דימות סידן חד-תאי לחקר הפעלת תעלות יוני סידן

סיכום

מאמר זה מציג שיטה לניטור כמותי בזמן אמת של ריכוזי יוני סידן (Ca²⁺) בתאים באמצעות הדמיה חד-תאית Ca²⁺ עם צבע Fura-2/AM. טכניקה זו מאפשרת העמסת צבע יעילה וחישוב מדויק של רמות Ca²⁺ באמצעות יחסי עוצמת פלואורסצנטיות, מה שהופך אותה לגישה פשוטה ומהירה ליישומי מחקר.

תקציר

הדמיה של תא יחיד Ca²⁺ חיונית לחקר ערוצי Ca²⁺ המופעלים על ידי גירויים שונים כמו טמפרטורה, מתח, תרכובת טבעית וכימיקלים וכו '. הוא מסתמך בעיקר על טכנולוגיית הדמיה מיקרוסקופית ועל מחוון Ca²⁺ הקשור Fura-2/AM (AM הוא קיצור של אסטר אצטוקסימתיל). בתוך התאים, Fura-2/AM עובר הידרוליזה על ידי אסטראזות לתוך Fura-2, אשר יכול להיקשר באופן הפיך עם Ca²⁺ ציטופלזמי חופשי. אורך גל העירור המרבי משתנה מ-380 ננומטר ל-340 ננומטר (כאשר הוא רווי ב-Ca²⁺) בעת הקשירה. עוצמת הפלואורסצנטיות הנפלטת קשורה כמותית לריכוז Ca²⁺ כבול. על ידי מדידת יחס 340/380, ניתן לקבוע את ריכוז Ca²⁺ בציטופלסמה, תוך ביטול טעויות הנגרמות כתוצאה משינויים ביעילות ההעמסה של הגשושית הפלואורסצנטית בין דגימות שונות. טכנולוגיה זו מאפשרת ניטור בזמן אמת, כמותי ובו-זמני של שינויי Ca²⁺ בתאים מרובים. התוצאות מאוחסנות ב- ". XLSX" פורמט לניתוח הבא, שהוא מהיר ומייצר עקומות שינוי אינטואיטיביות, שיפור משמעותי של יעילות האיתור. מנקודות מבט ניסיוניות שונות, מאמר זה מפרט את השימוש בטכנולוגיה זו כדי לזהות אותות Ca²⁺ בתאים עם חלבוני ערוץ אנדוגניים או בעלי ביטוי יתר. בינתיים הוצגו והושוו גם שיטות שונות להפעלת תאים. המטרה היא לספק לקוראים הבנה ברורה יותר של השימוש והיישומים של הדמיית Ca²⁺ תא בודד.

מבוא

Ca²⁺ ממלא תפקיד מכריע בהעברת אותות תאיים, מווסת תפקודים תאיים שונים כגון כיווץ שרירים¹, הולכה עצבית², הפרשה³ וביטוי גנים⁴, ובכך משפיע על תהליכים פיזיולוגיים מרובים. ריכוזי Ca²⁺ חריגים עלולים להוביל למחלות כגון הפרעות קצב⁵, הפרעות קרישה⁶ וחוסר איזון הורמונלי⁷. לכן, חקר המנגנונים של שינויי ריכוז תוך תאיים Ca²⁺ הוא בעל חשיבות עליונה.

תעלות יונים שונות מעורבות בוויסות ריכוז Ca²⁺ בתאים,^{כולל תעלות} סידן 8 (CRAC) 8 ותעלות קטיון לא סלקטיביות ממשפחת TRP⁹. תעלות יונים אלה יכולות להיות מופעלות על ידי גירויים כגון טמפרטורה¹⁰, תרכובות וחומרים פעילים הנמצאים ברפואה הסינית המסורתית¹¹, וממלאים תפקיד מכריע בתהליכים פיזיולוגיים שונים הקשורים ל- Ca²⁺.

ניטור יעיל של שינויים בריכוז Ca²⁺ תוך תאי חיוני לחקר תעלות יונים הקשורות ל- Ca²⁺, במיוחד בתחום הרפואה הסינית המסורתית, שם ויסות איתות הסידן משחק תפקיד מרכזי בגישות טיפוליות רבות. כיום, ניתן לסווג את השיטות העיקריות למדידת Ca²⁺ תוך תאי לשני סוגים: מדידות חשמליות ואופטיות. גישת המדידה החשמלית משתמשת בטכניקת מהדק טלאי כדי להעריך שינויים בפוטנציאל קרום התא עקב זרם Ca^{2+ 12}.

במדידה אופטית, גשושיות פלואורסצנטיות נקשרות באופן ספציפי ל-Ca²⁺, ומאפשרות לחוקרים לעקוב אחר שינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות התאית. שיטות אופטיות נפוצות כוללות טכניקות מבוססות חלבון פלואורסצנטי וטכניקות מבוססות צבע פלואורסצנטי. בשיטות מבוססות חלבון פלואורסצנטי, חוקרים יכולים לבטא יתר על המידה חלבונים פלואורסצנטיים רגישים ל-Ca²⁺ כמו Cameleon¹³ ו-GCaMP¹⁴ בתאים ולנטר שינויים באותות הפלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או ציטומטריית זרימה כדי לצפות בשינויים בריכוזי Ca²⁺ ציטופלזמי. בנוסף, חוקרים יכולים לבטא יתר על המידה חלבונים אלה בעכברים ולהשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של שני פוטונים לניטור בזמן אמת in vivo או ברמת הרקמה של ריכוזי Ca²⁺ תוך תאיים, מה שמספק רזולוציה גבוהה וחדירה עמוקה לרקמות¹⁰.

עבור שיטות מבוססות צבע פלואורסצנטי, בדיקות Ca²⁺ נפוצות כוללות Fluo-3/AM, Fluo-4/AM ו- Fura-2/AM¹⁰. חוקרים דוגרים על תאים בתמיסה המכילה את הגשושיות הפלואורסצנטיות הללו, אשר חוצות את קרום התא ונבקעות על ידי אסטראזות תוך-תאיות ליצירת תרכובות פעילות (למשל, Fluo-3, Fluo-4 ו-Fura-2) שנשארות בתוך התא. גשושיות אלה מציגות פלואורסצנטיות מינימלית בצורת הליגנד החופשי שלהן, אך פולטות פלואורסצנטיות חזקה כאשר הן קשורות ל-Ca²⁺ תוך תאי, ובכך מעידות על שינויים בריכוזי Ca²⁺ ציטופלזמי. בהשוואה לחלבונים וצבעים פלואורסצנטיים אחרים, Fura-2 מעורר בדרך כלל באורכי גל של 340 ננומטר ו-380 ננומטר. כאשר הוא קשור ל-Ca²⁺ חופשי תוך-תאי, Fura-2 עובר שינוי בליעה, ומעביר את שיא אורך גל העירור מ-380 ננומטר ל-340 ננומטר, בעוד שיא הפליטה קרוב ל-510 ננומטר נותר ללא שינוי. קיים קשר כמותי בין עוצמת הפלואורסצנטיות לבין ריכוז Ca²⁺ קשור, המאפשר חישוב ריכוז Ca²⁺ תוך תאי על ידי מדידת יחס עוצמת הפלואורסצנטיות בשני אורכי גל עירור אלה. מדידות יחס מפחיתות את ההשפעות של הלבנה פוטו, דליפת בדיקה פלואורסצנטית, עומס לא אחיד והבדלים בעובי התא, ומניבות תוצאות אמינות וניתנות לשחזור יותר (איור 1).

מערכות הדמיה חד-תאיות Ca²⁺ משתמשות בעיקר בטכניקות מיקרוסקופיה ובמחוון Ca²⁺ Fura-2/AM כדי לזהות ריכוזי Ca²⁺ תוך תאיים. מערכות אלה כוללות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מקור אור הדמיה Ca²⁺ ותוכנת הדמיה פלואורסצנטית, המאפשרת ניטור כמותי בזמן אמת של שינויים בציטופלסמה Ca²⁺ של תאים מרובים בו זמנית (עד 50 תאים לכל שדה ראייה). התוצאות נשמרות בפורמט ".xlsx" לניתוח הבא. המערכת מציעה מהירות ניתוח מהירה (כדקה לניתוח קבוצת תאים בשדה ראייה אחד) ומייצרת עקומות שינוי אינטואיטיביות, המשפרות משמעותית את יעילות האיתור. הדמיית Ca²⁺ חד-תאית היא גישה טכנית חיונית לחקר ערוצים הקשורים ל-Ca²⁺ ויש לה ערך רב במחקר ביו-רפואי הקשור לתעלות יונים. יישומה בטכנולוגיית דימות סידן חד-תאי צפוי לקדם מאוד את המחקר על המנגנונים העומדים בבסיס הרפואה הסינית המסורתית.

פרוטוקול

שיטות הניסוי אושרו על ידי ופעלו בהתאם להנחיות IACUC של אוניברסיטת צינגהואה ואוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית. פרוטוקול זה מציג שיטות הדמיה של Ca²⁺ חד-תאי עבור סוגי תאים שונים, כולל קרטינוציטים ראשוניים שבודדו מעורם של מספר עכברים שזה עתה נולדו (תוך שלושה ימים מהלידה, עם חברי המלטה אקראיים למין, C57BL/6 עכברים). פרטים על הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת תאים

הערה: תאים ראשוניים, שורות תאים עם גני מטרה אנדוגניים, או אלה הנגועים בפלסמידים בעלי ביטוי יתר מתאימים כולם להדמיית Ca²⁺ של תא יחיד. הפלסמידים ששימשו במחקר זה התקבלו ממעבדתו של פרופסור שיאו ביילונג באוניברסיטת צינגהואה. פלסמידים אלה נבנו על ידי שילוב רצפים של חלבון פלואורסצנטי GFP עם STIM1 אנושי, חלבון פלואורסצנטי DsRed עם Orai1 אנושי, חלבון פלואורסצנטי mRuby עם ארנב TRPV1, כמו גם חלבון פלואורסצנטי אדום mCherry לתוך וקטורים פלסמיד פאג^'10.

1. הכינו מגלשות זכוכית סטריליות בקוטר 8 מ"מ בצלחת בת 24 בארות. הוסף 500 μL של חיץ פולי-D-ליזין (PDL) (50 מיקרוגרם/מ"ל ב-DPBS) לכל באר.
2. יש לדגור על המגלשות בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת כדי לאפשר ציפוי, ולאחר מכן להשליך את תמיסת הציפוי באמצעות פיפטה.
3. שטפו את המגלשות פעם אחת עם DPBS והניחו אותן בצד לשימוש מאוחר יותר.
4. תרבית תאים ראשוניים וקווי תאים בנפרד בהתאם לשיטות הגידול הספציפיות שלהם¹⁰.
5. תאי זרעים על צלחת 24 בארות מוכן בצפיפות של כ 1.5 x 10⁵ תאים לכל באר. השתמש בתאים להדמיית Ca²⁺ לאחר שהם נצמדו לכיסוי.
6. עבור תאים המבטאים יתר על המידה פלסמידים, יש לבצע טרנספקציה^{של 10,15} פלסמיד המטרה (1 מיקרוגרם / באר) באמצעות מגיב טרנספקציה Lipofectamine 2000 (או Lipofectamine 3000) ביחס של 1:1, ולדגור באינקובטור תרבית תאים במשך כ -24 שעות.
   הערה: זמן דגירה ארוך יותר עשוי להיות נחוץ עבור חלבונים מבוטא גדולים יותר.

2. הכנת פתרון עבודה Fura-2/AM

1. הוסף 50 μL של dimethyl sulfoxide (DMSO) לצינור המכיל 50 מיקרוגרם של אבקת Fura-2/AM וערבב היטב כדי להכין תמיסת ציר 1 מיקרוגרם / μL של Fura-2/AM.
2. ערבבו את תמיסת המניות Fura-2/AM ואת Pluronic F-127 לתוך החיץ של האנק המכיל 1.3 mM Ca²⁺.
   הערה: הריכוז הסופי של Fura-2/AM ו-F-127 פלורוני בתמיסת העבודה הוא 2.5 מיקרוגרם/מ"ל. החיץ של האנק מוכן על ידי הוספת 10 mM HEPES למאגר HBSS 1x.
3. השתמש ברדיד אלומיניום כדי להגן על פתרון העבודה Fura-2/AM מפני אור.

3. טיפול מקדים בתאים להדמיית Ca²⁺ חד-תאי

1. העבירו את מגלשות הזכוכית עם התאים לצלחת חדשה בת 24 בארות המכילה את החיץ של האנק לשטיפה.
2. השליכו את החיץ באמצעות פיפטה והוסיפו 500 μL של חיץ עבודה Fura-2/AM לכל באר.
3. יש לדגור בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות כדי לאפשר העמסת בדיקה.
4. הסר את חיץ העבודה Fura-2/AM ושטוף את התאים שלוש פעמים עם המאגר של האנק כדי לסלק עודפי Fura-2/AM. התאים מוכנים כעת לשימוש.

4. הפעלת מערכת ההדמיה Ca²⁺

הערה: במחקר זה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש להדמיית Ca²⁺ .

1. הפעל את הרכיבים הבאים ברצף: אור DG4 (מנורת קסנון), מצלמה, מקור אור לבן, בקר במה במיקרוסקופ, מיקרוסקופ, מחשב ותוכנת הדמיה פלואורסצנטית.
   הערה: אם אתם מזהים הפעלה של תעלות יונים לפי טמפרטורה, הפעילו גם את הרכיבים הבאים: מערכת זילוח, מערכת חימום, בקר טמפרטורה ומכשיר חימום/קירור למחזור נוזלים.

5. נוהל תגובה סלולרי Ca²⁺

1. פתח את תוכנת ההדמיה הפלואורסצנטית (ראה טבלת חומרים).
   1. בחר פרוטוקול ולאחר מכן בחר קובץ, ולאחר מכן טען פרוטוקול. בחר את הפרוטוקול ולחץ על אישור.
   2. הגדר את הניסוי (ברשימת התפריטים).
   3. בחר ניסוי חדש.
2. הרכיבו את תא הזילוח על המיקרוסקופ.
   הערה: הנמיכו תמיד את המטרה במלואה בעת הרכבה או הסרה של תאים באמצעות ידית המיקוד המחוספסת כדי למנוע נזק למטרה.
3. הסר את שקופיות התאים שטופלו ב- Fura-2/AM ומקם אותן בתא המכיל את החיץ של האנק.
4. הפעל את מערכת הזילוח.
5. בחר את המטרה 20x DIC וכוונן את המיקוד תחת אור לבן.
6. לחץ על Cfg Exp בשורת המשימות.
   1. בחר את הפלואורים הרצויים להדמיה.
   2. קבע את תדירות הרכישה ואת הגדרות התצוגה על המסך (רכישה: בדוק עבור 340, 380, GFP; מרווח רכישה: 1 שניות; מרווח שמור: 1 שניות).
7. מוקד
   1. בלוח הבקרה של הניסוי, לחץ על כפתור פוקוס .
   2. התאימו את זמן הרכישה (בדרך כלל 100 מילישניות) והרוויחו לפי הצורך, ואז "שמרו לגל הזה".
      הערה: עבור אור UV, השתמש רווח במקום זמן חשיפה.
   3. בחר את אורך הגל הרצוי למיקוד (למשל, 380) ולחץ על התחל להתמקד.
   4. העבר את התצוגה מהמשקפת למחשב.
   5. ודא שצבע ירקרק קלוש נראה דרך המשקפת.
   6. התמקדו בתאים, השתמשו תחילה במיקוד גס כדי לקרב את המטרה, ולאחר מכן להתמקד בעדינות.
      הערה: המיקרוסקופ יצפצף אם יתקרב יותר מדי לבמה. אם זה קורה, הנמיכו את המטרה, יישרו מחדש את הצלחת על הבמה והתמקדו שוב. צמצם את זמן ההתמקדות כדי להפחית את הנזק לתאים הנגרם על-ידי לייזר.
   7. בדוק את עוצמת הפלואורסצנטיות של התאים במהלך תהליך המיקוד.
   8. התאם את עוצמת הפלואורסצנטיות של התאים על ידי שינוי זמן החשיפה והרווח.
      הערה: זמן החשיפה והרווח עבור 340 ו- 380 חייבים להיות עקביים.
   9. לאחר השגת מיקוד טוב, לחץ על הלחצן במיקרוסקופ כדי להעביר את התצוגה למחשב.
   10. מיקוד מחדש לפי הצורך כדי לקבל את התמונה החדה ביותר במחשב, ולאחר מכן לחץ על הפסק מיקוד.
8. הליך חלופי למציאת תאים חיוביים GFP
   1. השתמש תחילה בהליך 340/380 כדי להשיג מיקוד טוב בתאים.
   2. בחר FITC ולאחר מכן לחץ על התחל להתמקד.
   3. השתמש בבקר הבמה כדי למצוא תאים חיוביים ל- GFP.
   4. העבר את התצוגה למחשב ולאחר מכן לחץ על הפסק מיקוד.
9. בחירת אזור
   1. לחץ על אזור כפתור בשורת התפריטים.
   2. בחר את סוג התאורה שבחרת (340/380/FITC/TRITC). מסנני FITC ו-TRITC נבחרים עבור GFP ו-mCherry/DsRed/mRuby, בהתאמה, עבור תאים המבטאים יתר על המידה את הפלסמידים הממוקדים; אחרת, בחר Fura-2.
      הערה: הימנע מבחירת תאים במצב גרוע או מתים, כגון אלה שהם בבירור מעוגלים או שיש להם חלבונים פלואורסצנטיים חשופים יתר על המידה.
   3. לחץ על רכוש תמונות, ולאחר מכן אישור.
   4. יופיע חלון חדש; בחר תאים על-ידי לחיצה על הכלי הסגלגל ולאחר מכן לחיצה על התא.
   5. בחר את התאים הרצויים תחת הפלואורסצנטיות הנישא על ידי חלבון המטרה (FITC או TRITC). בחר את תאי הבקרה שאינם מבטאים את חלבון המטרה בתנאי 380 ננומטר.
   6. בטל אזור על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על העיגול ולאחר מכן בחירה באפשרות מחק אזור.
   7. בחר דוגמת רקע כאזור האחרון ורשום את מספר הזיהוי שלו.
   8. לחץ על שמור ולאחר מכן על סיום.
10. חיסור רקע
    1. לחץ על כפתור התפריט הפניות.
    2. ציין את מספר אזור הרקע.
       הערה: אם הרקע היה האזור האחרון שנבחר, הזנת מספר גבוה מאוד תעבור אוטומטית לאזור האחרון שנבחר.
    3. סמן את התיבה החסר הפניות ולאחר מכן לחץ על אישור.
11. נתוני יומן רישום
    1. לחץ על כפתור Log Data בלוח הבקרה של הניסוי.
       הערה: תמונות נשמרות רק אם יש רצון לחזור על הניסוי מאוחר יותר; בדרך כלל, מספיק רק לבדוק את תיבת הנתונים.
    2. ודא שמופיעה בקשה המבקשת את סוג קובץ הנתונים המועדף; בחירת. תבנית XLSX מומלצת.
    3. ייפתח גליון עבודה מסוג ".xlsx". מזעור גליון העבודה ימנע ממנו לתפוס שטח מסך.
12. איסוף נתונים
    1. במקטע Time Lapse בלוח הבקרה, הגדר את מרווח הזמן לרכישת נתונים ל - 1 s.
       הערה: ניתן להתאים זאת בהתאם לצרכים בפועל.
    2. לחץ על שעון אפס ורכוש בלוח הבקרה של הניסוי כדי להתחיל את הניסוי. קווי בסיס יוצגו בגרף המציין כל אחד מאזורי התא שנבחרו.
    3. לבצע סדרת טיפולים בתאים בהתאם לדרישות הניסוי.
    4. כדי לצפות בתגובת הטמפרטורה של התאים, חממו את החיץ במערכת הזילוח לטמפרטורה מתאימה באמצעות בקר טמפרטורה.
    5. כדי לבחון את ההשפעות של תרופות על תאים, יש לנקב או להוסיף ידנית חיץ המכיל תרופות ולתעד את השינויים בתאים.
    6. לאחר השלמת איסוף הנתונים, לחץ על השהה.
       הערה: ניתן להשהות את איסוף הנתונים, ולאפס את השעון בכל עת במהלך הניסוי.
    7. שמור ונתח את הנתונים.
13. לחץ על File and Close Experiment כדי לסיים את הניסוי, ובחר No בתיבת הדו-שיח כדי לשמור את הפרוטוקול.
14. פתח ניסוי חדש על ידי לחיצה על חדש בתפריט, וחזור על התהליך.
15. תסגור
    1. סגור את התוכנה והעבר את הנתונים מהמחשב.
    2. הפוך את הליך ההפעלה.
    3. רשמו את השעות בגיליון ההרשמה ונקו את כל הבלגן.
16. ניתוח נתונים
    1. ייצג את ריכוז Ca²⁺ התוך תאי ביחס Fura-2 340/380 או המר לריכוז Ca²⁺ המתאים.

תוצאות

זיהוי תגובת טמפרטורה
קרטינוציטים ראשוניים
קרטינוציטים ראשוניים בודדו מעכברים שזה עתה נולדו והוכנו על פי פרוטוקולים שנקבעו¹⁰. תאים אלה נזרעו לתוך לוחות של 24 בארות שהכילו מגלשות זכוכית. בעקבות ההעמסה של הגשושית Fura-2, המיקוד הותאם תחת המיקרוסקופ באורך גל של 380 ננומטר כדי להשיג הדמיה ברורה של המורפולוגיה של התא, כפי שמודגם באיור 2A. אם הגשושית לא נטענה בהצלחה במהלך התהליך, התאים לא יהיו גלויים. החיץ החוץ תאי בתא הוחלף ברציפות באמצעות מערכת זילוח, מה שהבטיח תנאים אופטימליים לתאים. מערכת בקרת הטמפרטורה חוברה למערכת הזילוח, ואפשרה זיהוי תגובות תרמיות תאיות על ידי שליטה בשינויי הטמפרטורה במאגר החוץ תאי. תהליך זה כלל חימום הדרגתי של המאגר החוץ תאי ולאחר מכן קירור הדרגתי שלו.

מערכת ההדמיה החד-תאית Ca²⁺ שימשה לניטור שינויים בריכוז Ca²⁺ תוך תאי בתנאי ניסוי שונים. כפי שניתן לראות באיור 2B, קרטינוציטים הציגו תגובה תרמית ברורה כאשר הם נתונים לחימום, כמו גם תגובה מורגשת במהלך שלב הקירור. יש לציין שתגובת הטמפרטורה הזו נעלמה כאשר הגן STIM1, האחראי העיקרי לתגובה הזו, נמחק (איור 2C)¹⁰. הדמיית Ca²⁺ חד-תאית מאפשרת תצפית בזמן אמת על שינויים בריכוז Ca²⁺ תוך תאי בתגובה לגירויים חיצוניים שונים, ומאפשרת ניתוח מפורט של התנהגות התא ואיתות.

HEK293T תאים המבטאים יתר על המידה את פלסמידים המטרה
HEK293T תאים נזרעו לתוך צלחת בת 24 בארות שהכילה שקופיות זכוכית על פי השיטה הניסויית. התאים קיבלו ביטוי יתר באמצעות STIM1/Orai1, והתגובה התרמית המתווכת שלהם זוהתה באותה שיטה שתוארה לעיל עבור תאים ראשוניים. במקרה של תאים המבטאים יתר על המידה את פלסמיד המטרה, העברה מוצלחת אושרה על ידי בחירת תאים המבטאים את הפלסמיד המתאים, כפי שמצוין על ידי חלבונים פלואורסצנטיים אדומים או ירוקים הנישאים על ידי הפלסמיד תחת אורכי גל TRITC או FITC. לצורך ניסוי זה נעשה שימוש בפלסמידים STIM1-GFP/Orai1-DsRed, כאשר GFP זוהה תחת FITC, פולט פלואורסצנטיות ירוקה, ו-DsRed זוהה תחת TRITC, פולט פלואורסצנטיות אדומה. תאים בעלי ביטוי יתר של mCherry ריק (TRITC) שימשו כקבוצת ביקורת שלילית. כפי שניתן לראות באיור 3A, תאים פלואורסצנטיים שנצפו תחת FITC הצביעו על ביטוי מוצלח של STIM1, מה שמאפשר בחירה ורישום של התגובה התרמית שלהם במהלך תהליכי החימום והקירור. תאים שלא עברו טרנספורמציה שימשו כבקרה שלילית. איור 3B מדגים ש-STIM1/Orai1 הפגין תגובה תרמית משמעותית במהלך תהליך הקירור, בניגוד לבקרה השלילית שמוצגת באיור 3C.

זיהוי תגובה לתרופות
טכנולוגיית הדמיה Ca²⁺ של תא יחיד יכולה לשמש גם לזיהוי תגובות תאים לתרכובות. הכנת התא לזיהוי תגובה תרמית זהה לזו שתוארה לעיל. ההבדל בין תגובה תרופתי לתגובה תרמית טמון בעובדה שתגובה תרמית דורשת בדרך כלל הפעלה של תאים על ידי שינוי הטמפרטורה של החיץ החוץ תאי דרך מערכת זילוח, בעוד שתרכובות יכולות להינתן באמצעות זילוח או על ידי הוספתן ישירות באמצעות פיפטה. תוספת ישירה עם פיפטה יכולה לשמר ביעילות את כמות התרכובת בה משתמשים; עם זאת, העקומה המתקבלת לא תמיד עשויה להיות מושכת מבחינה חזותית כמו זו המתקבלת באמצעות זילוח.

אם ניקח את איור 4 כדוגמה, איור 4A מראה את תגובת כניסת הסידן (SOCE) המופעלת בחנות של STIM1/Orai1, שבה ריכוז Ca²⁺ החוץ-תאי ותכולת החומצה הציקלופיאזונית (CPA) משתנים ברצף באמצעות מערכת זילוח כדי לגרום ל-SOCE. באיור 4B, קפסאיצין אגוניסט TRPV1 מתווסף ישירות באמצעות פיפטה לתאים המבטאים יתר על המידה את פלסמיד TRPV1. קפסאיצין יכול להפעיל TRPV1 ולגרום לשטף Ca²⁺ חוץ-תאי.

איור 1: תרשים סכמטי של Fura-2 AM. Fura-2 היא בדיקה פלואורסצנטית נפוצה Ca²⁺ בביולוגיה של התא אשר נקשרת באופן סלקטיבי ל- Ca²⁺ ביחס של 1:1 ופולטת פלואורסצנטיות. בשל טבעו הקוטבי מאוד כתרכובת חומצית, פורה-2 אינו יכול להיכנס לתאים. כדי לשפר את חדירות התא, הוא מצומד עם אצטוקסימתיל (AM) על הקבוצה השלילית שלו כדי ליצור Fura-2/AM. שינוי זה מגביר את מסיסות האסתר שלו ומבטל את המטען השלילי. בתוך התאים, Fura-2/AM עובר הידרוליזה על ידי אסטראזות לתוך Fura-2, אשר יכול להיקשר באופן הפיך עם Ca²⁺ ציטופלזמי חופשי. בעת הקשירה, אורך גל העירור המרבי משתנה מ-380 ננומטר ל-340 ננומטר (כאשר הוא רווי ב-Ca²⁺). עוצמת הפלואורסצנטיות הנפלטת קשורה כמותית לריכוז Ca²⁺ כבול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: זיהוי תגובת טמפרטורה של קרטינוציטים ראשוניים. (A) צביעת Fura-2 של קרטינוציטים מעכברים שזה עתה נולדו, שנצפתה תחת עדשה אובייקטיבית פי 20. (ב,ג) תגובת טמפרטורה של קרטינוציטים WT (B) וקרטינוציטים נוקאאוט STIM1 (C) באמצעות מערכת הדמיה Ca²⁺ חד-תאית. הגדלה: פי 20. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: זיהוי תגובת טמפרטורה של STIM1-GFP/Orai1-Dsred מבוטא יתר על המידה בתאי HEK293T. (A) איור מייצג המציג תאים חיוביים המבטאים STIM1-GFP תחת FITC. (ב,ג) תגובת טמפרטורה של תאי HEK293T המבטאים את הפלסמיד המתאים שזוהה על ידי מערכת הדמיה Ca²⁺ חד-תאית. הגדלה: פי 20. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: זיהוי תגובה לתרופות באמצעות הדמיית Ca²⁺ חד-תאית. (A) תגובת SOCE של תאי HEK293T המבטאים יתר על המידה STIM1/Orai1. המאגר החוץ תאי משתנה מ-Ca²⁺ המכיל ל-Ca²⁺ ללא שימוש במערכת זילוח. בהיעדר Ca²⁺, CPA מתווסף כדי לרוקן Ca²⁺ מהרשתית האנדופלסמית. לאחר מכן, המאגר החוץ-תאי מוחלף במאגר המכיל Ca²⁺ כדי לגרום לזרם Ca²⁺ חוץ-תאי, המייצג כניסה של Ca²⁺ המופעל בחנות. הדמיית Ca²⁺ חד-תאית משמשת לרישום דינמי של השינויים בריכוז Ca²⁺ ציטוסולי הנגרמים על ידי תהליכים אלה. (B) HEK293T תאים המבטאים יתר על המידה TRPV1-mRuby, כאשר mRuby הוא חלבון פלואורסצנטי המשמש לבדיקת מצב הטרנספקציה של חלבון TRPV1. קפסאיצין מתווסף באמצעות פיפטה בעוד זרם Ca²⁺ נרשם על ידי הדמיה חד תאית Ca²⁺ . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

היישום של מערכות הדמיה של Ca²⁺ חד-תאי הוא נרחב, ומאפשר מחקר של אותות Ca²⁺ בסוגי תאים שונים, כולל קרטינוציטים, תאי גזע¹⁶, תאי כבד, תאי לב¹⁷, פודוציטים¹⁸, תאי חיסון וקווי תאים המבטאים יתר על המידה חלבוני מטרה^10,19. טכניקה זו מודדת שינויים וערכים מוחלטים של ריכוזי Ca²⁺ תאיים וממלאת תפקיד מכריע בחקירת תעלות יונים הקשורות ל- Ca²⁺, מה שהופך אותה לאחד המכשירים החיוניים במעבדות מחקר תעלות יונים.

ככל שהמחקר מתקדם, המשמעות של תעלות יונים הקשורות לאותות Ca²⁺ זכתה להכרה גוברת בקרב חוקרי רפואה סינית מסורתית. מטרתם לפענח את סוגיות הליבה של הרפואה הסינית המסורתית דרך עדשת תעלות היונים. למשל, התכונות החמות והקרות של הרפואה הסינית מבססות את העיקרון של "טיפול בחום בקור וטיפול בקור בחום". תעלות יונים רגישות לטמפרטורה רבות המתווכות אותות Ca²⁺ קשורות קשר הדוק לעיקרון זה. יתר על כן, תרופות סיניות רבות מפעילות השפעות טיפוליות באמצעות פעולות אנטי דלקתיות, כאשר תעלות יונים מרובות הקשורות ל- Ca²⁺ ממלאות תפקידים משמעותיים בוויסות דלקת²⁰.

חיוני לחקור את ההשפעות של רכיבים חשובים ברפואה הסינית המסורתית על מאפייני תעלת היונים כדי לחשוף את התכונות הפרמקולוגיות של תרופות אלה ברמה המולקולרית. כיום, חוקרים ברפואה סינית מסורתית מתמקדים בעיקר באיתור ביטוי של תעלות יונים רלוונטיות. עם זאת, עדיין קיים ניטור מוגבל יחסית בזמן אמת לגבי השפעות הרפואה הסינית המסורתית על תעלות יונים הקשורות ל- Ca²⁺, ומנגנונים בסיסיים רבים עדיין אינם ברורים.

קבוצת מחקר זו הוקדשה לחקר תעלות יונים הקשורות ל- Ca²⁺, כגון STIM1/Orai1, STIM1/Orai3, TRPA1¹⁰ ו- TRPV1, והיא בקיאה ביישום ובשימוש מפורט במערכות הדמיה Ca²⁺ חד-תאיות. מחקר זה מדגים את השימוש הספציפי בדימות Ca²⁺ חד-תאי למטרות מחקר שונות, במטרה לספק לקוראים הבנה מקיפה של היישומים הנרחבים שלו והשימוש המפורט. בהשוואה למחקרים קשורים שפורסמו בעבר²¹, מחקר זה מציע נקודת מבט חדשה ומתודולוגיה ליישום של הדמיה חד תאית Ca²⁺ מזוויות שונות ובשילוב עם מערכות אחרות. לדוגמה, תאים ראשוניים או קווי תאים עם ביטוי אנדוגני של גני מטרה יכולים להיות נטענים ישירות עם הגשושית Fura-2 כדי לעקוב אחר שינויים באותות Ca²⁺ תוך תאיים בזמן אמת תחת גורמים מעוררים שונים באמצעות מערכת הדמיה תא יחיד Ca²⁺ . בנוסף, ניתן לבצע ביטוי יתר של פלסמידים המכילים חלבונים פלואורסצנטיים בשורות תאים. בתחילה, התאים נטענים עם הבדיקה Fura-2, כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, תאים עם ביטוי מוצלח של חלבון המטרה נבחרים בהתבסס על אותות FITC או TRITC, אשר מודגשים לאחר מכן לניטור בזמן אמת של אותות Fura-2 Ca²⁺ .

דימות Ca²⁺ חד-תאי היא מערכת גילוי שניתן לשלב עם מערכי ניסוי שונים אחרים בהתאם למטרות הניסוי. לדוגמה, אם יש צורך לזהות את התגובה של תעלות יונים רגישות לטמפרטורה לשינויי טמפרטורה, ניתן לשלב את המערכת עם מערכת תפעול בקרת טמפרטורה ומכשיר זילוח כדי לנטר בו זמנית שינויים באותות Ca²⁺ תוך תאיים על ידי שליטה בטמפרטורה של תמיסת החיץ החוץ תאית¹⁹. גישה זו מאשרת את תגובת תעלות היונים הרלוונטיות לטמפרטורה. יתר על כן, הדמיה של תא יחיד Ca²⁺ יכולה להיות משולבת גם עם מכשירים רלוונטיים להעברת תרופות או מכשירים אחרים לגירוי תאים לניסויים קשורים.

למעשה, מערכת ההדמיה Ca²⁺ של תא יחיד מאפשרת לא רק ניטור בזמן אמת של יחס 340/380, אלא גם את הערכים של FITC או TRITC באמצעות הגדרות ספציפיות. יתר על כן, טכנולוגיית דימות סידן חד-תאי ישימה לאיתור שינויים בריכוז יוני הסידן לא רק בציטופלסמה אלא גם ברשתית האנדופלסמית (ER), ומדגימה את היישומים הרחבים שלה¹⁹. הנתונים המתקבלים על ידי מערכת זו נשמרים באופן אחיד בפורמט ".xlsx", אשר ניתן לנתח במהירות כדי להשיג תוצאות. עקומת השינוי מאפשרת הבנה מהירה של מצב ההפעלה והמאפיינים של תאים, ויוצרת מערכת ניטור אותות נוחה Ca²⁺ . צפוי כי דו"ח מחקר זה יקדם ביעילות את היישום הנרחב של מערכת הדמיה Ca²⁺ חד-תאית בתחום מחקר הרפואה הסינית המסורתית ויתרום לפענוח הרפואה הסינית המסורתית.

עם זאת, ליישום של טכנולוגיית דימות סידן חד-תאי יש מגבלות מסוימות, כגון חוסר היכולת להשיג סינון בתפוקה גבוהה. לדוגמה, בניסויים מסוימים, כאשר יש צורך לסנן אגוניסטים או אנטגוניסטים של ערוץ מסוים, הדמיית סידן דורשת סינון אחד אחד, וזה מאוד זמן רב. במקרים כאלה, ייתכן שיהיה צורך לשלב טכניקה זו עם טכנולוגיות אחרות, כגון FLIPR²², כדי לבצע סינון בתפוקה גבוהה לפני אימות נוסף של התוצאות עם הדמיית סידן של תא יחיד. בנוסף, התמונות המתקבלות מהדמיית סידן של תא בודד מופקות ממיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי, בעל רזולוציה נמוכה יותר בהשוואה למיקרוסקופ קונפוקלי¹⁵. לכן, שילוב יעיל של טכנולוגיית דימות סידן חד-תאי עם טכניקות אחרות כדי למנף את היתרונות שלהם הוא גישה חשובה להתמודדות עם אתגרים בתחום זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מצלמה	ניקון
קפסאיצין	סיגמא	211275
CL-100 בקר טמפרטורה	וורנר אינסטרומנטס
חומצה ציקלופיאזונית (CPA)	סיגמא	C1530
DG-4 אור	סאטר אינסטרומנט חברת
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
תוכנת הדמיה פלואורסצנטית (MetaFluor, תוכנה בתשלום)			מולקולריים
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	Nikon
Fura-2/AM	Invitrogen	F1201
HBSS buffer	Gibco	14175103
HEPES	סיגמא	H3375
ליפופקטמין 3000	Invitrogen	L3000008
פלורוניק F-127	Beyotime	ST501
פולי-D-ליזין	Beyotime	ST508
SC-20 מכשיר חימום/קירור בזרימת נוזלים			הרווארד
מקור אור לבן	Nikon