אפיון ספקטרום בליעה ביולוגי מהגלוי ועד האינפרא אדום קצר הגל

סיכום

לדגימות ביולוגיות יש מאפיינים אופטיים מובהקים בתחום האינפרא-אדום הקצר (SWIR) בהשוואה לטווח אורכי הגל הנראה (VIS) והאינפרא-אדום הקרוב (NIR). עם זאת, רישום ספקטרום בליעת SWIR טהור הוא מאתגר ולעתים רחוקות מתבצע עבור מולקולות ביולוגיות. מאמר זה מציג שיטה לאפיון ספקטרום הבליעה VIS-SWIR של בולמים ביולוגיים.

תקציר

לניטור פיזיולוגי לא פולשני מבוסס אור, ניתן לזהות אורכי גל אופטימליים של רכיבי רקמה בודדים באמצעות ספקטרוסקופיית בליעה. עם זאת, בגלל חוסר הרגישות של חומרה באורכי גל ארוכים יותר, ספקטרוסקופיית בליעה יושמה בדרך כלל עבור אורכי גל בטווח הנראה (VIS) והאינפרא אדום הקרוב (NIR) בין 400 ל -1,000 ננומטר. התקדמות החומרה בתחום האינפרא-אדום בגלים קצרים (SWIR) אפשרה לחוקרים לחקור אורכי גל בטווח ~1,000 ננומטר עד 3,000 ננומטר, שבו יורדים שיאי בליעה אופייניים לשומנים, חלבונים ומים. מולקולות אלה קשות להדמיה ב-VIS-NIR ויכולות לספק מקורות ללא תוויות של ניגודיות ביולוגית. יתר על כן, ספיגת SWIR נמוכה יותר נצפתה עבור מלנין, הכרומופור העיקרי האחראי על פיגמנטציה בעור. מכשירים אופטיים In vivo כמו מדי דופק אוקסימטרים סטנדרטיים מבחינה קלינית נמצאו כבעלי דיוק מופחת אצל אנשים עם עור פיגמנטי כהה, אולי בגלל ספיגת המלנין החזקה יותר בטווח ה- VIS. לפיכך, ניתן להפחית את השגיאה הקשורה לפיגמנטציה של העור באמצעות מכשירים הפועלים ב- SWIR. תכנון מכשירים אופטיים מתאפשר על ידי הבנת תכונות הספיגה של רכיבי רקמת הליבה מה- VIS ועד לטווח SWIR. מאמר זה מתאר פרוטוקולים ומכשור להשגת ספקטרום ספיגה VIS-SWIR של בולמי רקמות נפוצים: המוגלובין מחומצן, המוגלובין לא מחומצן, מלנין, מים ושומנים.

מבוא

רוב הבולמים הביולוגיים אופיינו אופטית בטווח הספקטרלי הנראה (VIS, ~400-700 ננומטר) והתת-אדום הקרוב (NIR, ~700-1,000 ננומטר), אך לא בתחום האינפרא-אדום בגלים קצרים (SWIR, ~1,000-3,000 ננומטר)1,2,3,4 (איור 1). זאת למרות שה-SWIR מציע חדירת אור עמוקה יותר הודות לפיזור רקמות נמוך יותר וספיגת מלנין מופחתת, כמו גם ניגודיות ביולוגית נוספת ללא תוויות עבור מים, שומנים וחלבון ^1,5,6. היעדר ספקטרום ספיגה המשתרע על פני VIS-SWIR יצר פער בידע המונע פיתוח של מכשירים אופטיים ביו-רפואיים המנצלים יתרונות SWIR אלה. בעוד שמספר ניסיונות לאפיין את הספקטרום הוצגו בעבר, ספקטרום ספיגת VIS-SWIR באיכות גבוהה של רכיבים טהורים ללא ממצאים ממסים משמעותיים חסרים ^1,7,8. לדוגמה, חומרים מסיסים במים כגון המוגלובין התאפיינו ב- SWIR תוך שימוש במים כממס והפחתת ספיגת מים טהורים מהספקטרום⁹ המתקבל. עם זאת, הדיוק של גישה זו אינו ברור מכיוון שמים הם סופג דומיננטי באזור זה.

לעבודה ב- SWIR יש יתרון נוסף של הפחתת או אולי הסרת הטיה הנגרמת על ידי ספיגת מלנין חזקה ב- VIS בעת שימוש באבחון אופטי in vivo. מחקרים רבים מצאו כי מדי דופק אוקסימטרים מעריכים יתר על המידה חמצון בחולים שחורים, ולכן חולים שחורים נוטים יותר להיות בעלי רמות חמצן נמוכות באופן מסוכן כי מדי דופק אוקסימטרים לא זיהו¹⁰. הטיית פיגמנטציה זו של העור גרמה לטיפול רפואי מעוכב ולא מספק של חולי היפוקסים שחורים רבים^11,12 והניעה קריאה לפעולה בקהילות האופטיקה וההנדסה לשיפור הדיוק של מכשירים אופטיים לכל גווני העור¹³. המעבר מאורכי גל VIS סופגי מלנין גבוהים ל-NIR ו-SWIR הוא חידוש טכני מרגש אחד שיכול לצמצם את הפערים הגזעיים בטכנולוגיות אופטיקה ביו-רפואית בעלות חשיבות קריטית.

רישום ספקטרום בליעת אמת קרקעית של ביומולקולות חיוני להבנת התכונות האופטיות של דגימות רקמה המשמשות במגוון יישומים הנדסיים וביו-רפואיים¹⁴. ספקטרוסקופיית בליעה מודדת בליעת אור ספציפית למולקולה כפונקציה של אורך הגל. שיטת תקן הזהב לרכישת מדידות בליעה בתמיסה היא לכוון אור מונוכרומטי מתנגש דרך דגימה מומסת ולהקליט את האור המועבר באמצעות גלאי הממוקם בצד הנגדי של הדגימה ממקור האור. הספיגה (A) של הדגימה מוגדרת לאחר מכן על ידי Eq. (1).

A = יומן₁₀(I₀/I) (1)

כאשר I_o היא עוצמת האור על הדגימה, ו- I היא עוצמת האור המועברת דרך הדגימה הפוגעת בגלאי. I_o נרכש על ידי מדידת ייחוס, שהוא בדרך כלל הממס של מומס הריבית, תוך שימוש באותן הגדרות רכישה כמו I. ספקטרוסקופיית בליעה מספקת תכונות בליעה כמותיות ונשלטת על ידי חוק באר-למברט (Eq. 2), שאינו חל על דגימות בעלות פיזור אופטי. משוואה זו קובעת כי בליעה אופטית נקבעת על ידי מקדם הספיגה המולרי של הדגימה (ε, יחידות L^·mol−1·cm⁻¹) באורך גל λ כפול הריכוז המולרי שלה (C, יחידות mol∙^L-1) ואורך המסלול (L, יחידות cm), המוגדר כמרחק שעבר במדגם¹⁵:

A(λ) = ε(λ)*L*C (2)

חשוב לציין כי מקדם הספיגה המולרי ייחודי לכל בולם ביולוגי ומציין באיזו עוצמה דגימה בולעת אור באורך גל מסוים¹⁶.

בעת ביצוע מדידות ספקטרוסקופיית בליעה המשתרעות מה- VIS ועד ל- SWIR, נדרשות התאמות לחומרה, הכנת הדגימה ועיבוד עוקב ספקטרלי מעבר לספקטרום VIS-NIR סטנדרטי:

חומרה
מדידות VIS-NIR משתמשות בדרך כלל בגלאי סיליקון או שפופרות מכפיל אור (PMT) עם פוטוקתודות רגישות לפוטונים UV-VIS, בעוד שבליעת SWIR דורשת פוטו-גלאי הרגיש לפוטונים של SWIR, כגון גלאי אינדיום גליום ארסניד (InGaAs)¹⁷. מערכות VIS, NIR ו-SWIR דורשות בדרך כלל גם רכיבי פיזור ספציפיים לאורכי גל, כגון גרגרים אופטיים, לפיזור אור בתחומים אופטיים אלה. בנוסף, ספיגת SWIR דורשת קוביות זכוכית או קוורץ, שיש להן שידור גבוה יותר מאשר קוביות פלסטיק ב- SWIR, מה שהופך אותן למתאימות יותר לספקטרום VIS-SWIR. יש לבחור מקור אור או מקורות עם פליטה רחבה ואחידה יחסית המכסה את ה-VIS-SWIR, כמו מנורת טונגסטן-הלוגן (המשמשת בפרוטוקול זה). התאמת עוצמת האור, זמן החשיפה או משך הזמן שבו גלאי האור נחשף לאור יכולה לסייע במיטוב מדידות הספיגה.

הכנת דוגמאות
ריכוז הדגימה או אורך המסלול של הקובטה ישנו באופן ליניארי את כמות הבליעה המתרחשת כמתואר לעיל ב-Eq (2), ולכן ניתן לשנות כל אחד מהם כדי להשיג יחס אות לרעש גבוה (SNR, המחושב כאן כיחס של משרעת השיא חלקי סטיית התקן של אזור מגמתי בספקטרום, בדרך כלל SNR > 30 נחשב לאיכותי) מדידות במקטעים שונים של הספקטרום עם מדידות גבוהות או נמוכות יחסית ספיגה. כדי למטב את מדידות SWIR בתמיסה מימית, ניתן להשתמש בתחמוצת דאוטריום (D₂O), המכונה גם מים כבדים או מים מפורקים, במקום מים (H₂O), מכיוון שיש לה שיאי ספיגה נמוכים משמעותית ב- SWIR¹. זה מאפשר לאפיין את המומס ללא הפרעה של ספיגת המים הדומיננטית ב- SWIR.

עיבוד ספקטרלי
עיבוד לאחר נדרש מכיוון שספקטרום VIS-SWIR דורש שני גלאים, אחד עבור NIR גלוי (בדרך כלל סיליקון או PMT רגיש ל- UV-VIS) ואחד עבור SWIR (בדרך כלל InGaAs), ויש לתפור את הספקטרום יחד כדי להשיג ספקטרום VIS-SWIR מלא. כאשר הספקטרום חוצה את ה-VIS-SWIR, הבליעה יכולה להשתנות באופן משמעותי בהתאם לאזור אורך הגל, וייתכן שיהיה צורך לדלל את הדגימה או להקטין את אורך המסלול באזורים מסוימים כדי למנוע רוויה. יש לשנות את קנה המידה של הספקטרום באופן ליניארי כדי להתחשב בשינויים בריכוז הדגימה או באורך המסלול, ולאחר מכן לתפור אותה יחד כדי ליצור ספקטרום יחיד הכולל שני אזורים באורכי גל.

הפרוטוקולים הבאים יפרטו את ההכנה והמדידה הספקטרוסקופית מה- VIS ל- SWIR של חמישה בולמים ביולוגיים לדוגמה: מים (מהווים ~ 60% ממשקל הגוף), מלנין (סופג ראשוני לפיגמנטציה בעור), שמן תירס (משמש כאנלוגי לשומנים אנושיים מכיוון שיש לו שונות נמוכה בין אצוות, הרכב כימי קרוב לשומנים אנושיים ובעלי חיים, ופיזור מינימלי), והמוגלובין מחומצן ולא מחומצן (הבולמים העיקריים בדם).

פרוטוקול

1. הכנת דוגמאות

1. הכנת דגימת מים
   1. כדי להכין את הדגימה, מלא מיכל נקי במים טהורים במיוחד וסנן אותו באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. ודא שהפלט של המזרק מופנה לקובט זכוכית או קוורץ נקי כדי לבצע מדידות ספקטרוסקופיות ספיגה של הדגימה.
   2. כדי להכין את ההפניה, מלא מיכל נקי במים מטושטשים וסנן אותו באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. ודא שהפלט של המזרק מופנה לקובט זכוכית נקייה או קוורץ זהה לקובט הדגימה כדי לשמש כנקודת ייחוס.
      הערה: שלב הסינון ימזער את הפיזור האופטי מהדגימה על ידי סינון חלקיקים קטנים במים, שיש להם תרומות חזקות באזור הנראה לעין.
2. הכנת מדגם מלנין
   1. הכינו תמיסה של 1.7 מ"ג/מ"ל של מלנין על ידי הוספת אבקת מלנין לצינור צנטריפוגה מלא ב-3.5 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO). כדי להתחיל, המדידות צריכות להתחיל באורכי הגל עם הבליעה הצפויה הנמוכה ביותר, שם נדרש הריכוז הגבוה ביותר של מלנין. התחל מדידות מלנין עם כ 1.7 מ"ג / מ"ל עבור SWIR ודלל אותו עם DMSO מאוחר יותר לדילול 10x (כ 0.17 מ"ג / מ"ל) עבור אזורי VIS/NIR.
   2. הפעילו את הצינור למשך 10 דקות כדי להבטיח שאבקת המלנין תתמוסס ב-DMSO והעבירו את התמיסה לקובט זכוכית או קוורץ נקי למדידות ספקטרוסקופיות.
   3. הישאר בטווח הספיגה הליניארי של הספקטרומטר וודא מדידות SNR גבוהות על ידי שינוי הריכוז ו / או אורך המסלול (למשל, על ידי מעבר מאורך מסלול קצר (1 או 2 מ"מ) לקובט אורך מסלול של 10 מ"מ). לספיגת המלנין יש טווח רחב המשתרע מ-VIS ועד SWIR. עבור VIS, השתמש בריכוז הנמוך ביותר ו / או באורך המסלול של מלנין בשל מקדם ההכחדה המולרי הגבוה שלו; עבור SWIR, השתמש בריכוז הגבוה ביותר של מלנין ו / או קובטת אורך מסלול כדי לקבל מדידת ספקטרוסקופיה נקייה איכותית.
3. הכנת דגימת שמן תירס
   1. הוסיפו שמן תירס לקובט זכוכית או קוורץ נקי למדידות ספקטרוסקופיות.
   2. השתמש באוויר הפתוח כהפניה. שום קובטה או פתרון לא ישמשו כהפניה.
4. הכנת דגימת המוגלובין מחומצנת עם דם אנושי שלם heparinized
   הערה: דם אנושי שלם נרכש ונאסף במרכזי איסוף מורשים של ה- FDA הממוקמים בארצות הברית.
   1. כדי לבודד המוגלובין מתאי הדם האדומים (RBCs) ולהסיר כמה שיותר מים מהדם, תחילה פיפטה 1,800 μL של דם אנושי שלם heparinized לתוך צינורות microcentrifuge וצנטריפוגה ב 9.6 × גרם במשך 10 דקות.
      הערה: מומלץ להשתמש בכ-4-6 צינורות מיקרוצנטריפוגות
   2. לאחר הצנטריפוגה, הוציאו את הצינורות מהמיקרוצנטריפוגה, ואז הוציאו והשליכו את הסופרנאטנט (יהיה בערך 850 מיקרוליטר) מדגימת הדם הצנטריפוגה מבלי להפריע לגלולה (איור 2). הסופרנאטנט מורכב מהנוזל (בעיקר פלזמה וטסיות דם) מעל כדורית תאי הדם האדומים. חפש את גלולת תאי הדם האדומים בתחתית צינור המיקרוצנטריפוגה.
   3. הרכיבו מחדש כל גלולה באותו נפח של מים מפורקים כמו נפח הסופרנאטנט שהושלך לפח. צנטריפוגה שוב ב 9.6 × גרם במשך 10 דקות.
   4. מוציאים את הצינורות מהצנטריפוגה, ואז משליכים את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדור.
   5. הרכיבו מחדש את הגלולה עם אותו נפח של מים מפורקים כמו נפח הסופרנאטנט שהושלכ. צנטריפוגה מחדש ב 9.6 × גרם במשך 10 דקות.
   6. מוציאים את הצינורות מהצנטריפוגה, ואז מוציאים את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה ומשליכים אותו.
   7. כדוריות דם אדומות שוכבות (RBCs): הרכיבו מחדש את כדורי RBC עם נפח גדול (4.5 מ"ל) של מים מפורקים, אשר יגרום לפרץ היפוטוני. אם הגלולה נדבקת לצינור, שטפו אותה עם חלק מ-4.5 מ"ל המים שנמדדו כדי לשחרר אותה.
      הערה: נפח הסופרנאטנט יגדל לאחר כל שלב צנטריפוגה. נפח זה של supernatant יכול לנוע בין 800 μL ל 1,600 μL. נפח המים המפוזרים לשכיבה יכול להשתנות בהתאם לריכוז הדגימה הרצוי, אך צריך להיות גבוה מספיק כדי לגרום להתפרצות היפוטונית.
   8. הסר את פתרון הדם lysed מן הצינור עם מחט מזרק; לאחר מכן, הסר בזהירות את מחט המזרק הקהה והשליך אותה במיכל חדים מסוכנים ביולוגית. חברו את המזרק לפילטר מזרק 0.22 מיקרומטר ודחפו את תכולת המזרק דרך המסנן למסלול של 10 מ"מ, זכוכית 3.5 מ"ל או קובטת קוורץ.
      הערה: שלב הסינון ימזער את הפיזור האופטי מהדגימה על ידי סינון אברוני התאים והממברנות בתמיסה. אם הדגימה מרוכזת מאוד ומסנן המזרק הופך קשה לדחיפה, השתמש במספר מסנני מזרקים.
   9. אבטחו את הקובטה עם פקק אטום מעל הקובט כדי למנוע מאדי מים מהאוויר לזהם את הדגימה. מצלמים את החלק החיצוני של הפקק כדי למנוע זיהום נוסף ולהבטיח אטם אטום.
      הערה: עבור מדידות מ-600 ננומטר עד 1,600 ננומטר, כ-1,200-1,600 מיקרוליטר של גלולה מומסת ב-4.5 מ"ל של מים מפורקים יספקו מדידות נקיות איכותית.
      הערה: עבור אזורים ספקטרליים עם ספיגה צפויה גבוהה (400 ננומטר עד 600 ננומטר), יהיה צורך לדלל דגימות באמצעות מים מפוזרים כדי לקבל ערכי ספיגה בלתי רוויים ולהבטיח שערכי הספיגה נמצאים בטווח הליניארי של הגלאי. בנוסף, הדגימות ואת ההתייחסות צריך להיות ממוקם cuttes קצר Pathlength (1 או 2 מ"מ). עבור הספקטרום המוצג כאן, הדגימות דוללו פי 10 עבור 400-500 ננומטר ופי 5 עבור 500-600 ננומטר ונמדדו בקובטות אורך מסלול של 2 מ"מ.
      אורך המסלול הקצר יותר (1 או 2 מ"מ) יאפשר פחות בליעת אור באורכי גל בולעים מאוד, ויסייע להבטיח שחלק מהפוטונים יעברו לגלאי ויישארו בטווח הגילוי הליניארי.
   10. השג קובטה נקייה עם אותו אורך מסלול ונפח כמו קובטת הדגימה המכילה את תמיסת הדם המסוננת ומלאו אותה במים מפורקים למדידות בסיסיות וייחוס. אם אתם משנים נתיבי קובטה לטווחים ספקטרליים שונים, הקליטו ספקטרום ייחוס חדש לכל נתיב קובטה.
5. הכנת דגימת המוגלובין לא מחומצנת עם דם אנושי שלם heparinized
   1. בצע את השלבים 1.4.1-1.4.8.
   2. מוסיפים נתרן דיתיוניט לתמיסת הדם בקובט ומערבבים בעדינות. אבטחו את הקובטה עם פקק אטום מעל הקובט כדי למנוע מאדי מים מהאוויר לזהם את הדגימה. מצלמים את החלק החיצוני של הפקק כדי למנוע זיהום נוסף ולהבטיח אטם אטום. בזהירות להטות את cuvette מצד לצד כדי להבטיח כי dithionite נתרן מתמוסס בתמיסה; תמיסת הדם תשתנה מצבע אדום לצבע סגול-אדום כהה יותר.
      הערה: כדי לחמצן המוגלובין באופן מלא, המסה של נתרן dithionite הנדרש הוא כ 0.007 גרם לכל מ"ל של תמיסת דם. לדברי Briley-Sӕbø ו Bjørnerud, לפחות 2.5 מ"ג של נתרן dithionite/g של דם נדרש כדי deoxygenate מלא דם¹⁸. עם זאת, ריכוז זה נמצא לא מספיק במחקרים כאן. ריכוז של כ-3.4 מ"ג/גרם דם מלא נמצא כמנטרל לחלוטין את תמיסת הדם ללא הכנסת פיזור אופטי. עבור מדידות מ 400 עד 600 ננומטר, פתרון הדם יצטרך להיות מדולל עם מים deuterated. חשב את מסת הנתרן דיתיוניט הנדרשת בהתבסס על נפח תמיסת הבוד בשימוש ולא על הנפח לאחר דילול. עבור מדידות מ 600 ננומטר עד 1,600 ננומטר, כ 1,200-1,600 μL של גלולה מומסת ב 4.5 מ"ל של מים deuterated ייתן מדידות SNR גבוהה.
      קובטה באורך מסלול קצר יותר (1 או 2 מ"מ) תאפשר פחות בליעת אור באורכי גל בולעים מאוד, ותסייע להבטיח שחלק מהפוטונים ישודרו לגלאי ויישארו בטווח הגילוי הליניארי.
   3. מלאו קובטה נוספת באורך מסלול תואם כמו הקובטה בתמיסת דם מסוננת במים מפורקים למדידות בסיסיות וייחוס. אם אתם משנים נתיבי קובטה לטווחים ספקטרליים שונים, הקליטו ספקטרום ייחוס חדש לכל נתיב קובטה.

2. השגת מדידות ספיגה איכותיות

1. הכינו דוגמאות וסימוכין כמתואר בסעיף 1 והניחו אותן בקוביות זכוכית או קוורץ למדידות VIS NIR-SWIR. הפעל את מנורת הספקטרומטר והגלאים ואפשר למערכת להתחמם למשך 5-20 דקות לפחות, בהתאם למערכת הספקטרומטר ולמקור האור.
   הערה: חמש דקות סיפקו קירור גלאים מספיק ויציבות פלט המנורה עבור הספקטרום שנאסף כאן, אך יש לאפיין זאת עבור כל מערכת לפני לכידת מדידות הספיגה.
   שמור את הדגימה וההפניה בהישג יד במהלך תקופה זו של האיסוף. ודא שהמכסים על קוביות מאובטחים. שמור על מרחב מדידה חשוך ככל האפשר כדי למנוע עיוות של מדידות הבליעה על ידי אור הסביבה.
2. חזור על השלבים הבאים עבור אזורים שונים של הספקטרום עקב שונות גדולה בבליעה על פני VIS-SWIR.
   1. אם אתה משתמש בתצורת אלומה כפולה (שני גלאים נפרדים עבור דגימה והפניה), ודא שהמערכת מבוססת. רכוש את קו הבסיס על ידי הצבת דגימות ייחוס זהות המכילות את הממס לפני כל גלאי ואסוף מדידת ספיגה באמצעות פרמטרי הרכישה המדויקים שישמשו לאוסף ספקטרום ספיגת הדגימה. בעוד הגלאים אמורים תיאורטית להראות ספיגה אפסית, זה בדרך כלל לא מושלם. הפחת את ספקטרום הבליעה המתקבל מכל ספקטרום בליעת הדגימות הנרכש באמצעות אותן הגדרות.
      הערה: יש לחזור על התוכנית הבסיסית בכל פעם שהגדרות הרכישה עבור איסוף נתונים משתנות.
   2. מקמו את הדגימה בספקטרומטר ובחרו את הגלאי הרלוונטי לאזור הנמדד (VIS-NIR = סיליקון או UV-VIS PMT, SWIR = InGaAs) וצפו בבליעה במצב Live, שבו המדידה מתעדכנת באופן רציף עם כוונון פרמטרי המדידה.
   3. החל מפרמטרי הספקטרומטר המוגדרים כברירת מחדל, התאם את עוצמת האור ואת זמן החשיפה עד לקבלת ספקטרום בליעה נקי איכותית ללא רוויה.
      1. אם כוונון הפרמטרים אינו מוביל לספקטרום נקי מבחינה איכותית, שנה פרמטרים כגון עוצמת אור אירוע, זמן חשיפה, אורך נתיב וריכוז דגימה. ראשית, נסו לכוונן את העוצמה ואת זמן החשיפה. אם כוונון פרמטרים אלה אינו גורם לספקטרום SNR גבוה, שנה את ריכוז הדגימה או את אורך הדגימה וההפניה.
         הערה: פרמטרי ברירת המחדל ששימשו באוסף הספקטרום המוצג כאן היו עוצמת אור מקרית של 15 ננוואט ב-400 ננומטר ו-20 ננוואט ב-1,000 ננומטר, זמן חשיפה של 30 אלפיות השנייה, אורך מסלול קובטה של 10 מ"מ וריכוזים ספציפיים לדגימה: 100% מים, מלנין 1.7 מ"ג/מ"ל, 100% שמן תירס, המוגלובין מחומצן (15.9 גרם/ד"ל), והמוגלובין לא מחומצן (15.9 גרם / ד"ל).
      2. כדי להגדיל את ה- SNR, הגדל את מספר קריאות הנתונים בממוצע לכל נקודת נתונים. ככל שמספר קריאות הנתונים הממוצע גבוה יותר, כך הזמן לכל מדידה ארוך יותר.
      3. כדי להגדיל את הרזולוציה הספקטרלית, הקטן את גודל הצעד (nm) של המדידה עד למגבלת הרזולוציה של הספקטרומטר. פעולה זו תגדיל את הזמן לכל מדידה. בנוסף, צמצם את רוחב הפס של תאורת האירוע ל-1/10^מהרוחב המלא של הפסגה הצרה ביותר בחצי מקסימום¹⁹.
      4. לאחר שהגדרות המדידה ממוטבות לדגימה, תעדו את ההגדרות עבור כל ספקטרום שנרכש.
      5. לקבלת ספקטרום, השתמש בהגדרות הממוטבות כדי למדוד את ההפניה בלבד. לאחר מכן, החלף את קובטת הייחוס בקובט הדגימה ובצע מדידה נוספת. הקפד לשמור בנפרד את המדידות ההפניה ואת המדגם.
         הערה: הכרחי שמדידת הייחוס לא תהיה רוויה. אם כן, הפחיתו את עוצמת האור ו/או את זמן החשיפה עד שלא תהיה רוויה. שמור על כל פרמטרי המערכת זהים בין מדידות הייחוס והמדגם; אם צריך לשנות אחד, יהיה צורך לחזור גם על השני כדי להתאים אותו.
      6. עבור כל קבוצה זוגית של מדידות ייחוס ומדגם, חשב את הספיגה A (Eq 1) על ידי התייחסות למדידת הייחוס כ- I_o ולמדידת הדגימה כ- I.
      7. כדי לתפור יחד אזורים שונים שדרשו הבדלים בריכוז הדגימה או באורך המסלול, יש להחיל מקדם כפל על אחד האזורים הספקטרליים. לדוגמה, עבור אזור ראשון שיש לו 1/10 מהריכוז ואורך מסלול זהה לאזור שני, הכפל את האזור הספקטרלי הראשון ב- 10 כדי להתאים את קנה המידה של שני האזורים יחד.
         הערה: מקדם הכפל צריך להיות הפרש הריכוז ו/או המסלול בין האזורים.
      8. לאחר תיקון הספקטרום להבדלים באורך המסלול או בריכוז, בחר אורך גל חופף בשני האזורים הספקטרליים לתפירת שני האזורים יחד.
      9. לחתוך את שני הספקטרום כך שיסתיימו באורך הגל החופף; בחר ספקטרום אחד כדי לכלול את הערך הספקטרלי של המעבר שלו. שרשרו את שני הספקטרום הקטוע ליצירת ספקטרום יחיד המתקבל בטווח אורכי גל רחב יותר.

תוצאות

הנתונים זמינים דרך מאגר חומרי המחקר הדיגיטליים של WUSTL (DRMR) doi: https://doi.org/10.7936/6RXS-108249

אפיון ספקטרלי של מים
מים, אחד הבולמים הביולוגיים הנפוצים ביותר, הם בעלי פסגות אופייניות ובולעות מאוד ב-NIR וב-SWIR. פסגות אופייניות אלה הן כה חזקות, שכאשר מודדים את ספיגת המים, לעתים קרובות יש לדלל אותם במים מדוללים כדי למנוע רוויה. ההבדל בספיגה בין מים למים מדוללים מוצג באיור 3, ומדגיש יותר מסדר גודל של עלייה בספיגת מים לעומת מים מיובשים. ספיגת מים חזקה ב-SWIR מקשה גם על השגת ספקטרום הספיגה של בולמים ביולוגיים אחרים המכילים מים בדגימה או המשתמשים במים כממס וכנקודת ייחוס. כפתרון לבעיה זו, מים deuterated ניתן להשתמש במקום מים. מים מפוזרים פועלים באופן דומה למים תוך היותם בולמי SWIR חלשים בהרבה, מה שהופך אותם לתחליף אידיאלי למים במדידות ספקטרוסקופיית SWIR.

כדי למדוד את ספקטרום הספיגה של המים, מים שימשו כדגימה ומים מפורקים כנקודת ייחוס. כדי למנוע רוויה ב- SWIR, הדגימה נמהלה במים מדוללים באזור SWIR. ספקטרום ספיגת המים שנוצר מראה בליעה נמוכה ב- VIS, אשר גדלה באורכי גל ארוכים יותר. שיאי בליעה אופייניים נראים בסביבות 750 ננומטר, 970 ננומטר, 1,200 ננומטר ו-1,450 ננומטר (איור 4). ספקטרום המים המתקבל הוא בעל SNR של 3536.6 והושווה לספקטרום ספיגת המים²⁰ של Hale and Query, והראה עקומת בליעה דומה מ~500 ננומטר ל-1,600 ננומטר. עם זאת, בין 400 ל-500 ננומטר, עקומות הבליעה שונות, כאשר Hale ו-Querry מראים ערך בליעה גבוה יותר באורכי גל נמוכים יותר. הבדל זה יכול לנבוע משאריות חלקיקים קטנים במים שיהיו בעלי פיזור גבוה יותר באורכי גל קצרים יותר בהשוואה לאורכי גל ארוכים יותר³ ועשוי לפסול את ההנחות שאין פיזור במדידות בליעה מבוססות חוק באר-למברט.

אפיון ספקטרלי של מלנין
מלנין, הבולם האופטי העיקרי של העור, אופיין באופן ספקטרלי באמצעות אבקת מלנין כדגימה ו-DMSO כממס וייחוס. לספקטרום שהתקבל יש SNR של 172 והוא הושווה לנתוני אומלנין מסרנה ואחרים ^21,22 ומ-Crippa et ^al.23 (איור 5). Eumelanin הוא הפיגמנט העיקרי האחראי על צבע העור, ולכן, מספק את הנתונים המדויקים ביותר עבור איך מלנין ישפיע על התקנים אופטיים. הספקטרום שנאסף באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן מראה מתאם גבוה לערכי ספרות אלה.

אפיון ספקטרלי של שמן תירס
כדי לחקור את ספקטרום הספיגה של שומנים, שמן תירס נבחר בשל הפיזור האופטי המינימלי שלו בהשוואה לשומנים אחרים והדמיון הידוע שלו בהרכב הכימי לשומנים מן החי¹. כדי לקחת את ספקטרום הספיגה של שמן תירס, שמן תירס שימש כדגימה עם אוויר כנקודת ייחוס. כפי שניתן לראות באיור 6, ספקטרום שמן התירס מכיל פסגות אופייניות בערך ב-930 ננומטר, 1,210 ננומטר ו-1,410 ננומטר. ספקטרום שמן התירס שנוצר הוא בעל SNR של 10363.1 והוא היה מכוסה בספקטרום שמן התירס¹ של Cao et al., מה שמראה מתאם חזק.

אפיון ספקטרלי של המוגלובין מחומצן ולא מחומצן
בעוד אפיון הספיגה של המוגלובין מחומצן ולא מחומצן הוא אחד ההישגים החשובים ביותר באופטיקה ביו-רפואית, ספקטרום הספיגה שלהם, המשתרע מה-VIS ועד ה-SWIR, נותר לא מובן. אחד ההיבטים המאתגרים ביותר בקביעת ספקטרום הספיגה של המוגלובין מחומצן ולא מחומצן ב- SWIR הוא סילוק המים בדם, מה שמכריע את ספיגת ההמוגלובין הקטנה יחסית. כדי להתיר את ספיגת ההמוגלובין והמים, בודד תחילה המוגלובין מדם שלם אנושי באמצעות צנטריפוגה והסופרנאטנט הוסר והוחלף במים מפורקים. מים מפורקים שימשו גם כנקודת ייחוס וממס שההמוגלובין הורכב בהם מחדש כדי לגרום להתפרצות היפוטונית. כפי שניתן לראות באיור 3, למים מפורקים יש ספיגה אופטית נמוכה בהרבה מזו של מים, מה שהופך אותם לממס אידיאלי ונקודת ייחוס למדידות ספיגת SWIR. ספקטרום ההמוגלובין המחומצן שנוצר משתרע על פני VIS עד SWIR עם SNR של 23118.7 ותואם מאוד את ספקטרום ההמוגלובין המחומצן⁴  שפורסם על ידי פראהל (איור 7). ב-VIS, ספקטרום ההמוגלובין המחומצן מראה ספיגה גבוהה עם שיאי ספיגה אופייניים בכ-415 ננומטר ושיא כפול מכ-540 עד 575 ננומטר. בקרינה בלתי מייננת, ספקטרום ההמוגלובין המחומצן מראה שיא אופייני המשתרע על פני טווח רחב יותר של אורכי גל, בין 800 ננומטר ל-1,100 ננומטר. ב SWIR, ספיגת המוגלובין נמוכה. עם זאת, בין כ-1,400 ננומטר ל-1,600 ננומטר, ספקטרום ההמוגלובין מראה ספיגה גבוהה יותר עם שיאים, ככל הנראה בשל מים בהמוגלובין שלא ניתן היה להסיר במלואם בתהליך הצנטריפוגה.

עבור המוגלובין לא מחומצן, נתרן dithionite נוסף לתמיסת המוגלובין כדי להציג דיסוציאציה של dioxygen מן המוגלובין מחומצן והמרת הדגימה המוגלובין deoxygenated. לספקטרום שהתקבל יש SNR של 9813.9 והוא הושווה לספקטרום ההמוגלובין הלא מחומצן של פראהל ומראה מתאם חזק מאוד בין 400 ננומטר ל-1,000 ננומטר⁴  (איור 8). ספקטרום ההמוגלובין הלא מחומצן שנוצר מראה שיאי ספיגה אופייניים בכ-430 ננומטר, 560 ננומטר ו-760 ננומטר. לאחר מכן, ספיגת המוגלובין לא מחומצן יורדת אך מכילה שיאי ספיגה קטנים יותר סביב 1,200 ננומטר ומ-1,400 ננומטר ל-1,600 ננומטר. הספיגה בין 1,400 ל-1,600 ננומטר נובעת ככל הנראה ממים שלא הוסרו במלואם מדגימת ההמוגלובין בתהליך הצנטריפוגה.

השוואה בין בולמים ביולוגיים מה- VIS-SWIR
ספקטרום ה-VIS-SWIR המלא של כל הבולמים הביולוגיים המאופיינים בפרוטוקול זה מוצג באיור 9, בקנה מידה המבוסס על ריכוזם הביולוגי ברקמה², אשר מדגישים את ההבדלים הספקטרליים המובהקים בין הבולמים הביולוגיים. לדוגמה, למלנין, המוגלובין מחומצן והמוגלובין לא מחומצן יש ספיגה חזקה ואופיינית ב-VIS שבדרך כלל פוחתת עם אורך הגל, בעוד שמים ושומנים מראים שיאים אופייניים ב-NIR וב-SWIR. ברקמה ביולוגית, השילוב של ירידה במלנין ובהמוגלובין וכן ירידה בפיזור אופטי מספקים עומק חדירה אופטי מוגבר ב-NIR וב-SWIR. בנוסף, ספיגת המלנין המופחתת של NIR ו-SWIR מאפשרת חקירה אופטית של המוגלובין, שומנים ומים מחומצנים ולא מחומצנים עם השפעות מינימליות כתוצאה מפיגמנטציה של העור.

איור 1: ספקטרום שפורסם בעבר של בולמים ביולוגיים נפוצים על פני UV ל- SWIR. ספקטרום ההמוגלובין המחומצן והלא מחומצן שורטט באמצעות נתונים מפרהל⁴. ספקטרום המלנין שורטט באמצעות נתונים מסרנה²¹ וקריפה²³. ספקטרום השומנים שורטט באמצעות נתונים של ואן וין²⁴. ספקטרום המים שורטט באמצעות נתונים מ-Hale ומ-Querry²⁰. קיצור: SWIR = אינפרא אדום גל קצר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תמונה של כדורית סופרנאטנט ותאי דם אדומים מדם שלם צנטריפוגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: השוואת ספקטרום הספיגה של מים ומים שנאספו עם הגדרות רכישה זהות בסולם ספיגה לוג (משמאל) וליניארי (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: השוואה של ספקטרום ספיגת המים שנרכש בשיטות המתוארות כאן לעומת Hale ו-Querry²⁰. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: השוואה של ספקטרום ספיגת המלנין שנרכש בשיטות המתוארות כאן לעומת Sarna et ^al.21,22 ו- Crippa et ^al.23. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: השוואה של ספקטרום ספיגת שמן תירס שנרכש בשיטות המתוארות כאן לעומת Cao et ^al.1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: השוואה של ספקטרום ספיגת המוגלובין מחומצן שנרכש בשיטות המתוארות כאן לעומת Prahl⁴. מאפיינים ספקטרליים מ-1,400 עד 1,600 ננומטר מיוחסים ככל הנראה לשאריות מים בדגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: השוואה של ספקטרום ספיגת המוגלובין לא מחומצן שנרכש בשיטות המתוארות כאן לעומת Prahl⁴. מאפיינים ספקטרליים מ-1,400 עד 1,600 ננומטר מיוחסים ככל הנראה לשאריות מים בדגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: ספקטרום VIS-SWIR של בולמים ביולוגיים נפוצים. קיצור: VIS-SWIR = אינפרא אדום נראה-גל קצר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

ניתן להשתמש בפרוטוקול(ים) המתוארים במאמר זה כדי לקבל ספקטרום ספיגה VIS-SWIR של בולמים ביולוגיים וחומרי ניגוד. במאמר זה אנו מראים צעדים ספציפיים להשגת ספקטרום של מים, מלנין, שמן תירס, המוגלובין מחומצן והמוגלובין לא מחומצן בטווח שבין 400 ננומטר ל-1,600 ננומטר. הדיון הבא עוסק בשלבים קריטיים, טיפים לאופטימיזציה של מדידה, מגבלות השיטה ויישומים של פרוטוקול זה בביו-רפואה.

בעוד שכל שלבי הפרוטוקול חשובים, יש לבצע מספר שלבים קריטיים כדי להשיג ספקטרום מדויק עם פרוטוקול זה. ראשית, המדגם חייב להיות לא מפוזר; לדוגמה, בעת קבלת המוגלובין מחומצן ולא מחומצן מדם, יש לסנן את המפזרים במדגם (כאן, נעשה שימוש במסנן מזרק 0.22 מיקרומטר). בעת הכנת המוגלובין לא מחומצן, כמות הנתרן דיתיוניט שנוסף לא תעלה על המשקל שסופק, מכיוון שהיא תהפוך את הדגימה לעכורה באחוזי משקל גבוהים יותר ותבטל את דרישות חוק באר-למברט.

שנית, יש להשתמש במים מפורקים כממס הדגימה והתייחסות למומסים מסיסים במים כגון המוגלובין. ב- SWIR, ספיגת המים חזקה ויכולה להסוות בולמים אחרים. שלישית, יש לבצע מדידות בטווח הליניארי של הגלאי, המוגדר כאזור שבו שינוי בפוטונים המגיעים לגלאי גורם לשינוי ליניארי באות הגלאי. אם מתרחשת ספיגה מינימלית, הגלאי עשוי לרשום ספיגה של אפס, גם אם מתרחשת בליעה. מצב זה מתרחש כאשר הדגימה מדוללת מדי, זמן החשיפה נמוך מדי ו/או אורך מסלול הקובט קצר מדי, אך ניתן לתקן אותו על ידי עלייה בריכוז הדגימה, אורך מסלול הקובט ו/או זמן החשיפה. באופן דומה, אם מתרחשת בליעה גבוהה, הגלאי עלול שלא לרשום פוטונים כלשהם ולהפיק קו שטוח המכונה "רוויה" שאינו רגיש לשינויים בבליעה. מצב זה מתרחש כאשר הדגימה מרוכזת מדי, זמן החשיפה נמוך מדי ו/או אורך המסלול ארוך מדי, אך ניתן לתקן אותו על ידי הגדלת ריכוז הדגימה, הגדלת זמן החשיפה ו/או הקטנת אורך מסלול הקובט.

רביעית, הגלאים המשמשים חייבים להיות ליניאריים. אם לא בטוח אם הגלאי מראה תגובה ליניארית למספר הפוטונים המגיעים לגלאי, ניתן למדוד דילולים שונים של דגימה עם אותן הגדרות רכישה כדי לבדוק אם ערכי הבליעה שלהם מראים את המגמה הליניארית הצפויה בין בליעה לריכוז. לחילופין, ניתן למדוד דגימה בודדת ולהגדיל את זמן החשיפה כדי לבדוק אם יש עלייה ליניארית בעוצמת הגלאי. שתי הבדיקות אמורות להניב קשר ליניארי אם המשתמש פועל בגבולות הליניאריים שלו (ראה את הנקודה הקריטית השלישית לעיל).

חמישית, כדי להישאר בטווח הליניארי של הגלאי עבור כל הטווח הספקטרלי VIS-SWIR, יהיה צורך לשנות את ריכוז הדגימה, זמן החשיפה לגלאי ו/או אורך מסלול הקובט עבור אזורים ספקטרליים שונים עם בליעה גבוהה או נמוכה משמעותית מהאזור הספקטרלי ההתחלתי.

שישית, ספקטרום שנרכש באמצעות ריכוזי דגימה שונים או מסלולים שונים עבור אזורים ספקטרליים שונים חייב להיות תפור יחד על ידי קנה מידה ליניארי של אזור אחד בהתבסס על שינויים ידועים בריכוז או באורך המסלול. לאחר שינוי קנה המידה, יש לתפור את הספקטרום יחד באורך גל חופף בין שני האזורים. אם המדידה תכלול מדידות מגלאים שונים, צריך להיות ספקטרום בליעה חופף המכיל את אורך גל המעבר הרצוי לגלאי (800 ננומטר משמש בדרך כלל בעת תפירת אזורי UV-VIS ו- SWIR). כל ספקטרום נחתך באורך הגל של מעבר הגלאי, וספקטרום אחד נבחר לכלול את ערך בליעת המעבר המקורי של הגלאי. לאחר מכן, שני הספקטרום הקטוע משורשרים ליצירת ספקטרום מוארך יחיד.

טיפים נוספים לרכישת ספקטרום בליעה איכותי כוללים שימוש בספקטרום שפורסם בעבר של הדגימה המעניינת, גם אם אינו מכסה את מלוא הטווח הספקטרלי שיש למדוד, כדי להנחות את המדידות. לדעת מראש את טווח אורכי הגל עם הבליעה הנמוכה ביותר, ניתן להתחיל מדידות באזור זה עם דגימת הריכוז הגבוהה ביותר ולאחר מכן להתאים ולדולל משם. זה יכול לעזור לדעת כמה אזורים נפרדים יצטרכו להימדד בהתבסס על גודל שינויי הספיגה הצפויים. זה יכול גם לספק ביטחון שהספקטרום הצפוי התקבל אם הוא תואם את הספקטרום שפורסם, או אם הוא אינו תואם את הספקטרום שפורסם, ניתן לבחון מחדש את שיטת הכנת הדגימה יחד עם בעיות שעלולות לעוות את הספקטרום.

ספקטרום ספיגה עשוי לדרוש עיבוד לאחר עיבוד. לדוגמה, ניתן להשתמש במסנן ממוצע נע דיגיטלי כדי להחליק מדידות בליעה וניתן להסיר נקודות שגיאה ידועות באמצעות תיקון ערכת נתונים שבו נמחקות הנקודות השגויות, ולבצע אינטרפולציה בין נקודות שאינן שגויות.

מגבלות שיטה זו כוללות אי דיוק עבור דגימות עם פיזור אופטי כגון דם שלם. כדי למדוד במדויק המוגלובין, דגימת הדם עוברת ליזה ולאחר מכן מסוננת מזרק כדי להסיר את רוב שאריות הרכיבים התאיים האחרים הגורמים לפיזור אופטי. באופן דומה, שיטה זו אינה משמשת in vivo עקב פיזור רקמות. בעוד שמדידות ספיגה מבוססות חוק באר-למברט עשויות להיות מייגעות ולעיתים קשות לביצוע, זוהי שיטת תקן הזהב למדידות ספיגה אופטיות טהורות. בנוסף, חלק מהממסים הופכים את רכישת ספקטרום ספיגה טהור של מומסים מסוימים למאתגר במיוחד. לדוגמה, הממס הטבעי של המוגלובין מחומצן ולא מחומצן הוא מים, אך ספיגת המים חזקה ב- SWIR, ושולטת בספיגת ההמוגלובין המחומצן. לכן, אנו מנסים להוציא מים מהדם באמצעות צנטריפוגות חוזרות ונשנות, הסרת הסופרנטנט, והרכבה מחדש עם מים מפורקים בעלי ספיגת SWIR חלשה יותר. ספקטרום ההמוגלובין המחומצן והלא מחומצן שנוצר כתוצאה מכך מדם אנושי שלם שעבר הפרין חשוד כמכיל ספיגה שיורית קטנה עקב ספיגת מים מכ-1,300 ננומטר עד 1,600 ננומטר, כפי שניתן לראות באיור 3. בעוד שככל הנראה לא מדובר בניתוק מושלם של מים מההמוגלובין מחומצן ולא מחומצן, אנו צופים ביישור הדוק עם ספקטרום המוגלובין מחומצן ולא מחומצן מ-400 ננומטר ל-1,000 ננומטר, ואנו מרחיבים את הספקטרום בכמה מאות ננומטרים ^2,3.

הפרוטוקולים המתוארים כאן יסייעו לחוקרים להרחיב את ספריות ספקטרום הבליעה כך שיכללו ספקטרום VIS-SWIR של שורה של רכיבים ביולוגיים וחומרי ניגוד. ידע זה יכול לשמש לשיפור ההבנה של ביולוגיה ופיזיולוגיה בסיסיות באמצעות הדמיה ביו-רפואית לא פולשנית וחישה באורכי גל עמוקים יותר מכפי שרוב המערכות פועלות כיום. התוספת של אורכי גל SWIR מרחיבה את סוג רכיבי הרקמה שניתן לנטר באופן לא פולשני ויכולה לסייע בפיתוח ניטור ואבחון חדשניים. יתר על כן, מכשירים הפועלים ב- NIR וב- SWIR אמורים לסייע במזעור הטיית פיגמנטציה בעור שדווחה עבור מכשירים אופטיים הפועלים בטווחי VIS ו- NIR ומהווה אסטרטגיה מבטיחה ליצירת מכשירים רפואיים שוויוניים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.22 ומיקרו; מסנני מזרק בקוטר m	סיגמא-אולדריץ'	SLGPM33RS
1000 ומיקרו; L פיפטה	Millipore Sigma	EP3124000121
200 ומיקרו; L Pipette	Millipore Sigma	EP3124000083
צינורות חרוטיים	Avantor VWR	21008-089
שמן תירס	בטן שמחה	n/a	48 אונקיות נוזל
תחמוצת דאוטריום	מעבדות איזוטופ קיימברידג'	DLM-4-100
תחמוצת דאוטריום	סיגמא-אולדריץ'	7789-20-0
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	סיגמא-אולדריץ'	D5879-1L
מזרק חד פעמי 1 מ"ל	BH Supplies	BH1LL
מחט חד פעמית	Atshuhut/Amazon	66941
מקפיא (-80 ° ג)	כוסות זכוכית של פישר סיינטיפיק	IUE386FARK
	Millipore Sigma	CLS1000PACK
זכוכית או קוביות קוורץ	סיגמא-אולדריץ'	Z802875-1EA	700 ומיקרו; L נפח
זכוכית או קוורץ קובטות	Thorlabs	CV10Q35EP	3500 מ"ל נפח
Heparinized Human	Lampire	7203710
Microcentrifuge Tubes	Costar	3213
Microcentrifuge--accuSpin Micro 17	Fisher Scientific	13-100-675
MilliQ מים	Millipore Sigma	ZMQSP0D01
OSRAM FCS 64640 150 W 24 V HLX הלוגן נורת אמזון		B0001221DG
Parafilm	Millipore Sigma	HS234526B
קצות פיפטה	אפנדורף	22492055
אבקת מלנין סינטטי	סיגמא-אולדריץ'	8049-97-6
סולם	Sartorius	UX-11976-09
נתרן דיתיוניט	סיגמא-אולדריץ'	1065070500
סוניקטור	פישר CPX1800
מרית	Aozita	000 00 0 1 2 3
UV/VIS/SWIR ספקטרופוטומטר	מערכות מכשירים מקוונות	Olis Cary 14
סירות שקילה	אמזון