כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה חיה של החלוקה הא-סימטרית של תאי גזע של קו הנבט (GSCs) בנישת השחלות של דרוזופילה. אנו משתמשים בקו טרנסגני המבטא בכל מקום היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של חלבון הספקטרוזום Par-1.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster
במאמר זה
סיכום
תקציר
שיטות הדמיה חיות מאפשרות ניתוח של תהליכים תאיים דינמיים בפירוט ובזמן אמת. שחלת הדרוזופילה מייצגת מודל מצוין לחקר הדינמיקה של מספר עצום של תהליכים התפתחותיים, כגון חלוקת תאים, גזע, התמיינות, נדידה, אפופטוזיס, אוטופגיה, הידבקות תאית וכו', לאורך זמן. לאחרונה, יישמנו תרבות ex vivo מורחבת והדמיה חיה של נישת ה-GSC הנשית של דרוזופילה. באמצעות קו דרוזופילה המכיל טרנסגן GFP::P ar-1 כדוגמה, שיטה זו מאפשרת הדמיה של החלוקה הא-סימטרית של ה-GSCs בתוך הנישה שלהם ותיאור השינויים במורפולוגיה של הספקטרוזום לאורך מחזור התא. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתרבות ex vivo של Drosophila germaria, המאפשר הדמיה ממושכת של נישת ה-GSC הנשית. חשוב לציין, פרוטוקול זה ישים באופן נרחב להדמיה חיה של GSCs עם מספר חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים מעניינים הזמינים במרכזי מלאי ו/או בקהילת המחקר של דרוזופילה.
מבוא
הדמיה חיה של תהליכים ביולוגיים היא חיונית להשגת ראיות ניסיוניות ישירות. השילוב של מיקרוסקופיה קונפוקלית מתקדמת ואופטימיזציה של מתודולוגיות מאפשר לחקור אירועים ביולוגיים מרובים בדיוק גבוה. אופטימיזציה של שלבים בפרוטוקולים כגון מניפולציה ודיסקציה של רקמות, הכנת ושימור דגימות, והגדרות רכישת מיקרוסקופיה היא קריטית כדי למקסם את האמינות והחוסן של התוצאות המתקבלות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניטור דגימות להדמיה מורחבת, המתמקד במיוחד בשחלות Drosophila melanogaster. השחלה Drosophila melanogaster היא מערכת מודל מצוינת לניתוח של מגוון רחב של תהליכי התפתחות. בין רבים אחרים, איבר רבייה זה של זבוב הפירות Drosophila melanogaster מכיל נישה מוגדרת היטב של תאי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: יש לבצע את שלב 1.4 לפחות יומיים מראש. ניתן לבצע את שלבים 2.1 ו-2.2 יום אחד מראש.
1. הגדרה טרום ניסויית I
- הכינו 100 מיקרוליטר של תערובת אנטיביוטיקה סטרפטומיצין/פניצילין (10,000 U/mL פניצילין ו-10 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין) ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- הכינו 15 מ"ל מהתמיסות הבאות באמצעות מים טהורים שעברו חיטוי, אחסנו אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשתמשו בהם תוך חודש: נתרן ביקרבונט (NaHCO3) 0.1 M pH 8.0 ו-0.1% Tween 20.
- הכן את מדיום התרבות והתמיסה הבאים במכסה זרימה למינרי כדי למנוע זיהום. השתמש בקצות ובצינורות סינון מעוקרים.
- הכינו 2 מ"ל של סרום בקר ע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות פרוטוקול דימוי חי מורחב זה, אנו יכולים להקליט את המיטוזה האסימטרית של GSCs נקביים בתוך הנישה שלהם ללא הפרעות ביולוגיות ניכרות. לשם כך, אנו משתמשים ב-germaria המבטאים באופן גלובלי את החלבון GFP::Par-1, המבחין בין חמישה מורפולוגיות נפרדות של הספקטרוסום לאורך מחזור התא של ה-GSC: עגול (Round), פקק (Plug), מוט (Bar), איחוי (Fusing), וסימן קריאה (Exclamation point) (איור 1B,C). בתיאור מפורט יותר, הבחנו כי אות ה-GFP:Par1 החזק של ספקטרוסום Round-G2 (איור.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן אנו מציגים פרוטוקול לניטור נישת ה- GSC של Drosophila melanogaster למשך תקופה ממושכת, עד 16 שעות. רוב הפרוטוקולים לצילום תהליכים ביולוגיים של דרוזופילה מתמקדים בחלונות זמן קצרים יותר וניתן למצוא דוגמאות רבות לדיסקי כנף דמיוניים 15,16,17, בלוטות המין של העובר 18,19 או שחלות 20,21,22,23
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
אנו מודים ל-Acaimo González Reyes ול-María Olmedo López על ההערות המועילות על כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי PID2021-125480NB-I00 (H. S-G), "Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor" מ-Junta de Andalucía (J. G-M), "Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos" מ-VI ו-VII PPIT-אוניברסיטת סביליה (P. R-R) ו-"Contrato de Acceso de I+D+i" מ-VI PPIT-אוניברסיטת סביליה (P. R-R). אנו מביעים את תודתנו לחברת ביולוגים בע"מ על מתן זכויות לשיתוף תמונות שעובדו מהפרסום המקורי (doi:10.1242/DEV.199716).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחת זכוכית 9 בארות | קורנינג | 7220-85 | n/a |
| סידן כלוריד דיהידראט | סיגמא אולדריץ' | C3881 | CaCl2· 2H2O; להכנת הפתרון של רינגר |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | דבק תאים ורקמות המשמש לחיבור תאים או קטעי רקמה לסוגים רבים של משטחים, כולל פלסטיק, זכוכית, מתכת, פולימר FEP וחומרים ביולוגיים. |
| דומונט #5 מלקחיים | Finescience | 11252-20 | n/a |
| Dumont #55 מלקחיים | Finescience | 11255-20 | מידות 0.05 מ"מ x 0.02 מ"מ ואורך 11 ס"מ |
| סרום בקר עוברי | Gibco | 10500-064 | מוסמך, מושבת בחום, מאושר על ידי האיחוד האירופי, מוצא דרום אמריקה |
| כלי תחתית זכוכית | MatTek | P35GC-1.5-10-C | צלחת 35 מ"מ, מס' 1.5 כיסוי, קוטר זכוכית 10 מ"מ, מצופה פולי-D-ליזין |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | להכנת תמיסת רינגר |
| מגנזיום כלוריד | סיגמא אולדריץ' | M1028 | MgCl<תת>2; להכנת הפתרון של רינגר |
| מחזיק מחט | Roboz | RS-6061 | קל משקל, ידית נירוסטה חלולה; אורך 4 3/4 אינץ'. |
| ניקון SMZ18 דו-עיני | ניקון | https://www.microscope. healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | תרמו פישר סיינטיפיק | 15140122 | 10,000 יח'/מ"ל |
| אשלגן כלורי | סיגמא אולדריץ' | P3911 | KCl; להכנת התמיסה של רינגר |
| שניידר Drosophila Medium | Biowest | L0207 | מדיום תרבית תאים לתאי חרקים |
| נתרן ביקרבונט | סיגמא אולדריץ' | S8875 | NaHCO3; ≥ 99.5%, אבקת |
| נתרן כלורי | Sigma Aldrich | S9888 | NaCl; להכנת התמיסה של רינגר |
| סוכרוז | סיגמא אולדריץ' | S9378 | ≥ 99.5% (GC); להכנת הפתרון של רינגר |
| מחט דיסקציה טונגסטן | Roboz | RS-6064 | 0.25 מ"מ, דק במיוחד, קצה 1 מיקרון (Pk 10) |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | לביולוגיה מולקולרית, אבקת שמרים נוזלית צמיגה |
| Sigma Aldrich | 51475 | n/a |
מקורות
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 605-631 (2005).
- Drummond-Barbosa, D. Local and physiological control of germline stem cell lineages in Drosophila melanogaster. Genetics. 213 (1), e234(2019).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
