הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל עכבר של טרנספורמציה דימומית הנגרמת על ידי היפרגליקמיה חריפה בשילוב עם איסכמיה מוקדית חולפת

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67371

⸱

15 בנובמבר 2024

 ,  ,  , 
1Hubei Key Laboratory of Cognitive and Affective Disorder, Institute of Biomedical Sciences, School of Medicine, Jianghan University

* These authors contributed equally

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

מחקר זה מציג פרוטוקול לביסוס מודל בעלי חיים בעל יכולת שחזור גבוהה של טרנספורמציה דימומית (HT) באמצעות חסימה/רפרפוזיה של עורק המוח האמצעי (MCAO/R) בעכברי C57BL/6 עם היפרגליקמיה חריפה.

תקציר

טרנספורמציה דימומית (HT) היא סיבוך חמור שיכול להתרחש כתוצאה מטיפול טרומבוליטי לאחר שבץ איסכמי (IS), והיא מציבה מגבלות משמעותיות על היישום הקליני של מפעיל פלסמינוגן רקמות רקומביננטי (rt-PA). למרבה הצער, אין כיום התערבויות יעילות זמינות ל-HT בפרקטיקה הקלינית. לכן, יש צורך דחוף במודלים יציבים ואמינים של חיות ניסוי כדי להבהיר את הפתוגנזה של HT ולפתח אסטרטגיות התערבות יעילות. מחקר זה הציג פרוטוקול לביסוס מודל עכברי של HT המושרה על ידי היפרגליקמיה חריפה בשילוב עם איסכמיה מוקדית חולפת (tMCAO). עכברי C57BL/6J זכרים הוזרקו עם 30% גלוקוז כדי לגרום להיפרגליקמיה ולאחר מכן נחשפו ל-60 דקות של tMCAO עם רפרפוזיה. נפח האוטם, שלמות מחסום הדם-מוח (BBB) ומידת הדימום התוך גולגולתי הוערכו לאחר 24 שעות לאחר MCAO. התוצאות הראו כי הזרקת גלוקוז הובילה להיפרגליקמיה חולפת (14.3-20.3 ממול/ליטר), מה שהגדיל משמעותית הן את נפח האוטם והן את שכיחות HT. צביעת המטוקסילין-אאוזין (H&E) הצביעה על נגעים דימומיים משמעותיים באזור האוטם בעכברים היפרגליקמיים. בנוסף, עכברים היפרגליקמיים הראו הפרעה חמורה ב-BBB, כפי שמוצג על ידי דליפה חמורה יותר של כחול אוונס (EB) ו-FITC-Dextran. לסיכום, היפרגליקמיה חריפה הביאה באופן אמין ועקבי ל-HT מקרוסקופי במודל עכבר של tMCAO. מודל ניתן לשחזור זה מציע כלי רב ערך לחקירת המנגנונים הפתולוגיים של HT ולפיתוח התערבויות טיפוליות מתאימות.

מבוא

אוטם מוחי הוא הגורם העיקרי לנכות וגורם המוות השני המוביל בקרב מבוגרים ברחבי העולם1. השלב החריף ממלא תפקיד מכריע בהתקדמות אוטם מוחי, ומשמש כנקודת זמן מרכזית לטיפול במחלה. שיקום מוקדם ובזמן של זרימת הדם באזור הפנומברה חיוני למניעת מוות נוסף של תאי מוח, כאשר טרומבוליזה וטיפול התערבותי מייצגים את עמודי התווך לטיפול באוטם מוחי חריף (ACI). עם זאת, טרנספורמציה דימומית (HT) מהווה סיבוך משמעותי בעקבות פקקת וטיפול התערבותי, המתרחש ב-15%-30% מהחולים עם שבץ איסכמי, ובכך מגביל את יישומם במידה מסוימת 2,3. התרחשות HT מגדילה משמעותית את הסיכון לתמותה ונכות, ומשפיעה על הפרוגנוזה של ACI. לכן, יש חשיבות קלינית רבה לחקור את המנגנונים הפתולוגיים של HT ולזהות מטרות טיפוליות יעילות.

נכון לעכשיו, חסימת עורק המוח האמצעי הנגרמת על ידי תסחיף חוט (MCAO) משמשת לעתים קרובות כמודל של HT במכרסמים4. חסימה ממושכת עלולה לגרום לאוטם מוחי מסיבי המערב את קליפת המוח והסטריאטום, מה שעלול להוביל ל-HT משני. חוט MCAO אינו דורש קרניוטומיה, ניתן לשחזור מאוד ומייצר נזק מוחי מוקדי ו-HT בדומה לשבץ אנושי. עם זאת, למודל מכני זה יש כמה חסרונות ברורים, כולל שיעורי תמותה מוקדמים גבוהים ושיעורי הישרדות נמוכים לטווח ארוך5. מודל HT נפוץ נוסף הוא מודל הפקקת, שבו היווצרות קרישי דם מושרית תחילה בכלי המטרה, ולאחר מכן שימוש בתרופות טרומבוליטיות (למשל, rt-PA, וורפרין) כדי להמיס את הקריש, המחקה את התהליך הקליני של HT בשבץ איסכמי 6,7. למרות שכפול התהליך הפתולוגי של טיפול טרומבוליטי קליני במידה רבה, מודלים של בעלי חיים HT המושרים על ידי rt-PA או וורפרין מורכבים ליישום וקשורים לתמותה גבוהה של בעלי חיים כמו גם שכיחות ומיקום משתנים של דימום. על מנת לקדם מחקר תרגומי בסיסי וקליני על HT לאחר אוטם מוחי, חיוני לבסס מודל בעלי חיים הניתן לשחזור של HT שקל לתפעול ומציע יציבות גבוהה.

היפרגליקמיה תורמת משמעותית ל-HT בעקבות איסכמיה מוחית/רפרפוזיה (I/R)8. מספר מחקרים רטרוספקטיביים ניתחו את הנתונים הקליניים של חולים שעברו כריתת פקקת מכנית, וגילו כי רמות גבוהות של גלוקוז בדם בעת האשפוז קשורות לשכיחות גבוהה יותר של HT3 ספונטני. בחולי שבץ סוכרתי, היפרגליקמיה מגדילה משמעותית את הסיכון ל-HT ומובילה לליקויים נוירולוגיים חמורים יותר 9,10. חוקרים פיתחו מודלים של HT על ידי השראת I/R מוחי במודלים של בעלי חיים סוכרתיים באמצעות MCAO. עם זאת, למודל הסוכרת-MCAO יש משך ניסוי ארוך, הליך מורכב ועלויות גבוהות11,12. ניתן לבסס מודל אמין של HT על ידי גרימת היפרגליקמיה חריפה באמצעות הזרקה תוך-צפקית של גלוקוז ושילובו במודל I/R מוחי שנוצר על ידי טכניקת התפר. שיטה זו מבוצעת בקלות עם תנוחת דימום עקבית ומחקה ביעילות את המאפיינים הקליניים של היפרגליקמיה לאחר שבץ מוחי. עם זאת, ישנם הבדלים משמעותיים במצבים מכריעים כגון זמן איסכמי וריכוז הגלוקוז; בנוסף, יציבות המודל ושכיחות HT אינן עקביות בספרות שונה.

קבוצת המחקר שלנו השתמשה בהרחבה בשיטת היפרגליקמיה חריפה-MCAO כדי לבסס מודל HT. יתר על כן, ערכנו סדרה מקיפה של ניסויים כדי לחקור את הקשר בין זמן איסכמי, ריכוז הגלוקוז בדם, שיעור היארעות HT ותמותת בעלי חיים. ניסויים אלה הובילו בסופו של דבר לזיהוי תנאים אופטימליים ליצירת מודל HT לאחר אוטם מוחי. מחקר זה מציג פרוטוקול מפורט להקמת מודל HT המושרה על ידי היפרגליקמיה חריפה באמצעות הזרקה תוך צפקית של 30% גלוקוז בשילוב עם MCAO תסחיף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול הניסוי אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'יאנגהאן (JHDXLL2024-080) ונערך בהתאם להנחיות האתיות של בעלי חיים ניסיוניים שהונפקו על ידי המרכז לבקרת מחלות בסין. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים בוגרים C57BL/6J במשקל 21-26 גרם. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. קיבוץ בעלי חיים וגרימת היפרגליקמיה חריפה

  1. שכן את העכברים במרכז חיות המעבדה של אוניברסיטת ג'יאנגהאן בסביבה מבוקרת של 12 שעות אור / חושך (20-22 מעלות צלזיוס, 50%-55% לחות) עם מזון ומים אד ליביטום.
  2. חלקו את העכברים באופן אקראי לארבע קבוצות: Sham + מי מלח (n = 12), Sham + גלוקוז (n = 12), MCAO + מי מלח (n = 12) ו- MCAO + גלוקוז (n = 20).

2. הכנה טרום ניתוחית

הערה: כל עכברי הניסוי צמו במשך 12 שעות לפני הניתוח.

  1. יש לתת משככי כאבים מערכתיים (מלוקסיקם, 5 מ"ג/ק"ג תת עורי) והרדמה מקומית למקום החתך (בופיבקאין, 2 מ"ג/ק"ג תת עורי) לפני הניתוח.
  2. עקר את כל המכשירים הכירורגיים, צמר גפן ותפרים כירורגיים על ידי חיטוי בתנאים של 121 מעלות צלזיוס ו-15 psi למשך 30 דקות.
  3. נגב את פלטפורמת הניתוח ואת אזור העבודה שמסביב עם 75% אתנול, והפעל את מתג החימום כשהטמפרטורה מוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס.
  4. להרדים את העכבר עם תערובת גז חמצן 3% איזופלורן-20% בתא האינדוקציה להרדמה. לאחר מכן, הערך את רפלקס צביטת הבוהן כדי לבדוק את עומק ההרדמה.
  5. הזז את העכבר על משטח הניתוח במצב שכיבה, והכנס במהירות את אף העכבר לקונוס האף. פתח את זרימת הגז לקונוס האף, וסגור את הזרימה לתא האינדוקציה של ההרדמה. התאם את שיעור האיזופלורן ל-2% והגדר את זרימת תערובת הגז ל-0.4 מ"ל/דקה לתחזוקת הרדמה.
  6. מרחו ג'ל עיניים על עיני העכבר כדי לשמור על לחות במהלך הניתוח.
  7. לגלח את השיער של אזור הצוואר באמצעות קוצץ החיות. יש לנקות ולחטא את העור על ידי מריחה לסירוגין עם יוד ואתנול 70% באמצעות מקל כותנה מחטא.
  8. מכסים גזה סטרילית על הצוואר וחותכים פתח כדי לחשוף את אזור הניתוח.

3. מדידת זרימת דם מוחית בסיסית

  1. לגלח את השיער של אזור הקרקפת באמצעות קוצץ החיות. יש לנקות ולחטא את הקרקפת על ידי מריחה לסירוגין עם יוד ואתנול 70% באמצעות מקל צמר גפן מחטא.
  2. בצע חתך קו אמצע באורך 1.0 ס"מ בעור מעל האזור הקדמי כדי לחשוף את פונטנל הגולגולת. שמור על הגולגולת לחה עם מי מלח רגילים.
  3. הכן את מכשיר הזרימה של דופלר לייזר (LDF) והחזק את קצה בדיקת ה-LDF בניצב לפני השטח של הגולגולת הקודקודית השמאלית (1 מ"מ אחורי ו-5 מ"מ לרוחב הברגמה); ברגע שה-FLUX יציב ורשום את הערך הבסיסי.
    הערה: יחידת המדידה של FLUX היא יחידות זלוף (PU), עם טווח מדידה של 0-1000 PU. CBF בסיסי אידיאלי במדידת זרימה של דופלר לייזר הם >600 PU. פרק זמן רציף של 5 שניות עם טווח תנודות של פחות מ-10% נחשב לקריאת FLUX תקפה.
  4. יש לתפור את השריר והעור בנפרד באמצעות תפר נספג 5.0 PGA. מרחו על הפצע ג'ל נתרן דיקלופנק ומשחת מופירוצין.

4. הליך כירורגי MCAO

הערה: MCAO מבוצע בשיטת חסימת חוטים שונה, כפי שתואר בעבר על ידי צ'יאנג ואחרים.13.

  1. הפוך בעדינות את העכבר למצב שכיבה ומתן תוך צפקי 30% גלוקוז (7.2 מ"ל/ק"ג) או מי מלח רגילים לעכברים 15 דקות לפני ההליך הכירורגי.
    הערה: עכברים מקבוצות Sham + glucose ו-MCAO + glucose קיבלו זריקות תוך צפקיות של גלוקוז. עכברים מקבוצות Sham + מלח ו- MCAO + מלח קיבלו זריקות תוך-צפקיות של מי מלח רגילים.
  2. לגלח את השיער של אזור הצוואר באמצעות קוצץ החיות. יש לנקות ולחטא את העור על ידי מריחה לסירוגין עם יוד ואתנול 70% באמצעות מקל כותנה מחטא. מכסים גזה סטרילית על הצוואר וחותכים פתח כדי לחשוף את אזור הניתוח.
    הערה: ודא שהחתך נשמר ישר כדי להשיג הדמיה אופטימלית של עורק הצוואר.
  3. בצע חתך בקו האמצע של 1.5 ס"מ באספקט הגחון של הצוואר באמצעות אזמל. מפרקים את הרקמה התת עורית והפאשיה השטחית באמצעות פינצטה כירורגית.
    הערה: ודא שהחתך נשמר ישר כדי להשיג הדמיה אופטימלית של עורק הצוואר.
  4. מתחת לפאשיה השטחית, אתר את הבלוטה התת-לסתית ומשולש הפוך שנוצר על ידי שלושה שרירים: הסטרנוהיואיד, הממוקם בקו האמצע מעל קנה הנשימה; הבטן האחורית של השריר הדיגסטרי, הניתנת לזיהוי על ידי החלק הגידי הלבן המבריק שלה; ולבסוף, השריר הסטרנומסטואידי.
  5. בצע דיסקציה קהה בתוך המשולש ההפוך כדי לזהות ולהפריד את עורק הצוואר המשותף השמאלי (CCA).
  6. נתח את עצב הנרתיק הסמוך ל-CCA ולרקמה הרירית המקיפה את כלי הדם באמצעות מלקחיים עיניים. הכינו צלצול על CCA באמצעות תפר נספג של חומצה פוליגליקולית 5.0 (PGA), אך שמרו על התפר ללא מתח.
  7. בנפרד כלפי מעלה לאורך ה-CCA, ניתן להבחין בהתפצלות "Y" כדי לחלק את ה-CCA לעורק הצוואר החיצוני (ECA) ולעורק הצוואר הפנימי (ICA).
  8. הפרד את ההסתעפות כדי לחשוף באופן מלא את ה-ECA וה-ICA. לולאה וקשר בחוזקה תפר נספג 5.0 PGA סביב ה-ECA באופן מרוחק מההסתעפות.
    הערה: הקפידו על מרחק מספיק בין אתר הקשירה הקבוע לבין התפצלות כלי הדם כדי למנוע מהחוט לעקור במהלך סיבוב ה-ECA.
  9. הידוק זמני הן את ה-CCA והן את ה-ICA באמצעות שני מהדקי עורקי עורקים מיקרו-סראפיניים קלים בגודל 8 מ"מ על 2 מ"מ כדי לחסום את זרימת הדם מה-CCA ל-ICA.
  10. מתחו את עניבת התפר על ה-ECA הדיסטלי וה-CCA כדי ליישר את קטע ה-ECA.
  11. השתמש במספריים כדי לבצע חתך קטן בין שני קשרי התפרים ב- ECA.
  12. הכנס תפר מונופילמנט מצופה סיליקון (אורך 30 מ"מ, סיליקון מצופה 3-4 מ"מ) לתוך ה-ECA. לולאה וקשר מעט תפר נספג שני של 5.0 PGA על ה-ECA ליד ההסתעפות כדי למנוע מתפר המונופילמנט לסגת.
  13. חתכו לחלוטין את ה-ECA הדיסטלי לקשירה הקבועה והסירו את מהדק מלקחיים העורקים מה-ICA.
  14. משוך את התפר להתפצלות של ה-CCA, ואז נסוג בזהירות וסובב את גדם ה-ECA. כוונן את כיוון ההחדרה של התפר והכנס אותו לאט, כ-9.0-10.0 מ"מ מההסתעפות של CCA לתוך ה-ICA, כדי לחסום את ה-MCA.
  15. הדק את התפר הנספג השני של PGA סביב ה-ECA והסר את מהדק העורק מה-CCA.
  16. יש לתפור את השריר והעור בנפרד באמצעות תפר נספג 5.0 PGA. מרחו על הפצע ג'ל נתרן דיקלופנק ומשחת מופירוצין.
  17. הפוך בעדינות את העכבר למצב שכיבה וחזור על שלב 3.4. כדי לתעד את זרימת הדם לאחר חסימת MCA.
    הערה: עכברים שהפגינו ירידה בזרימת הדם של פחות מ-40% מהערך הבסיסי לאחר MCAO לא נכללו במחקר14.
  18. הפעל את מתג החימום של כלוב השחזור כשהטמפרטורה מוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס. הנח את העכבר בכלוב ההתאוששות במהלך התקופה שלאחר החסימה (60 דקות).

5. הסרת מונופילמנט ורפרפוזיה

  1. להרדים מחדש את העכבר כפי שתואר קודם לכן רגע לפני שתקופת החסימה אמורה להסתיים.
  2. מהדקים את ה-CCA באמצעות מהדק עורק מיקרוקליפ.
  3. החזר חלקית את המונופילמנט מה-ICA עד שהקצה המצופה סיליקון נראה דרך ה-ICA.
  4. הנח מהדק עורק מיקרוקליפ נוסף על ה-ICA מעל הקצה המצופה סיליקון.
  5. משוך לחלוטין את המונופילמנט וקשר בחוזקה את גדם ה- ECA.
  6. הסר את מהדק עורק המיקרוקליפ מ-ICA ו-CCA, בהתאמה.
  7. יש לתפור את השריר ואת העור שכבה אחר שכבה באמצעות תפר נספג 5.0 PGA.
  8. הנח את העכבר בתא ההתאוששות ועקוב אחר כל העכברים עד שהם ערים לחלוטין. יש לתת מלוקסיקם (5 מ"ג/ק"ג, תת עורי) לשיכוך כאבים כל 12 שעות למשך עד 24 שעות.

6. מדידת סוכר בדם

הערה: רמות הגלוקוז בדם נמדדו בנקודות הזמן הבאות: (1) ממש לפני ניתוח MCAO (נקודת ההתחלה), (2) מיד לאחר החדרת המונופילמנט (15 דקות לאחר הזרקת הגלוקוז), (3) מיד לאחר הוצאת המונופילמנט מיד לאחר החדרת המונופילמנט (75 דקות לאחר הזרקת הגלוקוז).

  1. נגב את זנב העכבר עם צמר גפן אלכוהולי כדי להפוך את וריד הזנב להיפראמי לחלוטין.
  2. חותכים את קצה הזנב ב-1-2 מ"מ בעזרת מספריים כירורגיים.
  3. יש ללחוץ בעדינות לאורך שורש הזנב עד לקצה הזנב, כדי להקל על זרימת הדם החוצה מהחתך.
  4. מקם את מיכל ספיגת הדגימה של נייר הבדיקה בקצה טיפת הדם.
    הערה: הדם יישאב לתוך נייר הבדיקה עקב אפקט הסיפון.
  5. קרא את קריאת מד הסוכר בדם ורשום את התוצאה.
    הערה: אל תכלול את העכברים שרמות הגלוקוז בדם שלהם לא עלו מעל 10 ממול/ליטר לאחר 15 דקות של הזרקת גלוקוז.
  6. הסר את כל עודפי הדם באמצעות צמר גפן והפעל לחץ כדי לעצור את הדימום.

7. צביעת 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC).

  1. המתת חסד של העכבר על ידי הזרקה תוך-צפקית של מנת יתר של פנטוברביטל (300 מ"ג/ק"ג).
  2. ברגע שהעכבר מפסיק לנשום, יש לשתק אותו מיד במצב שכיבה.
  3. פתחו את בית החזה בעזרת מספריים, וחתכו את הסרעפת כדי לחשוף את הלב.
  4. הכנס מחט הזרקה של 23 גרם לחדר השמאלי של העכבר וחתך את התוספתן האפרכסת במספריים.
  5. יש להחדיר 15 מ"ל של מי מלח רגילים עד שהנוזל המתנקז מהתוספתן האפרכסת נראה צלול ושקוף.
  6. ערפו את ראשו של העכבר וחתכו את הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת במלואה באמצעות מספריים. הכנס את קצה המספריים 2 מ"מ מעט לפני התפר העטרתי של הגולגולת כדי לפתוח אותו.
  7. השתמש בפינצטה כדי להסיר את רקמת המוח של העכבר שלמה.
  8. מניחים את רקמת המוח במטריצת מוח של מכרסמים וחותכים אותה לפרוסות עטרה של 2 מ"מ.
  9. מעבירים את הפרוסות לצלחת של 24 בארות ומדגרים אותן בתמיסת TTC של 2% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  10. הפעל את תוכנת הסריקה והגדר את הגדרות הפרמטרים לרזולוציה של 1200 dpi ופורמט JPG לניתוח תמונה.
  11. מהדקים את חלקי הרקמה מהצלחת בת 24 הבארות בעזרת מלקחיים מעוקלים ומסדרים את החלקים על צלחת סריקת הזכוכית.
  12. סרוק את חלקי הרקמה ולאחר מכן ייצא את התמונות לניתוח מדידה.
  13. מדוד את אזור האוטם על ידי תיקון נפיחות ברקמות. הפחיתו את האזור שאינו אוטם של הצד המקביל מאזור הצד הנגדי באמצעות תוכנת ImageJ15. העריכו את גודל האוטם כאחוז מחצי הכדור הנגדי. לפרטים נוספים על ניתוח שטח אוטם, עיין ב-Friedländer et al.16.

8. תצפית ג'י רוס

  1. חזור על שלבים 7.1-7.8.
  2. גזרו את חלקי הרקמה מהמטריצה של המוח בעזרת מלקחיים מעוקלים וסדרו את החלקים על צלחת הסריקה מזכוכית.
  3. סרוק את חלקי העטרה במוח כמתואר בשלבים 7.10 ו-7.12.

9. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)

  1. חזור על שלבים 7.1-7.4. יש להחדיר לאט 15 מ"ל של מי מלח רגילים, ואחריו זלוף של כ-15 מ"ל של פרפורמלדהיד (PFA).
  2. חזור על שלבים 7.6-7.7. יש לתקן את רקמת המוח עם 4% PFA למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר.
  3. הכניסו את רקמת המוח הקבועה לתוך מייבש הרקמות האוטומטי להתייבשות, ויטריפיקציה וטבילת שעווה.
  4. הטמיעו את הרקמה בשעוות פרפין וחתכו את רקמת המוח לפרוסות קורונליות בעובי 5 מיקרומטר על ידי מיקרוטום.
  5. הסירו את הפרוסה בשעווה על ידי טבילתה בקסילן שלוש פעמים, כאשר כל טבילה נמשכת 8 דקות. לאחר מכן, טבלו בהדרגה את הפרוסה בתמיסות אתנול בריכוזים יורדים (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), ואחריהם מים מזוקקים, כאשר כל שלב נמשך 5 דקות.
  6. מכתימים את הפרוסה בתמיסת המטוקסילין למשך 3 דקות. לאחר מכן, הבדיל אותו על ידי טבילתו באלכוהול חומצה הידרוכלורית 5% למשך 5 שניות.
  7. דגרו את הפרוסה בתמיסת אאוזין למשך דקה אחת, ואז ייבשו והיאליניזציה עם תמיסת אתנול שיפוע (90%, 95%, 100%) וקסילן.
  8. הרכיב את הקטע עם שרפים ניטרליים.
  9. צלם תמונות של פרוסות מוח מוכתמות של H&E תחת שדה בהיר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

10. קביעת הלקאג' של אוונס בלו (EB)

הערה: לפרטים על הליך זה, עיין ב-Wang et al.17.

  1. יש להזריק תמיסת 2% (w/v) של אוונס בלו (EB) (2 מ"ל/ק"ג) דרך וריד הזנב 23 שעות לאחר ה-MCAO.
  2. חזרו על שלבים 7.1-7.7 שעה לאחר הזרקת EB וצלמו תמונה של המוח כולו.
  3. מניחים את המוח במטריצת מוח של מכרסמים וחותכים אותו לפרוסות של 2 מ"מ. סרוק את חלקי העטרה במוח כמתואר בשלבים 7.10-7.12 כדי לצפות בדליפת EB.
  4. מחלקים את הפרוסות לחלקים ימניים ושמאליים, ומכניסים כל אחת לצינור צנטריפוגה.
  5. הומוגניזציה של כל פיסת רקמת מוח ב-50% חומצה טריכלורואצטית, עם יחס של 100 מ"ג רקמת מוח ל-0.4 מ"ל של חומצה טריכלורואצטית.
  6. לאחר הדגירה ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, צנטריפוגה את ההומוגנאט למשך 30 דקות ב-10,000 x גרם (ב-4 מעלות צלזיוס).
  7. העבירו את נוזל העל לצינור צנטריפוגה אחר ודללו אותו פי ארבעה באתנול.
  8. מדוד את הספיגה של נוזל ה-supernatant ב-620 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
  9. להמיר ערכי ספיגה לריכוז EB באמצעות עקומה סטנדרטית של EB באתנול (למשל, ב-31.25, 62.5, 125 ו-250 ug/mL).
    הערה: התוצאה מוצגת כמיקרוגרם של EB לגרם של רקמת מוח.

11. קביעת דליפת FITC-Dextran

  1. יש להזריק FITC-Dextran (10 KDa, 6 מ"ג/מ"ל, מדולל ב-0.01M PBS; 4 מ"ל/ק"ג) לווריד הזנב 24 שעות לאחר ה-MCAO, ולאפשר לו להסתובב בדם למשך 10 דקות.
  2. חזור על שלבים 7.1-7.7 כדי לבצע זלוף ולהסיר את רקמת המוח השלמה.
  3. קבעו את רקמת המוח ב-4% PFA למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר בחושך.
  4. העבירו את רקמת המוח הקבועה לתמיסת הסוכרוז עם ריכוזי שיפוע של 10%, 20% ו-30% (מדולל ב-0.01M PBS) להתייבשות.
  5. הטמיעו את רקמת המוח באמצעות תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) וחתכו לחלקי רקמת מוח בעובי 30 מיקרומטר. העבירו את החלקים לשקופית מיקרוסקופ באמצעות לולאת חיסון וודאו שהם נצמדים למשטח השקופית.
  6. הרכיבו את חלקי רקמת המוח באמצעות מדיום הרכבה המכיל 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI).
  7. הפעל את המיקרוסקופיה הקונפוקלית של הלייזר ואת תוכנת הבקרה שלה.
  8. תקן את שקופית המיקרוסקופ על האובייקט stage ואתר את אזור האוטם מתחת לעינית 200x.
  9. הגדר את הרזולוציה ל-1024 x 1024 והתאם את ערך הרווח וזמן החשיפה כדי לקבל את התמונה הברורה ביותר האפשרית.
  10. רכוש את התמונות של האזור המוכתם של אוטם מוחי FITC-Dextran תחת אורך גל עירור של 488 ננומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ההליך הניסויי של מחקר זה מתואר באיור 1. בקצרה, העכברים עברו MCAO המושרה על ידי חסימת חוטים במשך 60 דקות, ולאחר מכן רפרפוזיה. גלוקוז (30% במי מלח רגילים, 7.2 מ"ל/ק"ג משקל גוף) ניתן תוך צפקית 15 דקות לפני MCAO. רמות הגלוקוז בדם נמדדו בנקודת ההתחלה (לפני הזרקת הגלוקוז), מיד לאחר MCAO ובזמן הרפרפוזיה. לאחר 24 שעות של רפרפוזיה, העכברים הורדמו, ורקמות המוח נאספו לניתוח נפח האוטם, דליפת מחסום דם-מוח והיסטופתולוגיה. כפי שמתואר באיור 2, כל ארבע הקבוצות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול הנוכחי נועד ליצור מודל חייתי אמין של טרנספורמציה דימומית לאחר שבץ איסכמי, שיכול לשכפל את ההשפעות המזיקות של רה-וסקולריזציה של כלי דם בתנאים היפרגליקמיים. בין גורמי הסיכון השונים לשבץ איסכמי, רמת הגלוקוז בדם תוך 24 שעות לאחר הופעת השבץ נמצאת בקורלציה חיובית עם החמרת הפגיעה המוחית והתמותה המוגברת 3,18. מחקרים קליניים רבים הראו גם כי היפרגליקמיה לאחר שבץ מוחי היא אחד מגורמי הסיכון הקריטיים ביותר ל-HT ולתוצאות נוירולוגיות ג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים סותרים לחשוף.

תודות

איור 1 נוצר באמצעות תוכנת BioRender (https://www.biorender.com/). מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהפרויקט המנחה של הקרן למדעי הטבע של מחוז חוביי (מס' 2022CFC057).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)Sigma-Aldrich108380הצבע לצביעה TTC
24 בארות צלחת תרביתCorning IncorporatedCLS3527הכלי לצביעת TTC
30% הזרקת גלוקוזKelun PharmaceuticalH42021188אינדוקציה היפרגליקמיה חריפה
4% פרפורמלדהידווהאן Servicebio Technology
Co., Ltd. 		G1101קיבוע רקמות
5.0 תפר נספג חומצה פוליגליקוליתJinhuan Medical Co., LtdKCR531ציוד לניתוח
96-באר תרביתצלחת קורנינג משולבתCLS3596מדידת תוכן EB
מכונת הרדמהMidmark CorporationVMRהרדמה לבעלי חיים
Antifade הרכבה מדיום עם DAPIBeyotime BiotechP0131תושבת לקטעי רקמות
אוטומציה-ייבוש רקמות  מכונת
Leica BiosystemsTP1020ייבוש רקמות
מיקרוסקופיה קונפוקליתLeica BiosystemsSTELLARIS 5רכישת תמונה
דיקלופנק נתרן ג'לMaYinglong H10950214 פרמצבטימשככי כאבים לבעלי חיים
תמיסת צביעה EosinServicebio TechnologyG1001הצבע עבור H& E מכתים
אוונס כחולאלאדיןE104208EB מכתים
ג'ל עינייםגואנגג'ואו H44023098 פרמצבטיחומר לניתוח
Fitc-dextanSigma-Aldrich60842-46-8חדירות BBB הערכת
מיקרוסקופ פלואורסצנטיאולימפוסBX51רכישת תמונה
מיקרוטום קפואLeica BiosystemsCM1900השתמש בחלקים קפואים
גלוקומטרYuWell580מדידת גלוקוז בדם
תמיסת צביעת המטוקסיליןServicebioG1004הצבע ל-H&; E מכתים
יודLircon20020059חומר לניתוח
IsofluraneRwd מדעי החייםR510-22-10הרדמה לבעלי חיים
מד זרימת דם דופלר בלייזרMoor InstrumentsmoorVMSניטור זרימת דם
MCAO תפריםRwd מדעי החיים907-00023-01חומר לניתוח
מלוקסיקםBoehringer-IngelheimJ20160020משככי כאבים לבעלי חיים
ערכת מכשירים מיקרוכירורגייםRwd Life ScienceSP0003-Mציוד לניתוח
מיקרוטוםתרמו פישר מדעיHM325ייצור חתך רקמות
להב מיקרוטוםLeica Biosystems819ייצור חתך רקמות
משחת MupirocinGlaxoSmithKlineH10930064אנטי זיהום לבעלי חיים
בלסם ניטרליאבסין Bioscienceabs9177חותם ל-H&
מרכז הטמעת פרפיןE Thermo Fisher ScientificEC 350לייצר גושי פרפין
נתרן פנטוברביטלSigma-AldrichP3761המתת חסד לבעלי חיים
פוספט חוצץמלח Beyotime BiotechC0221Aשטיפה לקטע רקמות
סורקEPSONV330גילוח
לסריקת רקמותשנזן קודוס מכשירי חשמל ושות', בע"מCP-9200ציוד לניתוח
ספקטרופוטומטרתרמו פישר מדעי1510-02362תכולת EB מדידת
תמיסת סוכרוזשנחאי מקלין ביוכימי57-50-1התייבשות לרקמות
רקמה-טק O.C.T. תרכובתסאקורה4583הטמעת רקמות בינוניות
חומצה טריכלורואצטיתסיגמא-אולדריץ'T6399EB מדידת תוכן
מכתים מכונת

מקורות

  1. Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. Hyperacute management of ischemic strokes: JACC focus seminar. J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).
  2. Goncalves, A., et al. Thrombolytic tPA-induced hemorrhagic transformation of ischemic stroke is mediated by PKCβ phosphorylation of occludin. Blood. 140 (4), 388-400 (2022).
  3. Adebayo, O. D., Culpan, G. Diagnostic accuracy of computed tomography perfusion in the prediction of hemorrhagic transformation and patient outcome in acute ischaemic stroke: A systematic review and meta-analysis. Eur Stroke J. 5 (1), 4-16 (2020).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Knight, R. A., et al. Prediction of impending hemorrhagic transformation in ischemic stroke using magnetic resonance imaging in rats. Stroke. 29 (1), 144-151 (1998).
  6. Orset, C., et al. Combination treatment with U0126 and rt-PA prevents adverse effects of the delayed rt-PA treatment after acute ischemic stroke. Sci Rep. 11 (1), 11993(2021).
  7. Kwon, I., et al. Hemorrhagic transformation after large cerebral infarction in rats pretreated with dabigatran or warfarin. Stroke. 48 (10), 2865-2871 (2017).
  8. Mi, D., et al. Correlation of hyperglycemia with mortality after acute ischemic stroke. Ther Adv Neurol Disord. 11, 1756285617731686(2018).
  9. Seners, P., Turc, G., Oppenheim, C., Baron, J. C. Incidence, causes and predictors of neurological deterioration occurring within 24 following acute ischaemic stroke: A systematic review with pathophysiological implications. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 86 (1), 87-94 (2015).
  10. Reshi, R., et al. Hyperglycemia in acute ischemic stroke: Is it time to re-evaluate our understanding. Med Hypotheses. 107, 78-80 (2017).
  11. Graham, M. L., Schuurman, H. J. Validity of animal models of type 1 diabetes, and strategies to enhance their utility in translational research. Eur J Pharmacol. 759, 221-230 (2015).
  12. Rehni, A. K., Liu, A., Perez-Pinzon, M. A., Dave, K. R. Diabetic aggravation of stroke and animal models. Exp Neurol. 292, 63-79 (2017).
  13. Chiang, T., Messing, R. O., Chou, W. H. Mouse model of middle cerebral artery occlusion. J Vis Exp. 48, e2761(2011).
  14. Ma, F., Sun, P., Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. Endothelium-targeted deletion of the miR-15a/16-1 cluster ameliorates blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke. Sci Signal. 13 (621), eaay5686(2020).
  15. Wanson, R. A., et al. A semiautomated method for measuring brain infarct volume. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (2), 290-293 (1990).
  16. Friedländer, F., et al. Reliability of infarct volumetry: Its relevance and the improvement by a software-assisted approach. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (8), 3015-3026 (2017).
  17. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588(2014).
  18. Wang, C., et al. Association between red blood cell distribution width and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke patients. Cerebrovasc Dis. 48 (3-6), 193-199 (2019).
  19. Zhu, B., et al. Stress hyperglycemia and outcome of non-diabetic patients after acute ischemic stroke. Front Neurol. 10, 1003(2019).
  20. Won, S. J., Tang, X. N., Suh, S. W., Yenari, M. A., Swanson, R. A. Hyperglycemia promotes tissue plasminogen activator-induced hemorrhage by increasing superoxide production. Ann Neurol. 70 (4), 583-590 (2011).
  21. Zhang, F. H., et al. Rosiglitazone attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient focal ischemia in rats. Neuroscience. 250, 651-657 (2013).
  22. Soejima, Y., et al. Hyperbaric oxygen preconditioning attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient MCAO in rats. Med Gas Res. 2 (1), 9(2012).
  23. Chen, C., Ostrowski, R. P., Zhou, C., Tang, J., Zhang, J. H. Suppression of hypoxia-inducible factor-1alpha and its downstream genes reduces acute hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation in a rat model of cerebral ischemia. J Neurosci Res. 88 (9), 2046-2055 (2010).
  24. Lin, Y., et al. Docosahexaenoic acid attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient focal cerebral ischemia in rats. Neuroscience. 301, 471-479 (2015).
  25. MacDougal, E. L., Herman, W. H., Wing, J. J., Morgenstern, L. B., Lisabeth, L. D. Diabetes and ischaemic stroke outcome. Diabet Med. 35 (9), 1249-1257 (2018).
  26. Yang, C., Hawkins, K. E., Doré, S., Candelario-Jalil, E. Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke. Am J Physiol Cell Physiol. 316 (2), C135-C153 (2019).
  27. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Curr Protoc Neurosci. 79, 9.58.1-9.58.15 (2017).
  28. Ahishali, B., Kaya, M. Evaluation of blood-brain barrier integrity using vascular permeability markers: Evans Blue, Sodium Fluorescein, Albumin-Alexa Fluor conjugates, and Horseradish Peroxidase. Methods Mol Biol. 2367, 87-103 (2021).
  29. Kovács, K. B., Bencs, V., Hudák, L., Oláh, L., Csiba, L. Hemorrhagic transformation of ischemic strokes. Int J Mol Sci. 24 (18), 14067(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון


Formal Correction: Erratum: A Mouse Model of Hemorrhagic Transformation Induced by Acute Hyperglycemia Combined with Transient Focal Ischemia
Posted by JoVE Editors on 1/06/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/67371

גלה מאמרים נוספים

מודל עכברים להיפרגליקמיהחסימה של העורק המוחי האמצעימחסום דם-מוחנפח אוטם מוחיחדירות Evans Blueדליפה של FITC-Dextranצביעת Hematoxylin Eosinפלואמטריה של זרימת דם בלייזר
מודל עכבר של טרנספורמציה דימומית הנגרמת על ידי היפרגליקמיה חריפה בשילוב עם איסכמיה מוקדית חולפת
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.