למרות מאמצים ניכרים לטפל בפצעים כרוניים, ההצלחה הייתה מוגבלת. התהליכים התאיים והמולקולריים המשבשים ריפוי תקין ותורמים להתחלה והתפתחות של פצעים כרוניים אינם מובנים היטב. כתוצאה מכך, פיתוח טיפולים יעילים לפצעים אלה הוכח כמאתגר. הסיבה העיקרית לכך היא היעדר מודלים של בעלי חיים המחקים פצעים כרוניים בבני אדם ומאחר שניסויים בבני אדם עם פצעים כרוניים מוגבלים. בעבר פרסמנו מודל עכברי לחקר פצעים כרוניים שחולקים מאפיינים רבים עם פצעים כרוניים סוכרתיים בבני אדם. מודל זה כולל נוכחות של ביופילמים הנוצרים באופן טבעי מחיידקים המצויים במיקרוביוטה של העור והסביבה ללא צורך בהחדרת חיידקים חיצוניים לפצעים. לכן, מודל זה יכול לקדם את ההבנה הבסיסית של האופן שבו פצעים הופכים לכרוניים. כאן, אנו מציגים עדכון לפרוטוקול המקורי לפיתוח מודל עכבר זה. התרכזנו בהפחתת תמותת העכברים מ~30% ל~5%. אנו גם מתארים כיצד נעשה שימוש במודל זה כדי להבין את ההתחלה וההתקדמות של כרוניות פצע על ידי שימוש בגישות טרנסקריפטומיות של הדור הבא, הבהרת הדינמיקה של אוכלוסיית החיידקים במהלך זיהום ופיתוח ביופילם, והדגמת הערך של בדיקת יעילות הטיפולים, כולל מולקולות קטנות. עד כה, זהו מודל הפצע הכרוני היחיד שאינו נרפא ללא התערבות.
מאמר שיטה
פרוטוקול ליצירת פצעים כרוניים בעכברים סוכרתיים - עדכון לפרוטוקול שפורסם
במאמר זה
תקציר
מבוא
זהו עדכון לערך קיים. אנא לחץ כאן כדי לראות את הגרסה המקורית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
עדכונים:
זהו עדכון לפרוטוקול שהוצג קודם לכן1
כל הניסויים הושלמו בהתאם ועמידה בתקנות הפדרליות והמדיניות והנהלים של אוניברסיטת קליפורניה אושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד IACUC.
1. חיה
הוסף את ההערה הבאה לשלב 1.1:
הערה: אם עכברי סוכרת הומוזיגוטיים נרכשים ישירות מספקים, יש לשכן את העכברים בוויווריום קונבנציונאלי כדי לאפשר קולוניזציה של העור עם פלורת עור רגילה. ניתן להשתמש גם בזכרים וגם בנקבות.
הוסף את הסעיף הבא לאחר שלב 1.3:
1.4.לבצע גנוטיפ
הערה: בצע גנוטיפ לאחר גידול החיה כמתואר קודם לכן עד לשלב 1.31. הפרוטוקול הבא שונה מנוהל2 שפורסם בעבר. ניתן לבצע גנוטיפ של עכברים זכרים ונקבות כבר בגיל 14-21 יום בעת הגמילה.
1.4.1. מיצוי DNA גולמי
1.4.1.1. אסוף ביופסיית אגרוף אוזניים מהעכבר והנח את דגימת הרקמה בצינור מיקרוצנטריפוגה.
1.4.1.2. הוסף 180 מיקרוליטר של 50 מ"מ NaOH, וודא שהדגימה שקועה.
1.4.1.3. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, הורידו לחץ ומערבלו את הצינור כל 5 דקות.
1.4.1.4. יש לקרר את הדגימה על קרח למשך דקה אחת לפחות.
1.4.1.5. הוסף 20 מיקרוליטר של 1 M Tris HCl ב-pH 8.0 ומערבולת.
1.4.1.6. אחסן דגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
1.4.2. תגובת שרשרת פולימראז
1.4.2.1 הרכיבו את תערובת הפריימר הבאה בצינור מיקרוצנטריפוגה (טבלת פריימרים).
הערה: הפריימרים מגבירים את האזור סביב המוטציה הנקודתית של LepR.
1.4.2.2. הגדר 20 מיקרוליטר של תגובות שרשרת פולימראז בצינורות PCR. הוסף 10 מיקרוליטר של תערובת מאסטר 2x Taq פולימראז (המכילה Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl2 ו-KCI), 1 מיקרוליטר של תערובת פריימר (ראה טבלת פריימרים), 4 מיקרוליטר של תמצית DNA גולמית ו-5 מיקרוליטר של H2O.
1.4.2.3. הגדר את פרמטרי הרכיבה התרמית באופן הבא: 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 40 מחזורים של 97 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 52 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות; ואחריו 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ו-10 מעלות צלזיוס לאחיזה אינסופית.
1.4.2.4. לאחר השלמת ה-PCR, הוסף 4 מיקרוליטר של צבע טעינת DNA פי 6 למוצרי ה-PCR והפרד על ג'ל אגרוז 2% (איור 1).
הערה: כל תגובת PCR מייצרת 3 תוצרי PCR: מוצר נפוץ של 610 bp, מוצר אלל T מוטנטי של 406 bp ואלל G מסוג Wild של 264 bp. גנוטיפ מסוג בר מורכב מתוצרי 610 bp ו-264 bp, גנוטיפ הטרוזיגוטי מורכב מכל שלושת המוצרים, וגנוטיפ db/db מורכב מתוצרי 610 bp ו-406 bp.
2. ויבריום וגידול
החלף את שלב 2.1 בשלב הבא ובהערה:
2.1 לשכן עכברי db/db בוויווריום קונבנציונאלי (לא מתקן נטול מחסום/פתוגן ספציפי) כך שמיקרופלורה תוכל להתבסס על עורם של עכברי db/db . כדי לדגמן באופן ספציפי בני אדם הסובלים מפצעים כרוניים, אל תנקוט באמצעי זהירות מיוחדים כדי למנוע חשיפה לפתוגנים טבעיים הנמצאים בסביבת עכברים, מכיוון שפתוגנים חיוניים של המחקר עלולים ללכת לאיבוד בתנאים נקיים מחמירים יותר.
הערה: מכיוון שעכברים אלה גדולים מאוד וחולי סוכרת, עדיף לאכלס עד 3 עכברים db/db לכלוב לפני השימוש בהם לניסויים בפצעים כרוניים.
3. דרישות להתפתחות פצעים כרוניים
הוסף את השלב הבא לאחר שלב 3.2
3.3. שמור את הפצע מכוסה בחבישת סרט שקוף בכל עת כדי למנוע ייבוש של רקמת הפצע.
5. הגדרת ריאגנטים
הוסף את ההערה הבאה לאחר 5.2
הערה: השתמש רק ב-ATZ של החברה הרשומה בטבלת החומרים. ATZ של חברות אחרות אינו תואם למודל זה ויגדיל את התמותה.
6. ניתוח
6.1. טיפול והרדמה
הערה: משטר הרדמה מעודכן מתואר להלן.
6.1.5. במערכת פתוחה, יש לתת לעכבר 5% איזופלורן המועבר עם O2 בקצב זרימה (2-3.5 ליטר לדקה) כדי לגרום להרדמה. עקוב באופן רציף אחר מצב העכבר.
הערה: לאחר שהעכבר מחוסר הכרה או אינו זז יותר, הנח אותו על כרית ניתוח לבנה והתאם את הראש עם חרוט אף המחובר למכשיר האידוי כדי לאפשר מתן רציף של איזופלורן במהלך הניתוח.
6.1.6. במערכת פתוחה, יש לתת איזופלורן 1% באותו קצב זרימה במהלך הניתוח ולהתאים את זרימת האיזופלורן כדי לשמור על עומק ההרדמה.
6.3. פציעה
6.3.5. הפסק את מתן איזופלורן 1% לעכבר בסוף ההליך.
7. טיפול והחלמה לאחר הניתוח
החלף את שלב 7.1 בפרוטוקול המקורי בשלב הבא והערה:
7.1. לאחר מריחת חבישת הסרט השקוף מיד לאחר הניתוח, באמצעות מזרק אינסולין, יש להניח MSA באופן מקומי על החלק העליון של הפצע שנוצר בגב העכבר על ידי חדירת חבישת הסרט השקוף עם המחט. יש להשתמש ב-150 מ"ג/ק"ג של MSA בתמיסת PBS סטרילית תוך 10 דקות לאחר הניתוח. ריכוז זה נקבע לאחר חיפוש ספרותי מקיף, כפי שהוסבר קודם לכן 3,4.
הערה: MSA נוטה לזרז אם לא נסער כל הזמן. ודא ש-MSA מומס לחלוטין בתמיסה לפני מריחתו על הפצע כדי להעביר את המינון המחושב לעכבר.
החלף את שלב 7.4 בפרוטוקול המקורי בשלב הבא:
7.4. יש לתת את המנה השנייה של בופרנקס 6 שעות לאחר הניתוח. לאחר מכן, מינון העכברים מעת לעת על פי כללי IACUC המקומיים במשך 48 השעות הראשונות.
הערה: לא מומלץ להשתמש בתכשירים בשחרור מושהה של משככי כאבים הנדרשים למתן תת עורי במודל עכבר זה. ניתן להשהות את הבופרנורפין הקשור לשומנים בשמן טריגליצרידים של חומצת שומן בינונית (MCT). בעוד שההשפעה של שמן MCT נבדקה בעכברים צעירים מאוד עם db/db, ההשפעות של MCT על עכברים מבוגרים או גריאטריים עם השמנת יתר db/db לא נבדקו 5,6. בהתחשב במשקל העכברים, כמויות גדולות של משככי כאבים המוזרקים תת עורית ליד הפצע עשויים להשפיע באופן משמעותי על התהליכים התאיים והמולקולריים של ריפוי פצעים והתחלה והתפתחות של פצעים כרוניים. כמו כן, משכך כאבים זה יתמוסס ברמות השומן הגבוהות בעכברים אלה ולכן עשוי שלא להיות יעיל בהקלה על הכאב ועלול להפוך לרעיל.
8. איסוף נתונים, טיפול בעכברים לאחר פציעה, אסטרטגיות הישרדות וטיפים נוספים
8.1 איסוף נתונים
הוסף את השלבים הבאים לאחר שלב 8.1.3.
8.1.4. ודא שהרקמה שנאספה לניתוח צריכה לכלול רק רקמה הנמצאת במרחק של 2 מ"מ משולי הפצע הן בפצעי ביקורת והן בפצעים כרוניים. ניתן לאסוף פצעים באמצעות כריתה כבר 1-2 שעות לאחר מריחת MSA.
8.1.5. יש לאסוף עודפי נוזלים שהצטברו מהפצע, או מהפרשות הפצע, בעזרת מזרק סטרילי על ידי ניקוב דרך חבישת הסרט השקוף. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למחקרי חיידקים או -80 מעלות צלזיוס לכימיה ולמחקרים מולקולריים.
8.1.6 כדי לאסוף רקמות פצע שלמות, כולל ביופילם, לאחר 10 ימים, יש למרוח 4% PFA ב-PBS על הפצע, באופן מקומי למשך 10 דקות לפני הכריתה בעזרת מלקחיים ומספריים. בעת הסרת הרקמה, הוסף שולי פצע נוספים של 5-10 מ"מ כך שרקמת הפצע נתמכת ברקמה תקינה נוספת. המשך קיבוע ב-4% PFA ב-PBS וכביסות לאחר מכן והכנה להטמעה.
הערה: פצעים כרוניים 10 ימים לאחר הניתוח עלולים להיות שבירים מכדי לאסוף אותם להיסטולוגיה.
8.5. אסטרטגיות הישרדות
8.5.1. ספק תמיכה נוספת בהידרציה: בדוק אם עכברים הופכים רדומים ואינם אוכלים או שותים באופן פעיל מכיוון שהניתוח ויצירת הכרוניות מלחיצים. יש לתת מי מלח חמים (35-38 מעלות צלזיוס) תת עורית או תוך צפקית בנפח של 0.25 מ"ל לכל 10 גרם משקל גוף במהלך 48-72 השעות הראשונות לאחר הניתוח. ייתכן שיהיה צורך בתמיכה בהידרציה עד 2-3 פעמים ביום, תלוי עד כמה העכברים רדומים. כמו כן, ניתן להניח כדורי מזון וג'ל מים במצעים לגישה נוחה, אם כי ייתכן שיידרשו החלפות כלוב תכופות יותר.
8.5.2. ספק תמיכה נוספת בחום: ההישרדות לאחר הניתוח מוגברת משמעותית אם עכברים מונחים בכלובים על כרית המחוממת על ידי מים במחזור (93 מעלות צלזיוס) מיד לאחר הניתוח וכאשר הם נמצאים בוויווריום. הנח את הכלוב 1/2 על ו-1/2 מהרפידה כדי לאפשר לבעל החיים להתרחק מהחום אם הם מתחממים מדי ולנוע על גבי הרפידה אם הם מתקררים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1: גנוטיפ לזיהוי הטרוזיגוטים ליצירת מגדלים. ג'ל לדוגמה מציג את התוצאות של 8 דגימות עכבר לא ידועות. דגימה 2 ו-5 הם הטרוזיגוטים מכיוון שהם מכילים 3 רצועות (610 bp, 406 bp ו-264 bp). דגימות 1, 3, 4, 6, 7 ו-8 הן טיפוסים פראיים מכיוון שהן מכילות רק 2 רצועות (610 bp ו-264 bp). אנא לחץ כאן לצפ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ממצאים באמצעות מודל זה של פצעים כרוניים:
מודל זה שימש לביצוע מספר מחקרים בניסיון להבין את המנגנונים התאיים והמולקולריים של התחלה והתקדמות של פצע כרוני. הוכח כי על ידי עיכוב אנזימים נוגדי חמצון, פצעים כרוניים יכולים להיווצר בעכברי db/db. הפצעים הכילו בתחילה קהילה רב-מיקרוביאלית שעם הזמן נבחרה עבור חיידקים ספציפיים היוצרים ביופילם. הכרוניות התהפכה על ידי טיפול בעכברים בשני נוגדי חמצון: α-טוקופרול שניתן לעכברים IP ו-N-אצטיל ציס...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ניקוב אוזניים 1 מ"מ | Fisherbrand | 13812201 | קוטר חור 2 מ"מ |
| 3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) | TCI | A0432 | |
| 70% אתנול | |||
| Acu Punch ביופסיית עור 7 מ"מ אגרופים | Acuderm Inc. | P750 | |
| אגרוז | |||
| ב6. BKS(D)-Leprdb/J | מעבדת ג'קסון | 00697 | הומוזיגוטים והטרוזיגוטים זמינים |
| בופרנקס (בופרנורפין הידרוכלוריד) | הנרי שטיין לבריאות בעלי חיים | 059122 | 0.3 מ"ג/מ"ל, |
| צבע לטעינת ג'ל דרגה 3, סגול (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| כפפות | |||
| תחליב מסיר שיער עם אלוורה ולנולין מרגיעים | נאייר | משאבת מים להסרת שיער כימית | |
| HTP-1500 | Adroit MedicalSystems | ||
| כרית חימום | Conair | מתאמי צינור כרית חימום יבשה | |
| לחה | |||
| מזרקי אינסולין | BD | 329461 | 0.35 מ"מ (28 גרם) x 12.7 מ"מ (1/2 אינץ') |
| איזופלורן | הנרי שיין לבריאות בעלי חיים | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
| וופורייזר איזופלורן | JA Baulch & עורכי דין | ||
| שמיכת Kimwipes | |||
| Maxi-Therm היפר-היפותרמיה | סינסינטי סאב-זירו | חתול מס' 247 | 22 אינץ' x30 אינץ' לשימוש חוזר HeavyDuty Pad |
| חומצה מרקפטוסוקסינית (MSA) | Aldrich | 88460 | |
| חרוט | |||
| חמצן | חייב להיות תואם למערכת אידוי | ||
| תמיסת חיץ פוספט (PBS) | חיטוי | ||
| מעוקר מספריים | |||
| מיכלי פלסטיק קטנים | |||
| נתרן הידרוקסיד | |||
| טאק 2X מאסטר מיקס | ניו אינגלנד ביולאבס | M0270L | |
| טגאדרם | 3M | Ref: 1624W | חבישת סרט שקוף (6 ס"מ x 7 ס"מ) |
| מרית | |||
| Tri-HCl | |||
| פינצטה | |||
| קוצץ שיער | Wahl Wahl | Lithium Ion Pro |
מקורות
- Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. J Vis Exp. (151), e57656(2019).
- He, J. -F., Tan, T., Zhu, H. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacol Sin. 39 (1), 117-123 (2018).
- Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. J Diabetes Res. 2014 (562625), (2014).
- Kim, J., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nat Protoc Exch. , (2016).
- Martínez-Carrillo, B. E., et al. Changes in metabolic regulation and the microbiota composition after supplementation with different fatty acids in db/db mice. Int J Food Sci. , (2022).
- Zhang, Y., et al. Medium-chain triglyceride activated brown adipose tissue and induced reduction of fat mass in C57BL/6J mice fed high-fat diet. Biomed Environ Sci. 28 (2), 97-104 (2015).
- Basu, P., Kim, J. H., Saeed, S., Martins-Green, M. Using systems biology approaches to identify signalling pathways activated during chronic wound initiation. Wound Repair Regen. 29 (6), 881-898 (2021).
- Basu, P., Martins-Green, M. Signaling pathways associated with chronic wound progression: a systems biology approach. Antioxidants. 11 (8), 1506(2022).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS and skin microbiome are critical for initiation and development of chronic wounds in diabetic mice. Sci Rep. 9 (1), 19318(2019).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS create a microenvironment that significantly decreases the diversity of the microbiota in diabetic chronic wounds and promotes biofilm formation. Front Cell Infect Microbiol. 10 (259), (2020).
- Kim, J. H., et al. Pseudomonas aeruginosa activates quorum sensing, antioxidant enzymes and type VI secretion in response to OS to initiate biofilm formation and wound chronicity. Antioxidants. 13 (6), 655(2024).
- Kim, J. H., et al. Skin microbiota and its role in health and disease with an emphasis on wound healing and chronic wound development. , Elsevier eBooks. 297-311 (2022).
- Kim, J. H., et al. Targeting anaerobic respiration in Pseudomonas aeruginosa with chlorate improves healing of chronic wounds. Adv Wound Care. 13 (2), 53-69 (2024).
- Jabbari, P., et al. Chronic wound initiation: single-cell RNAseq of cutaneous wound tissue during initiation of chronic wound development. Antioxidants. 14 (2), 214(2025).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאהתגיות
