מאמר שיטה

חיסון פעיל להשראת קינאז אוטואימוני ספציפי לשריר (MuSK) מיאסטניה גרביס בעכברים

DOI:

10.3791/67408

⸱

3 ביולי 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Aziz Sancar Institute of Experimental Medicine, Istanbul University, 2Department of Immunology, Hellenic Pasteur Institute

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג פרוטוקול מקיף למודל עכבר ניסיוני של מיאסטניה גרביס קינאז אוטואימוני ספציפי לשריר (MuSK), שמטרתו לחקור את הפתופיזיולוגיה והאסטרטגיות הטיפוליות הפוטנציאליות למחלה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיאסטניה גרביס (MG) היא הפרעה אוטואימונית המשפיעה על הצומת העצבי-שרירי. בעוד שרוב חולי MG מייצרים נוגדנים עצמיים כנגד קולטן האצטילכולין (AChR), תת-קבוצה של חולים מציגה נוגדנים עצמיים המכוונים לקינאז הספציפי לשריר (MuSK). MuSK MG מאופיין בחולשת שרירים חמורה, ביטויים קליניים עמידים לטיפול ומשברים מיאסטניים, המחייבים לעתים קרובות הנשמה מכנית. כתוצאה מכך, חולים זקוקים לעתים קרובות לשימוש ממושך בתרופות מדכאות חיסון, הקשורות לתופעות לוואי ארוכות טווח. בהתחשב בחומרה ובנדירות של MuSK-MG, פיתוח מודל ניסיוני של בעלי חיים הוא חיוני לקידום שיטות טיפול חדשות והבנה עמוקה יותר של המנגנונים הפתופיזיולוגיים הבסיסיים. מיאסטניה גרביס אוטואימונית ניסיונית (EAMG) משמשת כמודל לבעלי חיים עבור MuSK-MG, ומחקה ביעילות אך באופן חלקי את המאפיינים הקליניים והאימונולוגיים של MG אנושי. ניתן להשיג אינדוקציה של מודלים של בעלי חיים אוטואימוניים באמצעות חיסון אקטיבי או פסיבי. בפרוטוקול הניסוי המוצג כאן, נעשה שימוש בחיסון פעיל על ידי מתן תת עורי של התחום החוץ-תאי המטוהר של MuSK אנושי מתחלב באדג'ובנט פרוינד מלא עם Mycobacterium tuberculosis המומת בחום. החיסון בוצע בארבעה אתרים, ואחריו זריקת דחף של MuSK ביום ה-28. אדג'ובנט זה עם M. tuberculosis מאפשר הפעלה של מערכת החיסון באמצעות TLR4 ופגוציטוזיס מוגבר של האנטיגן הניתן. מאמר זה מפרט באופן מקיף את הפיתוח והאפיון של MuSK-EAMG מתחילתו ועד סופו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיאסטניה גרביס (MG) היא מחלה אוטואימונית המתפתחת באמצעות מנגנונים תלויי תאי T בתיווך נוגדנים. היא נגרמת בעיקר על ידי נוגדנים נגד קולטני אצטילכולין ניקוטיניים (AChR) על הממברנה הפוסט-סינפטית של הצומת העצבי-שרירי (NMJ) ב-80%-85% מהחולים, ועל ידי נוגדנים נגד קינאז ספציפי לשריר (MuSK) בכ-5% מהחולים וכן חלבוני NMJ אחרים. MG הפך לאב-טיפוס להפרעות אוטואימוניות ומודל להבנת תפקוד פוסט-סינפטי1. ניתן לחלק מודלים של בעלי חיים של הפרעות אוטואימוניות לשתי קטגוריות עיקריות: (1) מודלים ספונטניים, שבהם בעלי חיים מפתחים באופן טבעי מחלה אוטואימונית, ו-(2) מודלים מושרים, שבהם המחלה האוטואימונית מחקה ומשוכפלת באופן מלאכותי. מחקרים על מיאסטניה גרביס (MG) הראו כי חיסון אקטיבי ופסיבי יכול לגרום למחלה, ולתרום באופן משמעותי להבנת מצבים מתווכים נוגדנים2.

העברה פסיבית היא שיטה יעילה ביותר להערכת ההשפעות החריפות של מחלות בתיווך נוגדנים עצמיים ונעשה בה שימוש נרחב לחקר נוגדנים שמקורם בחולה ב-MG. גישה זו הועילה בהרחבת ההבנה של הגורמים האימונולוגיים העומדים בבסיס המחלה. לדוגמה, מחקרי העברה פסיבית הראו את ההשפעה הפתוגנית של anti-MuSK IgG4 על הפחתת אשכולות AChR3. עם זאת, ישנן כמה מגבלות למודל ההעברה הפסיבית, כגון ההבדלים התפקודיים בין IgG אנושי ומכרסמים לבין מערכת החיסון וחוסר היכולת של מודל ההעברה הפסיבית לחקות את מנגנוני ההפעלה הראשוניים של האוטואימוניות האנטי-MuSK המתרחשת ברקמות הלימפה.

מצד שני, מגבלה פוטנציאלית של מחקרי החיסון היא שונות אימונוגנטית בין זני עכברים שונים4. לדוגמה, בעוד שעכברי C57BL/6 (B6) רגישים לחיסון פעיל עם AChR, עכברי AKR/J עמידים. לכן, בעת יצירת מודל בעלי חיים EAMG, חיוני לבחור נכון את מין החיה, שיטת החיסון ותוכן הפרוטוקול כדי לשקף במדויק את המחלה5.

בנוסף, שימוש באנטיגן המטרה כחלבון שלם מביא לעתים קרובות לרמות נוגדנים גבוהות. עם זאת, לא כל הנוגדנים עשויים להגיב עם אנטיגן העכבר או לייצר אפיטופים הגורמים למחלות. לכן, מודלים של חיסון פעיל לא תמיד משקפים במדויק את הפתולוגיה האנושית. עם זאת, כאשר הם יוצרים בהצלחה פנוטיפ קליני ופיזיולוגי מתאים, מודלים אלה מספקים פלטפורמה ארוכת טווח לבדיקת טיפולים ניסיוניים.

מחקרים קליניים מצביעים על מנגנוני מחלה שונים ודרישות טיפוליות שונות ל-MuSK-MG, ומדגישים את הצורך בזיהוי נוסף של המאפיינים הפתוגניים הספציפיים של תת-סוג MG זה 4,5,6. מחקרי MuSK EAMG קודמים מבוססי חיסון פעיל הראו מעורבות דומיננטית של חסינות מסוג Th2 ו-IgG1 נגד עכבר באוטואימוניות MuSK וזיהו מספר שיטות טיפול פוטנציאליות (למשל, טריפלונומיד, תאי גזע מזנכימליים, FCRLB shRNA) עבור MuSK MG 7,8,9 אנושי. זה הדגים את החשיבות של מודל MuSK EAMG בבדיקת מטרות טיפוליות חדשות ובחקירת פתופיזיולוגיה של MuSK MG.

במאמר זה פורטו נהלים להשראת המודל החי, ניטור התקדמות המחלה ואימות אינדוקציה של EAMG. ההערכה הקלינית כללה ניטור משקל, יציבה, חוזק אחיזה וציונים קליניים על ידי צופה. עכברים הומתו 28 יום לאחר החיסון השני, ורקמות שונות, כולל דם, שרירי הגפיים האחוריות, טחול ובלוטות לימפה בבית השחי והמפשעה, נאספו כדי לאשר את התבססות המחלה. נוגדנים נגד MuSK כומתו בסרום בשיטת ELISA. בנוסף, בוצעה צביעה אימונו-פלואורסצנטית על רקמות שריר כדי לדמיין משקעים בצומת העצבי-שרירי. כדי להדגים ולהשוות את התגובות הקליניות והחיסוניות בקבוצות עכברים עם רגישות שונה ל-MuSK EAMG, עכברים שטופלו ב-KCNS3 shRNA הראו פעולה פרו-דלקתית (לא פורסמה), ו-FCRLB shRNA הראה פעולה אנטי דלקתית9, כפי שנקבע במחקרים קודמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה המקומית לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת איסטנבול (HADYEK) עם החלטה מספר 2020/29. במחקרים הקודמים שלנו 7,8,9, מודל ה-EAMG הושרה בעכברי BALB/c או B6 בני 8-10 שבועות באמצעות חיסון פעיל עם חלבון MuSK. מאמר זה מציג נתונים לדוגמה שהתקבלו מניסויים שונים בעכברי BALB/C מחוסנים ב-MuSK (4-8 עכברים בקבוצה). הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. ייצור והכנה של MuSK אנושי לחיסון

  1. שכפל את חומצות האמינו החוץ-תאיות של MuSK האנושי 24-495 (רצף ייחוס NCBI: NP_005583.1) לתוך וקטור pPIC9.
  2. מפרישים ביטוי במערכת השמרים Pichia pastoris (זן GS115).
  3. לגרום לביטוי על ידי הוספת מתנול (2.5% v/v) למצע הגידול.
  4. הוסף תג C-terminal 6xHIS למטרות טיהור.
  5. בטא את החלבון כחלבון מסוכרר המופרש וטהר אותו בתנאים טבעיים. דיאליזה של מדיום התרבות כנגד 50 מ"מ מאגר פוספט pH 8.0, 300 מ"מ NaCl.
  6. המשך עם כרומטוגרפיה של זיקה של ניקל-יון באמצעות Ni2+/nitrilotriacetate agarose (Ni-NTA). אחסן את החלבון המטוהר לאחר תוספת של 10% גליצרול בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, שם הוא יציב לפחותשנתיים 10.
    הערה: רמות הביטוי, המוערכות לאחר טיהור Ni-NTA, הן כ-0.4 מ"ג/ליטר תרבית. לא זוהו זיהומי חלבון אחרים בדגימות שנותחו על ידי SDS-PAGE.
  7. לפני החיסון, ודא את טוהר התחום החוץ-תאי המבודד של חלבון MuSK על ידי אלקטרופורזה של ג'ל (איור משלים 1).
  8. הכן את ה-MuSK לכל עכבר בריכוז של 45 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר PBS.
  9. הומוגניזציה (תחליב) של ה-MuSK ביחס של 1:1 עם PBS (100 מיקרוליטר) ו-Complete Freund's Adjuvant (CFA-100 μL) המכיל Mycobacterium tuberculosis H37Ra (10 מ"ג/10 מ"ל) (הנפח הכולל של האמולסיה הוא 200 מיקרוליטר לעכבר).

2. הליך הרדמה וחיסונים

  1. לפני החיסון, יש לדלל את הפרופופול ב-PBS (יחס של 1:5).
  2. יש לתת תוך צפקי במינון של 50 מ"ג/ק"ג לעכבר.
    הערה: ניתן להשתמש באיזופלורן גם להרדמה באמצעות אינהלציה (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). הריכוז הראשוני נקבע בדרך כלל על 3%-5% עם קצב זרימת חמצן של 1-2 ליטר לדקה, בעוד שריכוז התחזוקה הוא בדרך כלל 1%-3% עם קצב זרימת חמצן של 0.5-1 ליטר לדקה.
  3. חיסון ראשון: יש להזריק בסך הכל 45 מיקרוגרם/200 מיקרוליטר MuSK מוכן ב-CFA באופן תת עורי לכתפיים ולכפות האחוריות הפנימיות (כ-11.25 מיקרוגרם/50 מיקרוליטר לכל חלק).
  4. חיסון שני: הזרקת סך של 45 מיקרוגרם/200 מיקרוליטר MuSK מוכן ב-CFA תת עורי לכתפיים ולירכיים (כ-11.25 מיקרוגרם/50 מיקרוליטר לכל חלק).
    הערה: יש לתת את הזריקות פעמיים במרווח של 28 יום כדי לבסס את המודל. מתן תוך שרירי קשור לכאבי שרירים, שעלולים להפריע להערכת חולשה קלינית. מכיוון ש-EAMG היא מחלת שרירים, ניצול הזרקה תוך שרירית עלול לגרום לחולשה שאינה מיאסטנית הקשורה לכאב ובכך לשמש כגורם מבלבל. מומלצת קבוצת ביקורת שחוסנה ב-CFA בלבד (ללא MuSK).

3. ניקוד קליני

  1. תרגלו את העכברים על ידי גרירתם בעדינות 40 פעמים על פני הרשת העליונה של הכלוב כשהם מנסים לאחוז ברשת כדי לגרום לעייפות, מכיוון שתסמינים של מיאסטניה גרביס בעכברים הופכים בולטים יותר לאחר פעילות גופנית ועייפות.
  2. לאחר האימון, התבונן היטב בעכברים לשינויים בפעילות, במשקל ובכוח השרירים. הקצה ציונים מתאימים על סמך תצפיות אלה כדי להנחות את קריטריוני ההערכה.
    הערה: ציון 0: עכברים נשארים פעילים וממשיכים לחקור את סביבתם; ציון 1: יציבה כפופה נצפית לאחר פעילות גופנית, אך עכברים חוזרים לפעילות רגילה ולחברותיות. טיפוח פרווה נשמר בדרך כלל. ציון 2: יציבה כפופה נראית עוד לפני האימון והופכת בולטת יותר לאחר האימון. נצפתה ירידה בטיפוח עצמי ובפעילות. ציון 3: תנוחה כפופה דרמטית נצפית לפני ואחרי האימון. יש ירידה משמעותית בתנועה, בחברותיות ובכוח השרירים, מלווה בירידה במשקל של 1-2 גרם כל 2-3 ימים. התייבשות מתרחשת, מה שמקשה על עכברים להגיע למים ולמזון. התייבשות מזוהה על ידי העור שאינו חוזר במהירות לאחר צביטה ושינויים בצואה. עכברים הסובלים מכאבים מאופיינים בפזילה ויציבה כפופה. עכברים המראים סימנים של כאבים עזים וירידה במשקל העולה על 20% מוקרבים. ציון 4: העכבר נמצא מת בכלוב. יש להוציא את העכבר שנפטר מיד, ולהחליף את הכלוב5.
  3. בדוק את העכברים מדי יום מכיוון שהתסמינים התקדמו במהירות כ-10 ימים לאחר החיסון השני. בצע ניקוד ומדידות קליניות מדי שבוע במשך 28 הימים הראשונים ולאחר מכן פעמיים בשבוע.
  4. בצע מדידת משקל.
    הערה: מדידת משקל מספקת פרמטר מכריע למעקב אחר התקדמות המחלה. בשל שיעורי חילוף החומרים הגבוהים של עכברים, משקל הגוף יכול להשתנות באופן משמעותי. חשוב להשתמש באותו סולם עבור כל המדידות ולבצע מדידות אלו באותה שעה ביום לעקביות.
  5. בצע מדידת כוח שרירים. השתמש בדינמומטר אופקי עם חוט רשת כדי למדוד את חוזק השרירים.
    1. תרגלו את העכברים לניקוד קליני על ידי גרירתם בעדינות מעל הכלוב 40 פעמים כדי לגרום לעייפות.
    2. הנח מיד כל עכבר על הרשת של הדינמומטר ומשוך בעדינות בזנב, וודא שכל הכפות אוחזות בחוזקה ברשת. שקול רק מדידות שבהן העכברים אוחזים ברשת עם כל ארבע הכפות.
      הערה: נסו להפעיל כמות שווה של כוח במהלך כל מדידה, ומומלץ שאותו חוקר יבצע את כל המדידות כדי לשמור על אמינות ולהפחית את השונות. מכיוון שעייפות היא סימן ההיכר של חולשת MG, יש לבצע סדרה של בדיקות חוזק אחיזה מבלי למדוד את חוזק האחיזה. לאחר מכן, בוצעו שבע מדידות לכל עכבר, וערכי המקסימום והמינימום הושלכו. הממוצע של חמש המדידות הנותרות מחושב כדי להבטיח תוצאות אמינות.

4. הכנת דגימת רקמות

הערה: הקריבו את העכברים 28 יום לאחר החיסון השני בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד. איסוף דם, שרירים, טחול ובלוטות לימפה מהעכברים שהוקרבו יועיל למחקרים נוספים.

  1. איסוף דם לבבי
    הערה: כדי לאסוף דם לבבי, יש להרדים את העכברים באמצעות חומר הרדמה מתאים (למשל, פרופופול) שאושר על ידי ועדת האתיקה. ניקור לב דורש הרדמה והוא הליך סופני, כלומר יש להמית בעלי חיים מיד לאחר מכן.
    1. לאחר הרדמה עמוקה של החולדה, הניחו אותה על גבה, פתחו את הבטן ואתרו את הלב, כ-1 ס"מ מעל הצלע התחתונה ומעט ימינה.
    2. בעזרת מחט 25-35 גרם, שאבו דם בזהירות מהחדר השמאלי בזווית של 45 מעלות מבלי להזיז את המזרק כדי למנוע סיבוכים11.
    3. להעביר את דגימות הדם לצינורות יבשים להפרדת סרום ו/או לצינורות EDTA לבידוד RNA - אם מתוכנן.
    4. הפרד את הסרום על ידי צנטריפוגה ושמור את דגימות הסרום בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. שימור והכנה של דגימות שריר
    1. אסוף שריר טיביאליס קדמי 11,12,13. שוטפים עם PBS קר כקרח.
    2. מניחים דגימות בצינורות קריו, צוללים מיד לאיזופנטן מקורר חנקן נוזלי בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס, ומאחסנים במקפיא של -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: יש להקפיא דגימות בהצמדה לקבלת תוצאות מדויקות יותר בניסויים.
    3. הנח את הרקמות אנכית על תושבת חתך; ניתן להשתמש בפקק. הטמע את הדגימות לצביעה אימונופלואורסצנטית ב-OCT (תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית).
    4. אפשר לרקמה לצוף על איזופנטן מקורר חנקן נוזלי. מאחסנים במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד לחיתוך עם קריוסטט.

5. הערכת צמתים עצביים-שריריים באמצעות תיוג אימונופלואורסצנטי

  1. חתך וקיבוע קריוסטט
    1. חתכו את הרקמות הקפואות המוטבעות ב-OCT ב-24 מעלות צלזיוס לעובי של 7 מיקרומטר באמצעות קריוסטט.
    2. תקן את החלקים באצטון מקורר ל -20 מעלות צלזיוס. שוטפים עם PBS למשך 5 דקות.
    3. יש לשטוף שוב PBS המכיל 0.4% טריטון X (PBS-T) למשך 10 דקות.
      הערה: ניתן לבצע שלב חדירות כדי לתקן את הקונפורמציה של מולקולות המושפעות מקיבוע, מה שמבטיח קשירה מדויקת יותר. חדירה כללה טיפול ב-PBS המכיל 1% FBS למשך 10 דקות ו-PBS-T למשך 10 דקות נוספות.
    4. חסום את החלקים עם PBS-T המכיל 10% FBS למשך 30 דקות כדי למנוע כריכה לא ספציפית.
  2. צביעה אימונופלואורסצנטית
    הערה: לצביעה ניתן להשתמש בנוגדנים הבאים: C3, IgG, סמן קולטן אצטילכולין α-bungarotoxin.
    1. לדלל את הנוגדנים שנבחרו ב-PBS-T המכילים 1% FBS.
    2. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 2.5 שעות.
    3. שטפו את החלקים עם PBS-T המכיל 1% FBS.
    4. כתם נגד עם DAPI.
    5. אחסן את החלקים עד לבדיקה במיקרוסקופ פלואורסצנטי בסביבה חשוכה ולחה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    6. בצע הדמיה וניתוח.
      הערה: יש לספור צמתים עצביים-שריריים חיוביים לבונגרוטוקסין (BTX) בכל קטע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. צלם תמונות בהגדלה של פי 20. לצורך ניתוח, BTX ו-C3 או צמתים עצביים-שריריים חיוביים ל-IgG נספרו באופן ידני תחת המיקרוסקופ. יש להשתמש באחוז הצמתים החיוביים הכפולים ביחס לסך הצמתים המסומנים ב-BTX בקטעים טוריים לניתוח.

6. כתם מערבי

  1. בידוד וכימות חלבונים
    1. השתמש בדגימות שריר קפואות.
    2. הכן מאגר ליזה עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז.
    3. הוסף חרוזי תחמוצת זירקוניום בגודל 0.5 מ"מ השווים למשקל הדגימה ופי 2 מנפח מאגר הליזיס.
    4. הומוגניזציה של דגימות באמצעות הומוגנייזר.
    5. צנטריפוגה ליזאט ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    6. אסוף את הסופרנטנט המכיל את החלבון ליזאט.
    7. השתמש בערכת בדיקת BCA או במגיב ברדפורד כדי לכמת את ריכוז החלבון.
    8. הכן דגימות חלבון לריכוז הרצוי עם מאגר ליזה. 25 מיקרוגרם חלבון לבאר יעיל להצגת AChR.
  2. אלקטרופורזה של ג'ל SDS-PAGE
    1. מערבבים דגימות חלבון עם 4x Laemmli buffer.
    2. מחממים את הדגימות בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לדנטורציה.
    3. טען כמויות שוות של חלבון וסולם חלבון לבארות של ג'ל SDS-PAGE.
    4. הפעל את הג'ל ב-200 וולט למשך 30 דקות (הזמן עשוי להשתנות בין ספקי כוח שונים).
  3. העברת חלבון
    1. להעברה חצי יבשה עם קרום ניטרוצלולוזה, הרטיבו כל רכיב עם מאגר העברה קר.
    2. הגדר את כריך ההעברה: ספוג, נייר פילטר, ג'ל, קרום, נייר פילטר, ספוג.
      הערה: ודא שאין בועות בין השכבות. יש לבחור את תוכנית ההעברה בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
  4. חסימה ודגירת נוגדנים
    1. חסום את הממברנה בחלב יבש ללא שומן 5% או BSA ב-TBST למשך שעה בטמפרטורת החדר עם נדנוד עדין.
    2. ממברנת דגירה עם נוגדן ראשוני (anti-AChR) מדולל ב-2.5% חיץ חוסם לילה ב-4 מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין.
    3. שוטפים את הממברנה 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחת ב- TBST.
    4. ממברנת דגירה עם נוגדן משני מצומד HRP (IgG HRP) מדולל במאגר חוסם של 2.5% למשך שעה בטמפרטורת החדר.
    5. שוטפים את הממברנה 3 פעמים למשך 10 דקות כל אחת ב- TBST.
  5. איתור והדמיה
    1. מרחו מצע ECL על הממברנה בהתאם להוראות היצרן.
    2. ללכוד את האות הכימילומינסנט באמצעות מערכת הדמיה.
    3. נתח רצועות באמצעות תוכנת הדמיה.
      הערה: שמור תמיד חלבונים וריאגנטים על קרח כדי למנוע פירוק. הקפידו על העמסה שווה על ידי הפעלת חלבון משק בית (למשל, בטא-אקטין, אלפא-טובולין או GAPDH) כבקרה. מטב את ריכוזי הנוגדנים וזמני הדגירה לקבלת התוצאות הטובות ביותר. חשוב להראות כי חלבון AChR מתבטא פחות בעכברים שחוסנו ב-MuSK.

7. אנטי-MuSK תוצרת בית IgG ELISA

  1. הכן אנטיגן MuSK בריכוז של 0.5 מיקרוגרם לבאר ב-100 מיקרוליטר של מאגר קרבונט ביקרבונט (ציפוי צלחת).
  2. הוצא 100 מיקרוליטר מתמיסת האנטיגן לכל באר של צלחת בדיקה חיסונית.
  3. דוגרים את הצלחת למשך הלילה בחום של 4 מעלות צלזיוס.
  4. שטפו את הצלחת עם PBS המכיל 0.5% Tween 20 (תמיסת כביסה).
  5. דגרו את הצלחת עם PBS המכיל 5% FBS (תמיסת חסימה) למשך 90 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לחסום אתרי קשירה לא ספציפיים (חסימה).
  6. מכיוון שמחקרי אופטימיזציה הראו רמות גבוהות של MuSK-IgG, יש לדלל את דגימות הסרום ב-1/50,000 בתמיסת חסימה.
  7. מבלי לשטוף לאחר החסימה, הוסף את דגימות הסרום המדוללות לבארות.
  8. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.
  9. שוטפים את הצלחת שלוש פעמים עם תמיסת הכביסה.
  10. לדלל נוגדן משני IgG מצומד HRP נגד עכבר (ab97023) 1/5000 בתמיסת חסימה.
  11. הוסף 100 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המדולל לכל באר.
  12. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.
  13. שוטפים את הצלחת שלוש פעמים עם תמיסת הכביסה.
  14. הוסף 100 מיקרוליטר של מצע TMB לכל באר והתבונן בשינוי הצבע.
  15. עצור את התגובה בזמן המתאים באמצעות 2 M H2SO4.
  16. מדוד את הצפיפות האופטית ב-450 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
  17. בצע את כל הדגימות בכפילויות ובאותה צלחת לעקביות.
    הערה: יש להשתמש בערכי צפיפות אופטית לניתוח מכיוון שלא היו דילולי דגימה סטנדרטיים זמינים. לא אמור להיות שינוי צבע בבארות הבקרה השליליות (ריק). צפוי שינוי צבע מהיר, ולכן יש לשמור את תמיסת העצירה בקרבת מקום כדי לעצור מיד את התגובה בבארות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהערכה ואימות מודל MuSK Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis (EAMG), מספר פרמטרים מרכזיים ותוצאות ניסוי הם קריטיים כדי להדגים את האינדוקציה והאפיון המוצלח של מודל המחלה. להלן התוצאות המייצגות המאשרות את הקמת מודל MuSK EAMG.

ניקוד קליני
עכברים מנוטרים ומקבלים ניקוד לתסמינים קליניים של מיאסטניה גרביס באמצעות מערכת ניקוד קלינית סטנדרטית. ניקוד זה כולל הערכת כוח השרירים, היציבה והמצב הגופני הכללי. עלייה בציונים הקליניים לאורך זמן, בהשוואה לעכברי בסיס ועכברי ביקורת, מאשרת א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MuSK-EAMG של עכברים מחקה MuSK-MG אנושי הן בהיבטים הקליניים והן בהיבטים האימונופתוגניים שלו במונחים של חולשת שרירים, ירידה במשקל עקב חולשת שרירים בולבריים, נוגדנים נגד MuSK במחזור הדם והפחתת AChR בשרירים. באשר לאבני דרך וציר הזמן הצפוי למודל MuSK-EAMG זה, סימנים קליניים של חולשת שרירים אמורים להופיע בשבוע הראשון לאחר החיסון השני. כ-5% מהעכברים עלולים לפתח סימני מחלה לאחר החיסון הראשון. שכיחות של >70% EAMG (לפחות דרגה 1) צפויה לאחר שני חיסונים. אם שכיחות המחלה נמוכה יותר, ניתן לתת חיסון של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין גילויים להצהיר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להכיר בתמיכה ובתרומות של המכון למדעי הבריאות של אוניברסיטת איסטנבול והמכון לרפואה ניסויית ע"ש עזיז סנקר בהשלמת מחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
125I-α-bungarotoxinInvitrogenBTX T1175
2-מתילבוטןסיגמא-אולדריץ'M32631
40 μ m מסננת תאיםNEST258369
96 באר צלחת MaxisorpSigma-AldrichM9410
אדג'ובנט לא שלםBecton Dickinson & Co.& 263910
אנטי-AChR alfa1 אלומוןANC-001
נגד עכבר IgG HRPAbcamab97023
כדור בלנדר סערההבא מתקדםרקמות הומוגנייזר
C3NovusNB200-540G
מאגר קרבונט-ביקרבונטMerckC3041
CryostatLeicaCM1860 
דינמומטר Imada DST-50NMuromachiMK380Si
מיקרוסקופ פלואורסצנטיLeicaDM4M
מזרק זכוכית עם מנעול לוארISOLAB094.92.005
IgGAbcamab96871
פוטומטר מיקרופלייט, Multiskan FCThermo Scientific51119000
ערכה כירורגית לעכברקנט מדעי קורפרציהINSMOUSEKIT
מיקובקטריום טוברקולוזיס H37Raבקטון דיקינסון ושות'& 
מזרקי OCTCompound Agar ScientificAGR1180
, 1 מ"לBecton Dickinson & Co.&;מזרקי 309625
, 2 מ"לB. Braun7389
מסנן בעלי חיים אוניברסליMerckZ756911-1EA
WesternBright Sirius-Western ערכת זיהוי כתמיםAdvanstaK-12043-D10ECL
231141

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Keesey, J. A. A history of treatments for myasthenia gravis. Semin Neurol. 24, 5-16 (2004).
  2. Giannoccaro, M. P., Wright, S. K., Vincent, A. In vivo mechanisms of antibody-mediated neurological disorders: Animal models and potential implications. Front Neurol. 10, 1394(2020).
  3. Verschuuren, J. J. G. M., Plomp, J. J. Passive transfer models of myasthenia gravis with muscle-specific kinase antibodies. Ann N Y Acad Sci. 1413 (1), 111-118 (2018).
  4. Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
  5. Kusner, L. L., et al. Guidelines for pre-clinical assessment of the acetylcholine receptor-specific passive transfer myasthenia gravis model-recommendations for methods and experimental designs. Exp Neurol. 270, 3-10 (2015).
  6. Koneczny, I., et al. IgG4 autoantibodies in organ-specific autoimmunopathies: Reviewing class switching, antibody-producing cells, and specific immunotherapies. Front Immunol. 13, 834342(2022).
  7. Ulusoy, C., et al. Dental follicle mesenchymal stem cell administration ameliorates muscle weakness in MuSK-immunized mice. J Neuroinflammation. 12, 231(2015).
  8. Yilmaz, V., et al. Effects of teriflunomide on B cell subsets in MuSK-induced experimental autoimmune myasthenia gravis and multiple sclerosis. Immunol Invest. 50 (6), 671-684 (2021).
  9. Koral, G., et al. Silencing of Fcrlb by shRNA ameliorates MuSK-induced EAMG in mice. J Neuroimmunol. 383, 578195(2023).
  10. Trakas, N., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. J. Development of a highly sensitive diagnostic assay for muscle-specific tyrosine kinase (MuSK) autoantibodies in myasthenia gravis. J Neuroimmunol. 240-241, 79-86 (2011).
  11. JoVE, Science Education Database. Blood withdrawal I. JoVE Sci Educ. , (2023).
  12. Peretti, A. L., et al. Action of vanillin (Vanilla planifolia) on the morphology of tibialis anterior and soleus muscles after nerve injury. Einstein (Sao Paulo). 15 (2), 186-191 (2017).
  13. Van Der Meulen, J. H., Kuipers, H., Stassen, F. R., Keizer, H. A., Van Der Vusse, G. J. High energy phosphates and related compounds, glycogen levels and histology in the rat tibialis anterior muscle after forced lengthening and isometric exercise. Pflugers Arch. 420 (3-4), 354-358 (1992).
  14. Kucukerden, M., et al. MuSK-induced experimental autoimmune myasthenia gravis does not require IgG1 antibody to MuSK. J Neuroimmunol. 295-296, 84-92 (2016).
  15. Ulusoy, C., et al. Preferential production of IgG1, IL-4 and IL-10 in MuSK-immunized mice. Clin Immunol. 151 (2), 155-163 (2014).
  16. Mori, S., et al. Antibodies against muscle-specific kinase impair both presynaptic and postsynaptic functions in a murine model of myasthenia gravis. Am J Pathol. 180 (2), 798-810 (2012).
  17. Wu, B., Goluszko, E., Huda, R., Tuzun, E., Christadoss, P. Experimental autoimmune myasthenia gravis in the mouse. Curr Protoc Immunol. Chapter 15, Unit 15.23. , (2011).
  18. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135 (Pt 4), 1081-1101 (2012).
  19. Vergoossen, D. L. E., et al. Functional monovalency amplifies the pathogenicity of anti-MuSK IgG4 in myasthenia gravis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (13), e2020635118(2021).
  20. Oh, S., et al. Precision targeting of autoantigen-specific B cells in muscle-specific tyrosine kinase myasthenia gravis with chimeric autoantibody receptor T cells. Nat Biotechnol. 41 (9), 1229-1238 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MuSKComplete Freund s Adjuvant
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים