מאמר שיטה

רתימת כוחם של מטעני מיקרו-רנ"א בשלפוחיות חוץ-תאיות קטנות המשתחררות מחלקי מוח אנושיים קפואים טריים

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67379

⸱

8 בנובמבר 2024

 ,  ,  , 
1Translational Medicine Laboratory, Biomedical Research and Innovation Centre, University of Salford

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מקימים פרוטוקול המשתמש בכמויות מינימליות של מקטעי רקמת מוח קפואים טריים ושיטת צנטריפוגה נגישה במהירות גבוהה יחד עם כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל כדי להשיג שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות כמקורות לסמנים ביולוגיים של מיקרו-RNA (miRNA) להפרעות נוירולוגיות.

תקציר

שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) הן מתווכות חיוניות בתקשורת תא-תאי, ומעבירות מטענים מגוונים כמו חלבונים, שומנים וחומצות גרעין (microRNA, mRNA, DNA). למטען ה-microRNA sEV יש תועלת פוטנציאלית כסמן ביולוגי רב עוצמה לא פולשני למחלות בשל יכולתו של sEV לחצות מחסומים ביולוגיים (למשל, מחסום דם-מוח) ולהיות נגיש באמצעות נוזלי גוף שונים. למרות מחקרים רבים על סמנים ביולוגיים של sEV בנוזלי גוף, זיהוי תת-אוכלוסיות sEV ספציפיות לרקמות או לתאים נותר מאתגר, במיוחד מהמוח. המחקר שלנו מתמודד עם אתגר זה על ידי התאמת שיטות קיימות לבידוד sEVs מכמויות מינימליות של חלקי מוח אנושיים קפואים באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC).

לאחר אישור אתי, כ-250 מיקרוגרם של רקמת מוח אנושית קפואה טרייה (שהושגה מבנק המוח של מנצ'סטר [בריטניה]) נחתכה מ-3 רקמות התורם והודגרה בתמיסת קולגנאז מסוג 3/Hibernate-E, עם תסיסה ביניים, ואחריה צנטריפוגה סדרתית ושלבי סינון. לאחר מכן, sEVs בודדו בשיטת SEC ואופיינו על ידי ביצוע הנחיות MISEV. לפני בידוד RNA מתוך sEVs אלה, התמיסה טופלה ב-Proteinase-K ו-RNase-A כדי להסיר כל RNA חוץ-תאי שאינו sEV. כמות ואיכות ה-RNA נבדקו ועובדו עוד עבור qPCR וניסויי ריצוף RNA קטנים.

נוכחותם של sEVs אושרה באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים (fNTA) וכתם מערבי לסמני פני השטח (CD9, CD63, CD81). התפלגות הגודל (50-200 ננומטר) אושרה על ידי NTA ומיקרוסקופ אלקטרונים. ריכוז ה-RNA הכולל בתוך sEVs שעברו ליזה נע בין 3-9 ננוגרם/מיקרוליטר ושימש לכימות מוצלח על ידי qPCR עבור מיקרו-רנ"א מועמדים נבחרים. ריצוף RNA קטן ב-MiSeq סיפק נתונים באיכות גבוהה (Q >32) עם 1.4-5 מיליון קריאות לדגימה.

שיטה זו מאפשרת בידוד ואפיון יעיל של sEVs מנפח מינימלי של רקמת המוח, מקלה על מחקר סמנים ביולוגיים לא פולשני וטומנת בחובה הבטחה למחקרי סמנים ביולוגיים שוויוניים של מחלות, המציעים תובנות לגבי מחלות ניווניות והפרעות אחרות.

מבוא

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן אחד משחקני המפתח בתקשורת בין-תאית בכל האורגניזמים הרב-תאיים1. EVs הם חלקיקי ממברנה דו-שכבתית של שומנים שמקורם בתאים שיכולים להקל על העברת מגוון עומסי מטען, כגון חלבונים, ליפידים וחומצות גרעין, לתאים המקבלים. לרכבים חשמליים יכול להיות טווח גדלים רחב שנע בין 30 ננומטר ל-1 מיקרומטר. לרכבים חשמליים קטנים (sEVs), המוגדרים כשלפוחיות קשורות לליפידים עם גודל קוטר ממוצע של <200 ננומטר, יש את היכולת לחצות את מחסום הדם-מוח; לכן, הם היו מעורבים בהתפשטות דמוית פריון והחמרה של מחלות ניווניות ומצבים אחרים כגון מחלת אלצהיימר (AD), דמנציה פרונטו-טמפורלית (FTD), מחלת פרקינסון (PD) וסרטן 2,3. יתר על כן, מכיוון שניתן למצוא sEVs במגוון נוזלים ביולוגיים כגון דם, נוזל מוחי (CSF), רוק ואפילו שתן, השימוש המועיל בהם יכול להתפרש על פני תחום הסמנים הביולוגיים והאבחון הלא פולשני. לדוגמה, מחקר AD עשוי להצביע על שימוש ביחסי חלבון פתוגניים ביו-נוזליים, כגון tau/Aβ, או אפילו Aβ42/Aβ404.

מטען ידוע אחד של sEVs הוא microRNA (miRNA), קבוצה של מולקולות RNA קטנות שאינן מקודדות באורך של כ-22 נוקלאוטידים הנקשרות לאזורי 3'-UTR של mRNA ובדרך כלל מווסתות באופן שלילי את ביטוי החלבון. מעורבים בתפקידים תאיים רבים, miRNAs היו מעורבים גם בפתוגנזה של מחלות שונות, כולל סרטן ומחלות ניווניות. Cheng et al. ערכו ניתוח ריצוף בתפוקה גבוהה של חתימות ביטוי sEV miRNA שמקורן בסרום מחולי אלצהיימר5. לאחר שילוב עם רשומות הדמיה מוחית וגורמי סיכון ידועים של גיל, מין והצגת אלל APOE ε4, נמצא כי התוצאות מנבאות אלצהיימר עם רגישות של 87% וספציפיות של 77%. יתר על כן, מחקרים זיהו שני miRNAs CSF מווסתים (miR-151a-3p, let-7f-5p) ו-3 miRNAs מווסתים (miR-27a-3p, miR-125a-5p ו-miR-423-5p) שיכולים לאבחן PD6 בשלב מוקדם. במחלות פתולוגיות, המצב הפתולוגי עשוי להקדים תסמינים אופייניים מסוימים של מחלות, ואילו בניוון עצבי, הצטברות סימני היכר פתולוגיים מתרחשת הרבה יותר מוקדם מירידה קוגניטיבית.

מיקרו-רנ"א הם סמן ביולוגי יעיל יותר מחלבונים, בשל תפקידיהם המגוונים, וויסות אפיגנטי מסדר גבוה יותר. באמצעות רקמת מוח, חוקרים יכולים לזהות חתימות miRNA ספציפיות של sEV (BDsEV) שמקורן במוח עבור מחלות ותת-הסוגים שלהן. לדוגמה, sEVs עם סמני עצב וגליה יכולים להציג מטען miRNA שונה, והניתוח יכול לגרום לשיטות מדויקות יותר לזיהוי מחלות. יתר על כן, מוצע כי BDsEVs ממלאים תפקיד גדול בהתפשטות הטרנס-סינפטית של חלבונים נוירופתוגניים7. דיווחים קודמים הציעו אולטרה-צנטריפוגה של משקעים חיסוניים ושיפוע צפיפות (שיפוע סוכרוז) כדי להשיג sEVs מרקמת מוח קפואה טרייה 8,9. עם זאת, גישות אלו דורשות תשתית ספציפית עם אולטרה-צנטריפוגה ושיטות טיהור במורד הזרם כדי להשיג דגימות sEV באיכות גבוהה10. דיווחים עדכניים יותר הציעו מספר שינויים ושיפורים בגישה 11,12,13; עם זאת, למרות זאת, בידוד ומחקר של מיקרו-RNA שמקורו ב-sEV מרקמות אנושיות עדיין אינם מיושמים באופן נרחב. הגישה המתוארת בפרוטוקול זה נועדה לספק פרוטוקול מעודן צעד אחר צעד למחקר sEV שמקורו במוח כדי לשפר את הנגישות לטכניקה זו. הקמנו פרוטוקול המשתמש בכמויות מינימליות של רקמת מוח, שממנו בודדנו sEVs טהורים באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל ומציגים נתוני ריצוף באיכות גבוהה מהדור הבא ממטען המיקרו-RNA של ה-sEVs הללו.

פרוטוקול

העבודה אושרה מבחינה אתית על ידי בנק המוח של מנצ'סטר (הפניה ל-REC 09/H0906/52) ועל ידי ועדת האתיקה באוניברסיטת סלפורד (מזהה יישום: 3408).

1. פירוק מטריצה תוך-תאית באמצעות קולגנאז על קטעי רקמת מוח קפואים

  1. פורסים דק 250 מ"ג רקמת מוח קפואה (שברים בעובי של כ-0.4 מ"מ) בעזרת אזמל מעוקר על צלחת קרה ומוסיפים 2 מ"ל של תמיסת קולגנאז מסוג 75 U/mL מסוג III/Hibernate-E.
  2. דגרו כל דגימה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. בנקודת 5 הדקות, הפוך כל דגימה פעמיים לערבוב; בנקודת 10 הדקות, פיפטה כל דגימה שלוש פעמים בעדינות באמצעות פס חד פעמי מפלסטיק בנפח 10 מ"ל.
  3. מניחים כל דגימה על קרח ומוסיפים קוקטייל מעכב פרוטאז אחד ומעכב פוספטאז אחד. זה עוצר את תגובת האנזים ומהווה את נקודת הקצה של העיכול באמצעות קולגנאז מסוג III.
  4. צנטריפוגה כל דגימת רקמת מוח ב-300x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. יש לאסוף כל סופרנטנט וצנטריפוגה נוספת בטמפרטורה של 2000 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  5. אספו שוב כל סופרנטנט וסננו דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. צנטריפוגה כל סינון ב-10,000 x גרם למשך 48 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  6. אספו את הסופרנטנט והוסיפו מאגר משקעים ביחס של 2:1 לכל דגימה. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  7. צנטריפוגה כל דגימה ב-10,000 x גרם למשך 96 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ותשעה מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של PBS ללא שלפוחית חוץ-תאית (EV).

2. הכנת עמודות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל

  1. לפני השימוש, יש לאזן את עמודת ה-SEC שהוכנה מראש בטמפרטורת החדר (RT) למשך 15 דקות.
    הערה: יש להסיר את המכסה התחתון לפני מכסה הבורג.
  2. לאחר שיווי המשקל, הסר את המאגר המשמר מהחלק העליון של העמודה ושטוף את העמודה פעמיים באמצעות 250 מיקרוליטר של PBS נטול EV. כל שטיפת PBS נותרת להיכנס לעמודה דרך כוח הכבידה.

3. בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל

  1. הוסף את הגלולה המושעה לחלק העליון של עמודת ה-SEC וצנטריפוגה את העמודה ב-50 x g למשך 30 שניות. השליכו את הזרימה.
  2. הוסף 180 μL של PBS נטול-EV לחלק העליון של עמודת ה-SEC וצנטריפוגה של העמודה ב-50 x g למשך דקה אחת, מה שמאפשר ל-sEVs שמקורם במוח להיפלט מהעמודה.
    הערה: החלק של הפרוטוקול המפורט לעיל מסוכם באיור 1.

4. אישור סמני שלפוחית חוץ-תאיים קטנים על ידי כתמים מערביים

  1. כדי ליז sEVs לפני ניתוח כתמים מערביים (כדי להבטיח שכל מטעני הממברנה והציטוזוליים מנותחים), יש לדלל דגימת sEV מבודדת 1:1 במאגר ליזה ומיצוי (מעכב פרוטאז 1x ומעכב פוספטאז 1x).
  2. מערבבים את הדגימה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. דגימת צנטריפוגה ב 14 000 x גרם למשך 15 דקות.
  4. אסוף את חומר החלבון ומדוד את ריכוזי החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון.
  5. מערבבים דגימות עם 4x Laemmli buffer ומעמיסים 20 מיקרוגרם חלבון לכל באר כנגד סולם חלבון צבוע מראש.
  6. לאחר הפתרון, העבירו את החלבונים לקרום ניטרוצלולוזה של 0.45 מיקרומטר. לאחר ההעברה, חסום את הממברנה למשך שעתיים ב-5% BSA.
  7. דגרו על הממברנות עם נוגדנים ראשוניים (טבלה 1) למשך הלילה.
  8. שטפו את הממברנה שלוש פעמים עם מאגר כביסה (1% Tween20 ב-PBS) וצבעו באמצעות נוגדן משני נגד עכבר. לאחר מכן, יש לשטוף שלוש פעמים עם מאגר כביסה (1% Tween20 ב-PBS).
  9. בצע את השלבים לעיל בכתב היד לפני הדמיית הכתמים.
  10. תמונה באמצעות מצע פרוקסידאז חזרת (HRP).

5. אישור שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות על ידי ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA)

  1. לבצע NTA כדי לנתח את הריכוז והגודל של כל החלקיקים בדגימה. בצע זאת על ידי דילול כל דגימה ב-PBS במקדם דילול של 1:1000.
  2. הזרקו את הדגימה למכשיר ה-NTA וקראו את הדגימה באורך גל של 550 ננומטר. בשלב זה, השתמש בכמות החלקיקים כדי למדוד את כמות החלבון לחלקיק (המתבטאת בדרך כלל בפמטוגרמה) כפי שהומלץ בהנחיות MISEV.
  3. לאחר מכן, עבור NTA פלואורסצנטי, יש לדלל את מסכת התא בכתום (CMO) (מכתים את כל החלקיקים הביולוגיים בתוך דגימה) ב-PBS במקדם דילול של 1:1000. מכאן, יש לדלל את צבע ה-CMO באמצעות דגימת sEV במקדם דילול של 1:10 - דגרו את שלב הדילול הזה בחושך למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  4. לדלל את דילול ה-CMO השני באמצעות PBS במקדם דילול של 1:1000.
    הערה: הדילול הסופי של צבע CMO חייב להיות 1:10 000 000.
  5. קרא את ה-CMO של כל דגימת sEV באורך גל של 550 ננומטר באמצעות מכשיר ה-NTA.
  6. עבור הנוגדנים הפלואורסצנטיים של טטרספנין (ראה טבלת חומרים), ראשית, יש לדלל כל נוגדן בהתאמה ב-PBS במקדם דילול של 1:10. מכאן, יש לדלל כל אחד מהצבעים באמצעות דגימת sEV במקדם דילול של 1:10 - לדגור את שלב הדילול בחושך למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס.
  7. לדלל את דילול הנוגדנים השני באמצעות PBS במקדם דילול של 1:1000.
    הערה: הדילול הסופי של כל נוגדן טטרספנין חייב להיות 1:100,000.
  8. קרא את קריאות הנוגדנים הפלואורסצנטיים של דגימת ה-sEV באורך גל של 550 ננומטר באמצעות מכשיר ה-NTA.

6. אישור שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)

הערה: פרוטוקול זה בוצע על ידי מתקן המיקרוסקופיה הביו-רפואית באוניברסיטת ליברפול.

  1. ראשית, תקן דגימות sEV באמצעות גלוטרלדהיד וצבוע באמצעות אורניל אצטט.
  2. באמצעות סדרה מדורגת של אלכוהולים, יש לייבש את הדגימה מוכנה ל-TEM.
  3. דגימות תמונה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה מתאים.

7. טיפול בפרוטאינאז K ו-RNase A

  1. ל-50 מיקרוליטר של מוח מבודד מפיקים EVs, הוסף 1 מיקרוליטר של 20 מיקרוגרם/מיקרוליטר פרוטאינאז K ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  2. עצור כל תגובה על ידי הוספת קוקטייל מעכב חלבון 1x ודגירה על קרח למשך 10 דקות.
  3. לאחר הדגירה, הוסף 1 מיקרוליטר של 10 מיקרוגרם/מיקרוליטר RNase A לכל דגימה ודגירה נוספת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    הערה: עבור מיד לסעיף 8.

8. בידוד RNA מוחלט משלפוחיות חוץ-תאיות קטנות

  1. כדי לבודד את ה-RNA הכולל, הוסף 700 מיקרוליטר של ריאגנט ליזה לשחזור RNA באיכות גבוהה ל-50 מיקרוליטר של דגימת EV שמקורה במוח (BDsEV). מערבבים כל דגימה למשך שעה.
  2. מוסיפים 140 מיקרוליטר כלורופורם, מנערים כל דגימה במרץ במשך 20 שניות, ומניחים לדגור ב-RT למשך 3 דקות.
  3. צנטריפוגה את הדגימה ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ואספו את האינטרפאזה מהדגימה. הוסף פי 1.5 נפח של 100% אתנול.
  4. הוסף 700 מיקרוליטר של עמודות בידוד RNA של תערובת בין-פאזית/אתנול וצנטריפוגה ב-≥8000 x g למשך 15 שניות ב-RT.
    הערה: חזור על שלב זה באמצעות כל דגימות הבין-פאזי/אתנול.
  5. לעמודה, הוסף 700 מיקרוליטר של מאגר כביסה וצנטריפוגה ב-≥8000 x גרם למשך 15 שניות. השליכו את הזרימה.
  6. הוסף 500 מיקרוליטר של RPE מאגר ושוב צנטריפוגה ב-≥8000 x g למשך 15 שניות. השליכו את הזרימה.
  7. הוסף 500 מיקרוליטר של 80% אתנול וצנטריפוגה ב-≥8000 x גרם למשך 2 דקות. השליכו את הזרימה.
  8. בשלב זה, יבש את קרום העמוד על ידי צנטריפוגה של העמודים במהירות מלאה (>8000 x גרם) למשך 5 דקות כשהמכסה פתוח.
  9. העבירו את העמודה לצינור איסוף חדש, הוסיפו 14 מיקרוליטר מים נטולי RNase ישירות לקרום העמוד, וצנטריפוגה ב-≥8000 x g למשך דקה אחת כדי לסלק את סך ה-RNA מ-BDsEVs.
  10. כמת את סך המיקרו-RNA עם דגימות באמצעות ערכת בדיקת כימות miRNA, שבה נמדדו דגימות על פלואורומטר כמות, ובחר את סוג בדיקת ה-miRNA.

9. ריצוף RNA קטן

  1. לאחר כימות ה-miRNA בתוך הדגימה, סנתז ספריית cDNA באמצעות ערכת ההכנה של ספריית RNA-Seq קטנה.
    הערה: באמצעות פרוטוקול זה, יצירת הספרייה כללה ארבעה שלבים: קשירת מתאם 3', טיהור, קשירת מתאם 5' ושעתוק הפוך - כאשר, בסופו של דבר, נוצרת ספריית RNA/cDNA. לאחר יצירת הספרייה, הגברת PCR של נקודת קצה מתרחשת עם הוספת פריימרים לאינדקס (המשמשים למטרות ריבוב), ולאחר מכן מטוהרים הדגימות.
  2. כדי לבדוק את איכות ה-RNA, השתמש בבדיקת יישום בקרת איכות המפרטת את הגודל של כל תכשיר ואת עוצמת השיא.
  3. כדי לבדוק את ריכוז ה-DNA, מדוד את כימות ה-DNA על פלואורומטר כמות, ובחר את סוג בדיקת dsDNA.
  4. הכן את הדגימות ל-RNA Seq קטן באמצעות ערכת הריאגנטים, ולאחר מכן הדגימות נטענות לתא הזרימה.

תוצאות

כדי לאשר את נוכחותם של BDsEVs, נעשה שימוש בשלוש טכניקות: כתמים מערביים, NTA ו-TEM (איור 3). תוצאות הכתם המערבי (איור 3A וקובץ משלים 1) מראות את נוכחותם של כל חמשת הסמנים החיוביים (CD9, CD63, CD81, Flot-1 ו-TSG101) והיעדר קלנקסין ב-sEVs (המשמש כבקרה שלילית), מה שמאשר שאין זיהום בתוכן הסלולרי. כצפוי, ההומוגנטים של המוח (BH) מראים יותר חלבון ממה שנצפה ב-sEVs עבור הסמנים שנבדקו. תמונות TEM אישרו את המורפולוגיה של BDsEVs ואת גודלם היחסי בתוך הדגימה (איור 3B), מה שאושר עוד יותר על ידי ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (איור 3C).

איור 3C (פאנל עליון) מציג את גדלי החלקיקים המבודדים הנופלים בין 50-200 ננומטר. מנתוני NTA, שלוקחים את תוצאת הפיזור כ-100% מהחלקיקים המיוצגים, CMO מייצג כ-52.35% מהחלקיקים (איור 3C, פאנל תחתון) שיש להם שכבת שומנים. מבין החלקיקים המוכתמים ב-CMO, 34.66% הכילו CD9, 15.49% הכילו CD63 ו-12.01% הכילו CD81. עיין בקובץ משלים 2 לנתוני בקרת NTA.

נתוני כימות של RNA מבודד (טבלה 2) מראים רמות הנעות בין 3.24-8.76 (ng/μL), ערכים שנורמלו בעת יצירת ספריות ה-cDNA. תוצאות הבדיקה של TapeStation (איור 4) מראות שיאים עיקריים של כ-120-160 נקודות בסיס, עם שיאים קטנים יותר מתחת לזה של כ-50 נקודות בסיס ושיאים קטנים יותר הגבוהים בסביבות 484 נקודות בסיס.

בדיקות איכות עבור נתוני ריצוף הדור הבא מציגות קריאות באיכות גבוהה ביותר לאחר חיתוך המתאם (איור 5A). כל מיקומי הרצף מציגים ציון Phred של >30, המציין שיעורי שגיאה של פחות מ-1 ל-1000 נוקלאוטידים. איור 5B מראה שהרצפים הרבים ביותר הם בסביבות 21-22 bp, התואמים את טווח הגודל הצפוי עבור מיקרו-רנ"א. באמצעות מיפוי נוסף במורד הזרם (באמצעות BowTie2), באמצעות הכלי הביולוגי לניתוח דגל הדגל של Samtools, מתוך 1,304,100 רצפים מיושרים, 1,116,264 (85%) מופו לאזורי המיקרו-רנ"א בגנום האנושי (build hg38; טבלה 3).

מתוך סך כל ה-miRNAs, 808 miRNAs באו לידי ביטוי בכל 3 הדגימות, כאשר 344 miRNAs חולקו בין כל שלוש הדגימות (~43%), 5 חולקו בין בקרה 1 לבקרה 2, 183 חולקו בין בקרה 1 לבקרה 3, ו-16 חולקו בין בקרה 2 לבקרה 3 (איור 6). מנתונים אלה, ה-miRNA המבוטא הגבוה ביותר בכל שלושת ה-BDsEVs הם has-let-7b-5p, has-miR-143-3p, has-miR-30a-5p, has-miR-221-3p ו-has-let7i-5p. באותה מידה, חמשת ה-miRNA הכי פחות דיפרנציאלי בדגימות BDsEVs (קורא >10) הם has-miR-128-2-5p, has-miR-182-5p, has-miR-193b-5p, has-miR-448 ו-has-miR-505-3p. כל ספירת הקריאה הגולמית והנורמלית ניתנת בקובץ משלים 3.

figure-results-1
איור 1: זרימת עבודה של עיבוד רקמות. האיור מציג את התהליך ההדרגתי לבידוד של sEVs שמקורם במוח (BDsEVs) מחלקי מוח קפואים טריים באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: זרימת עבודה של בידוד RNA מ-BDsEVs. האיור מציג את התהליך ההדרגתי של בידוד ה-RNA הכולל מה-BDsEVs, כולל שלב הטיפול המקדים של הסרת כל RNA חוץ-תאי באמצעות פרוטאינאז K ו-RNase A. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: זרימת עבודה של אפיון BDsEV. האיור מציג שיטות שונות לאפיון ה-BDsEVs. (A) כתם מערבי לזיהוי סמני חלבון ספציפיים ל-sEV. BH מוח הומוגני. Calnexin הוא בקרה שלילית עבור sEVs - היעדר ב-sEV ונוכחות ב-BH מאשרים את טוהר דגימת ה-sEV. עבור סמנים אחרים, כצפוי, כמות החלבון גבוהה יותר ב-BH מאשר בדגימות sEV (20 מיקרוגרם חלבון טעון לבאר). (B) תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור מייצג (TEM) עבור BDsEVs בקנה מידה של 200 מיקרומטר, המאשרת את המורפולוגיה הצפויה עם ממברנה דו-שכבתית של שומנים. (C) תרשים התפלגות גודל לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) עבור כל החלקיקים (פאנל עליון). כל נקודת נתונים מייצגת את השונות על פני שלושה שכפולים. פרופורציות מנורמלות עבור חלקיקים ביולוגיים (sEVs) ופרופורציות יחסיות עבור סמני משטח ספציפיים (פאנל תחתון) (הנתונים מוצגים כממוצע ±-SEM של בארות משולשות (n = 3)). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: בדיקת איכות עבור הכנת ספריית cDNA. ניתוח תחנת טייפ לדגימות בודדות לאחר הכנת ספריית cDNA הפסגות המוצגות בכל גרף מציגות את הגודל של כל תכשיר (ציר אופקי, ב-bp) ואת העוצמה המתאימה של כל שיא (ציר אנכי, FU). ספריית ה-RNA הקטנה הצפויה מגיעה לשיא בסביבות 120-160 bp, כפי שניתן לראות באיור. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: בדיקת איכות עבור ריצוף miRnome. (A) תרשים FASTQC לאיכות קריאה עבור הדגימות הבודדות לאחר חיתוך המתאם. הציר האופקי מיועד למיקום נוקלאוטידים, והציר האנכי מיועד לציוני פרד. תרשימי קופסאות עבור כל עמדה מציגים את התפלגות ציון פרד על פני כל הקריאות עבור כל עמדה. כל ההתפלגויות בתוך האזור הירוק מאשרות נתונים באיכות גבוהה מאוד (>Q30) המרמזים על הכנת דגימות באיכות גבוהה. (B) התפלגות אורך הרצף עבור כל דגימה מראה שעבור כל שלוש הדגימות, רוב הקריאות היו סביב 21-22 נוקלאוטידים - טווח הגודל הצפוי עבור מיקרו-רנ"א. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: חפיפה של ביטוי MicroRNA על פני כל הדגימות. מספר ה-miRNAs שזוהו מכל דגימה (ספירת קריאה ≥-10) ומיקרו-רנ"א ספציפיים המשותפים ביותר מדגימה אחת מוצגים בדיאגרמת ון. כל הקריאות הגולמיות והמנורמלות מוצגות בקובץ משלים 3. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

נוגדן אפיטופגורם דילול של נוגדן 
עכבר נגד CD91:2000
עכבר נגד CD631:2000
עכבר נגד CD811:2000
עכבר נגד משט 11:2000
עכבר Anti-TSG1011:1000
עכבר נגד קלנקסין1:10 000
נוגדן משני נגד עכבר1:3000

טבלה 1: אפיטופים של נוגדנים המשמשים לאפיון BDsEVs וגורמי הדילול שלהם.

לדוגמהריכוז miRNA (ng/μL)
18.76
23.24
35.33

טבלה 2: נתוני כימות של RNA מבודד.

לדוגמהרצפים מיושריםmiRNA ממופהאחוז (%)
דוגמת בקרה 11 444 6651 133 43778.46
דוגמת בקרה 2442 808381 63186.18
דוגמת בקרה 32 024 8281 983 72697.97
ממוצע1 304 100.331 166 264.6789.43

טבלה 3: כמות רצפי miRNA מיושרים וממופים בהצלחה.

קובץ משלים 1: נתוני ניתוח כתמים מערביים משלימים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 2: נתוני בקרה משלימים של נת"ע. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 3: ספירת קריאה גולמית ומנורמלת של ניתוח ביטוי miRNA. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 4: נתוני ריכוז חלבון משלים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

פרוטוקול שונה ומשופר זה לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן במוח ומטען המיקרו-RNA שלהן מדגים את ההיתכנות של שימוש ברקמה מינימלית מבלי לפגוע באיכות ובכמות המוצרים במורד הזרם. בתחום גילוי הסמנים הביולוגיים, זיהוי מזהים מולקולריים ספציפיים לסוגי תאים ורקמות יכול להוביל לאמצעים נגישים יותר של בדיקות אבחון לא פולשניות באמצעות נוזלי גוף. יתר על כן, הגישה המתוארת כאן מספקת את המסגרת לזיהוי תת-אוכלוסיות sEV ספציפיות בתוך סוגי תאים שונים (עצביים לעומת גליה), סוגי רקמות (רקמת היפוקמפוס לעומת רקמת קליפת המוח הקדם-מצחית) ונוזלים ביולוגיים - מה שיציע הבנה טובה יותר של חתימות העמסת מטען, פתופיזיולוגיה והיקף המחלה. כפי שתואר בעבר ב-Vella et al., הוצע להשתמש ב-450 מ"ג עד 1 גרם לבידוד BDsEV, יחד עם אולטרה-צנטריפוגה בשיפוע צפיפות (תוך שימוש במהירויות של עד 180,000 x גרם)8. במתודולוגיה זו, sEVs בודדו בהצלחה באמצעות כמויות נמוכות יותר (>50% הפחתה) של דגימות רקמת מוח קפואות טריות (250-450 מ"ג). הפחתת כמות רקמת המוח המשמשת לבידוד sEVs מובילה להפחתת עלויות וחומרים מתכלים. באותה מידה, הפרוטוקול הפך לנגיש יותר באמצעות יישום SEC בשילוב עם צנטריפוגה במהירות גבוהה (10,000 x g) במקום אולטרה-צנטריפוגה (180,000 x g).

באמצעות fNTA ו-TEM, קבענו שפרופיל טווח הגודל של ה-sEVs נופל בטווח הגודל האופייני של 30-200 ננומטר, כפי שהומלץ על ידי הנחיות MISEV13,14, כאשר TEM מספק אישור מורפולוגי של ה-sEVs שהתקבלו. כפי שמוצג באיור 3C ובקובץ משלים 4, >87% מהחלקיקים הם בטווח גודל של <250 ננומטר, והדגימות, בממוצע, מראות 10.56 fg חלבון/BDsEV. מינים ספציפיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות משתנים בגודלם ובצורתם, כאשר תת-אוכלוסיות קטנות יותר באופן אופייני, כגון אקסוזומים, נצפות כבעלות מורפולוגיה אחידה בהשוואה למיקרו-שלפוחיות שנאמר שיש להן מבנה לא סדיר בשל אופי הביוגנזהשלהן 15. עבור ה-fNTA, הופקה קריאת פיזור (520 ננומטר) כדי לנתח את סך החלקיקים בדגימות, תוך מתן פרטים על פרופיל הגודל והריכוזים. הקריאות מראות כי למעלה מ-50% מהחלקיקים היו ביולוגיים (באמצעות צביעה של CMO), כאשר אוכלוסיות של חלקיקים ביולוגיים הנכללים בטווח הגודל של sEVs מציגות סמני טטרספנין, כאשר CD9 הוא הדומיננטי ביותר בדגימות הביקורת שלנו (34.66%). בעוד שעבור Western Blotting, נוכחותם של מטעני ממברנה וחלבון ציטוזולי אופייניים סיפקה עדות לנוכחות sEV, כאשר היעדר Calnexin אישר כי BDsEVs נקיים מכל זיהום תאי. כדי להבטיח עוד יותר שה-miRNA הזמין לעיבוד במורד הזרם היה חלק ממטען sEV (ולא RNA חוץ-תאי אחר), טיפלנו ב-sEVs עם אנזימי Proteinase K ו-RNase A לפני ששיבשנו את ממברנות ה-sEV כדי לפרק כל חלבון ו-RNA שהיו נוכחים חיצונית בחלל החוץ-תאי מחוץ ל-BDsEVs16.

סך ה-RNA חולץ מה-sEVs והוכן ליישומים במורד הזרם כגון qRT-PCR וריצוף הדור הבא (עבור RNA קטן). בדיקות סטנדרטיות באמצעות מבחני בקרת איכות הראו דגימות באיכות גבוהה וספריות cDNA מוכנות לריצוף. ספריות ה-cDNA מגיעות לשיא בסביבות 120-160 bp, המיוחסות לפסגות cDNA שמקורן ב-miRNA עם רצפי מתאמים באורכים משתנים, כאשר כל פסגות קטנות יותר מייצגות דימרים מתאמים.

ניתוח נתוני הריצוף של הדור הבא באמצעות FASTQC ו-CutAdapt מראה תוצאות באיכות גבוהה המתקבלות מ-BDsEV miRNAs. כפי שמוצג באיור 5, לכל מיקום שנקרא יש ציון Q גבוה מ-30 (Q30), המראה הסתברות שגיאה של 0.001-0.0001 (1 ל-1000-10,000). יתר על כן, ניתוח התפלגות אורך הרצף (איור 6) מראה שיאים דומיננטיים הנופלים בטווח האופייני של miRNA (19-25 bp), מה שמרמז על איכות גבוהה וספציפיות לנתונים שהתקבלו.

מחקרים עתידיים רבים ייהנו משיטה זו בשל הנגישות המשופרת שלה, לצד חיסכון בעלויות ומשאבים באמצעות הפחתת לא רק כמות דגימות הרקמה, אלא גם חיסכון בעלות הריאגנטים. ההפחתה (>50%) בכמות הרקמה הנדרשת הופכת את השיטה הזו גם לאתית יותר. בהתאם למאמצים הגלובליים בבריאות מדויקת, זרימת העבודה המשופרת המפורטת כאן מספקת כלים זולים יותר יחסית ליציאה לסמנים ביולוגיים מדויקים ספציפיים לסוג התא באמצעות מסלולים לא פולשניים (או זעיר פולשניים) באמצעות BDsEVs והמטען שלהם. זה יכול לשמש למגוון רחב של מצבים נוירולוגיים. מגבלה אפשרית של שיטה זו היא שהפרוטוקול יזדקק להתאמה אם חוקרים ירצו להשתמש ברקמה שאינה המוח האנושי לבידוד sEV. בטווח הארוך, שיטה משופרת זו תהפוך את הגילוי והאימות של סמנים ביולוגיים לא פולשניים ספציפיים לרקמות לשוויוניים ונגישים יותר ברחבי העולם.

גילויים

אין ניגודי אינטרסים לאף אחד מהכותבים.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי מלגת הדוקטורט של ג'וזף מורגן מאגודת האלצהיימר בבריטניה (מענק מספר 549/SERA-52) ועל ידי קרנות אסטרטגיית החדשנות של אוניברסיטת סלפורד (מענק SEFA-39). רקמת המוח התקבלה מבנק המוח של מנצ'סטר (REC Reference 09/H0906/52) של רשת המוח לדמנציה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סרום בקר אלבומיןMerckA9418-100G
מסכת תאים כתם קרום פלזמה כתוםThermoFisher ScientificC10045
קולגנאז Type-IIIStemCell Technologies07422
ExoSpin עמודיםומערכות הנחיית תאי חיץ בע"מEX01-50ערכה זו מכילה עמודות SEC המשמשות בניסוי זה, מאגר משקעים ו-PBS נטול EV.
קוקטייל מעכב פרוטאז עצור (100x)ThermoFisher Scientific78429
Hibernate-E MediumThermoFisher ScientificA1247601
Laemmli Sample Buffer (4x)BioRad1610747
Lexogen ערכת הכנה לספריית RNA-Seq קטנהLexogen052.24ערכה זו מכילה קופסת ריאגנטים להכנת RNA קטנה עם לוחית פריימר i7 Index. 
miRNeasy Micro Kit (50)Qiagen217084ערכה זו מכילה ריאגנט ליזה לשחזור RNA באיכות גבוהה (Qiazol), עמודות בידוד RNA, חוצצי בידוד (RWT, RPE) ומים נטולי RNase.
ערכת ריאגנטים של MiSeq v3IlluminaMS-102-3001זוהי ערכת ההכנה של Illumina
ממברנת ניטרוצלולוזה, 0.45 μ mThermoFisher Scientific88018
PE/Dazzle 594 אנטי-אנושי CD63 נוגדןBioLegend143914משמש לניתוח fNTA
PE/Dazzle 594 אנטי-אנושי CD81 נוגדןBioLegend349520משמש לניתוח fNTA
PE/Dazzle 594 אנטי-אנושי CD9 נוגדןBioLegend312118משמש לניתוח fNTA
PhosSTOPMerck
ערכת בדיקת חלבון 4906845001 פירס BCAThermoFisher Scientific23225
Proteinase KThermoFisher Scientific25530049
ערכת בדיקת מיקרו-RNA של קיוביטThermoFisher ScientificQ32880
קיוביט 1X dsDNA ערכת בדיקהThermoFisher ScientificQ33230
קיוביט 3.0 פלואורומטרThermoFisher ScientificQ33216
RIPA מאגר ליזה ומיצויThermoFisher Scientific89901
RNase AThermoFisher ScientificEN0531
SuperSignal West Femto מצע רגישות מקסימליתThermoFisher Scientific34094

מקורות

  1. Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
  2. Fornari, S., Schäfer, A., Jucker, M., Goriely, A., Kuhl, E. Prion-like spreading of Alzheimer's disease within the brain's connectome. J R Soc Interface. 16 (159), 20190356(2019).
  3. Zhang, P., et al. Tumor-derived small extracellular vesicles in cancer invasion and metastasis: molecular mechanisms, and clinical significance. Mol Cancer. 23 (1), 18(2024).
  4. Constantinides, V., et al. CSF Aβ42 and Aβ42/ Aβ40 ratio in Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Diagnostics. 13 (4), 783(2023).
  5. Cheng, L., et al. Prognostic serum miRNA biomarkers associated with Alzheimer's disease shows concordance with neuropsychological and neuroimaging assessment. Mol Psychiatry. 20 (10), 1188-1196 (2015).
  6. Roser, A. E., Caldi Gomes, L., Schünemann, J., Maass, F., Lingor, P. Circulating miRNAs as diagnostic biomarkers for Parkinson's disease. Front Neurosci. 12, 625(2018).
  7. Jackson, N., Guerrero-Muñoz, M. J., Castillo-Carranza, D. L. The prion-like transmission of tau oligomers via exosomes. Front Aging Neurosci. 14, 974414(2022).
  8. Vella, L., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).
  9. Yousif, G., Qadri, S., Parray, A., Akhthar, N., Shuaib, A., Haik, Y. Exosomes derived neuronal markers: Immunoaffinity isolation and characterization. Neuromolecular Med. 24 (3), 339-351 (2022).
  10. Kumar, K., et al. Recent advances in microfluidic approaches for the isolation and detection of exosomes. TRAC-Trend Anal Chem. 159, 116912(2023).
  11. Ransom, L., et al. Human brain small extracellular vesicles contain selectively packaged, full-length mRNA. Cell Rep. 43 (4), 114061(2024).
  12. Gomes, P., et al. A novel isolation method for spontaneously released extracellular vesicles from brain tissue and its implication for stress-driven brain pathology. Cell Commun Signal. 21 (1), 35(2023).
  13. Welsh, J., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV 2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2023).
  14. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  15. Pirisinu, M. The long journey of extracellular vesicles towards global scientific acclamation. Adv Pharm Bull. 13 (3), 489-501 (2023).
  16. Bender, A., Sullivan, B. P., Lillis, L., Posner, J. D. Enzymatic and chemical-based methods to inactivate endogenous blood ribonucleases for nucleic acid diagnostics. J Mol Diagn. 22 (8), 1030-1040 (2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

סממנים ביולוגיים של microRNAsEVs מרקמת מוחכרומטוגרפיית הדרכה על בסיס גודל (Size Exclusion Chromatography)ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקיםWestern Blotמעקב נוגדנים פלואורסצנטיCD9 CD63 CD81רצף RNAגילוי סממנים ביולוגיים למחלה
רתימת כוחם של מטעני מיקרו-רנ"א בשלפוחיות חוץ-תאיות קטנות המשתחררות מחלקי מוח אנושיים קפואים טריים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.