות מגושמת יותר (אם היא מכילה אוויר).

2. מתכוננים למטוס

  1. תיאום עם אנשי הצוות
    1. מיד עם העלייה לספינה, שתף את נקודות הדגימה שנבחרו עם הקברניט וצוותו כך שיצוינו הזמנים שבהם המעבורת תהיה הקרובה ביותר לכל נקודה שנבחרה כ"תחנת דגימה קבועה" (FSS).
    2. רשום את זמן הדגימה עבור כל FSS ואת מהירות השיוט הנוכחית (או הממוצעת, אם זמינה) של המעבורת למסלול זה: זה מאפשר להעריך את הארכת (ק"מ) של רצועת הים שנדגמה.
    3. מכיוון שהמעבורת לעולם לא עוברת בדיוק באותה נקודה, תקן את הקואורדינטות של כל איסוף דגימות מי ים לאחר הדגימה בפועל.
      הערה: מרווח הדגימה המדויק הוא הנתונים החשובים ביותר לזיהוי נאמן של אזור הים שנדגם בפועל; לכן, כדאי להדפיס מפה של הנקודות הגסות שבהן מדווחים על קואורדינטות הדגימה בפועל (למשל, בקובץ משלים 2).
    4. אם החברה מעניקה גישה לחדר המכונות, בקש שילוו אותך לחדר.
    5. ללבוש את ציוד המגן האישי (PPE) לפני הכניסה לחדר המכונות. כאן, הסביבה לא מסבירת פנים (רעש מחריש אוזניים וטמפרטורות גבוהות) ומלאה בנקודות שעלולות להיות ערמומיות (מדרגות תלולות, רווחים גדולים בקומות). לאחר קבלת אישור כניסה לחדר המכונות, הצטיידו בכל ציוד הבטיחות החיוני, כגון נעלי בטיחות, קסדה ואוזניות להגנה על שמיעה.
    6. אם משטח הסינון מסופק על ידי חברת השילוח (בדרך כלל רצוי שיהיה שולחן מתקפל משלך), בדוק שניתן לחטא אזור זה בין דגימות באמצעות תמיסת אקונומיקה של 10%.
  2. התמקמות בחדר המכונות
    1. מכיוון שישנם כניסות מי ים שונות על ספינות, הזדהו עם מנהל חדר המכונות, המאפשר נתיב מינימלי למים הנשאבים דרך צינורות הספינה כדי למזער את זיהום דגימת המים בחומרים ואורגניזמים שעלולים להימצא בצינורות.
    2. לאחר שזוהתה הנקודה/הכניסה המתאימה ביותר לאיסוף מי הים הנכנסים, שאלו את הצוות אם ניתן להשאיר את ברז איסוף הדגימות פתוח מעט למשך כל השייט על מנת לשטוף באופן רציף את הצינור המשמש לאיסוף הדגימות במים "מקומיים". השלך את מי הים הזורמים ללא הרף מהברז בבור.

3. איסוף דגימות מים (בחדר המכונות)

הערה: איור 4 מציג את שלבי איסוף דגימות מי הים.

  1. הכנה לאיסוף מים
    1. הביאו את כל הציוד הדרוש (חלק ראשון רשימת תיוג לקובץ משלים 1 ) לחדר המכונות. הגיעו לחדר המכונות לפחות 15 דקות לפני זמן הדגימה המתוכנן כדי לעקר את האזור שבו מטפלים ב-BiB באמצעות תמיסת אקונומיקה של 10%.
    2. אם הברז הייעודי לא נשאר פתוח במשך כל ההפלגה, פתחו אותו לאיסוף דגימות מי ים, ותנו למים לזרום לפחות 5 דקות (המים מושלכים לבור) לפני הנסיגה בפועל (איור 4A).
    3. הכן את תחנת הסינון.
      הערה: ישנם מספר אמצעים בהקמת תחנת הסינון שיכולים לשפר משמעותית את יעילות הסינון (ראה שלב 4.3): 1) השתמש בצלוחיות ואקום בעלות קיבולת גבוהה (בקבוק 2 ליטר, 4 ליטר או 5 ליטר, בהתאם לנפח שיש למשוך). זה, בנוסף לחיסכון בזמן הדרוש לריקון הבקבוק בין 1 ליטר להבא, ממזער את הטיפול בגליל הסינון ולכן כל זיהום; 2) ניתן להשתמש במספר צלוחיות סינון המסודרות בסדרה, אמצעי המאפשר סינון בו זמנית של מספר דגימות (שקיות). אמצעי זה מומלץ במשטרי דגימה הדוקים, שבהם אחרת קיים הסיכון שלא יהיה להם את הזמן הדרוש לעבד את השקיות לפני ההגעה לנמל העגינה.
    4. השתמש בטוש קבוע כדי להכין ולתייג את ה-BiB על ידי כתיבה עליו: 1) קוד הזיהוי האלפאנומרי הייחודי של הדגימה משני צידי ה-BiB (חשוב במיוחד אם ה-BiB אינו מעובד מיד על הסיפון ומסוננים ביבשה) 2) התאריך; 3) הזמן המדויק של תחילת מילוי ה-BiB.
  2. איסוף מים
    1. הסר את סרט האיטום מפתח ה-BiB והתחל למלא אותו עד שהוא מלא לחלוטין (כ-13 ליטר) (איור 4B).
    2. כאשר השקית כמעט מלאה, הסר את סרט האיטום מהמכסה, אך לא מפתח הברז: שמור על סרט האיטום סביב הברז מאובטח (לשונית פלסטיק אדומה) עד לסינון (איור 4C). אטמו את ה-BiB עם המכסה, ולחצו עליו בחוזקה עד לסגירה מלאה.
    3. שימו לב לזמן המדויק שבו איסוף הדגימה הושלם: זה מאפשר לחשב את משך הזמן הכולל (דקות) של איסוף הדגימות.
  3. לאחר איסוף מים
    1. כתוב עם הסמן הקבוע ב-BiB את השעה המדויקת שבה איסוף הדגימה הושלם ודווח על כל הנתונים בטופס איסוף/סינון הדגימה (קובץ משלים 2).
    2. העבר את ה-BiB המלא למחסן או לאזור הסינון (חלל ייעודי בחדר המכונות עצמו או בתא).
    3. העבר את כל הנתונים בטופס איסוף/סינון הדגימה (קובץ משלים 2).
      הערה: משלים file 2 מציג את גיליון האיסוף/סינון לדוגמה שיש להשלים על הסיפון על כל חלקיו.
      1. לחלק הנוגע לאיסוף הדגימה (ירוק), הזן את זמני ההתחלה והסיום של דגימת מי הים מחדר המכונות.
      2. שנית, לאחר התייעצות עם אנשי הצוות או רישומי GPS, הזן את הקואורדינטות הגיאוגרפיות ביחס להתחלה ולסיום של הדגימה ומהירות השיוט. זה מאפשר לך לחשב לאחר מכן את אורך קטע הים שנדגם.
        הערה: לגבי החלק הנוגע לסינון (כחול), יצוין אם הסינון מתרחש על הסיפון או מאוחר יותר ביבשה: זמני הסינון יצוינו עבור כל אחד מ-3 המסננים.

4. סינון דגימות מי ים

  1. התכוננו לסינון
    הערה: מנקודה זו ואילך, ניתן לנהל את תהליך הסינון על פי פרוטוקולים שונים בהתבסס על המטרות הספציפיות של פרויקט המחקר. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר סינון יעיל של כמות גדולה של מי ים (יותר מ-10 ליטר) ישירות על הסיפון, תוך הימנעות ממגבלות הנפח הטבועות בערכות או פרוטוקולים מסחריים נפוצים אחרים. במידת האפשר, סינון דגימות מים על הסיפון: סינון יכול להתבצע בחדר המכונות עצמו או בתא הנוסעים, רצוי הממוקם בסמוך לחדר המכונות. תמיד רצוי לסנן דגימות מי ים מיד לאחר האיסוף, הן כדי להגביל את פירוק ה-eDNA והן מטעמי נוחות, ובכך להימנע מירידה עם כמויות גדולות של מי ים לעיבוד. במידת האפשר, ניתן לאחסן דגימות במיכלי השקית בקופסה ולהעביר אותן לסינון לאחר מכן.
    1. בחלל המסופק המוקדש לסינון על הסיפון (בחדר המכונות או בתא ייעודי), התכוננו עם כל מה שמופיע בחלק השני של רשימת הבדיקה בקובץ משלים 1 והרכיבו את מערכת הסינון כפי שמוצג באיור 5.
    2. הכן את גליל הסינון (טבלת החומרים) כפי שמוצג באיור 6 ובאיור 7. השתמש בצילינדר חדש לכל תחנה, בזוג פינצטה חד פעמית חדשה או בזוג מעוקרים.
      הערה: ניתן להשתמש בצילינדר בודד מספר פעמים כדי לסנן דגימות מאותו מיקום. עם זאת, יש לעקר אותו עם 10% אקונומיקה, ולאחר מכן לשטוף במים מתוקים, לפני שהוא נשאר לייבוש באוויר במעבדה ולאחר מכן לארוז אותו באופן יחיד כדי לאחסן אותו עד לקמפיין הבא.
    3. לפני תחילת הסינון, מלא את יומן הנתונים של איסוף/סינון לדוגמה (קובץ משלים 2). זה הכרחי הן כדי לעקוב אחר מספר הליטרים המעובדים והן כדי למדוד את זמן הסינון (המעיד על כמות החלקיקים בדגימה). ברגע שמשאבת הוואקום מופעלת, הפעל את הטיימר כדי למדוד את זמן הסינון.
  2. סינון במטוס
    1. על מנת למזער את הסיכון לזיהום (במיוחד כאשר מספר שקיות מעובדות בו זמנית, ראה להלן), בודד את זרימת המים לסינון מהסביבה הסובבת על ידי הנחת שרוול בידוד - שקית ניילון - בין הברז לגליל הסינון (ראה איור 7).
      הערה: זהו אמצעי זהירות חשוב שכן הרגישות של הטכנולוגיות המשמשות לניתוח DNA סביבתי הופכת את הגישה לרגישה במיוחד לזיהום סביבתי (מהמפעיל או זיהום צולב בין דגימות).
    2. הפעל את משאבת הוואקום וסנן עד 4 ליטר מים לכל מסנן. שמור על הצילינדר מלא תמיד במהלך הסינון כדי למנוע כניסת אוויר למערכת ולהאט את תהליך הסינון.
      הערה: באשר לבחירת נקבוביות הממברנה, הדבר תלוי במטרת המחקר, בקבוצות הטקסונומיות היעד ובכמות המים המיועדים לעיבוד. נושא זה טופל בעבודות קודמות 9,12.  בהם הושוו מסננים בעלי נקבוביות שונה. לחקר בעלי חוליות והבחירה לעבד 4 ליטר מים לכל מסנן, קרום עם נקבוביות של 0.45 מיקרומטר הוכיח את הפיתרון הטוב ביותר, המאפשר לעבד כמויות גדולות של מים מבלי לגרום לעומס של המסנן עקב רוויה של הנקבוביות.
    3. כאשר מפלס המים המסוננים בתוך הבקבוק מגיע לסימון מפלס 4 ליטר, כבה את משאבת הוואקום ועצור את הטיימר, ודווח על ערך זמן הסינון ביומן הנתונים.
      הערה: מכל BiB של 12/13 ליטר, יתקבלו 3 שכפולים טכניים, של 4 ליטר כל אחד (נקראים A, B ו-C).
    4. בשלב זה, באמצעות הפינצטה (ובמידת הצורך, קיסם סטרילי כדי לסייע בהרמת קצה המסנן), שחזר את המסנן הראשון (מסנן A) מהגליל, כפי שמוצג באיור 8, תוך הימנעות מכל נזק אפשרי למסנן.
    5. קפלו את המסנן לשניים (כשהצד ששמר על החומר הביולוגי מקופל על עצמו) ועטפו אותו בנייר אלומיניום, וכתבו מיד את מספר הדגימה ואת מזהה שכפול המסנן (למשל, 15A) על העטיפה. אחסנו אותו במקפיא המשולב עד לירידה.
    6. הרכיבו מסנן חדש (מסנן B) בתוך גליל הסינון כדי לעבד דגימה נוספת של 4 ליטר (איור 9). רוקנו את הבקבוק והתחילו שוב בסינון השכפול השני עד לסינון מלא של 4 ליטר. שחזר את מסנן B כפי שהוסבר וחזור על אותם שלבים עבור מסנן C.
  3. שיטות עבודה מומלצות
    1. כדי לקצר את זמני הסינון, השתמש בבקבוק ואקום גדול המסוגל להכיל את כל המים המסוננים המעובדים דרך פילטר יחיד (לכן, במקרה זה, קיבולת של 4 ליטר לפחות).
    2. צמצם את זמני הסינון במידה ניכרת על ידי סינון שקיות מרובות בו זמנית על ידי סידור מנגנון הסינון במקביל (כלומר, צלוחיות ואקום מרובות המוגשות על ידי משאבה אחת).
      הערה: בקמפיין CONCEPTU MARIS, שתי האסטרטגיות אומצו (איור 10). שימו לב שמקסום יעילות הסינון חשוב מאוד מכיוון שמספר הדגימות שנאספו לאורך מסלול יכול להיות גדול. לכן, יש צורך לעבד את השקיות תוך זמן קצר על מנת להימנע מצבירת דגימות עם הסיכון שיהיה צורך לרדת מהשקיות אם אין מספיק זמן לעבד אותן על הסיפון.
    3. על מנת לנטר את שכיחות התוצאות החיוביות השגויות (זיהום), יש לכלול בהליך הסינון, לפחות פעם אחת בכל הפלגה, "שקית ריקה", המסננת במקביל לדגימות שקית מלאה במי שתייה שנלקחו מבקבוקים אטומים. דגימת בקרה זו אינה דורשת שכפולים ומתייחסים אליה כאל שאר הדגימות וכוללים אותה בריצת NGS.
  4. אחסון והובלה של מסננים
    1. לאחר הסינון, אחסן את כל המסננים בין -4 מעלות צלזיוס ל-20 מעלות צלזיוס עד לעיבוד מעבדה נוסף.
    2. אספו את הדגימות מהמקפיא המובנה ממש לפני הירידה מהאונייה והכינו אותן להובלה בטמפרטורות נמוכות באמצעות מצננים ניידים, כפי שמוצג באיור 11.
      הערה: אם הדגימות אינן מסוננות על הסיפון, שקיות מי הים מועברות בצורה בטוחה יותר אם הן נשמרות אנכית כשהמכסה מוחזק בצד העליון, נתמך בזוגות בתוך שקיות קניות בתוך ארגזי פלסטיק כדי להקל על ההובלה (איור 12).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בביצוע הפרוטוקול כמתואר, מספר מסננים השווה למספר ה-FSS כפול 3 העתקים ייאסף על ידי המפעיל. כל מסנן שומר על עקבות ביולוגיים (DNA סביבתי) באחד משני הצדדים. השלבים האנליטיים לאחר מיצוי דנ"א סביבתי תלויים מאוד בשאלת המחקר, במטרה ובמטרה. לדוגמה, במחקר הפיילוט של Valsecchi et al.9, פרוטוקול איסוף ה-eDNA המתואר איפשר תכנון של סקר מגה-פאונה ימי שיטתי וניתן לשכפול. באמצעות גישת מטא-ברקוד ובחירת שני סמנים שונים ספציפיים לחולייתנים לניתוח, ניתן היה לזהות מספר מינים של בעלי חוליות (דגי טלאוסטים, אלסמוברנץ' ויו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מכיוון ששלבי הפרוטוקול פשוטים ופשוטים, ישנם כמה שיקולים רלוונטיים שיש לקחת בחשבון בעת עבודה על מעבורות מסחריות. צינור הפקת מי הקירור ממוקם בדרך כלל באזור חדר המכונות, אליו עשויה להיות מוגבלת או בכפוף לאישור מראש. לכן, הקפדה על אישור כזה, יחד עם ציוד מגן אישי מתאים, היא חיונית (איור 4). יתר על כן, איסוף וסינון מים צריכים להתבצע בתנאים הסטריליים ביותר האפשריים כדי למנוע זיהום. שימור והעברת הדגימה שמירה על שרשרת הקירור היא שלב מכריע נוסף שיש להבטיח לפני הסינון....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים מעומק הלב לאנשים שאפשרו לשיטה המוצגת כאן להיבדק ולפתח, כלומר אנטונלה ארקאנג'לי (ISPRA), שמנהלת את פרויקט FLT במשך עשרות שנים שבעזרתו יונקים ימיים ים תיכוניים (ולא ים תיכוניים) מנוטרים ויזואלית באופן קבוע בהסתמך על רשת צפופה של מעבורות ואשר האמינו בהצעה השאפתנית של חיפוש DNA בנתיבים שחוצות מעבורות; כריסטינה פיצוטי, מקורסיקה וסרדיניה פריס, שקיבלה את האתגר בהתלהבות, והעניקה לנו את התמיכה הלוגיסטית לבחון את המתודולוגיה בפעם הראשונה על נושאת מטוסים מהצי שלהם, (קיבלה בברכה גם את צוות יוצרי הווידיאו שצילמו); Fulvio Maffucci, על התנהלות מול חברות ימיות שונות על מנת להנפיק אישורים לאיסוף דגימות על הסיפון. אנו מודים לרוברטו לומברדו, שפרויקט עבודת המאסטר שלו יזם את חקר הדנ"א הסביבתי והמעבורות. לבסוף, אנו מודים לחברות הימיות שאפשרו לנו לעלות ולדגום דנ"א סביבתי ביחס לפרויקט LIFE-CONCEPTU MARIS מכיוון שזה נתן לנו את ההזדמנות לבחון את השיטה שלנו על מספר כלי שיט שונים ברחבי הים התיכון: קווי גרימלדי, קווי מינואן, טירניה, בלאריה, מעבורות קורסיקה וסרדיניה, Grandi Navi Veloci (GNV). הפרויקט המתמשך במימון האיחוד האירופי מספק הוכחת היתכנות לשכפול הגישה בקנה מידה גדול, מלבד מימון הפקת פרסום וידאו זה שיאפשר לפרוטוקול התפעולי הסטנדרטי (SOP) להיות נרחב לקהילה מדעית גדולה יותר ולציבור. אנו מודים למתיה נוצ'ולה ולפרנצ'סקו טומסינלי (Triton Research) על שסיפקו כמה צילומים של הפרוטוקול. לבסוף, אנו מודים לכל הצוותים שקיימו איתנו אינטראקציה וסייעו בדגימה שלנו בחמש השנים האחרונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ממברנות סינון בקוטר 4.7 ס"מBiosigma S.p.A.https://www.biosigma.com/ממברנות סינון של 0.45 μ נקבוביות m, ארוז בנפרד 
צלוחיות ואקום 4/5 ליטרDuranhttps://www.duran-bottle-system.com/5 ליטר בקבוק זכוכית עם פקק
רפידות נייר סופגותAdvantec MFS, Inc.https://www.advantecmfs.com/category/absorbent-pads-1רפידות סופגות נייר סינון, גודל 47 מ"מ.
תיק בקופסה (BiB)G.M.V. Agricenter S.r.l.https://www.gmvagricenter.it/10 ליטר שקיות בקופסה עם ברז
גלילי סינון Sartorius AGhttps://shop.sartorius.com/in/industrial-microbiology-filtration-devices/biosart-100-monitors/p/M_Biosart_100_Monitors#Biostart 100 צילינדרים למוניטור, עם 0.45 μ קרום M כלול 
סרט איטוםMerckhttps://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/hs234526a?utm_source=bing&utm_medium=
cpc& utm_campaign=הכל+product_
dsa_WW_%28bing+ebizpfs%29&
utm_id=626946489& utm_content=
1166583023365595& msclkid=
d2b55b82440b1aef56fc3ca803c
6486f& utm_term=%2Fproduct%2F		4 אינץ' x 125 רגל גליל של סרט איטום מעבדה
משאבת ואקוםKNF Grouphttps://knf.com/en/usLaboport משאבת ואקום ניידת N. 96 

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andruszkiewicz, E. A., et al. Biomonitoring of marine vertebrates in Monterey Bay using eDNA metabarcoding. PLoS One. 12 (4), e0176343(2017).
  2. Djurhuus, A., et al. Environmental DNA reveals seasonal shifts and potential interactions in a marine community. Nat Commun. 11 (1), 254(2020).
  3. DiBattista, J. D., et al. Environmental DNA can act as a biodiversity barometer of anthropogenic pressures in coastal ecosystems. Sci Rep. 10 (1), 8365(2018).
  4. Beng, K. C., Corlett, R. T. Applications of environmental DNA (eDNA) in ecology and conservation: Opportunities, challenges, and prospects. Biodivers Conserv. 29 (7), 2089-2121 (2020).
  5. He, X., et al. eDNA metabarcoding enriches traditional trawl survey data for monitoring biodiversity in the marine environment. ICES J Mar Sci. 80 (5), 1529-1538 (2023).
  6. Pawlowski, J., et al. The future of biotic indices in the ecogenomic era: Integrating (e)DNA metabarcoding in biological assessment of aquatic ecosystems. Sci Total Environ. 637 - 638, 1295-1310 (2018).
  7. Arcangeli, A., Marini, L., Crosti, R. Changes in cetacean presence, relative abundance and distribution over 20 years along a trans-regional fixed line transect in the central Tyrrhenian sea. Mar Ecol. 34 (1), 112-121 (2013).
  8. Matear, L., Robbins, J. R., Hale, M., Potts, J. Cetacean Biodiversity in the Bay of Biscay: Suggestions for environmental protection derived from citizen science data. Mar Policy. 103672, 109(2019).
  9. Valsecchi, E., et al. Ferries and environmental DNA: Underway sampling from commercial vessels provides new opportunities for systematic genetic surveys of marine biodiversity. Front Mar Sci. 8, 704786(2021).
  10. Boyse, E., Beger, M., Valsecchi, E., Goodman, S. J. Sampling from commercial vessel routes can capture marine biodiversity distributions effectively. Ecol Evol. 13 (2), e9810(2023).
  11. Arcangeli, A., et al. Testing indicators for trend assessment of range and habitat of low-density cetacean species in the Mediterranean Sea. Front Mar Sci. 10, 1116829(2023).
  12. Valsecchi, E., et al. Novel universal primers for metabarcoding environmental DNA surveys of marine mammals and other marine vertebrates. Environ DNA. 2 (4), 460-476 (2020).
  13. Hunter, M. E., et al. Improving eDNA yield and inhibitor reduction through increased water volumes and multi-filter isolation techniques. Sci Rep. 9 (1), 5259(2019).
  14. Capo, E., et al. Effects of filtration methods and water volume on the quantification of brown trout (Salmo trutta) and Arctic char (Salvelinus alpinus) eDNA concentrations via droplet digital PCR. Environ DNA. 2 (2), 152-160 (2020).
  15. Li, J., et al. The effect of filtration method on the efficiency of environmental DNA capture and quantification via metabarcoding. Mol Ecol Resour. 18 (5), 1102-1114 (2018).
  16. Collins, R. A., Wangensteen, O. S., O'Gorman, E. J., Mariani, S., Sims, D. W., Genner, M. J. Persistence of environmental DNA in marine systems. Commun Biol. 1, 185(2018).
  17. Kelly, R. P., Gallego, R., Jacobs-Palmer, E. The effect of tides on nearshore environmental DNA. PeerJ. 6, e4521(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים