מאמר שיטה

הפלת גנים יעילה בכבד באמצעות הזרקה תוך-טחולית של RNA סיכת ראש קטנה המסופקת על ידי נגיף הקשור לאדנו Serotype 8 (AAV8)

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67376

⸱

1 בנובמבר 2024

 , 
1Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Translational Medical Sciences, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר כיצד הזרקה תוך-טחולית של RNA סיכת ראש קטנה המועברת על ידי AAV8 משיגה את אותה יעילות הפלת גנים בכבד כמו הזרקת וריד פורטלי, המייצגת הליך פשוט יותר עם תמותה וסיבוכים נמוכים בהרבה סביב הניתוח ואחרי הניתוח.

תקציר

הכבד הוא איבר מרכזי המבצע פונקציות מטבוליות חיוניות. פיתוח שיטה יעילה ובטוחה לפגיעה בביטוי גנים בכבד מספק כלי חשוב לקביעת תפקוד גנים בפתופיזיולוגיה של הכבד. במחקר זה, אנו מתארים שיטה להזרקה תוך טחולית של סרוטיפ 8 של נגיף הקשור לאדנו-(AAV8) שהונדס לבטא RNA סיכת ראש קטנה (shRNA) כנגד גן מטרה מעניין, נוקלאוסטמין (NS). הזרקה תוך-טחולית של AAV8 המבטאת shRNA מכוון NS, (AAV8-shNS1) השיגה את אותה יעילות נוקדאון של NS בכבד כמו הזרקת וריד פורטלי, בהשוואה להזרקת AAV8 המבטאת shRNA ברצף מקושקש (AAV8-shScr). יתר על כן, הזרקת נגיף AAV8-shRNA עוררה תגובות דלקתיות מינימליות בפרנכימת הכבד. והכי חשוב, פרוטוקול הזרקה תוך טחול זה לא היה תובעני מבחינה טכנית וגרם לדימום מינימלי במקום ההזרקה, שהוא הגורם המוביל לתמותה סביב הניתוח ואחרי הניתוח בעת ביצוע הזרקת וריד פורטלי. מחקר זה מדווח על שיטה משופרת ובטוחה יחסית להשגת הפלת גנים יעילה בכבד.

מבוא

הכבד הוא איבר חיוני המבצע חילוף חומרים מזינים וכימיקלים, אך גם חשוף כל הזמן לעלבונות ציטוטוקסיים ומסרטנים. בעוד שהכבד הבוגר מסוגל לצמוח מחדש לאחר פציעה, כוח ההתחדשות שלו נפגע קשות עד גילשנה. נכון להיום, האופציה הטיפולית היחידה לחולים עם מחלות כבד כרוניות סופניות או נזק חריף מסיבי לכבד היא השתלת כבד, המציבה אתגריםרבים בפני עצמה. כדי להבין טוב יותר את הפתופיזיולוגיה המולקולרית של הכבד על ידי חקירת התפקודים של גנים מעניינים, פותחו מניפולציות גנטיות ליישום in vivo , כולל נוקדאון בתיווך RNAi ומחיקה ממוקדת על ידי Cre recombinase בנוכחות אתרי loxP3. קלטת ביטוי Cre ומבנה shRNA יכולים להיות מועברים על ידי כלי רכב ויראליים.

סרוטיפ 8 של נגיף הקשור לאדנו (AAV8) הוא וקטור חזק להעברת גנים לסוגי רקמות סלקטיביות (למשל, כבד, שרירי שלד, לב, מוח ולבלב) עם יעילות גבוהה ותגובה דלקתית נמוכה 4,5. כדי להתמקד באיברי גוף פנימיים, AAV8 מוחדר בדרך כלל על ידי הזרקת וריד זנב, שבה חלקיקים נגיפיים עוברים תחילה דרך הריאה לפני שהם מגיעים למחזור הדם המערכתי. לעומת זאת, הזרקת וריד פורטלי מאפשרת להם להגיע תחילה לכבד לפני שהם מסתובבים דרך הריאות, מקור פוטנציאלי לבידוד ודילול. עם זאת, הזרקת וריד פורטלי היא מאתגרת מבחינה טכנית ולעתים קרובות מסובכת על ידי דימום המושרה על ידי ניתוח ושיעור תמותה גבוה. כדי להשיג הפלה יעילה של גנים (KD) בכבד תוך הימנעות מנושא התמותה הגבוהה לפני ואחרי הניתוח, בדקנו שיטה של הזרקה תוך טחולית של AAV8 הנושא shRNA מהונדס המכוון לנוקלאוסטמין (NS) (AAV8-shNS1) והשווינו את יעילות ה-KD שלו לזו של AAV8-shNS1 המוזרק לווריד פורטלי.

NS הוא חלבון מועשר בתאי גזע/אב שהתגלה תחילה בתאי גזע עצביים ובהמשך במספר סוגים אחרים של תאי גזע וסרטן 6,7. החשיבות הביולוגית של NS מוצגת על ידי הפנוטיפ הקטלני העוברי המוקדם של עכברי NS-knockout (NSKO) in vivo 3,8 ועל ידי הפרעה הנגרמת על ידי NSKD של חידוש עצמי במבחנה 9,10. בבעלי חיים בוגרים, רמות גבוהות של ביטוי NS נמצאות באשך ובמספר רקמות שעוברות התחדשות, כולל תאי אפיתל פיגמנטיים של ניוט לאחר כריתת עדשה ותאי שריר לאחר כריתת גפיים11, כמו גם רקמות יונקים מתחדשות, כגון קרדיומיוציטים של עכברים לאחר פגיעה לבבית12 והפטוציטים לאחר פגיעה בכבד (למשל, CCl4) או כריתה כירורגית (למשל, כריתת כבד חלקית)13,14. יתר על כן, הוכח כי NS ממלא תפקידים חשובים בהתפתחות גידולי שד, כבד ופה 15,16,17. מבחינה מכנית, הוכח כי NS מקדם התחדשות עצמית על ידי הגנה על הגנום המשתכפל מפני נזק ל-DNA18,19. עם זאת, בשל הפנוטיפ הקטלני העוברי המוקדם של NSKO, יש צורך בשיטה ניסיונית להחדרה זמנית של NSKD לאחר השלמת התפתחות הרקמה כדי לקבוע עוד יותר את פעילותו הביולוגית באיברים בוגרים.

במאמר זה, אנו משתמשים ב-NS כמקרה לדוגמה כדי להמחיש את ההקמה והבדיקה של שיטת KD של גן כבד in vivo שהיא יעילה ובעלת תמותה נמוכה הנגרמת על ידי הליך.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים שהושלמו במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס A&M ביוסטון (מספר אישור: 2021-0264-IBT) ובוצעו בהתאם ובהתאם לכל ההנחיות הרגולטוריות והמוסדיות הרלוונטיות. נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J נקבות (בנות 4-5 חודשים, משקל גוף 23-30 גרם). פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. AAV8- תכנון וייצור shRNA

הערה: אנא עיין ב-Sands et al.4 לפרטים פרוצדורליים.

  1. חוש תכנון ואנטי-חוש shRNA אוליגונוקלאוטידים המכוונים לרצף ארוך של 21 נוקלאוטידים באזור המקודד של הגן המעניין. במקרה זה, נעשה שימוש ב-NS של עכבר (shNS1) וברצף מקושקש של 21 נוקלאוטידים כבקרה שלילית (shScr) (איור 1A, פאנל תחתון).
  2. כלול במבנה סיכת הראש רצף לולאת גזע של TTCAAGAGA, קצה קהה 5', קצה מגובש תואם 3' XhoI, ורצף חישה ממוקד ספציפי לגן של 5'-GAA CTA AAA CAG CAG CAG AAA-3' (shNS1) או רצף מקושקש של 5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3' (shScr).
  3. זרחן וחישול כל זוג אוליגונוקלאוטידים.
  4. עיכול וקטור העברת גנים AAV, AV5-siRNA-GFP (איור 1A, פאנל עליון), עם HpaI ו-XhoI, דפוספורילאט וג'ל מטהרים את שבר הווקטור.
  5. קשר אוליגונוקלאוטידים מחוסמים לווקטור המטוהר בג'ל.
  6. הפוך מוצרי DNA קשורים לחיידקי DH5α מוכשרים עם יעילות תת-שיבוט.
  7. בחר שיבוטים בודדים על ידי עמידות לאמפיצילין וגדל תרבית חיידקים של 100 מ"ל עבור מיני-הכנת פלסמיד. אשר שיבוט נכון על ידי ריצוף והכנת פלסמידים באמצעות הערכה נטולת האנדוטוקסינים הזמינה מסחרית (בהתאם להוראות היצרן).
  8. ארוז נגיפי AAV8 על ידי העברת וקטור ההעברה AV5, סרוטיפ Rep/Cap 8 ופלסמידים מסייעים של AdF6 לתאי 293T באמצעות מגיב טרנספקציה iMFectin. בסך הכל 40 × 15 ס"מ הועברו ונקטפו / עוכלו 3 ימים לאחר הטרנספקציה.
  9. שחזר AAV8 הקשור לתאים על ידי ליזה תאית וזרז AAV8 המופרש במדיה עם 40% PEG. לאחר העיכול, שלב נגיפי AAV8 בליזאט התא ובמדיום, מטהר על שיפוע יודיקסנול לא רציף, ורכז ביחידות צנטריפוגה חתוכות במשקל מולקולרי (1,00,000 מגה-וואט).
  10. כמת טיטרים של AAV8 על ידי qPCR נקודת קצה מוחלטת עם פריימרים: WPRE-172 (5'- TTTATGAGGAGTTGTGGCCC-3') ו-WPRE-392 (5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3').

2. הזרקה תוך-טחולית של AAV8 (איור 1B, 1C) 

  1. הנח עכברי C57BL6/J בתא הרדמה מלא ב-2% איזופלורן וחמצן (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). לאחר אובדן הכרה, העבירו עכברים לאזור הניתוח האספטי בתנוחת שכיבה רוחבית ימנית. שמור על הרדמה על ידי 2% איזופלורן עם חמצן המועבר דרך חרוט אף.
  2. עקר את מקום החתך עם 2% כלורהקסידין ואחריו 80% אתנול. השתמש במספריים רפואיים בגודל 6.3 אינץ' כדי לבצע חתך של 15 מ"מ בדופן הבטן העליונה השמאלית, ולאחר מכן חתך של 10 מ"מ על הצפק.
  3. חשפו בעדינות את הטחול בעזרת מלקחיים והחזיקו אותו במקומו בעזרת גזה רטובה המונחת מתחת לאיבר.
  4. מערבבים בעדינות והזרקו נגיפי AAV8 (50 מיקרוליטר) במשך תקופה של 30 שניות לתוך הטחול באמצעות מחט 30 G כשהקצה ממוקם בעומק של 3 מ"מ מתחת לפני השטח (איור 1B). מכסים את מקום ההזרקה בחתיכת צמר גפן ודוחסים למשך דקה.
  5. לתפור את הצפק בתפר מעי כרומי נספג 4-0.
  6. סגור את דופן הבטן והעור עם תפר משי 4-0.
  7. הניחו עכברים בכלוב נקי על גבי כרית חום חשמלית ועקבו אחריהם עד להתאוששות.

3. הזרקת וריד פורטל של AAV8

  1. להרדים עכברי C57BL6/J על ידי שאיפת איזופלורן (2%) מעורבב עם חמצן (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד).
  2. בצע לפרוטומיה 4,13 דרך חתך בקו האמצע (~1 אינץ') על העור ולאחר מכן לתוך הצפק.
  3. הניחו פד גזה סטרילי ספוג במי מלח סטריליים בצד שמאל של העכבר והשתמשו במקלון צמר גפן סטרילי כדי לשלוף בעדינות את המעי הגס והדק. הניחו את המעי על גבי גזה רטובה וכסו אותו בפד כדי למנוע מגע עם העור או ייבוש.
  4. הזריק את נגיף ה-AAV לווריד הפורטל עם מחט סטרילית 32 G בנפח של 50 מיקרוליטר. הכנס את המחט 3-5 מ"מ לווריד היציאה בזווית של פחות מ-5 מעלות. אפשר לדם לזרום מעבר למחט למשך 5 שניות כדי למנוע זרימה חוזרת.
  5. הנח קצה צמר גפן סטרילי על גבי מקום ההזרקה בלחץ עדין עד לסגירת הווריד כולו וללא דימום (כ-5 דקות) כדי למנוע דימום.
  6. החזירו בעדינות איברים פנימיים לחלל הבטן.
  7. סגור את דופן הבטן והעור עם תפר משי 4-0.

4. ניתוח qRT-PCR

  1. חלץ RNA מ-50-100 מ"ג של רקמת כבד 4,13 באמצעות מגיב בידוד RNA זמין מסחרית בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
  2. סנתז cDNAגדיל אחד מסך ה-RNAs עם הקסמרים אקראיים ו-M-MLV reverse transcriptase 20,21.
  3. קבע את ערכי ה-ΔC(t) בין גן היעד לגני הייחוס באמצעות מערכת זיהוי PCR בזמן אמת בצבע יחיד ומגיב ירוק סופרמיקס SYBR בעקבות דוחות שפורסמובעבר 22,23.
  4. מדוד את ערכי ΔΔC(t) מארבעה שכפולים ביולוגיים ושלוש חזרות טכניות (n = 12). הגדר את Tm על 60 מעלות צלזיוס עבור כל התגובות. אשר את התוצאות באמצעות שני גני ייחוס, Rps3 ו-Rplp0.
  5. תכנן רצפי פריימר באופן הבא: Ns, 5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3' ו-5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3'; Rps3, 5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3' ו-5'-cat tct gtg tcc tgg tgg c-3'; Rplp0, 5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3' ו-5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'.

תוצאות

יעילות הגן KD בכבד על ידי תוך-טחול לעומת הזרקת וריד פורטל של AAV8-shRNA
מלאי נגיף AAV8 דולל לריכוז עבודה של 2E+12 עותקי גנום (gc) למיליליטר (gc/mL). לעכברים בודדים הוזרקו 1E+11 gc של AAV8-shNS1 או AAV8-shScr (50 מיקרוליטר) באמצעות הזרקה תוך טחולית או וריד פורטלי. שבועיים לאחר ההזרקה, נאספו רקמות כבד לבידוד RNA, סינתזת cDNA גדיל אחד וניתוח qPCR. התוצאות הראו כי שיטת ההזרקה התוך-טחולית השיגה סטטיסטית את אותה יעילות NSKD (20.8% ± 4.4%) כמו שיטת הזרקת וריד הפורטל (16.3% ± 3.6%) תוך שימוש ב-Rsp3 ו-Rplp0 כהתייחסות פנימית (איור 2). חשוב מכך, ניתן היה להשלים את הליך ההזרקה התוך-טחולית תוך 15 דקות כמעט ללא מוות שנגרם מההליך, בעוד ששיטת הזרקת וריד הפורטל דרשה בדרך כלל 25-30 דקות עם הרבה תרגול והייתה קשורה לשיעור תמותה גבוה יותר (שיעור תמותה של ~25%-30%).

תגובה דלקתית ברקמות
רקמות כבד נאספו מעכברים שקיבלו הזרקה לווריד הפורטל או הזרקה תוך-טחולית של AAV8-shScr (איור 3A) או AAV8-shNS1 (איור 3B), והושוו לזו של עכברי ביקורת (איור 3C). תגובות דלקתיות נבדקו על ידי צביעת H&E4. התוצאות הראו כי לא AAV8-shScr ולא AAV8-shNS1 עוררו תגובות דלקתיות בולטות בפרנכימת הכבד בהשוואה ל-PBS שהוזרקו בשיטת הזרקה תוך-טחולית (Spl) או הזרקת וריד פורטלי (PV) (איור 3A-C).

figure-results-1
איור 1: איורים של עיצוב AAV8-shRNA והליך ההזרקה התוך-טחולית. (A) (למעלה) תרשים של הפלסמיד AV5-siRNA-GFP שנועד ליצור סרוטיפ 8 של וירוס הקשור לאדנו-(AAV8) עבור ניסויי נוקדאון in vivo . AV5-siRNA-GFP מכיל רצף shRNA מונע על ידי מקדם CMV ו-EGFP. (למטה) מבני RNAi סיכות ראש קטנות המיועדים לטיפול ברצפי 21 נוקלאוטידים על עכבר NS (shNS1) או רצף מקושקש של 21 נוקלאוטידים (Scr). (B) דיאגרמת זרימת עבודה סכמטית בהליך הזרקת AAV8 תוך טחול. (ג) תצוגות מדורגות של ההליך הכירורגי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: היעילות של נוקדאון בתיווך AAV8-shRNA של נוקלאוסטמין (NS) בכבד באמצעות הזרקת וריד תוך טחול לעומת וריד פורטלי. מבחני qRT-PCR של ביטוי NS בדגימות כבד שנלקחו מעכברים שבועיים לאחר קבלת הזרקה תוך-טחולית (Spl) או וריד פורטלי (PV) של AAV8-shScr או AAV8-shNS1 (1E+11 gc). גרפים מראים תוצאות בהתייחס לשני בקרות פנימיות, Rps3 (A) ו-Rplp0 (B). עמודות מראות ממוצע ± SEM של ארבעה שכפולים ביולוגיים, כל אחד עם שלוש חזרות טכניות PCR; *עמ' < 0.01; **עמ' < 0.001; עמ' < 0.0001. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: היסטולוגיה של רקמות כבד לאחר הזרקה תוך טחולית או הזרקת וריד פורטלי של PBS, AAV8-shScr או AAV8-shNS1. צביעת H&E של רקמות הכבד שבועיים לאחר הזרקה תוך-טחולית (Spl) או הזרקת וריד פורטל (PV) של AAV8-shScr (A) או AAV8-shNS1 (B), בהשוואה לזו של דגימות ביקורת שאינן מוזרקות AAV8 (C). פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. החלוניות הימניות מציגות תצוגות מוגדלות של הכניסות בחלוניות השמאליות. מוטות קנה מידה: 50 מיקרומטר. שישה עד תשעה חלקים משני בעלי חיים שונים נבדקו בכל קבוצה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

גן KD על ידי מסירה ויראלית של מבנה המבטא shRNA ברקע פראי24,25 או מבנה המבטא Cre recombinase ברקע פלוקסי26 הוא דרך רבת עוצמה לחקור את תפקוד הגנים in vivo באופן אינדוקטיבי ומבוקר זמן. שיטת אספקה אידיאלית למחקרי KO/KD בגן in vivo אמורה להשיג יעילות KO/KD גבוהה באיבר המבוקש, ובנוסף, ההליך עצמו צריך להיות קל מבחינה טכנית עם מינימום תמותה לפני / אחרי הניתוח.

עבור איברים פנימיים כמו הכבד, חלקיקים נגיפיים יכולים להיות מוחדרים על ידי הזרקה דרך וריד הזנב27 או וריד הפורטל28,29 או על ידי הזרקה ישירה לטחול (הזרקה תוך טחול)30,31. זריקות וריד פורטל ותוך טחול מכניסות חלקיקים נגיפיים למחזור הפורטל, המתנקזים לכבד לפני הכניסה לווריד הנבוב התחתון ולאחר מכן למחזור הריאות. לעומת זאת, חלקיקים נגיפיים המוחדרים דרך הזרקת וריד הזנב עוקפים את מחזור הפורטל ונכנסים למחזור הריאות לפני שהם מגיעים למחזור הדם המערכתי. עבור איברים המקבלים זרימת דם פורטלית, כגון הכבד, וריד השער וזריקות תוך טחול מציעים את היתרון של העברת חלקיקים נגיפיים ישירות לאיברים אלה ללא סיכון של בידוד על ידי הריאה או דילול במחזור הדם המערכתי. עבור איברים שאינם מקבלים זרימת פורטל, כגון המוח, הזרקת וריד הזנב עשויה להועיל יותר לאי חשיפת חלקיקים נגיפיים לכבד לפני הגעתם למחזור הדם הריאתי ולאחר מכן, למחזור הדם המערכתי.

במחקר זה, הזרקנו AAV8-shNS1 במינון של 1E+11 gc לכל חיה, מה שהעניק יעילות KD טובה יותר בהשוואה ל-1E+10 gc אך השיג את אותו אפקט KD כמו 5E+11 gc באמצעות הזרקה תוך-פורטלית (נתונים לא מוצגים). במינון 1E+11 gc, בהשוואה בין שיטת הזרקת וריד הפורטל לשיטת ההזרקה התוך-טחולית, לא נמצא הבדל סטטיסטי בין שיטות אלו ביעילות ה-NSKD בכבד, והשיג יעילות של 70%-80% KD. השפעת הגן KD של AAV8 המוזרק לווריד הפורטלי בכבד יכולה להימשך עד שישה שבועות באופן תלוי מבנה23. יש לציין כי סיבוכים הקשורים להליך, כגון דימום המושרה על ידי ניתוח והידבקות אומנטום/צפק, כמו גם קושי טכני, הם פחותים ונמוכים משמעותית בשיטת ההזרקה התוך-טחולית בהשוואה לשיטת הזרקת וריד הפורטל. כתוצאה מכך, הזרקת וריד פורטל מתבצעת פעם אחת, ואילו הזרקה תוך טחולית יכולה להתבצע שובושוב 32. לבסוף, התגובות הדלקתיות היו מועטות עד אפסיות בפרנכימה של כבד שקיבל הזרקת וריד פורטלי או הזרקה תוך טחולית של AAV8-shScr או AAV8-NS1. עם זאת, הממצא האחרון אינו שולל את האפשרות שטיטר גבוה במיוחד של AAV עדיין יכול לעורר תגובות דלקתיות המבלבלות את ממצאי הניסוי. לכן, המינון האופטימלי של AAV צריך להיקבע באופן אמפירי ומאוזן בין יעילות KD לתגובה הנגרמת על ידי AAV8 ועשוי להשתנות בין גנים ו/או רצפים ממוקדים שונים. לסיכום, תוצאות אלו מדגימות כי הזרקה תוך טחולית של AAV8-shRNA היא שיטה יעילה ביותר, בטוחה יחסית ופשוטה להשגת KD בגן in vivo בכבד.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרס מחקר החוקרים האישיים של המכון למניעת סרטן של טקסס (CPRIT) (RP200081) ל-RYT.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
יחידות צנטריפוגה מסנן AmiconMilliporeSigma UFC9100אולטרה-סינון מהיר
AV5-siRNA-GFP אדג'ן #124972פלסמיד
מוכשר DH5 ואלפא; חיידקים Invitrogen#18265-017זן מוכשר כימית לשיבוט 
HpaI ניו אינגלנד BiolabsR0105אנזים הגבלה
iMFectin transfection reagnt GenDepotI7100-101
M-MLV טרנסקריפטאז הפוך PromegaM1708DNA פולימראז תלוי RNA 
מערכת זיהוי PCR בזמן אמת בצבע יחיד MyiQ Bio-RadBUN9740RADqRT-PCR
ערכה נטולת אנדוטוקסין אומגה BioteckD6915-03הכנת מידי DNA פלסמיד 
הקסמרים אקראיים Invitrogen48190-011
סופרמיקס SYBR ריאגנט ירוק Bio-Rad1708882יישומי PCR בזמן אמת
T4 DNA LigasePromegaM1801
TRIzol Reagent Life Technologies15596-018בידוד של אנזים הגבלה RNA כולל באיכות גבוהה
XhoINew England BiolabsR0146

מקורות

  1. Wang, J., et al. Epigenome-wide analysis of aging effects on liver regeneration. BMC Biol. 21 (1), 30(2023).
  2. Jindal, A., Jagdish, R. K., Kumar, A. Hepatic regeneration in cirrhosis. J Clin Exp Hepatol. 12 (2), 603-616 (2022).
  3. Meng, L., et al. Nucleostemin deletion reveals an essential mechanism that maintains the genomic stability of stem and progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11415-11420 (2013).
  4. Sands, M. S. Aav-mediated liver-directed gene therapy. Methods Mol Biol. 807, 141-157 (2011).
  5. Tenney, R. M., Bell, C. L., Wilson, J. M. AAV8 capsid variable regions at the two-fold symmetry axis contribute to high liver transduction by mediating nuclear entry and capsid uncoating. Virology. 454-455, 227-236 (2014).
  6. Tsai, R. Y., Mckay, R. D. A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells. Genes Dev. 16 (23), 2991-3003 (2002).
  7. Tsai, R. Y., Meng, L. Nucleostemin: A latecomer with new tricks. Int J Biochem Cell Biol. 41 (11), 2122-2124 (2009).
  8. Zhu, Q., Yasumoto, H., Tsai, R. Y. Nucleostemin delays cellular senescence and negatively regulates trf1 protein stability. Mol Cell Biol. 26 (24), 9279-9290 (2006).
  9. Qu, J., Bishop, J. M. Nucleostemin maintains self-renewal of embryonic stem cells and promotes reprogramming of somatic cells to pluripotency. J Cell Biol. 197 (6), 731-745 (2012).
  10. Lin, T., Meng, L., Li, Y., Tsai, R. Y. Tumor-initiating function of nucleostemin-enriched mammary tumor cells. Cancer Res. 70 (22), 9444-9452 (2010).
  11. Maki, N., et al. Rapid accumulation of nucleostemin in nucleolus during newt regeneration. Dev Dyn. 236 (4), 941-950 (2007).
  12. Siddiqi, S., et al. Myocardial induction of nucleostemin in response to postnatal growth and pathological challenge. Circ Res. 103 (1), 89-97 (2008).
  13. Lin, T., Ibrahim, W., Peng, C. -Y., Finegold, M. J., Tsai, R. Y. A novel role of nucleostemin in maintaining the genome integrity of dividing hepatocytes during mouse liver development and regeneration. Hepatology. 58 (6), 2176-2187 (2013).
  14. Shugo, H., et al. Nucleostemin in injury-induced liver regeneration. Stem Cells Dev. 21 (16), 3044-3054 (2012).
  15. Lin, T., et al. Nucleostemin reveals a dichotomous nature of genome maintenance in mammary tumor progression. Oncogene. 38 (20), 3919-3931 (2019).
  16. Wang, J., et al. Nucleostemin modulates outcomes of hepatocellular carcinoma via a tumor adaptive mechanism to genomic stress. Mol Cancer Res. 18 (5), 723-734 (2020).
  17. Crawford, M., Liu, X., Cheng, Y. L., Tsai, R. Y. Nucleostemin upregulation and stat3 activation as early events in oral epithelial dysplasia progression to squamous cell carcinoma. Neoplasia. 23 (12), 1289-1299 (2021).
  18. Lin, T., Meng, L., Wu, L. J., Pederson, T., Tsai, R. Y. Nucleostemin and gnl3l exercise distinct functions in genome protection and ribosome synthesis, respectively. J Cell Sci. 127 (10), 2302-2312 (2014).
  19. Tsai, R. Y. Balancing self-renewal against genome preservation in stem cells: How do they manage to have the cake and eat it too. Cell Mol Life Sci. 73 (9), 1803-1823 (2016).
  20. Meng, L., Hsu, J. K., Tsai, R. Y. Gnl3l depletion destabilizes mdm2 and induces p53-dependent G2/m arrest. Oncogene. 30 (14), 1716-1726 (2011).
  21. Huang, G., Meng, L., Tsai, R. Y. P53 configures the G2/m arrest response of nucleostemin-deficient cells. Cell Death Discov. 1, e15060(2015).
  22. Liu, X., Wang, J., Wu, L. J., Trinh, B., Tsai, R. Y. L. IMPDH inhibition decreases TERT expression and synergizes the cytotoxic effect of chemotherapeutic agents in glioblastoma cells. Int J Mol Sci. 25 (11), 5992(2024).
  23. Liu, X., Wang, J., Li, F., Timchenko, N., Tsai, R. Y. L. Transcriptional control of a stem cell factor nucleostemin in liver regeneration and aging. PLoS One. 19 (9), e0310219(2024).
  24. Mayra, A., et al. Intraperitoneal AAV9-shRNA inhibits target expression in neonatal skeletal and cardiac muscles. Biochem Biophys Res Commun. 405 (2), 204-209 (2011).
  25. Cohen, A., et al. Virus-mediated shRNA knockdown of prodynorphin in the rat nucleus accumbens attenuates depression-like behavior and cocaine locomotor sensitization. PLoS One. 9 (5), e97216(2014).
  26. Jeon, Y., et al. Topbp1 deficiency causes early embryonic lethality and induces cellular senescence in primary cells. J Biol Chem. 286 (7), 5414-5422 (2011).
  27. Smith, T. A., et al. Adenovirus-mediated expression of therapeutic plasma levels of human factor IX in mice. Nat Genet. 5 (4), 397-402 (1993).
  28. Nakai, H., Iwaki, Y., Kay, M. A., Couto, L. B. Isolation of recombinant adeno-associated virus vector-cellular DNA junctions from mouse liver. J Virol. 73 (7), 5438-5447 (1999).
  29. Jung, S. C., et al. Adeno-associated viral vector-mediated gene transfer results in long-term enzymatic and functional correction in multiple organs of Fabry mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2676-2681 (2001).
  30. Hurford, R. K., Dranoff, G., Mulligan, R. C., Tepper, R. I. Gene therapy of metastatic cancer by in vivo retroviral gene targeting. Nat Genet. 10 (4), 430-435 (1995).
  31. Sarkar, R., Xiao, W., Kazazian, H. H. Jr A single adeno-associated virus (AAV)-murine factor viii vector partially corrects the hemophilia a phenotype. J Thromb Haemost. 1 (2), 220-226 (2003).
  32. Czekaj, P., et al. Optimization of methods for intrasplenic administration of human amniotic epithelial cells in order to perform safe and effective cell-based therapy for liver diseases. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1599-1617 (2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

AAV8NucleosteminRNA
הפלת גנים יעילה בכבד באמצעות הזרקה תוך-טחולית של RNA סיכת ראש קטנה המסופקת על ידי נגיף הקשור לאדנו Serotype 8 (AAV8)
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.