פלטפורמה מרובת אלקטרודות למידול אפילפסיה באמצעות מכלולי מוח פלוריפוטנטיים אנושיים שמקורם בתאי גזע

Summary

פרוטוקול זה נועד להרכיב ביציבות מכלולים מאוחים גביים-גחונים על מערכים מרובי אלקטרודות לצורך מידול אפילפסיה במבחנה.

Abstract

אורגנואידים של מוח אנושי הם מבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) המשחזרים היבטים של התפתחות המוח העוברי. המיזוג של הגב עם אורגנואידים במוח הגחון באזור מוגדר במבחנה מייצר assembloids, אשר יש משולבים פונקציונלית microcircuits עם נוירונים מעוררים ומעכבים. בשל מורכבותם המבנית ואוכלוסיית תאי העצב המגוונת שלהם, אסמבלואידים הפכו לכלי שימושי במבחנה לחקר פעילות רשת חריגה. רישומי מערך מרובה אלקטרודות (MEA) משמשים כשיטה ללכידת פוטנציאלים של שדות חשמליים, קוצים ודינמיקת רשת אורכית מאוכלוסיית תאי עצב מבלי לפגוע בשלמות קרום התא. עם זאת, הדבקת מכלולים על האלקטרודות לצורך הקלטות ארוכות טווח יכולה להיות מאתגרת בשל גודלן הגדול ושטח הפנים המוגבל שלהן עם האלקטרודות. כאן, אנו מדגימים שיטה להרכבת מכלולים על לוחות MEA לרישום פעילות אלקטרופיזיולוגית על פני טווח של חודשיים. למרות שהפרוטוקול הנוכחי משתמש באורגנואידים קליפת המוח האנושית, ניתן להתאים אותו באופן נרחב לאורגנואידים המובחנים כדי ליצור מודל לאזורי מוח אחרים. פרוטוקול זה קובע בדיקה אלקטרופיזיולוגית חזקה, אורכית, לחקר התפתחותה של רשת עצבית, ולפלטפורמה זו יש פוטנציאל לשמש בבדיקות סקר תרופתיות לפיתוח טיפולי באפילפסיה.

Introduction

אורגנואידים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) שמקורם בתאי גזע הם מבנים תלת-ממדיים המאורגנים באופן מרחבי ומשקפים את ארכיטקטורת הרקמה ואת מסלולי ההתפתחות in vivo. הם מורכבים מסוגי תאים מרובים, כולל אבות (תאי נוירואפיתל, גליה רדיאלית, אבות עצביים, אבות גלייה), נוירונים (נוירונים מעוררים דמויי קליפת המוח ונוירונים מעכבים), ותאי גלייה (אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים)^1,2. אסמבלואידים מייצגים את הדור הבא של אורגנואידים במוח, המסוגלים לשלב אזורי מוח מרובים ו / או שושלות תאים בתוך תרבית תלת ממדית. הם מספקים כלי שימושי למידול קשרים בין אזורי מוח שונים הדומים למקביליהם in vivo, לכידת אינטראקציות בין נוירונים ואסטרוציטים כדי לחקות טוב יותר רשתות עצביות בוגרות ומורכבות, ולחקור את הרכבת המעגלים העצביים. לכן, מכלולים הופכים לכלי בשימוש נרחב כדי לשחזר סימני היכר של פתופיזיולוגיה אפילפסיה, שבו אמצעים פונקציונליים נחוצים כדי לחקור רשתות עצביות חריגות שעשויות לעמוד בבסיס הגורם למחלה 3,4,5,6.

כדי למדל אינטראקציות בין נוירונים גלוטמטרגיים בקליפת המוח לבין נוירונים בין-עצביים GABAergic, מספר קבוצות פיתחו אורגנואידים נפרדים הדומים למוח הגבי והגחוני ואז התמזגו יחד למכלול רב-אזורי 7,8,9,10. כאן, פרוטוקול תרבית אסמבלואיד שתואר קודם לכן עם תת-סוגים עצביים ספציפיים לאזור^{יושם 9}. עם זאת, מחסום משמעותי הוא היעדר בדיקות תפקודיות הניתנות לשחזור כדי לנטר את פעילות הרשת העצבית במהלך ההתפתחות העצבית. בדיקות תפקודיות רבות של הרשתות באורגנואידים מניבות תוצאות בעלות שונות גבוהה בין קבוצות של התמיינות וקווי תאים. טכניקות הכרוכות בחיתוך או ניתוק אורגנואידים משנות את הרשתות הטבועות בהן על ידי ניתוק קישוריות סינפטית⁸.

מערכים מרובי אלקטרודות (MEA) מספקים תצוגה בקנה מידה גדול של פעילות הרשת לאורך זמן עם רזולוציה טמפורלית גבוהה כדי לאפיין תכונות אלקטרופיזיולוגיות של אורגנואידים מבלי להפריע לתנאי התרבית או לשלמות קרום התא¹¹. בהשוואה לאלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי, MEA מאפשר איסוף נתונים בתפוקה גבוהה המבוסס על אוכלוסיות גדולות של נוירונים ולא על תאים בודדים. פלטפורמות MEA משתנות בצפיפות האלקטרודות שלהן, ומספקות צרכים שונים במחקר אורגנואידים במוח¹². המערכות שנמצאות בשימוש נרחב, כפי שמוצג בפרוטוקול זה, רושמות בין 8 ל-64 אלקטרודות לבאר 13,14,15. MEAs בצפיפות גבוהה עם עד 26,400 אלקטרודות לכל באר מאפשרים רזולוציה מרחבית וזמנית מוגברת, כימות מהירות התפשטות פוטנציאל פעולה ושילוב עם גירוי אופטוגנטי 14,16,17. לכן, MEA משמש ככלי רב עוצמה למידול אפילפסיה במבחנה ופרדיגמה תרגומית לבדיקת תרופות נגד פרכוסים.

אתגר מרכזי אחד הוא לייצב את המכלולים הגדולים על משטח מתכת הידרופובי להקלטות ארוכות טווח. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה מפורטת לציפוי מכלולים שלמים על לוחות MEA לרישום אורכי ארוך טווח יחד עם בדיקות פרמקולוגיות. היתרונות הייחודיים של הפרוטוקול כוללים חיבור יציב של מכלולים למשטח האלקטרודה מבלי לאבד את הפעילות החשמלית, שימוש במדיה בזאלית נוירופיזיולוגית זמינה מסחרית כדי להאיץ את הבשלת הרשת התפקודית לאחר הציפוי, היתכנות לביצוע בדיקות פונקציונליות במורד הזרם כמו טיפול תרופתי, ויישום רחב לאורגנואידים שנוצרו עם פרוטוקולים ספציפיים לאזור אחרים.

המטרה היא לספק בדיקה תפקודית ברזולוציית זמן גבוהה כדי לחקור את פעילות הרשת, לבחון שינויים ספציפיים למחלה ולבדוק תרופות עם פוטנציאל טיפולי באפילפסיה. הוראות וידאו מסופקות עבור השלבים המאתגרים ביותר של פרוטוקול זה, המציגות את הטכניקות לציפוי מכלולים על לוחות MEA, כמו גם הקלטות מייצגות מתרבויות אלה.

Protocol

כל הליכי הניסוי שהודגמו להלן נערכו בהתאם להנחיות האתיות של מועצת הביקורת המוסדית של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מישיגן וועדת הפיקוח על מחקר תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. קווי iPSC המשמשים בפרוטוקול זה והניסויים המייצגים נגזרו מפיברובלסטים של עורלה אנושית שהתקבלו ממקור מסחרי. הפרטים של קווי התאים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. גזירה של אורגנואידים ספציפיים לגורל במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

הערה: פרוטוקול זה מכיל מידע להכנת 3 בארות בצלחת תרבית מיקרווול מ-5 בארות מפגש (~85%) של צלחת בעלת 6 בארות. פרוטוקול תחזוקת iPSC משתנה בהתאם לקווי התא.

1. הכן את המדיה הבודדת של תרביות תאים באמצעות ההרכב המפורט בטבלה 1. יש לאחסן מוגן מפני אור בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
2. יש לשטוף את כל הבארות לשימוש בצלחת תרבית המיקרווול עם 1 מ"ל DMEM/F-12 פעם אחת. הוסף 1 מ"ל / באר mTeSR פלוס + 50 מיקרומטר Y-27632 וסובב את הצלחת ב 2000 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר בועות אוויר מ microwells. אחסנו את הצלחת באינקובטור 37°C 5% CO₂ .
3. אזורים נקיים של iPSCs מובחנים עם קצה פיפטה P10 סטרילי מתחת למיקרוסקופ בספסל נקי זרימה למינרית. יש לשטוף את פסולת התאים מהשכבה החד-שכבתית עם PBS של 1 מ"ל/באר ללא סידן או מגנזיום.
4. נתקו את החד-שכבה לתאים בודדים על ידי הוספת 1 מ"ל/באר של מגיב דיסוציאציה תאי שחומם מראש והנחת הצלחת באינקובטור_CO2 של 37°C 5% למשך 4-7 דקות (תלוי במאפיינים ובמפגש של קווי התא) עד שרוב התאים יתרוממו, עם תסיסה עדינה כל 2-3 דקות.
5. הוסף 4 מ"ל של DMEM/F-12 לכל באר כדי לדלל את מגיב הדיסוציאציה של התא, וטריטוראט בינוני עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. לאסוף תרחיף תאים מכל הבארות של אותו קו לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
6. מסתובבים ב 200 x גרם במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר, שואפים את supernatant באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל, ומשעיפים תאים ב 2 מ"ל של mTeSR בתוספת + 50 μM Y-27632. הוציאו את תרחיף התאים 10 μL, ערבבו 1:1 (v/v) עם כחול טריפאן וספרו תאים עם מונה תאים אוטומטי.
7. צלחת 3 x 10⁶ תאים חיים לכל באר, 3 בארות לכל שורה. הוסף mTeSR פלוס + 50 מיקרומטר Y-27632 לפי הצורך כדי להביא את הנפח הכולל ל -2 מ"ל / באר. מסובבים את הצלחת ב 100 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר ומחזירים אותה לאינקובטור.
   הערה: צלחת תרבית המיקרווול המשמשת כאן מכילה 300 מיקרו-בארות לכל באר, כך שציפוי 3 x 10⁶ תאים מביא ל-10,000 תאים / מיקרו-באר.
8. למחרת, בצע החלפת מדיה בחצי נפח על ידי הסרה עדינה של 1 מ"ל מדיה והוספה איטית של 1 מ"ל של mTeSR בתוספת מדיה (ללא Y-27632) עם קצה פיפטה P1000. שמור את הקצה קרוב לפני השטח של המדיה ושאפו לאט ככל האפשר, כדי לא להפריע לתאים הצוברים בתחתית.
9. בדוק תחת מיקרוסקופ הפוך יום לאחר שינוי המדיה, וניתן לראות מתאר ברור של כל צבר. הסר את המדיה המקורית מכל באר עם קצוות פיפטה P1000.
10. רססו במתינות 0.5 מ"ל של מדיה אינדוקציה עצבית (NIM) עם דורסומורפין (DM) ו-SB-4321542 (SB) לכל באר עם קצוות P1000 סטריליים וחתוכים. מיד, מזלפים בעדינות אגרגטים התלויים במדיה ומעבירים אותם לצלחת תרבית תרחיף סטרילית בקוטר 10 ס"מ. חזור על הפעולה עד להעברת כל הצברים. אל תטריטור.
11. הוסף NIM + SB/DM נוספים לפי הצורך כדי להביא את הנפח הכולל ל- 10 מ"ל/מנה. שים את המנה על שייקר מסלול ב 37 ° C 5% CO₂ אינקובטור כדי למנוע היתוך ספונטני של אגרגטים. סמן את תאריך ההעברה כיום 0 של תרבית אורגנואידים.
12. מהיום הראשון ועד סופו, עקבו אחר מתכון המדיה בטבלה 1 וציר הזמן של שינוי המדיה⁹ באיור 1. יש לציין כי האורגנואידים מחולקים לשתי תרביות תרחיף המוגדרות כ"גביות" ו"גחון" ביום הרביעי.
    הערה: מספר נקודות זמן מרכזיות שיש לזכור: התרחבות אורגנואידים מתחילה ביום 6, כאשר המדיה עוברת למדיום התמיינות עצבית (NDM) עם EGF/FGF. התמיינות עצבית נתמכת החל מהיום ה-25 על ידי NDM + BDNF/NT3, ואורגנואידים נשמרים ב-NDM ללא גורמי גדילה החל מהיום ה-46.

2. תיוג ויראלי ויצירת מכלולים

הערה: תיוג ויראלי ^7,9 מומלץ לזיהוי הזהות של כל אורגנואיד ספציפי לאזור באסמבלואיד ולהקצאת פעילות אלקטרופיזיולוגית מאלקטרודות ספציפיות לאזורי אסמבלואיד. זה אופטימלי אם רק אורגנואיד אחד מצופה עבור כל MEA באר. פרוטוקול זה יכול לחול גם על ציפוי אורגנואיד יחיד.

1. חשב את נפחי מלאי הווירוסים ומדיית הדילול שיש להשתמש בהם: יש צורך במדיה של 200 μL עם וירוס כדי שכל אורגנואיד יסומן. אורגנואידים גביים מסומנים עם pAAV1-CAG-tdTomato, בדרך כלל ביחס דילול של 1:1000 (v/v), או בערך 2 x^{10 10} vg/mL. עבור אורגנואידים גחון, 1:300 (v/v), או 2 x 10¹¹ vg/mL pAAV1-mDLX-GFP וירוס.
   הערה: דילול צריך להיות titrated לאפקט הרצוי והם מושפעים titer ויראלי.
2. יש לחמם את כמות המדיה המתאימה ל-37°C. הפשרת מלאי וירוס מאוחסן ב -80 ° C על קרח. יש לסמן מספיק צלחות בנות 48 בארות כדי להכיל את כל האורגנואידים המסומנים.
3. שים המכילה 10% אקונומיקה במכסה המנוע. יש לגרש את כל החומרים הבאים במגע עם וירוסים לתוך הכד. לדלל את הנגיפים המופשרים במלואם באמצעי תרבית בצינורות חרוטיים נפרדים של 15 מ"ל, המסומנים כ"גביים" ו"גחונים".
4. העבר את יום 56 אורגנואידים מצלחות תרבית לצלחות של 48 בארות. אורגנואיד אחד לכל באר מומלץ כדי למנוע איחוי ספונטני בתרבית סטטית. הסר כמה שיותר מדיה תרבותית שיורית.
5. הוסף 200 μL של תערובת וירוס-מדיה לכל באר, בהתאמה. החזירו את הצלחות לאינקובטור 37°C 5% CO₂ . הטו את הצלחות על צלחת ריקה סטרילית כדי לסייע בריכוז חלקיקים נגיפיים לתחתית הבאר ולמטב את יעילות הטרנסדוקציה.
   הערה: חלקיקים נגיפיים נוטים לשקוע לתחתית הצינור החרוטי של 15 מ"ל, ולכן לעתים קרובות היפוך הצינור כדי לערבב וירוסים עם מדיה לפני הוספתם לכל באר חשוב מאוד כדי להבטיח יעילות התמרה אחידה לכל האורגנואידים.
6. למחרת (יום 57), הוסף 800 מיקרוליטר נוספים של מדיה תרבותית לכל באר כדי להביא את הנפח הכולל ל 1 מ"ל / באר.
7. שלושה ימים לאחר מכן (יום 60), בצע שינוי מדיה מלא על האורגנואידים המסומנים. אקונומיקה של כל חומר הבא במגע עם חלקיקים נגיפיים.
8. שלושה ימים לאחר מכן (יום 63), בדוק את ביטוי הפלואורסצנטיות תחת מיקרוסקופ הפוך אפיפלואורסצנטי. אם האות חזק, התחל לייצר מכלולים (ראה שלב 2.9).
9. שטפו את כל האורגנואידים המסומנים ב-PBS של 1 מ"ל/באר פעמיים כדי למנוע זיהום צולב על ידי חלקיקים נגיפיים שנותרו במהלך איחוי אורגנואידים. השתמש בקצה פיפטה P1000 חתוך כדי להעביר אורגנואיד גחוני אחד לכל באר גבית (או להיפך) ותייג מחדש את לוח האסמבלואיד בהתאם. הטו את הצלחות כמו בשלב 2.5 לאיחוי טוב יותר.
10. בצע בזהירות החלפת מדיה בחצי נפח 3 ימים לאחר הליך האיחוי (יום 66) מבלי להפריע למכלולים. בדרך כלל לוקח כשבוע ליצור מכלולים יציבים (יום 70).

3. הנחת מכלולים על לוחות MEA שטופלו מראש

הערה: לוקח לפחות 4 ימים להשלים את הליכי הכנת פני השטח של לוחות MEA לפני ציפוי מכלולים. כדי לחסוך זמן, ניתן לבצע במקביל איחוי אורגנואידים גביים וגחונים (כלומר, שלב 2.9) וטיפול מקדים MEA.

1. הכינו ריאגנטים לטיפול מקדים ולציפוי פני השטח.
   1. להכנת תמיסת דטרגנט/אנזים 1%, יש להמיס 0.5 גרם אבקת אנזים/דטרגנט ב-50 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה. מערבבים היטב עד להמסת האבקה במלואה. יש לעקר את התמיסה באמצעות מסנן ואקום סטרילי עליון בארון הבטיחות הביולוגית לפני הוספתה לבארות MEA. יש להכין טרי לפני כל שימוש.
      הערה: חומר הניקוי/אנזים מעקר את משטח MEA, מסיר שאריות שמנים מתהליך הייצור של MEA ומבטיח שהמשטח הידרופילי מספיק כדי לקדם אינטראקציות עם התרכובת ההידרופילית פוליאתילנימין (PEI)¹⁸.
   2. כדי להכין תמיסת PEI 0.07%¹⁹, התחל בהכנת תמיסת PEI של 7% על ידי ערבוב 1 מ"ל של תמיסת 50% PEI לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל עם 6 מ"ל של חיץ בוראט 1x. לדלל 1 מ"ל של מלאי 7% פתרון PEI ב 99 מ"ל של 1x borate buffer כדי להשיג את ריכוז העבודה הסופי. לעיקור, יש לסנן דרך יחידת סינון של 0.22 מיקרומטר בארון הבטיחות הביולוגית לפני השימוש.
      הערה: PEI, פולימר טעון חיובית, משמש בתהליך הציפוי הראשוני כדי להקל על החיבור של ציפוי משני טעון שלילית עם מטריצת קרום מרתף (BMM) והמכלולים²⁰. להוציא 1 מ"ל של 50% PEI על ידי מזיגה במקום pipetting לתוך צינור חרוט, שכן פתרון המניות הוא צמיג מאוד. ניתן למדוד בקלות רבה יותר את הכמות הדרושה על ידי שקילתה לתוך צינור חרוט, ולתמיסת PEI של 50% יש צפיפות של 1.08 גרם / מ"ל. ניתן לאחסן את תמיסת PEI של 7% במלאי ב- 1 מ"ל ב- -20 °C למשך עד חודש. בצע את כל השלבים הבאים בארון הבטיחות הביולוגית.
2. בהתחשב בגודל של כל assembloid, לוחות MEA 6-באר עם 64 אלקטרודות לכל באר משמשים כדי להכיל אסמבלואיד אחד לכל באר. חשב את מספר לוחות MEA הדרושים לניסויים כדי להבטיח מספיק עותקים ביולוגיים.
3. הוסף 1 מ"ל של 1% דטרגנט/תמיסת אנזים לכל באר של צלחת MEA סטרילית. היזהר לא לפגוע אלקטרודות עם קצה פיפטה. אם אתם משתמשים בשואב ואקום לשטיפות, אל תאפשרו לקצה לגעת במערך האלקטרודות. דגירה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
4. הסר חומר ניקוי/אנזים ושטוף כל באר חמש פעמים עם 1.5 מ"ל של מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה. מאחר שדטרגנט/אנזים אינו תואם ביולוגית, חשוב לוודא שהכימיקלים הנותרים נשטפים לחלוטין.
5. מלאו כל באר ב-1 מ"ל של מדיה תרבותית לריכוך מוקדם. החזירו את הצלחות לאינקובטור 5% CO₂ של 37°C למשך יומיים. חשיפת משטח MEA לתנאי תרבית תאים מקדמת את היצמדות התא.
6. הסר את מדיית התרבית וכסה את אלקטרודות MEA בכל באר ב- 50 μL של תמיסת PEI 0.07% לציפוי ראשוני. לדגור ב 37 ° C במשך 1 שעות.
7. שאפו לחלוטין לפתרון PEI. לשטוף כל באר עם 1 מ"ל של מים סטריליים deionized. בצעו 3 שטיפות מהירות בסך הכל. יבשו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בארון הבטיחות הביולוגית כשהמכסה כבוי.
8. כסו את אזור האלקטרודות בכל באר ב-50 μL של 1:20 (v/v) BMM מדולל בתרבית לציפוי משני. החזירו את לוחות MEA לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הוסיפו מים סטריליים לתאים המקיפים בארות כדי להבטיח לחות מספקת לאורך כל תקופת הציפוי.
9. למחרת, לשאוף BMM מדולל עם ואקום, משאיר שכבה דקה על פני השטח. אם נוצרה שכבה עבה, רססו בכוח את אזור המגע של האלקטרודה עם אמצעי תרבית באמצעות קצה פיפטה P1000. שטפו כמה פעמים שצריך כדי להסיר גושים עבים.
   הערה: BMM עבה שיורי יכול להפריע למגע אלקטרודות עם התאים.
10. אספו מכלול עם קצה P1000 חתוך באופן נרחב והניחו אותו על גבי האלקטרודות בבאר תוך העברת כמה שפחות מדיה.
11. במכסה מנוע זרימה למינרית תחת היקף דיסקציה, דחפו בזהירות את המכלול עם מחט דיסקציה סטרילית או קצה P20 למיקום הרצוי, שם ניתן לכסות בעיקר אורגנואידים גביים וגחונים על ידי אלקטרודות. השתמש בקצה P20 כדי להסיר נוזלים סביב המכלול. חזור על פעולה זו עבור כל המכלולים או תת-קבוצה, אשר ניתן לעשות זאת תוך מספר דקות.
    הערה: נסה לא לגעת או לשרוט את משטח MEA עם קצה פיפטה ו / או מחט. נסו לא לדקור או לקרוע את המכלול עם קצות פיפטה. סיימו את הציפוי מהר ככל האפשר כדי למנוע מהאורגנואיד להתייבש לחלוטין.
12. לדגור על המכלולים ב 37 ° C במשך 10 דקות (ללא מדיה). מעבירים את הלוחות מהאינקובטור למכסה מנוע זרימה למינרי ומורחים 2-3 טיפות קטנות של 1:50 BMM מדוללות במדיה תרבותית על גבי המכלולים תחת היקף דיסקציה. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות נוספות.
13. מוסיפים בזהירות 3 טיפות של מדיה תרבותית קרוב למכלולים תחת היקף דיסקציה. זה שומר על האורגנואידים hydrated. לדגור ב 37 ° C במשך 1 שעות.
    הערה: אם המכלול זז או צף בשלבים הבאים, יש להפעיל מחדש את הציפוי משלב 3.11.
14. בכל שעה, להוסיף בזהירות 20-50 μL של מדיה תרבית תאים לכל באר תחת היקף דיסקציה. זה יכול להיעשות במהלך יום. המטרה היא להגיע לפחות 250 μL של נפח כולל בסוף היום.
15. למחרת, בדוק אם כל המכלולים מיושבים, ומתייצבים תחת היקף הדיסקציה. הוסף 750 μL נוספים של מדיה תרבותית כדי להגיע לנפח כולל של 1 מ"ל / באר. השאירו את הצלחות ללא הפרעה במשך יומיים לפחות.
16. בצע בזהירות שינויי מדיה שבועיים על ידי הוצאת 500 μL של מדיה תרבותית והוספת 700 μL של מדיה בסיסית נוירופיזיולוגית. נפח המדיה הנוסף מהווה אידוי וניתן לכוונן אותו בהתאם לכמות האידוי שיש ללוחית MEA שבה נעשה שימוש. הוסיפו מים סטריליים סביב הבארות לפי הצורך כדי למזער את האידוי מבארות MEA.

4. רישום MEA וניתוח נתונים

1. התחל להקליט MEA כשבוע לאחר המעבר למדיה הבסיסית הנוירופיזיולוגית (בדרך כלל סביב יום 78).
2. המתן עד שתא ההקלטה יגיע לטמפרטורה שנקבעה לו (בדרך כלל 37 מעלות צלזיוס). העבירו צלחת למכשיר ואפשרו להם להתאזן לפחות 5 דקות לפני ההקלטה.
3. הגדרות חומרה בזמן אמת
   1. הגדר את תדירות הדגימה, כלומר את קצב רישום נתוני המתח הגולמי. מומלץ להגדיר את ברירת המחדל (12.5 kHz).
   2. ציין מצב אנלוגי (בדרך כלל קוצים עצביים, כמו במקרה זה) כדי להגדיר את רוחב הפס והרווח של החומרה עבור יישומים מסוימים. לניטור חזותי של הפעילות במהלך ההקלטה, השתמש במודולים גלאי ספייק וגלאי פרץ.
      הערה: ההגדרות האנלוגיות משפיעות על האופן שבו נתוני המתח הגולמי נרשמים ולא ניתן לשנות אותן לאחר רישום הנתונים.
   3. (אופציונלי) החל מסנן דיגיטלי של חומרה על נתוני ההקלטה. אפשרויות סינון מעבר נמוך כוללות חלון קייזר של 2 קילו-הרץ או 3 קילו-הרץ. ניתן לשנות את הגדרות ברירת המחדל לאחר בחירת ההגדרות האנלוגיות.
   4. הגדר להפניה לפי חציון (ברירת מחדל), המומלצת מאוד להקלטה עצבית, כמו במקרה זה. הפניה משפרת את האיכות של אותות באמפליטודה נמוכה על ידי הפחתת הפרעות הרעש המשותפות לקבוצות ערוצים.
      הערה: ניתן לכוונן את הפרמטרים לעיל לפי הצורך בהתאם לפעילות הנראית במכלולים, אך יש לשמור עליהם עקביים עבור כל ההקלטות בניסוי נתון.
4. הוסף מפות לוחות ותיאורים (במידת הצורך). ייבא את מפת הלוח מההקלטה הקודמת עבור אותו לוח כדי להבטיח עקביות ולהקל על עיבוד נתוני האצווה. ודא ששמות הקבצים נכונים.
5. אם האותות נראים טוב (רעש מינימלי וחפץ), רשום את הנתונים הגולמיים. בדרך כלל 2-5 דקות של הקלטה מספיקות למדגם מייצג.
6. תיעדו לאורך הפעילות החשמלית פעם או פעמיים בשבוע, במשך 5-15 דקות, בהתאם לתכנון הניסוי. המתן לפחות 24 שעות לאחר כל החלפת מדיה לפני שתתחיל בסבב ההקלטה הבא, מכיוון שהפעילות החשמלית יורדת מיד לאחר כל שינוי מדיה.
7. (אופציונלי) אם יש צורך למקם את הפעילות החשמלית ולהבדיל בין אורגנואידים גביים וגחונים, או אם יש צורך לנתח את הפעילות של כל אלקטרודה בנפרד, קבלו תמונה של כל מכלול תחת שדה בהיר ואפיפלואורסנציה (איור 2B) לאחר כל הקלטה.
8. בעת ניתוח הנתונים, החל תצורת ניתוח, כולל גלאי ספייק/פרץ ומהדר סטטיסטיקה. השתמש בערכי סף אדפטיביים שנקבעו ל- 5.5-6 סטיות תקן מקו הבסיס לזיהוי ספייק. זהה התפרצויות כפעילות עם קפיצות של ≥5 ב-100 מילישניות¹³. הגדר את פעילות הרשת כאשר יותר מ- 25% מכלל האלקטרודות הפעילות יורות בטווח של 100 אלפיות השנייה, עם מינימום של 50 קפיצות לכל פרץ רשת^13,14.
   הערה: פרמטרים אלה מווסתים בהתאם למאפייני הירי של ניסוי ספציפי. כדי להגביר את הרגישות עבור קוצים באמפליטודה נמוכה, ניתן להוריד את הסף המסתגל לזיהוי ספייקים. לזיהוי פרצים ניתן להשתמש בשיטות שונות, וניתן להתאים את הפרמטרים לאיתור פרצי קוצים השונים משמעותית מפעילות הרקע. הפרמטרים של פעילות הרשת עשויים להיות מווסתים לאחוז נמוך יותר של אלקטרודות, במיוחד כאשר מכלולים אינם מכסים את כל שדה האלקטרודות. כל הפרמטרים צריכים להישאר עקביים למשך הניסוי כדי לאפשר השוואות אורך.
9. הפעל את מודול מהדר הסטטיסטיקה לעיבוד אצווה תוך הפעלה חוזרת של הנתונים המוקלטים. ייצא מדדים מתקדמים ו/או קובצי פלט ספייק לניתוח מתקדם.
   הערה: פלט מדדים מתקדמים מכיל קובץ .csv עם ממוצעי אלקטרודה, באר וקבוצה עבור ממוצע ירי, פיצוץ וסנכרון. פלט ספייק (קובץ .spk) כולל עקבות צורת גל לכל הדוקרנים, שניתן לייבא לפלטפורמות אחרות לצורך ניתוח מתקדם, למשל מיון ספייק.

5. בדיקה פרמקולוגית בנקודת קצה ומיחזור צלחות

הערה: ניתן לבצע בדיקות טיפול תרופתי לאחר שהמכלולים בוגרים מספיק והפעילות החשמלית מגיעה לשיא. רישום הפעילות הבסיסית/לפני הטיפול והפעילות שלאחר הטיפול צריך להתבצע באותו היום.

1. מוסיפים 1-10 מיקרוליטר של תמיסת סמים ממש על גבי המכלול, ומערבלים בעדינות את הצלחת כדי להבטיח תערובת אחידה. זמן דגירה ארוך יותר במדיה המכילה תרופות מומלץ במקרים מסוימים, למשל, בדיקות טיפול תרופתי הקשורות לסינפסה עם אגוניסטים/אנטגוניסטים לקולטן גלוטמט/GABA (איור 2E) (ראו פרטים בסעיף התוצאות).
   הערה: מומלץ להוסיף כמות קטנה של תמיסת תרופות לכל באר כדי להשיג ריכוז עבודה סופי מכיוון ששינוי נפח גדול יפחית באופן זמני את הפעילות החשמלית באופן כללי. חשוב לוודא כי תוספת של רכב שבו תרופות עניין מומסים אינו מעורר שינויים משמעותיים בפרמטרים אלקטרופיזיולוגיים.
2. בצע מספיק שטיפות PBS (בדרך כלל 3) ושטוף את התרופות לאחר ההקלטה שלאחר הטיפול. בצע הקלטה נוספת למחרת לאחר שטיפת התרופה כדי לראות אם הפעילות החשמלית חוזרת לרמה הבסיסית.
3. לחלופין, יש להפריד בכוח את המכלולים מלוחית MEA בסוף ההקלטות כדי לבצע ניסויים נוספים, כגון הדמיה חיה, קיבוע עם 4% פרפורמלדהיד עבור אימונוסטיין שלם, או ליזה עבור RNA או מיצוי חלבונים.
4. למטרות ניתוח, השתמש לפחות בשלושה עותקים טכניים וביולוגיים עבור כל מצב. לבטא נתונים אלקטרופיזיולוגיים כממוצע של n ≥ 3 משוכפלים.
5. כדי למחזר את הצלחת בסוף הניסויים, שאפו את המדיה הנותרת לאחר הסרת המכלולים המחוברים. יש לשטוף פעם אחת עם PBS סטרילי. כסו לחלוטין את אזור המתכת ב-200 מיקרוליטר/באר של 0.25% טריפסין-EDTA והחזירו את הצלחת לאינקובטור של 37°C למשך הלילה.
6. למחרת, לשאוף טריפסין, לשטוף פעמיים עם אתנול סטרילי 70% ושלוש פעמים עם מים סטריליים deionized.
7. יבשו את הצלחת באוויר בארון הבטיחות הביולוגית למשך 15 דקות כשהמכסה כבוי או עד שהיא יבשה לחלוטין. אטמו את הצלחת הנקייה בשקית ניילון ואחסנו אותה בטמפרטורת החדר עד לשימוש עתידי.
   הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בצלחת MEA מנוקה היטב שלוש פעמים מבלי לאבד באופן משמעותי את איכות ההקלטה.

Results

מכלולים גביים-גחונים אנושיים צופו על לוח MEA בעל 6 בארות (n = 6 לכל הבחנה, 3 התבדלויות), כאשר כל באר הכילה 64 אלקטרודות (איור 2A). תשעה מתוך עשרה מכלולים שתוכננו לרישום אורכי היו מחוברים היטב לאלקטרודות במשך יותר מ-50 יום במבחנה (איור 2D). 6 מתוך 8 מכלולים המיועדים לבדיקות פרמקולוגיות יושבו בהצלחה בשלב השטיפה עם פעילות רשת מתאימה לשלב הפיתוח (איור 2E). מוצגות תמונות של ניגודיות פאזה ופלואורסצנטיות מבאר מייצגת אחת (איור 2B), שבהן ניתן להבחין בקלות בין אורגנואידים גביים המסומנים בתווית AAV-CAG-tdTomato לבין אורגנואידים גחונים המסומנים בתווית AAV-mDLX-GFP ^7,9.

ניתן לנתח את פעילות תאי העצב באזור המזרח התיכון וצפון אפריקה כדי להעריך את ההתרגשות התאית הכוללת ואת פעילות הרשת, באמצעות מגוון פרמטרים. קצבי הירי הכוללים ברחבי התרבית מספקים מידע על רגישות התאית והרשת, בעוד שתדירות ההתפרצויות המסונכרנות על פני אלקטרודות מרובות מצביעה על טווח הרשתות הפעילות סינפטית של נוירונים. קפיצות חוזרות מרובות המתרחשות על פני אלקטרודות מובחנות מרחבית במשך פרק זמן קצר (התפוצצות רשת) יכולות לשמש כמתאם ביולוגי לפעילות דמוית התקף, אם כי מכלולים על MEAs נותרו מוגבלים בהשוואה לאורגניזם שלם שיכול לחוות התקפים בתום לב . איור 2C מדגים את דפוסי התפוצצות הרשת של מכלולים שגודלו בתרבית במדיה בסיסית נוירופיזיולוגית זמינה מסחרית בימים 84 ו-91, עם משך התפוצצות מוגבר בנקודת הזמן המאוחרת יותר, ככל הנראה עקב הבשלה תפקודית של תאי העצב. במקרה הזה, הפעילות התאית והרשתית עולה בהדרגה מהיום שבו משטחים מצופים, בדרך כלל מגיעה לשיאה ביום 92, וכמעט דועכת ביום 125 (איור 2D). ההבשלה המוגברת בשלב מאוחר יותר תורמת ככל הנראה למשך ההתפרצות המסונכרנת המורחבת בנקודת זמן ההקלטה המאוחרת יותר.

Bicuculline, אנטגוניסט קולטן GABA_A , משפר את פעילות הרשת המסונכרנת של המכלולים, כפי שמוצג על ידי קצבי ירי גבוהים משמעותית ותדרי פרץ (רשת) לאחר הוספת התרופה ביום 108 (איור 2E). הדבר דומה למה שהוכח בעבר בהקלטות אלקטרופיזיולוגיה של תא בודד²¹. ניתוח הספק לבדיקה הפרמקולוגית נערך באמצעות בסיס G*Power3 על גודל אפקט של 0.94, ואלפא של 0.05. נדרש מדגם כולל של 15 מכלולים עם שלוש קבוצות שוות בגודלן n = 5 כדי להשיג חזקה של 0.8 (איור 2E). בקרת רכב כלולה כדי לוודא שהתגובה היא אירוע איתות אמיתי ולא רק שינוי בעוצמת האות שעשוי לנבוע מהוספה של כמות קטנה של מדיה (איור 2E).

איור 1: סקירה כללית של המחקר. פרוטוקול ליצירה וציפוי של מכלולים בעלי תווית כפולה על ציר הזמן של MEA של פרוטוקול ההתמיינות המפרט שלבים קריטיים ותוספים מתאימים של מולקולות קטנות (למידע נוסף על ההרכב, ראה טבלה 1 וטבלת חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: רישום MEA של מכלולים. (A) מפת חום של פעילות ירי ממוצעת מלוח MEA יחיד (n = 6 בארות) ביום 82, כלומר ביום 10 שלאחר הציפוי. כל הבארות מייצגות תרבויות מאותו מצב וגנוטיפ. (B) ניגודיות פאזה מייצגת ותמונות קונפוקליות של המכלול, כאשר המכלול הגבי מסומן באדום והגחון בירוק. ראשי חץ לבנים מצביעים על נוירונים בין-עצביים GABAergic נודדים מהצד הגחוני לצד הגבי. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (C) שרטוט רסטר מייצג מעל 120 שניות של זמן הקלטה מבאר יחידה. פרצי רשת מודגשים בקופסה סגולה. מודגמות שתי נקודות זמן נפרדות, יום 78 (שבוע לאחר הציפוי, יום תחילת ההקלטה) ויום 92 (3 שבועות לאחר הציפוי, גם הוא כאשר הפעילות מגיעה לשיא). (D) כימות של קצבי ירי ממוצעים, תדירות התפוצצות ותדירות התפוצצות הרשת מהיום ה-78 ועד היום ה-127 (n = 3 הבדלים, 3 מכלולים/דיפרנציאציה). כל עקומה מציינת מכלול בודד אחד, המורכב מ-3 הבדלים (מקודדים בצבע). העקומה האדומה מדגימה את הערך הממוצע. (E) כימות תוצאות הבדיקה הדו-קולינית (n = 6 אסמבלואידים/תנאי). גרף העמודות הוצג כממוצע ± SEM. כל נקודה מייצגת מכלול אחד, המורכב מ-3 קבוצות של בידול (מקודד בצבע). בוצע מבחן פרידמן לא פרמטרי. **p < 0.01; NS, לא משמעותי. MEA, מערכים מרובי אלקטרודות. מפת חום ותרשימי רסטר נוצרים באמצעות התוכנה האנליטית Neural Metric Tool. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: מרכיבי מדיה בשלבי בידול שונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

שיטות מבוססות MEA לרישומים אלקטרופיזיולוגיים של פעילות הרשת במכלולים שמקורם ב- iPSC שימשו למידול חוץ גופי של אפילפסיה^22,23. לפלטפורמה מוצעת זו המשלבת קשרים סינפטיים מעוררים ומעכבים יש פוטנציאל לטפל במנגנונים של רגישות יתר עצבית ובתפקיד של נוירונים בין-עצביים בקליפת המוח בתהליך של אפילפטוגנזה. בנוסף, פלטפורמה זו מאפשרת ייצוב מכלולים ואיסוף נתונים אלקטרופיזיולוגיים אורכיים למשך כ-50 יום במבחנה, גם בנוכחות הפרעות פרמקולוגיות, ובכך מספקת גישה לבדיקת תרכובות בעלות מטרות טיפוליות פוטנציאליות.

ייצוב מכלולים בוגרים וגדולים יחסית על משטח הידרופובי במשך תקופה ארוכה במבחנה היה מאתגר מבחינה טכנית. כדי להתגבר על מכשול זה, אסטרטגיית הציפוי הכפול מיושמת עם כימיקלים טעונים הפוך כדי להקל על היצמדות לטווח קצר וארוך של אורגנואידים למשטח האלקטרודה. פרוטוקול זה מייעל את שיטה²⁴ שהייתה בשימוש בעבר על ידי החלפת ריאגנטים של ציפוי לוחות מפולי-L-אורניתין (PLO)/למינין ל-PEI/BMM, ומשיג חיבור מוצק עם שיעורי הצלחה גבוהים ורעילות נמוכה. יתר על כן, למערכת תרבות ארוכת טווח מיוצבת זו יש פוטנציאל להניב נתונים בעלי תפוקה גבוהה. לדוגמה, תיוג מראש עם וירוסים כפולים יכול להשלים מיון ספייק לפי אלקטרודות בודדות כדי למקם ולהשוות פעילות מאזורים שונים. הפלטפורמה המוצעת מספקת גם כלי יציב לרישום פוטנציאלי שדה מקומיים, הרלוונטי ביותר לתפקוד האינטרנוירונים מבלי לשבש את המבנה השלם של מכלולים²⁵. המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא שהמכלולים משוטחים לאחר הציפוי, מה שמעלה חששות לגבי האם המבנים התלת-ממדיים הראשוניים נשמרים או לא. גידול אורגנואידים סביב האלקטרודות באמצעות פלטפורמות MEA מתקדמות יותר העוטפות אורגנואיד באלקטרודות²⁶ עשוי להתגבר על המגבלה.

אחד המכשולים העיקריים של שיטות מבוססות MEA לרישום אלקטרופיזיולוגי של אורגנואידים הוא השונות והשכפול של ממצאי ניסוי על פני פרוטוקולי התמיינות ואפילו קבוצות של התמיינות. מחקרים קודמים הראו כי פעילות הרשת של נוירונים הנמדדת על ידי MEA תלויה במצב ההתבגרות העצבית של אורגנואידים גביים וגחונים²⁷. הקלטה ממכלולים בנקודת זמן מאוחרת יותר עם נוירונים ומעגלים בוגרים יחסית היא אחת הדרכים לשפר את העקביות. יתר על כן, הבחירה במערכות MEA מרובות בארות המייצרות נתונים בתפוקה גבוהה תאפשר השוואות סטטיסטיות לאור השונות הניסויית. אם הפעילות האלקטרופיזיולוגית של תרבית אינה עולה בקנה אחד עם מה שצפוי בנקודת זמן נתונה, איסוף התרבית השלמה מהפלטפורמה הפונקציונלית עבור אמצעי בקרת איכות, כולל ניתוח אימונוציטוכימי ושעתוק (transcriptomic analysis), יהיה חשוב ומועיל.

החשיבות העליונה לפלטפורמה המוצעת היא לשלב באופן פונקציונלי נוירונים מעוררים בקליפת המוח בצד הגבי ואינטרנוירונים מעכבים בצד הגחוני. פרוטוקולים ליצירת אורגנואידים ספציפיים לאזור המוח שנמצאו בספרות שונים מאוד ביחס לתנאי התקשורת, עיתוי התרביות, פרופילי התשואה וההבשלה, בין גורמים אחרים²⁸. בעוד פרוטוקול זה הוא ספציפי לקליפת המוח ולגנגליונים ביכולתו לייצר נוירונים מעוררים ונוירונים בין-עצביים GABAergic, ניתן להשתמש בטכניקות התמיינות מבוססות היטב כדי ליצור נוירונים שמקורם ב-iPSC המציגים זהויות אחרות, כגון נוירונים מוטוריים²⁹ ותאי Purkinje³⁰. לפיכך, לפלטפורמה המוצעת יש פוטנציאל למדל מעגלים עצביים בין קליפת המוח לבין חוט השדרה / המוח הקטן. לאחר אופטימיזציה מסוימת הקשורה לעיתוי של ציפוי והדמיה של סוגי תאים עם תיוג ויראלי, שיטה זו יכולה להיות מתורגמת למודלים אחרים של מחלות מלבד אפילפסיה, כמו טרשת אמיוטרופית צידית (ALS)¹⁷.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ס"מ קורנינג כלי תרבית לא מטופלים	TC קורנינג	08-772-32	לתרבית השעיה על השייקר
100 מ"ל	פישר סיינטיפיק	FB100100
100% אתנול	פישר סיינטיפיק	BP28184-4L
2-Mercaptoethanol (β-ME)	תרמו פישר		21985023 ריכוז עבודה 100 μ צלחת
תרבית תאים M 48 בארות	פישר סיינטיפיק	50-202-140
צלחת תרבית תאים 6 בארות	פישר סיינטיפיק	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Allegra X-14R צנטריפוגה מקוררת	בקמן קולטר	BE-AX14R
Allopregnanolone	Cayman	16930	השהה 5 מ"ג לתוך DMSO כדי לקבל תמיסת מלאי של 1 מ"מ. Aliquot והקפאה ב- & מינוס; 80 מעלות צלזיוס יש לדלל ב-1:10,000 לשימוש. ריכוז עבודה 100 ננומטר.
מונה תאים אוטומטי	Thermo Fisher	AMQAX2000
Axion CytoView MEA צלחות 6 בארות	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Axion Maestro פלטפורמת MEA	Axion Biosystems	Maestro	בקרת סביבה טמפ'
(רגיל, עם ויטמין A)	Thermo Fisher	21985023
B-27 (ללא ויטמין A)	Thermo Fisher	12587010
מטריצת ממברנת הבסיס - Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
אמבט חרוזים	פישר סיינטיפיק	10-876-001
מיקרוסקופ הפוך Isotemp Benchtop	Olympus	CKX53	נשמר בזרימה למינרית ספסל נקי
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	ריכוז עבודה 10 μ M
Bleach	CLOROX	67619-26
מאגר בוראט 20x	Thermo Fisher	28341	ריכוז עבודה ב-1x
BrainPhys media	StemCell Technologies	5790
מגיב דיסוציאציה של תאים (StemPro Accutase)	Thermo Fisher	A1110501
Celltron שייקר אורביטלי	HT-Infors	I69222
חומר ניקוי/אנזים (Terg-A-Zyme)	סיגמא-אולדריץ		Z273287 ריכוז עבודה 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-גלוטמין	תרמו פישר	113300
DMSO	סיגמא-אולדריץ'	67685
דורסומורפין	סיגמא-אולדריץ'	P5499	ממיסים 5 מ"ג לתוך DMSO כדי לקבל תמיסת מלאי של 10 מ"מ. Aliquot והקפאה ב- & מינוס; 20 מעלות צלזיוס יש לדלל ב-1:2000 לשימוש. (ריכוז עבודה 5 μ M)
D-PBS ללא סידן או מגנזיום	Thermo Fisher	14190144
נוירוטרופי (GDNF)	Peprotech	450-10	ממיסים 100 μ g ב-1 מ"ל של PBS עד 100 μ גרם/מ"ל. Aliquot והקפאה ב- & מינוס; 20 מעלות צלזיוס יש לדלל ב-1:5000 לשימוש. (ריכוז עבודה 20 ננוגרם/מ"ל).
תוסף GlutaMAX	תרמו פישר	35050061
המציטומטר	בחירת מיקרוסקופיה מדעי	63510-20
HEPES	תרמו פישר	15630080
Heraguard ECO ספסל נקי	תרמו פישר	51029692
חממת תרבית תאים מבוקרת לחות	תרמו פישר	370	מוגדר ל 37 מעלות; C, 5% CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	Aliquot ולהקפיא ב & מינוס; 80 מעלות צלזיוס. זה ישקע אם יופשר בטמפרטורת החדר. יש למקם את הכמות הקפואה ישירות לתוך 37 מעלות; C לפני השימוש.
החלפת סרום נוקאאוט (KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus (בינוני + תוספים)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP, מדיום מיוצב ללא מזין לתאי iPSC אנושיים
תוסף N2	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal A	Thermo Fisher	21103049
חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)	תרמו פישר	11140050
NT3	Peprotech	450-03	ממיסים 100 μ g ב-1 מ"ל של PBS עד 100 μ גרם/מ"ל. Aliquot והקפאה ב- & מינוס; 20 מעלות צלזיוס יש לדלל ב-1:5000 לשימוש. (ריכוז עבודה 20 ננוגרם/מ"ל).
NuFF פיברובלסטים של עורלה יילודים אנושיים	MTI-GlobalStem	GSC-3002
Parafilm		PARAFILM P7793
Penicilin/Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Pipette (P10, P200, P1000)	Eppendorf	EP4926000034	חיתוך חיטוי P1000 טיפים לאיסוף אורגנואידים
פולי (אתילנימין) (PEI)	סיגמא-אולדריץ'	P3143	לדלל מלאי במאגר בוראט סטרילי. ריכוז עבודה 0.07%. ראה פרטים בכתב היד.
גורם גדילה אפידרמלי אנושי רקומביננטי (EGF)	R& D Systems	236-EG-200	מושעה ב-PBS. יש להקפיא ולהקפיא ב -20 מעלות צלזיוס.
גורם גדילה פיברובלסטים אנושי רקומביננטי (FGF) - בסיסי	פפרוטק	100-18B	מושעה ב-PBS. יש להקפיא ולהקפיא ב -20 מעלות צלזיוס.
גורם נוירוטרופי רקומביננטי שמקורו במוח אנושי (BDNF)	Peprotech	450-02	זמן קצר לפני הרכבה מחדש. יש להמיס 100 μ g ב-1 מ"ל של PBS עד 100 μ גרם/מ"ל. Aliquot והקפאה ב- & מינוס; 20 מעלות צלזיוס יש לדלל ב-1:5000 לשימוש. (ריכוז עבודה 20 ננוגרם/מ"ל).
חומצה רטינואית (RA)	Sigma-Aldrich	R2625	ממיסים 100 מ"ג ל-3.3 מ"ל של DMSO כדי לקבל תמיסת מלאי של 100 מ"מ. Aliquot את המניה 100 μ L / צינור והקפאה ב & מינוס; 80 מעלות צלזיוס. קח 200 μ L של מלאי 100 מ"מ ולדלל פי 10 (הוסף 1.8 מ"ל של DMSO) כדי ליצור מלאי של 10 מ"מ. Aliquot 50 μ L / צינור ואחסון ב & מינוס; 80 מעלות צלזיוס יש לדלל ב-1:100,000 לשימוש. (ריכוז עבודה 100 ננומטר).
מעכב ROCK Y-27632	Tocris	1254	1:200 מ-10 מ"מ מלאי
SAG (אגוניסט מוחלק)	Selleckchem	S7779	Aliquot והקפאה ב-& מינוס; 80 °C. ריכוז מלאי 1 מ"מ. יש להשתמש בדילול של 1:10,000 (ריכוז עבודה 100 ננומטר).
SB-431542	Tocris	1614	ממיסים 5 מ"ג ל-1.3 מ"ל של DMSO כדי לקבל תמיסת מלאי של 10 מ"מ. Aliquot והקפאה ב- & מינוס; 80 מעלות צלזיוס יש לדלל ב-1:1000 לשימוש. (ריכוז עבודה 10 μ M)
מילוי פיפטה סרולוגי	פישר סיינטיפיק	14-387-166
צינור ואקום Steriflip מסנן עליון	סיגמא-אולדריץ'	SE1M179M6
קולטי אדים לתרבית תאים סטריליים	חברת בייקר	SG-600
תמיסה כחולה טריפן (0.4%)	תרמו פישר	15250061
טריפסין-EDTA (0.25%)	תרמו פישר	25200056
סטריאומיקרוסקופ זום	Olympus	SZ61/SZ51	נשמר בספסל נקי בזרימה למינרית