הפרוטוקול המוצג מתאר הליך לכימות תאים ברי קיימא אך לא ניתנים לתרבית (VBNC) בתרביות חיידקים שטופלו בדבש מאנוקה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
צביעה חיה/מתת לכימות תאים ברי קיימא אך לא ניתנים לתרבית בחיידקים הגורמים לפצעים שטופלו בדבש מנוקה
במאמר זה
סיכום
תקציר
עמידות לאנטיביוטיקה וסבילות בקרב חיידקים מהווים איום משמעותי על הבריאות העולמית. מנגנונים התורמים לעמידות וסבילות לאנטיביוטיקה כוללים מוטציות גנטיות, רכישת גנים עמידים, ומעבר למצבי תרדמה ברי קיימא אך לא ניתנים לתרבות (VBNC) ומצבי תרדמה אחרים, בהתאמה. למרות שהם זהים גנטית לעמיתיהם שאינם עמידים לאנטיביוטיקה, תאי VBNC מתחמקים מהשפעות אנטיביוטיות על ידי הישארות לא פעילים מבחינה מטבולית. אנטיביוטיקה יעילה רק כאשר תהליכי היעד שלה, כגון שכפול או שעתוק DNA, פעילים. מאחר שגורמי לחץ סביבתיים, במיוחד אנטיביוטיקה, יכולים לגרום לחיידקים להיכנס לתרדמה, יש צורך באנטי-מיקרוביאלים חלופיים כדי למזער או למנוע את התגובה הזו. דבש מנוקה אנטי-בקטריאלי (MH) יעיל נגד חיידקים רבים, עם התפתחות נדירה של עמידות. המנגנונים האנטי-מיקרוביאליים הרב-גוניים שלו הופכים אותו לסוכן רב ערך לטיפול בזיהומים חיידקיים. מחקר זה חקר את סרבנות MH להתפתחות עמידות לאנטיביוטיקה על ידי בדיקת ההשערה ש-MH משרה פחות תאי VBNC מאשר אנטיביוטיקה קונבנציונלית. כדי לחקור זאת, פותח פרוטוקול לטיפול בחיידקים הגורמים לפצעים Staphylococcus aureus ו-Pseudomonas aeruginosa עם ריכוזים מעכבים מינימליים של MH או האנטיביוטיקה הקונבנציונלית tobramycin או meropenem, שהשתמשו בספירת הצלחות הקיימא כדי לזהות תאים פעילים מטבולית וצביעה חיה/מתה כדי לזהות את כל התאים הברי קיימא. מספר תאי ה-VBNC היה שווה למספר התאים הקיים פחות מספר התא הניתן לתרבית. בניסויים מסוימים, מספר התאים הניתנים לתרבית היה גבוה ממספר התאים הבר-קיימא, מה שנתן מספר שלילי של תאי VBNC; לפיכך, מספרי תאי VBNC לא הושוו ישירות. במקום זאת, הושוו מספרי תאים ניתנים לתרבות וברי-קיימא עבור כל טיפול. רק ל-P. aeruginosa שטופל בטוברמיצין היו פחות תאים ניתנים לתרבית באופן משמעותי מאשר תאים ברי קיימא, מה שמעיד על מספר גבוה יותר של תאי VBNC. פרוטוקול זה מהיר וקל וניתן להשתמש בו כדי להעריך אינדוקציה MH של תאי VBNC בחיידקים פתוגניים אחרים.
מבוא
חיידקים במצב תרדמה בר-קיימא אך לא מתורבת (VBNC) שורדים טיפול אנטיביוטי וגורמים למחלות זיהומיות חוזרות ולעיתים קטלניות 1,2,3. מוכרת לנו יותר היא עמידות לאנטיביוטיקה, המתרחשת באמצעות שינוי גנטי תורשתי4. השינוי הגנטי מספק עמידות לאנטיביוטיקה ספציפית על ידי מספר מנגנונים, כולל הגבלת ספיגת אנטיביוטיקה, הגדלת פליטת האנטיביוטיקה, שינוי מטרת האנטיביוטיקה או השבתת האנטיביוטיקה4. לעומת זאת, חיידקים במצבי תרדמה מציגים סבילות אנטיביוטית רחבה יותר ולא תורשתית על ידי הפחתת חילוף החומרים שלהם
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מכיוון ש-P. aeruginosa (ATCC9721) ו-S. aureus (ATCC29213) מסווגים כסוכני בטיחות ביולוגית ברמה 2, החדרים שבהם מתבצעת העבודה חייבים להיות בעלי גישה מוגבלת ולהיות מצוידים בארון בטיחות ביולוגית למניפולציות שעלולות ליצור התזות או אירוסולים, כגון תרביות תסיסה וצנטריפוגות. בכל השלבים של פרוטוקול זה, יש ללבוש ציוד מגן אישי (PPE), כולל חלוק מעבדה, משקפי מגן וכפפות. כל הריאגנטים והציוד המשמשים בניסויים רשומים בטבלת החומרים.
1. הכנת מרק סטרילי ומדיה לתרבות אגר
- הכינו לוריא ברטאני ומולר הינטון, NaCl (0.85%), אנטיביוטיקה וכלי זכוכית.
- מכינים את אמצע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
צורות חיים חיידקיות ברות קיימא אך לא ניתנות לתרבות (VBNC) נגרמות על ידי גורמי לחץ, כולל טיפול אנטיביוטי, וגורמות לזיהומים חוזרים בשל הסבילות שלהם לאנטיביוטיקה. מכיוון ש-MH הוא אנטי-מיקרוביאלי רחב טווח שאליו זוהתה עמידות רק לעתים רחוקות, הועלתה השערה ש-MH גרם לפחות VBNCs מאשר אנטיביוטיקה קונבנציונלית. השיטה המתוארת כאן שימשה לכימות VBNCs שנוצרו על ידי שני חיידקים גורמי פצעים, S. aureus ו-P. aeruginosa. מספר ה-VBNCs שווה למספר התאים בני הקיימא שנקבעו על ידי צביעה חיה/מתה, פחות מספר התאים הניתנים לתרבית שנ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר זיהוי של אוכלוסיות תאי VBNC בחיידקים גורמי פצעים המטופלים בריכוזים מעכבים מינימליים (MICs) של MH ואנטיביוטיקה קונבנציונלית. שלבים קריטיים בפרוטוקול כללו הכנת דילול MH ביום הניסוי, מניעת אובדן דגימה במהלך צביעה חיה/מתה, וחישוב נכון של הנפח המנותח. עבור מחקר זה ואחרים, MH MICs עבור S. aureus ו-P. aeruginosa נקבעו בניסוי27. כהכנה לבדיקת אחוזי MH בין 1%-20% MH, יוצרו תמיסות מלאי של 25% או 50% במצעי התרבות ששימשו בניסויים. מ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי שני מענקים מאוניברסיטת מזרח וושינגטון, מענק המחקר והיצירה של הפקולטה ל-A.R.C ומענק המחקר והפעילויות היצירתיות לתואר ראשון ל-L.T.B. ביל וקוני קרוס תרמו כספים ל-EWU לרכישת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך Leica DMIL עם מצלמה דיגיטלית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מרק מולר הינטון | פישר ביוריאגנטים | B12322 | |
| מרק לוריא ברטאני (LB) | פישר ביוריאגנטים | BP142602 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0812-07-1 | |
| נתרן כלורי | סיגמא | S3014-500 גרם | |
| מרופנם | TargetMol | T0224 | |
| טוברמיצין | Selleck Chemicals | S2514 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC29213 | |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC9721 | |
| חממת טלטול | Eppendorf | M13520000 | |
| חממת | Benchmark Scientific | H2200-H | |
| Manukaguard Manuka Honey | Amazon | NA | |
| DMIL מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך | Leica Microsystems | 11521265 | |
| מצלמה דיגיטלית | Leica Microsystems | 12730522 | |
| צינורות בז 15 מ"ל | Genesee Scientific | 28-103 | |
| פיפטים סרולוגיים | Diagnocine | DP-LB0100005, DP-LB010010 | |
| Pipet Aid Pipettor | Drummond Scientific Company | 4-000-101 | |
| מבער בונסן | פישר Scientific | S48108 | |
| Rainin pipets | Pipette.com L-20, L-200, L-1000 | ||
| איזון | מטלר טולדו | XS603S | |
| 96 בארות | צלחת פלקון | ||
| לולאת חיסון | פישר סיינטיפיק | 13-104-5 | |
| איזופרופנול | פישר סיינטיפיק | BP2618-1 | |
| זכוכית מפזר | תוצרת בית | NA | |
| ערכת צביעה מתים חיים לחיידקים | Invitrogen | L7012 | |
| מחקר Biologix | מק"ט 80-1500 / P80-1500 | ||
| רדיד פח | Costco | NA | |
| תוכנה ליצירת דמויות | GraphPad | NA | GraphPad GraphPad Prism שימשה ליצירת דמויות וביצוע ניתוחים סטטיסטיים. |
מקורות
- Spoering, A., Lewis, K. Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials. J Bacteriol. 183 (23), 6746-6751 (2001).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
