כתב יד זה מתאר את הנהלים התפעוליים ואמצעי הזהירות כדי לחקור את המנגנונים הפתוגניים הנפוצים הפוטנציאליים המקשרים בין תסמונת סיוגרן ראשונית ואדנוקרצינומה ריאתית באמצעות ניתוח ביואינפורמטי ואימות ניסיוני.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תסמונת סיוגרן ראשונית הקשורה לאדנוקרצינומה של הריאות: בחינת המנגנונים הפתוגניים הנפוצים הפוטנציאליים ואימות ניסיוני
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחקר זה נועד לחקור את המנגנונים הפתוגניים הנפוצים הפוטנציאליים המקשרים בין תסמונת סיוגרן ראשונית (pSS) ואדנוקרצינומה ריאתית (LUAD) באמצעות ניתוח ביואינפורמטי ואימות ניסיוני. הגנים הרלוונטיים הקשורים ל-pSS ו-LUAD אוחזרו ממסד הנתונים של Gene Expression Omnibus (GEO) וממסד הנתונים של Genecard. לאחר מכן, גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) הקשורים ל-pSS ו-LUAD הוקרנו כ-pSS-LUAD-DEGs. אנציקלופדיה של קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) ואונטולוגיה גנטית (GO) בוצעו כדי להבהיר את הפונקציות הביולוגיות המשמעותיות של pSS-LUAD-DEGs. מטרות הליבה זוהו על ידי בניית רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI), הערכה נוספת של דיוק האבחון של גן הרכזת באמצעות ניתוחי עקומת מאפיין הפעלה של מקלט (ROC). במחקר זה, עכברי NOD/Ltj שימשו כמודלים של בעלי חיים pSS ועוררו עם חומר חלקיקי 2.5 (PM2.5) כדי ליצור תגובה דלקתית. תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qPCR), בדיקת אימונוסורבנט מקושרת לאנזים (ELISA) וכתמים מערביים שימשו לאימות ניסויים רלוונטיים בביולוגיה מולקולרית. התוצאות שהתגלו באמצעות ניתוחי העשרה של KEGG ו-GO מצביעות על כך שדלקת ממלאת תפקיד קריטי בקישור בין pSS ל-LUAD. IL6, CCNA2, JAK2, IL1B, ASPM, CCNB2, NUSAP1 ו-CEP55 נקבעו כמטרות עיקריות של pSS-LUAD. עכברי BALB/c ועכברי NOD/Ltj הראו ביטוי מוגבר של ציטוקינים דלקתיים IL-6 ו-IL-1β ברקמות הריאה לאחר 21 יום של גירוי עם PM2.5, הפעלת מסלול האיתות JAK2/STAT3 וויסות הביטוי של גנים הקשורים לגידול CCNA2, CCNB2 ו-CEP55, כאשר עכברי NOD/Ltj הראו שינויים בולטים יותר מעכברי BALB/c. פרוטוקול זה מדגים כי קרצינוגנזה הנגרמת על ידי המיקרו-סביבה הדלקתית הריאתית עשויה להיות סיבה מרכזית לשכיחות הגבוהה של LUAD בחולי pSS. בנוסף, מנגנונים הקשורים לחסימה עשויים לסייע במניעת התרחשות של LUAD בחולי pSS.
מבוא
תסמונת סיוגרן ראשונית (pSS) היא מחלה אוטואימונית המאופיינת בחדירה לימפוציטית של הבלוטות האקסוקריניות ומובילה לתסמינים קליניים של עיניים יבשות (קסרופתלמיה) ויובש בפה (קסרוסטומיה)1,2. pSS מלווה בדרך כלל גם בביטויים חוץ-בלוטיים של מעורבות, כולל היפרגלובולינמיה3, מחלת ריאות אינטרסטיציאלית4, חמצת צינורית כלייתית5, נזק נוירולוגי6 וטרומבוציטופניה7, המהווים את הגורמים הפרוגנוסטיים השליליים העיקריים. בשנים האחרונות, שורה של מחקרים הוכיחה כי pSS מלווה בדרך כלל בשכיחות ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
חיות הניסוי שוכנו במתקן בעלי החיים של בית החולים לידידות סין-יפן, שם תנאי הדיור עמדו בסביבת האכלת בעלי החיים בהתאם לתקן הלאומי של סין, דרישות חיות מעבדה של סביבה ומתקני דיור (GB14925-2010). כל ההליכים והניסויים לטיפול בבעלי חיים עמדו בהנחיות ARRIVE והתבססו על עקרונות 3R (הפחתה, החלפה, עידון), תוך הקפדה על הנחיות החוק הלאומי לרווחת בעלי חיים של סין. עכברי BALB/c נרכשו מ-SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd., ועכברי NOD/Ltj נרכשו מ-Huafukang (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.
1. ניתוח ביואינפורמטי
- הכנת מערכי נתונים
- פתח את מסד הנתונים Gene Expression Omnibus (GEO) (www.ncb....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בסך הכל זוהו 3290 DEGs מתוך 23348 גנים ב-GSE84884 (pSS), כולל 2659 גנים מווסתים ו-631 גנים מווסתים (איור 1A). עבור GSE51092 (pSS), זוהו בסך הכל 3290 DEGs מ-11409 הגנים, כולל 667 גנים מווסתים ו-587 גנים מווסתים (איור 1B). מסד הנתונים של GeneCards השיג 102 DEGs הקשורים ל-pSS בשחלות, וציון המתאם של קריטריוני הסקר היה ≥20. האיחוד ומניעת הכפילויות של ה-DEGs הקשורים ל-pSS שהתקבלו מ-GEO ו-GeneCards הביאו ל-453 DEGs (pSS-DEGs). בסך הכל זוהו 7154 DEGs מתוך 25440 גנים ב-G.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
למרות ש- pSS נחשבת למחלה המאופיינת בעיקר בפלישה של בלוטות אקסוקריניות, לא ניתן להתעלם מהנזק של בלוטות חוץ24. הריאות מייצגות איבר מטרה ל-pSS, ומעורבות ריאות היא ביטוי חוץ-בלוטי שכיח של pSS, בדרך כלל כרוך בחדירה לימפוציטית של רירית הסימפונות ואינטרסטיציום ריאתי25. מחקרים מצביעים על כך שלפחות 20% מחולי pSS חווים מחלת ריאות אינטרסטיציאלית (ILD)26,27. ILD הוא גורם סיכון משמעותי לסרטן ריא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מימון המחקר הקליני של בית החולים הלאומי ברמה גבוהה (2023-NHLHCRF-BQ-01) ופרויקט הנוער של בית החולים לידידות סין-יפן (No.2020-1-QN-8).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סמן חלבון צבוע מראש בעל 3 צבעים | Epizyme | WJ103 | |
| מאגר דילול נוגדנים | Epizyme | PS119 | Western Blot |
| BCA ערכת כימות חלבון | Epizyme | ZJ101 | Western Blot |
| Cytoscape 3.7.1 תוכנה | המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) | גרסה 3.7.1. | תוכנת קוד פתוח לניתוח והדמיה של רשתות ביולוגיות |
| ECL נוזל זוהר | Epizyme | SQ203 | מאגר |
| אלקטרופורזה | Epizyme | PS105S | Western Blot |
| GraphPad Prism 10.0 | GraphPad | גרסה 10.0 | ניתוח נתונים |
| מצומד HRP עז אנטי-ארנב IgG (H+L) (AS014) | אבקלונלי | AS014 | Western Blot |
| JAK2 טכנולוגיית | איתות תאים | 3230T | עכבר כתם |
| מערבי IL-1β אליסה קיט | בייג'ינג 4א Biotech Co., Ltd | CME0015 | ELISA |
| Mouse IL-6 ELISA Kit | בייג'ינג 4א Biotech Co., Ltd | CME0006 | קוקטייל מעכב פוספטאז ELISA |
| (100&) | Epizyme | GRF102 | Western Blot |
| Phospho-JAK2 (Tyr1007/1008) | טכנולוגיית איתות תאי | 3776S | Western Blot |
| Phospho-STAT3 (Tyr705) | טכנולוגיית איתות תאי | נוגדנים 9145S | |
| קוקטייל מעכב פרוטאז כתם מערבי (100&) | Epizyme | GRF101 | מאגר |
| חסימה מהירה ללא חלבון Western Blot (5&) | Epizyme | PS108 | Western Blot |
| PVDF ממברנה | Millipore | IPVH00010 | Western Blot |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | Not ישים | תוכנת ניתוח סטטיסטי ושפת תכנות המשמשת ליישומי ניתוח נתונים, הדמיה ולמידת מכונה |
| בדיקת רדיו Immunoprecipitation | Epizyme | PC101 | Western Blot |
| מערכת תמלול הפוך | Promega | A3500 | PCR |
| SDS-PAGE | Epizyme | LK303 | Western Blot |
| SDS-PAGE מאגר טעינת חלבון (5&) | Epizyme | LT103 | Western Blot |
| STAT3 טכנולוגיית איתות תאי נוגדנים | 9139S | כתם מערבי | |
| SYBR ירוק בזמן אמת PCR מאסטר מיקס | TOYOBO | QPK-201 | PCR |
| TBST (10&) | Epizyme | PS103 | מאגר |
| העברת כתם מערבי (10&) | Epizyme | PS109 | Western Blot |
| β-Actin Antibody | acclonal | AC026 | Western Blot |
מקורות
- Thorlacius, G. E., Bjork, A., Wahren-Herlenius, M. Genetics and epigenetics of primary sjogren syndrome: Implications for future therapies. Nat Rev Rheumatol. 19 (5), 288-306 (2023).
- Bjordal, O., Norheim, K. B., Rodahl, E., Jonsson, R., Omdal, R. Primary Sjogren's syndrome and th....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
