מאמר שיטה

חקירת התמיינות תאי T CD4 של עכברים באמצעות אבלציה גנטית בתיווך קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין CRISPR-Cas9

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67380

⸱

20 ביוני 2025

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים גישה מסתגלת מאוד לשימוש באבלציה גנטית בתיווך קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין CRISPR-Cas9 בתאי CD4 T נאיביים של עכברים כדי לחקור את תפקוד הגנים בהתמיינות תאי CD4 T.

תקציר

הנגישות הנרחבת של טכנולוגיית CRISPR-Cas9 הפכה את מיקוד הגנים בתאים ראשוניים לשיטה שגרתית להערכת תפקוד הגנים בתאי T. בהתחשב בעלות ובזמינות המוגבלת של זני עכברים נוקאאוט (KO), בדיקת השערות ראשוניות הכוללות תפקוד גנים בתאי T יכולה להיות מונעת שימוש במודלים של בעלי חיים ממוקדי גנים. עם זאת, באמצעות משאבים זמינים מסחרית, כולל RNA מנחה (gRNAs) שתוכננו מראש, חוקרים יכולים ליצור בנוחות תאי T נאיביים ממוקדי גנים שניתן להשתמש בהם למחקרי הפעלה והתמיינות של תאי T.

כאן אנו מתארים פרוטוקול לשימוש בקומפלקסים ריבונוקלאופרוטאין CRISPR-Cas9 (RNPs) המועברים על ידי נוקלאופקציה כדי ליצור ביעילות תאי CD4 T נאיביים של עכברי KO שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את תפקוד הגנים בהתמיינות תאי CD4 T, במבחנה. בידוד של תאי CD4 T נאיביים מאיברי לימפה משניים של עכבר, ואחריו נוקלאופקציה עם קומפלקסים Cas9-gRNA מבטיח שהגן KO מתחיל לפני הפעלת תאי T במורד הזרם, ומציע יתרון אסטרטגי על פני אספקת gRNA בתיווך רטרו-ויראלי, הדורש בדרך כלל הפעלה מוקדמת של תאי T, ומונע הערכת השפעות בתאי T נאיביים. יתר על כן, שיטה מבוססת נוקלאופקציה זו עוקפת בעיות התפתחותיות פוטנציאליות הקשורות לבעלי חיים בגן KO.

לאחר אספקת Cas9-gRNA, אנו מתארים פרוטוקולים לחקר התמיינות תאי CD4 T לשושלות Th1, Th2, Th17 ו-Treg באמצעות קיטוב במבחנה . בנוסף, פרוטוקול זה ניתן להתאמה לשימוש בתאי CD4 או CD8 T ממוקדי גנים עבור יישומים רבים במורד הזרם, כולל מחקרי הפעלת תאי T אחרים במבחנה ומחקרי העברה מאמצת in vivo. השימוש בשיטות CRISPR-Cas9 ייעל את יכולתנו להעריך את תפקוד הגנים בתאי T ומאפשר KO שגרתי של גנים רבים מעניינים, ושחרר חוקרים ממגבלות הקשורות לחקר חיות KO גנטיות.

מבוא

השימוש בטכנולוגיות מבוססות CRISPR שינה את יכולתנו לתפעל רצפי DNA גנומיים, ושיפר מאוד את יכולתנו לחקור את תפקוד הגנים באינספור מערכות ביולוגיות. ביחס לתאי CD4 T, הופיעו שיטות המשתמשות בקומפלקסים של ריבונוקלאופרוטאין (RNP) CRISPR-Cas9, המאפשרות נוק-אאוט יעיל של גנים (KO) בתאי T נאיביים ראשוניים שניתן להשתמש בהם למחקרי מבחנה ו-in vivo 1,2,3,4. זיהוי גנים משוערים חדשים המווסתים את התמיינות תאי CD4 T מונע לעתים קרובות על ידי ניתוחים טרנסקריפטומיים ואפיגנומיים, ויוצר מטרות חדשות שעבורן יכולים להיות מעט משאבים או קשים להשגה לחקירה, במיוחד אם הגן משפיע על רקמות מרובות ועשוי לדרוש הערכה באמצעות עכברים ממוקדי גנים מותנים. מיקוד גנים באמצעות התמרה רטרו-ויראלית של gRNAs 5,6 שימש להערכת תפקוד הגנים בתאי T, אך דורש הפעלת תאי T לזיהום רטרו-ויראלי, ולא ניתן להשתמש בו כדי למקד גנים בתאי T נאיביים. CRISPR-Cas9 המסופק על ידי נוקלאופקציה בתאי T נאיביים מציע כלי חלופי זול ומהיר יחסית לאימות וחקירה של גנים חדשים מעניינים לפני השקעה במודלים של עכברים גוזלי זמן ויקרים.

בפרוטוקול שלנו המתואר כאן, עריכת גנים בתיווך CRISPR-Cas9 מתבצעת באמצעות חלבון Cas9 רקומביננטי המורכב עם מולקולות RNA מנחה (gRNA) המועברות לתאי CD4 T נאיביים באמצעות נוקלופקציה. ה-gRNA מורכב משני רכיבים נפרדים, RNA CRISPR מפעיל טרנס-מפעיל (tracrRNA) ו-CRISPR RNA (crRNA). מבחינה פונקציונלית, רצפים שמקורם ב-tracrRNA מקלים על שיוך ה-gRNA עם Cas9, בעוד שרצפי ה-crRNA מכילים ספציפיות לאזורי ה-DNA המעניינים. קומפלקסים של Cas9-gRNA מתווכים שבירות DNA דו-גדילי ממוקדות (dsDNA), כאשר gRNAs מתווכים את ספציפיות הרצף של פעילות אנדונוקלאז Cas9 7,8. המחשוף בתיווך Cas9 של dsDNA מוביל להשבתת גנים, באמצעות יצירת מוטציות אינדל בעקבות הצטרפות קצה לא הומולוגית בתאי מטרה9. בפרוטוקול זה, אנו ממליצים להשתמש במספר gRNAs המכוונים לגנים מעניינים כדי להבטיח KO חזק בתאי CD4 T נאיביים.

תאי CD4 T מסייעים הם שחקני מפתח במערכת החיסון, והם מנחים את התגובות החיסוניות באמצעות ייצור של מגוון ציטוקינים המווסתים את התפקוד של סוגים רבים של תאי חיסון. עם גירוי דרך קולטן תאי T (TCR) בנוכחות ציטוקינים ספציפיים, תאי CD4 T נאיביים יכולים להתמיין לשושלות נפרדות של תאי T מסייעי T (Th) CD4, כולל Th1, Th2, Th17 ותאי T רגולטוריים (Treg)10,11,12. הגדרת שושלות תאי CD4 T מובחנות אלה היא הביטוי של גורמי שעתוק ספציפיים המגדירים שושלת (TFs) וציטוקינים (איור 1). ניתן למדל התמיינות תאי CD4 T באמצעות קיטוב במבחנה 13,14,15, תוך שימוש בתאי CD4 T נאיביים המופעלים דרך ה-TCR בנוכחות ציטוקינים מקדמי שושלת ונוגדנים חוסמים המונעים אימוץ שושלת לא הולם.

שילוב של מיקוד גן CRISPR-Cas9 בתאי CD4 T נאיביים עם קיטוב תאי CD4 T במבחנה מציע מערכת חזקה להערכת תפקוד הגנים בתאים אלה (איור 2). בהתחשב בזמינות הנרחבת של ריאגנטים להערכת התמיינות CD4 על ידי זרימה ציטומטרית, ניתן לחקור בקלות היבטים מרכזיים של התמיינות תאי CD4 T, כולל ביטוי TF וייצור ציטוקינים, באמצעות הפרוטוקולים המתוארים כאן. זיהוי גנים חדשים המווסתים את תפקוד תאי CD4 T משפר את הבנתנו את התאים הללו, ושיטות CRISPR-Cas9 בשילוב עם קיטוב במבחנה מציעות שיטה חזקה להערכת תפקוד הגנים לפני התחייבות למודלים של עכברי KO של גנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עבור כל ההליכים המתוארים כאן, השתמשנו בעכברי C57/BL6J מסוג פרא (WT). עכברים הוחזקו וטופלו בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים (SPF) בהתאם להנחיות של NIAID (פרוטוקול LISB-22E) וועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים ב-NIH (Animal Welfare Assurance #A-4149-01).

1. שיקולים לפני שמתחילים

  1. בחירת ריאגנטים gRNA
    הערה: עיין בטבלת החומרים להשגת ריאגנטים gRNA מתוכננים מראש המכוונים לגנום העכבר המשמש בפרוטוקול זה.
    1. חפש את הגן המעניין (טבלת חומרים, crRNAs רצויים) ובחר את שלושת ה-crRNAs המדורגים המובילים (פורמט 2 ננומול). בנוסף, השג crRNA בקרה שלילית לשימוש במקביל (טבלת חומרים).
      הערה: היווצרות gRNAs פונקציונליים דורשת crRNA דופלקס עם tracrRNA; השג מגיב tracrRNA ובצע את השלבים בסעיף 3.
    2. עצב רצפי gRNA ממוקדים בהתאמה אישית.
      הערה: התכנון של רצפי gRNA ממוקדים בהתאמה אישית הוא מחוץ לתחום של פרוטוקול זה אך ניתן לבצע אותו באמצעות כלים זמינים לציבור כגון CRISPick (טבלת חומרים).
  2. חוצצים, מדיה וציוד
    הערה: אלא אם צוין אחרת, השתמש במאגרים קרים (4 מעלות צלזיוס) וריאגנטים.
    1. הכן מאגר MACS, מאגר FACS, מאגר טריטון X-100 0.5%, מאגר חדירות 1x, מדיית RPMI מלאה ומדיית IMDM מלאה (טבלת חומרים) לפני תחילת ההליך ואחסן ב-4 מעלות צלזיוס.
    2. השג בידוד תאי CD4 T נאיבי וערכות מיקרו-חרוזים נגד FITC (טבלת חומרים) לפני שתתחיל בהליך זה.
    3. לפני תחילת הנוקלאופקציה (סעיף 4), יש לחמם מראש (37 מעלות צלזיוס) 5 מ"ל של מדיה IMDM מלאה ולהכין מינימום של 10 מ"ל של IMDM מלא בתוספת IL-7 ב-5 ננוגרם/מיקרוליטר מחומם ל-37 מעלות צלזיוס (טבלת חומרים). התאם את נפח המדיה המחוממת מראש לפי הצורך כדי לקחת בחשבון הוספת 125 מיקרוליטר לדגימה לאחר נוקלאופקציה. התאם את עוצמת הקול של IMDM מלא המכיל IL-7 לפי הצורך, בהתבסס על מספר התאים שעברו גרעין (סעיף 4).
    4. לפני תחילת בידוד תאים מציגי אנטיגן (APC), הכינו את מגיב המיטומיצין C על ידי הוספת 4 מ"ל של H2O סטרילי לבקבוקון 2 מ"ג של מיטומיצין C (ריכוז מלאי של 0.5 מ"ג/מ"ל).
      הערה: בצע את כל השלבים במכסה המנוע של תרבית רקמות והשתמש בטכניקות אספטיות סטריליות.

2. בידוד תאי CD4 T נאיבי

הערה: ניתן לבודד תאי CD4 T נאיביים באמצעות בידוד מגנטי או באמצעות מיון תאים. הטוהר המתקבל מבידוד מגנטי הוא בדרך כלל 97%, וכדאיות התאים גבוהה מאוד, בעוד שמיון אלקטרוני יכול לשפר את טוהר התאים על חשבון כדאיות התא. הפרוטוקול המתואר כאן ישתמש בבידוד מגנטי אך ניתן להתאים אותו לכל אחד מהתרחישים. ודא שעמודות ה-LS מוכנות כראוי (טבלת חומרים).

  1. בודד את הטחול ובלוטות הלימפה (מפשעתיות, ברכיאליות, ציריות וצוואריות) מהעכברים (עכברי WT C57BL/6J המשמשים כאן).
  2. הנח מסך של 70 מיקרומטר בצלחת של 60 מ"מ עם 5 מ"ל של RPMI (טבלת חומרים) מלאה עבור כל רקמה מעובדת. מעבדים את בלוטות הלימפה והטחול בכלים שונים כדי להגדיל את התשואה. טוחנים בעדינות את הרקמות דרך המסנן באמצעות בוכנה ממזרק 3 מ"ל. שטפו את המסנן עם 1-3 מ"ל מדיה והעבירו את המתלים החד-תאיים לצינורות חרוטיים של 15 מ"ל.
  3. חזור על שלב 2.2 עבור בלוטות לימפה ורקמות טחול נוספות, לפי הצורך.
  4. צנטריפוגה את המתלים החד-תאיים ב-500 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  5. התכוננו לספור את התאים באופן הבא.
    1. עבור דגימות טחול, שאפו את הסופרנטנט, השעו בעדינות את כדור התא ב-1 מ"ל של מאגר ליזה ACK, דגרו למשך 2-5 דקות ב-RT, ואז הוסיפו 2 מ"ל של RPMI מלא, סובבו למטה, השעו מחדש ב-5 מ"ל של RPMI מלא וספרו את התאים.
    2. עבור תאי בלוטות לימפה, שאפו את הסופרנטנט, השעו מחדש את כדור התא ב-5 מ"ל של RPMI שלם טרי וספרו את התאים.
  6. לקלט לערכת הבידוד הנאיבית CD4, ערבבו את הטחול עם תאי בלוטות הלימפה כדי להגיע למספר התא הרצוי לבידוד.
    הערה: בדרך כלל, 1 × 108 תאי בלוטות לימפה וטחול מעכברי WT-B6 מניבים 2-8 ×10 6 תאי CD4 T נאיביים.
  7. צנטריפוגה את תאי הטחול ובלוטות הלימפה המאוחסנים ב-500 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את גלולת התא בנפח המתאים של מאגר MACS (טבלת חומרים) כפי שמצוין בפרוטוקול היצרן (ערכת בידוד תאי CD4 T נאיבית).
  8. עקוב במדויק אחר פרוטוקול היצרן לבידוד תאי CD4 T נאיביים על ידי בחירה שלילית (טבלת חומרים) באמצעות קוקטייל נוגדנים נאיבי CD4+ T Cell ביוטין, מיקרו-חרוזים אנטי-ביוטין ומיקרו-חרוזי CD44; השתמש בעמודות LS לבידוד זה ואסוף את התאים בצינורות חרוטיים של 15 מ"ל.
  9. לאחר הבידוד, צנטריפוגה של התאים ב-500 × גרם למשך 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט, השהה מחדש את כדור התא ב-2 מ"ל של אמצעי RPMI מלא וספור את התאים.
  10. אחסן את התאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים להתחיל בנוקלאופציה.

3. היווצרות קומפלקס Cas9-gRNA

הערה: הכן בקרה שלילית ומלאי crRNA ספציפי לגנים. אנו מתארים שימוש ב-crRNA ייחודי אחד לתנאי בקרה שליליים ושלושה crRNAs ייחודיים לתנאי מיקוד גנים. שימוש בשלושה crRNAs נפרדים בו זמנית מבטיח KO של הגנים המעניינים.

  1. השעו מחדש את ה-crRNAs וה-tracrRNA לריכוזי מלאי של 100 מיקרומטר באמצעות מאגר דופלקס (טבלת חומרים). זה מסתכם ב-10 מיקרוליטר של מאגר לכל 1 ננומול של RNA.
  2. שלב crRNAs בודדים עם tracrRNA ביחס של 1:1 בצינורות PCR סטריליים וערבב על ידי פיפטינג. מחממים ל-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב-thermocycler. לאחר מכן, תנו למתחמים להתקרר ל-RT על ספסל למשך 10 דקות לפחות.
    הערה: דופלקסים crRNA/tracrRNA מכונים gRNAs מנקודה זו ואילך. מתחמים יציבים לפחות 6 חודשים אם הם מאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. בדרך כלל אנו מייצרים 6 מיקרוליטר של gRNA (3 מיקרוליטר של crRNA + 3 מיקרוליטר של tracrRNA) בכל ריצה, ומספקים מספיק חומר לכחמש דגימות (1 מיקרוליטר לדגימה).
  3. עבור gRNAs מכוונים לגנים: בצינורות PCR סטריליים, הוסף 3 מיקרוליטר של gRNAs (1 מיקרוליטר כל אחד משלושה gRNAs ייחודיים לכל מטרה), 1 מיקרוליטר של חלבון Cas9 ו-1 מיקרוליטר של מאגר דופלקס (5 מיקרוליטר בסך הכל לדגימה). יש לערבב בעדינות ולוודא שכל החומר נמצא בתחתית הצינור. דגירה ב- RT למשך 10 דקות. סנכרן את התזמון של שלב זה עם נוקלאופקציה (שלבים 4.1-4.2).
  4. ל-gRNA בקרה שלילית: בצינורות PCR סטריליים, הוסף 1 מיקרוליטר של gRNA, 1 מיקרוליטר של חלבון Cas9 ו-3 מיקרוליטר של מאגר דופלקס (5 מיקרוליטר בסך הכל לדגימה). יש לערבב בעדינות ולוודא שכל החומר נמצא בתחתית הצינור. דגירה ב- RT למשך 10 דקות. שוב, סנכרן את התזמון של שלב זה עם נוקלאופקציה (שלבים 4.1-4.2).
    הערה: שימוש ב-50 pmol של gRNA לבקרה שלילית (לעומת 3 x 50 pmol לבדיקה) הוא חסכוני יותר ואין לו השפעה על התוצאות.

4. נוקלאופקציה - אבלציה גנטית בתיווך Cas9-gRNA

  1. צנטריפוגה 1-8 × 106 תאי T מטוהרים ב-500 × גרם למשך 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס לכל דגימת נוקלאופקציה. הסר בזהירות כמה שיותר סופרנטנט.
  2. השעו מחדש את התאים ב-20 מיקרוליטר של מאגר P3 (16.4 מיקרוליטר של P3 + 3.6 מיקרוליטר של תוסף לדגימה; ערכת נוקלאופקטור, טבלת חומרים) ולהעביר את התרחיף לצינורות PCR המכילים את קומפלקסי Cas9-gRNA. מערבבים ומעבירים לבארות עצמאיות של נוקלאוקובט בן 16 בארות (ערכת נוקלאופקטור, טבלת חומרים). ודא שלא נוצרו בועות בעת העברת תאים לקובטה, מכיוון שהדבר עלול להשפיע לרעה על יעילות הנוקלופיקציה. הקישו את הקובט על משטח עבודה כדי לוודא שכל החומר נמצא בתחתית כל באר וללא בועות.
  3. בצע נוקלאופקציה באמצעות תוכנית DN100 של הנוקלאופקטור המוזכר (טבלת חומרים). הוסף מיד 125 מיקרוליטר של מדיה IMDM מלאה שחוממה מראש לבארות הנוקלאוקובט והעביר את התאים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. שטפו כל באר פעם נוספת עם 125 מיקרוליטר של מדיה מחוממת מראש כדי להבטיח את איסוף כל התאים.
  4. צנטריפוגה של התאים ב-500 × גרם למשך 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס, הסר את כל המדיה והשהה מחדש ב-200 מיקרוליטר של מדיה IMDM מלאה מחוממת + 5 ננוגרם/מ"ל IL-7 (טבלת חומרים).
  5. מעבירים 200 מיקרוליטר מהתאים לצלחת התרבית ומוסיפים מדיה IMDM שלמה מחוממת + 5 ננוגרם/מ"ל IL-7 כדי ליצור את הנפח הרצוי הסופי בהתאם לגודל הצלחת באופן הבא: 1-2 ×10 6 תאים לבאר על צלחת של 48 בארות (1 מ"ל מדיה לבאר), 2-4 ×10 6 תאים לבאר על צלחת של 24 בארות (1.5 מ"ל מדיה לבאר) נפח, 4-6 × 106 תאים לבאר על צלחת של 12 בארות (2 מ"ל מדיה לבאר), ו-6-10 × 106 תאים לבאר על צלחת של 6 בארות (4 מ"ל מדיה לבאר). תרבית התאים בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 3 ימים.
    הערה: בהתאם למחזור החלבון ולבדיקה במורד הזרם, בצע אופטימיזציה של תקופת תרבית זו. מצאנו תקופת מנוחה אופטימלית של 3 ימים, אך ניתן להתאים אותה על סמך גן המטרה בין 1 ל-7 ימים באמצעות תנאים אלה.
  6. לאחר התרבית במדיה IMDM מלאה + 5 ננוגרם/מ"ל IL-7, השעו מחדש את התאים על ידי פיפטינג וקצרו אותם לצינורות חרוטיים של 15 מ"ל. צנטריפוגה של התאים ב-500 × גרם למשך 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא ב-1 מ"ל של מדיית RPMI מלאה.
  7. ספור את התאים כדי לקבוע את מספר תאי CD4 T הנאיביים החיים המתאימים לתאים המעניינים עם גרעין gRNA.
    הערה: בתהליך של נוקלאופקציה, צפו לאבד ~ 50% מתאי הקלט במהלך פרוטוקול זה ולהתאים את מספר תאי ה-CD4 T הנאיביים המשמשים בהתאם. כמו כן, בשלב זה, אתה יכול לבדוק את יעילות מיקוד הגן בתאי CD4 T נאיביים באמצעות מגוון טכניקות (ציטומטריית זרימה, כתם מערבי, qPCR או בדיקת T7EI).

5. בידוד תאים מציגי אנטיגן (APC)

הערה: ודא שמגיב המיטומיצין הוכן שישמש לטיפול ב-APCs לאחר בידוד (טבלת חומרים). קרא את פרוטוקול המיקרו-חרוזים נגד FITC של היצרן לפני שתתחיל וודא שעמודות ה-LS מוכנות כראוי (טבלת חומרים).

  1. לבודד טחול מעכברי WT המיועדים לבידוד APC.
  2. הכינו תרחיפים חד-תאיים כמתואר לעיל (2.2, 2.5.1)-ליז אריתרוציטים עם מאגר ליזה ACK, השעו מחדש את כדור התא ב-5 מ"ל של RPMI מלא (4 מעלות צלזיוס), וספרו את התאים.
    הערה: לאחר בידוד APC, צפו להשיג כמחצית ממספר תאי הקלט, למשלample, 1 × 108 טחולי קלט יניבו ~40-50 × 106 APCs. הכן את המספר הרצוי של טחול לבידוד.
  3. צנטריפוגה של התאים ב-500 × גרם למשך 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס, והשעיה מחדש של כדור התא ב-800 מיקרוליטר של מאגר MACS (טבלת חומרים).
  4. הוסף 4 מיקרוליטר כל אחד מהנוגדנים נגד CD4 ואנטי-CD8 מצומדים ל-FITC (טבלת החומרים) לטחול. מערבבים היטב ודוגרים בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  5. תאי צנטריפוגה בטמפרטורה של 500 × גרם למשך 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס ומסירים את הסופרנטנט. בהתאם להוראות היצרן, השעו מחדש את התאים בנפח המומלץ של מאגר MACS והוסיפו את הכמות המתאימה של מיקרו-חרוזים נגד FITC (טבלת חומרים).
  6. דגרו את התאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 500 × גרם למשך 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר MACS והעבירו את התאים דרך עמודת ה-LS המוכנה כמתואר בפרוטוקול היצרן, ואספו את התאים בצינור חרוטי של 15 מ"ל.
  7. צנטריפוגה את התאים ב-600 × גרם למשך 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים ב-2.7 מ"ל של PBS סטרילי 1x.
    הערה: נגמ"שים עשויים להתגלגל בצורה גרועה; השתמש במהירות מוגברת לצנטריפוגה.
  8. הוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת מיטומיצין C לתאים כדי ליצור ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/מ"ל. מערבבים היטב ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 30 דקות או למשך 45 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בחממה.
  9. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את התאים ב-600 × גרם למשך 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס, ושטוף אותם עם 10 מ"ל של PBS סטרילי 1x. השתמש בוואקום כדי להסיר כמה שיותר supernatant. חזור על הכביסה פעמיים.
  10. צנטריפוגה את התאים שוב ב-600 × גרם למשך 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא ב-5 מ"ל של מדיית RPMI מלאה (4 מעלות צלזיוס). ספור את התאים. אחסן APCs ב-4 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לבצע התמיינות של תאי CD4 T.

6. התמיינות תאי CD4 T

הערה: פרוטוקול זה מוגדר לתרבית תאים בפורמט צלחת של 48 בארות - 2 × 105 CD4 נאיבי + 1 × 106 APC לבאר - יחס של 1:5. התאים מתורבתים במדיית IMDM מלאה. כאן, נספק תנאים להתמיינות של תאי Th1, Th2, Th17 ו-Treg CD4 T; עם זאת, ניתן לבחור תנאי שושלת בודדים בהתאם למיקוד המשתמש.

  1. קבע את מספר התאים בצלחת של 48 בארות לשימוש וחשב את מספר התאים הדרושים לכל סוג תא.
    הערה: לדוגמה, 10 בארות ידרשו 2 ×10 6 CD4 נאיבי ו-10 × 10 6 APCs כדי לשמור על יחס של 1:5. אם מספרי התאים מאפשרים, חשב מספיק תאים לבאר נוספת אחת כדי להסביר כל שגיאת פיפטינג בעת הציפוי.
  2. מערבבים יחד את המספר הרצוי של CD4 ו-APC נאיביים ב-1:5, צנטריפוגה את התאים ב-600 × גרם למשך 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס, מסירים את הסופרנטנט ומשהים מחדש את גלולת התא ב-500 מיקרוליטר של מדיה IMDM מלאה לכל באר (למשל, תאים המתאימים ל-10 בארות ב-5 מ"ל מדיה).
  3. צלחת 500 מיקרוליטר מגדילה תאים לבארות של צלחת של 48 בארות, ומבטיחה שכל באר מכילה 2 × 105 CD4 נאיבי + 1 × 106 APCs.
  4. לתנאי ההתמיינות הרצויים של תאי CD4 T, הכינו 2x תערובות ציטוקין + נוגדנים ב-IMDM מלא כמתואר בטבלה 1. הוסף 500 מיקרוליטר מתערובת 2x למרווחים של 500 מיקרוליטר של תאים שצופו בעבר כדי להפוך את הריכוזים הסופיים של ריאגנטים ל-1x.
    הערה: דוגמאות אלה מבוססות על הכנת 2.5 מ"ל של תכשירים פי 2, המספיקים לחמש בארות לכל מצב. שוב, אם כמויות המגיב מאפשרות, בצע תוספת אחת נוספת של תערובת פי 2 כדי להסביר את שגיאת הפיפטינג.
  5. הוסף 500 מיקרוליטר של 2x ציטוקין + מדיה נוגדנים ל-500 מיקרוליטר של בארות המכילות תאי CD4/APC כדי ליצור ריכוז סופי של ריאגנטים ב-1x.
  6. מניחים את צלחת 48 הבארות בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. תרבית התאים למשך 72 שעות כדי לאפשר השלמת קיטוב CD4.
    הערה: בדוק את הצלחת לאחר תקופת התרבות כדי להבטיח צמיחה חזקה. המדיה צריכה להיות בצבע כתום לאחר הדגירה, כאשר המדיה הצהובה מצביעה על צמיחת יתר פוטנציאלית של תאים.

7. הערכת ההשפעה של אבלציה גנטית בהתמיינות תאי CD4 T

הערה: עבור כל שלבי הצביעה, הכינו תערובת מאסטר של נוגדנים שנוספו בדילול המתאים למאגר הצביעה הנדרש. נעשה שימוש בנפח של 50 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים/חוצץ לכל דגימה. התאם נוגדנים ספציפיים המשמשים על סמך הניסוי. על המשתמשים לבחור לוחות נוגדנים הרלוונטיים לניסויים הספציפיים שלהם; כאן אנו מספקים תבנית שבעזרתה ניתן לגשת לכך בהקשר של הגנים הממוקדים כאן.

  1. לאחר התמיינות CD4, הסר בזהירות 600 מיקרוליטר של הסופרנטנט, ולאחר מכן השהה מחדש את התאים בכל באר על ידי פיפטינג.
  2. הסר 200 מיקרוליטר מהתאים מכל באר והוסף אותם לצלחת מסומנת של 96 בארות לצביעה של גורם שעתוק. גלולה את הדגימות על ידי סיבוב ב-500 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, העיפה את הסופרנטנט והמשיכה לצביעה על פני השטח (שלב 7.5).
  3. לניתוח ציטוקינים, עורר מחדש את 200 המיקרוליטר הנותרים של התאים עם PMA (50 ננוגרם/מ"ל), יונומיצין (500 ננוגרם/מ"ל) וגולגי סטופ (דילול של 1/2,000) ב-IMDM מלא. הוסף 200 מיקרוליטר מתערובת הרסטימולציה פי 2 לכל באר ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 4 שעות.
    הערה: צריכים להישאר 200 מיקרוליטר בצלחת 48 הבארות; לפיכך, הוספת 200 מיקרוליטר מתערובת 2x של PMA (2x, 100 ננוגרם/מ"ל), יונומיצין (2x, 1 מיקרוגרם/מ"ל) וגולגי סטופ (2x, 1/1,000) תיצור ריכוז סופי של 1x (טבלת חומרים).
  4. בינתיים, התחל לצבוע את גורם השעתוק. בצע צביעת אנטיגן על פני השטח על ידי השעיית התאים ב-50 מיקרוליטר של מאגר FACS המכיל את הנוגדנים הרצויים המצומדים לפלואורוכרום לכל דגימה (טבלה 2). יש לדגור בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  5. הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר FACS לכל באר כדי לשטוף את מאגר הצביעה. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. העיף את הסופרנטנט. חזור על הפעולה בסך הכל שתי כביסות.
  6. תקן את התאים עם 100 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע Foxp3 (טבלת חומרים) בחושך ב-RT למשך 25 דקות.
  7. לאחר 25 דקות, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר FACS לכל באר כדי לשטוף את הקיבוע. צנטריפוגה את הצלחת ב-500 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והעיפו את הסופרנטנט. חזור על הפעולה בסך הכל שתי כביסות.
  8. בצע צביעה תוך תאית על ידי השעיית התאים ב-50 מיקרוליטר של מאגר חדירות 1x Foxp3 המכיל נוגדנים ספציפיים לגורם שעתוק מצומד ישירות לכל דגימה (טבלה 2) למשך שעה אחת לפחות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.
  9. לאחר השלמת הצביעה התוך-תאית, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר FACS לכל באר. צנטריפוגה את הצלחת ב-500 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והעיפו את הסופרנטנט. חזור על הפעולה בסך הכל שתי כביסות. השעיה מחדש של תאים בנפח סופי של 200 מ"ל לצורך ציטומטריית זרימה.
  10. לאחר רסטימולציה של PMA/ionomycin/Golgi Stop, השעו מחדש את התאים על ידי פיפטינג והעבירו 400 מיקרוליטר מכל דגימת ציטוקינים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. גלולה את הדגימות ב-500 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והסר את הסופרנטנט. השעו מחדש את דגימות התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר FACS והעבירו אותן לצלחת של 96 בארות לצביעה על פני השטח. גלול את הדגימות שוב על ידי סיבוב ב-500 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, החלק את הסופרנטנט.
  11. הכן קוקטייל מכתים על פני השטח עם מאגר FACS המכיל נוגדנים פלואורסצנטיים המכוונים כנגד אנטיגנים על פני השטח (טבלה 2). השעו מחדש את התאים ב-50 מיקרוליטר של מאגר צביעה לכל דגימה ודגרו למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.
  12. הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר FACS לכל באר כדי לשטוף את מאגר הצביעה. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. העיף את הסופרנטנט. חזור על הפעולה בסך הכל שתי כביסות.
  13. תקן את התאים ב-100 מיקרוליטר של 4% PFA (טבלת חומרים) בחושך ב-RT למשך 25 דקות.
  14. הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר FACS לכל באר כדי לשטוף את הקיבוע. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. העיף את הסופרנטנט. חזור על הפעולה בסך הכל שתי כביסות.
  15. בצע צביעת ציטוקינים תוך תאית על ידי השעיית התאים ב-50 מיקרוליטר של נוגדן אנטי-ציטוקינים המכיל 0.5% מאגר צביעה טריטון X-100 לדגימה (טבלה 2) למשך שעה אחת לפחות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.
  16. לאחר השלמת הצביעה התוך-תאית, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר FACS לכל באר. צנטריפוגה את הצלחת ב-500 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והעיפו את הסופרנטנט. חזור על הפעולה בסך הכל שתי כביסות. השעיה מחדש של תאים בנפח סופי של 200 מ"ל לצורך ציטומטריית זרימה.
  17. נתח את גורם השעתוק ודגימות מוכתמות בציטוקינים על ידי ציטומטריית זרימה.
    הערה: פרופילי ציטומטריית זרימה צפויים מלוחות הצביעה המתוארים יוצגו בסעיף התוצאות המייצגות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לאמת שאוכלוסייה טהורה של תאי CD4 T נאיביים הושגה באמצעות הפרוטוקול שלנו (סעיף 2), השתמשנו בזרימה ציטומטרית כדי לזהות תאים אלה לפני ואחרי בידוד מגנטי. באמצעות הגישה שלנו, השגנו אוכלוסייה טהורה ביותר של CD4+TCRb+CD25-CD44-CD62L+ תאי CD4 T נאיביים לאחר בידוד (איור 3A). יתר על כן, כדי לאשר כי קומפלקסים של Cas9-gRNA עברו בהצלחה גרעין לתאי CD4 T נאיביים (סעיף 4), ביצענו זרימה ציטומטרית על תאים שטופלו ב-Cas...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שילוב פרוטוקולים להעברת קומפלקסים של CRISPR-Cas9 לתאי CD4 T נאיביים עם שיטות לחקר התמיינות תאי CD4 T מספק כלי חזק לחקר גנים חדשים המווסתים את הביולוגיה של תאי CD4 T. כאן, אנו מספקים מדריך מקיף לשימוש בריאגנטים Cas9 ו-gRNA זמינים מסחרית שפשוט לעבוד איתם. אספקה בתיווך נוקלאופקציה של קומפלקסים Cas9-gRNA לתאי CD4 T נאיביים מספקת עריכת גנים יעילה ביותר, ומאפשרת נוקאאוט כמעט מוחלט של גנים מעניינים. בנוסף, ניתוח זרימה ציטומטרית של תאי CD4 T מקוטבים במבחנה מאפשר בחינה מקיפה של התמיינות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר הפנימי של NIAID, NIH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5 M EDTA, pH = 8.0IPM Scientific11005-016
16% Paraformaldehyde, PFAElectron Microscopy Sciences15710לדלל עם PBS כדי ליצור תמיסה מקבעת של 4% PFA
1x eBioscience Buffer (1x מאגר פרמיביליזציה)Thermo Fisher Scientific00-5523-00השתמש במאגר חדירות מהערכה כדי ליצור תמיסה 1x
1x PBS, pH = 7.4איכות ביולוגי114-058-101
2-מרקפטואתנול (1000x)Gibco21985-023
יחידת ליבת נוקלאופקטור 4DLonzaAAF-1003B
4D Nucleofector X UnitLonzaAAF-1003X
60 מ"מצלחת פלקון353002
70 ומיקרו; m מסננת רשת ניילוןFisherbrand22363548
ACK Lysing BufferGibcoA10492-01
Amaxa P3 תא ראשוני 4D-Nucleofector X KitLonzaV4XP-3032ערכה זו כוללת: P3 תמיסת תאים ראשונית, תוסף 1 ורצועות נוקלאוקובט 16 בארות
מיקרו-חרוזים נגד FITCMiltenyi Biotec130-048-701עקוב אחר פרוטוקול Miltenyi Anti-FITC Microbeads
CD28 נגד עכבר (37.51)bioXcellBE0015-1ראה טבלה 1 לריכוז
מלאי נגד עכבר CD3e (145-2C11)bioXcellBE0001-1ראה טבלה 1 לריכוז
מלאי נגד עכברים IFNγ (XMG1.2)bioXcellBE0055ראה טבלה 1 לריכוז מלאי
נגד עכבר IL-12p40 (C17.8)bioXcellBE0051ראה טבלה 1 לריכוז מלאי
נגד עכבר IL-4 (11B11)bioXcellBE0045ראה טבלה 1 לריכוז מלאי
BioLite 48-well MutlidishThermo Fisher Scientific130187
בקר סרום אלבומין ScienceA3059
Cas9 אנזיםIDT1081059Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 (10 מ"ג/מ"ל) - מכיל רצף לוקליזציה גרעינית
IMDM מלא + IL-7 MediaIMDM מלא עם 5 ננוגרם/מ"ל IL-7
מדיהIMDM מלאה IMDM+GlutMAX, 10% FBS, 1% L-גלוטמין, 1% עט/סטרפטוק, 0.1%
BMEמדיה RPMI מלאהRPMI-1640, 10% FBS, 1% L-גלוטמין, 1% עט/סטרפטוק, 0.1%
BME CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
crRNA רצוי IDTמשומש שתוכנן מראש מאתר IDT: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN  
eBioscience FOXP3/סט מאגר צביעה של גורם שעתוקThermo Fisher Scientific00-5523-00הערכה מכילה שלושה ריאגנטים: תרכיז קיבוע/פרמביליזציה (4x), מדלל קיבוע/פרמביליזציה, ומאגר פרמיביליזציה (10x)
מאגר1x PBS, 1% FBS, 1 מ"מ EDTA
סרום בקר עוברי (FBS)VWR Seradigm Life Science97068-085יש לנטרל את החום לפני השימוש (לחמם עד 56&00 מעלות; C למשך 45 דקות)
FITC נגד עכבר CD4 (RM4-5)Biolegend1005101/200 דילול (ריכוז מלאי 0.5 מ"ג/מ"ל)
FITC נגד עכבר CD8 ואלפא; (53-6.7)Biolegend100706דילול 1/200 (ריכוז מלאי של 0.5 מ"ג/מ"ל)
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZדילול 1/2000
IMDM (1x) + GlutMAX-1 MediaGibco31980-030
מלח סידן יונומיצין מ-Streptomyces conglobatus (1 מ"ג/מ"ל)Sigma Aldrich10634ריכוז סופי מומלץ של 500 ננוגרם/מ"ל
L-גלוטמין 200 מ"מ (פי 100)Gibco25030-081
עמודות LSMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Buffer1x PBS, 0.5% BSA, 1 mM EDTA, מסנן מעוקר
מיטומיצין C (0.5 מ"ג/מ"ל)Millipore SigmaM4287-2MG 
עכבר Naï ve ערכת בידוד תאי CD4 TMiltenyi Biotec130-104-453עקוב אחר Miltenyi Naï ve פרוטוקול בידוד תאי CD4 T. ערכה זו כוללת Naï ve קוקטייל נוגדנים ביוטין תאי T CD4+, מיקרו-חרוזים אנטי-ביוטין ומיקרו-חרוזים CD44
בקרה שלילית crRNAIDT1072544 אלטרנטיבה לעיצוב בקרה שלילית משלו
מאגר דופלקס ללא נוקלאזIDT1072570
רצועות צינור PCRארה"ב Scientific1402-2700
פניצילין סטרפטומיציןGibco15140-023
פורבול 12-מיריסטט 13-אצטט, PMA (100 ומיקרו; גרם/מ"ל)Sigma AldrichP8139ריכוז סופי מומלץ של 50 ננוגרם/מ"ל
ProSeries צינורות צנטריפוגה בעלי ביצועים גבוהים 15 מ"לאלקלי מדעיPS560015 מ"ל צינורות חרוטיים
רקומביננטיים אנושיים (h) IL-2Peprotech200-02ראה טבלה 1 לריכוז מלאי
רקומביננטי אנושי TGF-b1 (נגזר HEK293)Peprotech100-21ראה טבלה 1 למלאי ריכוז
עכברים רקומביננטי IL-12p70Peprotech210-12ראה טבלה 1 עבור ריכוז מלאי
עכברים רקומביננטיים IL-4Peprotech214-14ראה טבלה 1 עבור ריכוז מלאי
עכברים רקומביננטיים IL-6Peprotech216-16ראה טבלה 1 עבור ריכוז מלאי
עכברים רקומביננטיים IL-7Peprotech217-17הכן ב 100 ng/mL
RPMI 1640 MediaGibco21870-076
Thermal CyclerApplied Biosystems4375786אנו משתמשים במודל זה של thermocycler, אולם כל ציוד דומה יעבוד היטב בפרוטוקול זה
tracrRNA Atto550 label IDT1075928מאפשר זיהוי של קומפלקסים של Cas9-gRNA לאחר nuceloefection באמצעות פלואורסנטיות Atto550 כקריאה. אנו ממליצים על מגיב זה במידת האפשר. 
Triton-X Buffer1x PBS, 0.5% TritonX-100, 0.1% BSA
TritonX-100BioRad161-0407
tracrRNA ללא תווית IDT1072534אפשרות tracrRNA חסכונית יותר, אך אינה מאפשרת הערכה של יעילות הנוסלופיקציה של קומפלקסי Cas9-gRNA
Veriti Thermal Cycler, 96-well FastThermo Fisher Scientific4375305אנו משתמשים במודל זה של thermocycler, אולם כל ציוד דומה יעבוד היטב בפרוטוקול זה
FACS

מקורות

  1. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med. 215 (3), 985-997 (2018).
  2. Nussing, S., et al. Efficient CRISPR/Cas9 gene editing in uncultured naive mouse T cells for in vivo studies. J Immunol. 204 (8), 2308-2315 (2020).
  3. Albanese, M., et al. efficient and activation-neutral gene editing of polyclonal primary human resting CD4+ T cells allows complex functional analyses. Nat Methods. 19 (1), 81-89 (2022).
  4. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein transfection for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Curr Protoc Immunol. 124 (1), e69(2019).
  5. Huang, B., Johansen, K. H., Schwartzberg, P. L. Efficient CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis in primary murine T lymphocytes. Curr Protoc Immunol. 124 (1), e62(2019).
  6. Huang, B., et al. In vivo CRISPR screens reveal a HIF-1α-mTOR network regulates T follicular helper versus Th1 cells. Nat Commun. 13 (1), 805(2022).
  7. Asmamaw, M., Zawdie, B. Mechanism and applications of CRISPR/Cas-9-mediated genome editing. Biologics. 15, 353-361 (2021).
  8. Li, T., et al. CRISPR/Cas9 therapeutics: progress and prospects. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 36(2023).
  9. Yang, H., et al. Methods favoring homology-directed repair choice in response to CRISPR/Cas9-induced double-strand breaks. Int J Mol Sci. 21 (18), (2020).
  10. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annu Rev Immunol. 28, 445-489 (2010).
  11. Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., Xia, B. CD4+ T cells: differentiation and functions. Clin Dev Immunol. 2012, 925135(2012).
  12. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  13. Rumble, J., Segal, B. M. In vitro polarization of T-helper cells. Methods Mol Biol. 1193, 105-113 (2014).
  14. Yang, W., Chen, X., Hu, H. CD4(+) T-cell differentiation in vitro. Methods Mol Biol. 2111, 91-99 (2020).
  15. Wang, W., Ai, X. Primary culture of immature, naive mouse CD4+ T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100756(2021).
  16. Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
  17. Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
  18. Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
  19. Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
  20. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
  21. Wan, Y. Y., Flavell, R. A. Regulatory T-cell functions are subverted and converted owing to attenuated Foxp3 expression. Nature. 445 (7129), 766-770 (2007).
  22. Williams, L. M., Rudensky, A. Y. Maintenance of the Foxp3-dependent developmental program in mature regulatory T cells requires continued expression of Foxp3. Nat Immunol. 8 (3), 277-284 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CRISPR Cas9TTIn VitroTh1 Th2 Th17 TregAdoptive Transfer
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים